热点05 基因编辑-2025年高考生物【热点·重点·难点】专练（北京专用）

热点05 基因编辑 基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。早期的基因工程技术只能将外源或内源遗传物质随机插入宿主基因组，基因编辑则能定点编辑想要编辑的基因。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称"分子剪刀"，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑， 在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。 1.Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 2.CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。 其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 3.In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 （建议用时：40分钟） 一、选择题 1．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 2．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【答案】A 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。其过程如下: ①高温变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 ②低温复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③中温延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】 A、图示操作中不需要用限制酶处理目的基因，A错误； B、实现基因的定点诱变时，需要根据目的基因序列设计两种常规引物，以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物，图中属于突变引物的是引物2、3；与常规引物相比，图中的2、3两种引物必须要有一段互补的序列，可以进行碱基互补配对，而且应含有拟突变位点，否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成，B正确； C、进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，不需要另加引物。但是，若要获得大量目的基因需要进行PCR3，引物选择2、3，C正确； D、利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变。可见，此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组，D正确。 故选A。 3．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，A错误； BC、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误，C正确； D、由于将目的基因导入大肠杆菌，因此用钙离子处理法最有效，D错误。 故选C。 4．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 【答案】B 【分析】结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，随后将基因表达载体导入同一细胞中。 【详解】AC、结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，AC错误； B、设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因，为构建基因表达载体作准备，B正确； D、将含有M5和B72的基因表达载体导入同一细胞中，D错误。 故选B。 5．（2024·北京丰台·二模）CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞通过基因工程改造，使其表达肿瘤嵌合抗原受体（CAR），大量扩增后输回患者体内以清除癌细胞。下列有关说法错误的是（　　） A．CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞 B．该疗法利用了细胞免疫和基因重组的基本原理 C．CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞坏死 D．CAR-T细胞上的CAR能够精准识别癌细胞 【答案】C 【分析】细胞免疫的过程：被病毒感染的靶细胞膜表面的某些分子发生变化，细胞毒性T细胞识别变化的信号，开始分裂并分化，形成新的细胞毒性T细胞和记忆T细胞。同时辅助性T细胞分泌细胞因子加速细胞毒性T细胞的分裂、分化。新形成的细胞毒性T细胞在体液中循环，识别并接触、裂解被同样病原体感染的靶细胞，靶细胞裂解、死亡后，病原体暴露出来，抗体可以与之结合，或被其他细胞吞噬掉。 【详解】A、细胞毒性T细胞能够识别并接触、裂解被同样病原体感染的靶细胞，CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞，A正确； B、CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞（细胞毒性T细胞）通过基因工程改造，利用了细胞免疫和基因重组的基本原理，B正确； C、CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞凋亡，C错误； D、CAR-T细胞表面有肿瘤嵌合抗原受体（CAR），故可以通过CAR能够精准识别癌细胞，D正确。 故选C。 6．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。 下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 【答案】B 【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。 【详解】A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A正确； B、该方法需利用DNA连接酶实现目的基因与载体的连接，不需要使用限制酶，B错误； C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物与目的基因配对，C正确； D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D正确。 故选B。 7．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点，A正确； B、由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确； C、重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织中不含有该基因，故不会出现蓝色组织，C错误； D、若启动子为抗除草剂诱导启动子，即只有在除草剂存在的情况下抗除草剂基因A才诱导其表达，没有除草剂时不表达，所以减少了细胞物质和能量的浪费，D正确。 故选C。 8．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ） A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，卡那霉素抗性基因与GFP基因融合到DNA2上后导入大肠杆菌，因此用用卡那霉素筛选含DNA2的大肠杆菌，A错误； B、易错DNA聚合酶能催化DNA的复制，即能催化GFP基因复制，B正确； C、易错DNA聚合酶使DNA复制过程中发生基因突变的概率增加，因此GFP基因在复制过程中突变率升高，C正确； D、连续传代并筛选，逐代淘汰，就会筛选出荧光菌落，从而加速GFP进化，D正确。 故选A。 9．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因一DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误； B．可通过感受态细胞的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌，B错误； C．基因表达载体上的启动子可调控蛛丝蛋白基因的表达，C错误； D．若需对蛛丝蛋白进行设计和改造以增强其韧性，可通过蛋白质工程来实现，D正确。 故答案为：D。 10．（2023·北京昌平·二模）转座子是基因组中可移动的DNA片段，玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座，Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时，才能从原位点切离并插入到新位点中。研究者利用玉米转座子系统构建烟草突变体，下列叙述错误的是（　　） A．推测Ds转座元件不具有编码转座酶功能 B．可构建同时含有Ac/Ds的基因表达载体 C．利用农杆菌转化法将基因表达载体导入烟草细胞 D．Ds与其被插入的基因间发生基因重组 【答案】D 【分析】题中的转座就是转座子在基因组上的转移。转座需要转座酶，而且从原位点切离后要能插入到新位点中。农杆菌的Ti质粒上可转移的T-DNA就是一段转座子，在有相关酶和转座所需的特异性序列的情况下，T-DNA能切离，整合到受体细胞的染色体DNA上，利用这些原理，可以将目的基因转化入受体细胞，最后进行选择培养、筛选获得转基因植株。 【详解】A、玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座，Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时，才能从原位点切离并插入到新位点中，说明Ds转座元件不具有编码转座酶功能，A正确； B、Ds转座元件与Ac转座子同时存在时，能让转座子从原位点切离并插入到新位点中，所以可以构建同时含有Ac/Ds的基因表达载体，将目的基因插入转座子，让目的基因随转座子插入到受体细胞，B正确； C、农杆菌易感染植物细胞，其Ti质粒上的T-DNA就是可转移的DNA，即转座子，Ti质粒上的转座子可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上。在基因工程中，可以用农杆菌作为转移基因表达载体的工具。利用农杆菌转化法，先将基因表达载体导入农杆菌，继而农杆菌在侵染烟草细胞后，基因表达载体中包含目的基因的转座子就会整合到烟草细胞的染色体DNA中，C正确； D、基因重组是指控制不同性状的基因重新组合的过程，Ds转座元件不一定是一段基因，而且当Ds转座元件插入基因，Ds转座元件本身的中间序列已经发生了改变，所以，Ds转座元件与插入它内部的基因间不是发生了基因重组，D错误。 故选D。 二、非选择题 11．（2025·北京通州·模拟预测）平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员为开发特异性标记血管SMC的方法，开展了相关研究。 (1)与肌肉收缩相关的M蛋白在SMC中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，根本原因是 。 (2)为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠用于研究，研究人员进行了下列实验，如图1所示。 ①利用PCR技术获得CE，为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠M基因的 之后，获得小鼠A． ②构建含Stop和tdT的表达载体，导入 细胞，获得小鼠B．将A与B杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C（CE/+）。 ③在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。用药物T饲喂小鼠C后，可观察到 。 (3)为利用工具鼠研究血管SMC中S基因表达在主动脉瘤形成中的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠（flox/+）后，将其与C鼠作为亲本进行系列杂交（不考虑tdT的遗传情况），流程如图2所示。 已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为 ，经T诱导后，该小鼠 。从中筛选出能发出红色荧光的个体，观察血管SMC是否有改变。 (4)为评估血管SMC标记是否具有组织特异性和药物T的外源诱导性，需要做的检测有 。 【答案】(1)基因的选择性表达 (2) 启动子 受精卵 SMC发出红色荧光 (3) 1/8 SMC中S基因被敲除 (4)检测C鼠多种组织中tdT的表达情况；检测C鼠饲喂与不饲喂T条件下tdT的表达情况 【分析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）与肌肉收缩相关的M蛋白在SMC中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，是由于分化导致的，其根本原因是基因的选择性表达。 （2）将CE插入小鼠M基因的启动子之后，可保证CE在SMC中特异性表达，从而获得小鼠A。 受精卵的分化程度低，欲获得目标个体，应将构建好的表达载体导入受精卵中。 在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失，则Stop序列丢失，tdT表达出红色荧光蛋白，由于CE在SMC中特异性表达，经杂交后，小鼠C同时含有CE和tdT，所以可观察到SMC发出红色荧光。 （3）已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为1/4×1/2=1/8。外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，所以经T诱导后，SMC中S基因被敲除。 （4）通过检测C鼠多种组织中tdT的表达情况，可评估血管SMC标记是否具有组织特异性；通过检测C鼠饲喂与不饲喂T条件下tdT的表达情况，可评估药物T的外源诱导性。 12．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因 出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 （选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 （填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 【答案】(1)转录 (2) ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 (3) 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，东方果蝇中dsx基因（DNA）通过转录形成前体RNA。 （2） ①用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad。 ②RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3） ①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下： 。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 13．（2024·北京房山·一模）肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的。科研人员利用基因工程技术，对小鼠肠道内相关菌株（B菌）进行改造，以期获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 (1)高脂饮食是引起高血脂症的一个主要原因，但脂质也是人体必要的物质，请写出属于脂质的2种化学物质 。 (2)工程菌的制备： ①X菌的筛选：16SrRNA基因是鉴定微生物的重要依据，其大小约为1500bp，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，其他菌株中只有一个。通过PCR→ → →观察，结果如图1，可知 （填图1中序号）为所选目的菌种。 ②表达载体的构建： 科研人员操作如图2，进行同源重组构建表达载体。 I.将NC质粒用相关的限制酶进行酶切。 Ⅱ.在X菌株BSH基因两侧分别添加一段与上述载体同源（碱基排列次序相同）的序列A、B。 Ⅲ.表达载体同源重组过程如图2所示。如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为 ，两者在5’-3’外切酶的作用下被降解，在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成 键，完成基因表达载体的构建。 ③科研人员将表达载体用电击法导入B菌，获得BS菌株。 (3)关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有________ A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 (4)用BS菌株给小鼠灌胃，同时给小鼠饲喂高脂饮食，对照组1不做处理，8周后检测小鼠肠道内容物，进行体外BSH活性检测，如图3所示，结果说明 。 (5)有人认为BS菌株适合开发为人体降脂的功能性菌剂，请辩证地评价该观点 。 【答案】(1)脂肪、磷脂（胆固醇、性激素） (2) 酶切 电泳 1/5/10/12 -T-T-T-C- 磷酸二酯 (3)ABC (4)成功获得分泌更多BSH的工程菌BS (5)为人体降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路；可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全性评估 【分析】利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的片段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克服传统方法中会破坏目的基因的局限性。 【详解】（1）脂质包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇可分为胆固醇、性激素和维生素D三种。 （2）①DNA电泳的基本步骤为PCR扩增基因、酶切处理适当大小的DNA片段、电泳分离、观察；根据题目信息可知，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，16SrRNA基因经限制酶ApaI处理后可获得三种长度的DNA片段，普通菌株中的16SrRNA基因上只有一个该酶的切割位点，经该酶处理后可获得两种长度的DNA片段，观察图1发现，2、3、4、6、7、8、9组中电泳出1000和500两种DNA片段长度，1、5、10和12组中电泳出750、500、250三种DNA片段长度，11组电泳结果不明显，由此可知1、5、10和12组为所选目的菌种； ②Ⅲ.据图2可知，目的基因M链的3'端与NC质粒N'链的3'端在第二步时可以通过碱基互补配对将两个黏性末端拼接在一起，因此如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为-T-T-T-C-；在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成磷酸二酯键，将DNA链连在一起，完成基因表达载体的构建。 （3）利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的片段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克服传统方法中会破坏目的基因的局限性。 故选ABC。 （4）分析图3可得，BS菌灌胃组的胆汁含量明显高于对照组，结合题干信息“肠道菌群分泌BSH，高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量”可知，该结果说明成功获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 （5）根据题干信息“肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的”可知，BS菌株有利于人体降脂，为人体降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路，但作为新开发菌株，还缺少实验数据来确保该菌株的安全性，贸然摄入可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全性评估。 14．（2024·北京石景山·一模）贝氏不动杆菌（A菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A菌的HGT能力检测结肠癌。 (1)通常用含蛋白胨的培养基培养A菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成 等物质（答出2个即可）。 (2)结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。 ①如图1所示，将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断 键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。 ②为验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，依据①中的原理，构建图2所示的表达载体，导入A菌中获得传感器A。将传感器A与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A在不同培养基中的生长情况。请从a～e中选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列 。 a．KRAS片段1 b．KRAS片段2 c．kanR d．specR（壮观霉素抗性基因） e．G12位点 能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是 。 (3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，并对图2所示表达载体进行进一步改造（如图3）。请分析其能检测出结肠癌的机理 。 【答案】(1)蛋白质、核酸（或ATP等） (2) 磷酸二酯 bda 能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落 (3)若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成蛋白质（元素组成是C、H、O、N等）、核酸（或ATP等）（元素组成是C、H、O、N、P）。 （2）①分析题意，该过程的酶能够切断DNA，DNA的基本单位是脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，故该酶作用的位点是磷酸二酯键。 ②本次设计的目的是验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，需要将G12位点突变切除，然后再重新连接，结合图2启动子方向与图1的箭头方向可知，该过程中III对应的应是KRAS片段1，I是KRAS片段2，两者之间需要插入标记基因，可选择dspecR（壮观霉素抗性基因），故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列是bda；A菌可以从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，所以含有卡那霉素抗性基因的KRAS片段会被传感器A吸收，继而卡那霉素抗性基因与传感器中的壮观霉素抗性基因发生交换，使得卡那霉素抗性基因可以表达，壮观霉素抗性基因不能表达，故能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是：能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落。 （3）肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，结合图示可知，若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落。 15．（2024·北京丰台·一模）研究人员利用水稻突变体对相关基因进行研究。 (1)将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，获得水稻突变体库。该突变体库中包含株高、叶色、叶型、育性、分蘖数等明显性状改变，构建该突变体库的过程中，引起性状改变的原因可能有______ A．实验操作中其它微生物的污染 B．实验过程中偶然接触紫外线或化学药品 C．DNA复制过程中的DNA序列变化 D．外源T-DNA的插入导致DNA序列变化 E．组织培养过程中染色体的互换 (2)对突变体库进行自交和表型筛选获得纯合的早衰突变体。为研究早衰突变与T-DNA整合之间的关系，将纯合的早衰突变体与“中花11”回交之后，分析F2的性状分离情况和对bar基因的PCR检测结果： ①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，则突变体的早衰性状是由 控制的； ②若F2的所有植株中含bar基因与不含bar基因之比为3：1，则T-DNA是单个插入； ③若F2的 ，则该突变为T-DNA插入引起。 经检验，实验结果与预期相符。请在下图中标出bar基因（用表示）可能的位置 。 (3)为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，主要过程见下图。外源接头包括长单链接头和短单链接头，二者部分互补。以长单链接头的部分序列为引物a和b，根据T-DNA已知序列设计引物c、d、e、f。 实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链，再以 为引物合成互补链，得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以 为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 (4)引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和 等。该研究为延缓水稻衰老、提高水稻产量提供了理论依据。 【答案】(1)ABCD (2) 隐性单基因 早衰突变体全部具有bar基因 (3) a bc (4)基因的表达 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）生物的性状是由基因和环境共同影响的，将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，该过程中实验操作中其它微生物的污染、实验过程中偶然接触紫外线或化学药品都可能导致基因改变，DNA复制过程中若出现差错导致DNA序列变化、外源T-DNA的插入导致DNA序列变化都会引起DNA改变，而组织培养过程进行的是有丝分裂，染色体的互换（同源染色体非姐妹染色单体之间交换）发生在减数分裂过程中，ABCD正确，E错误。 故选ABCD。 （2）①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，分离比符合一对等位基因控制的情况，即符合分离定律，且的表现为1/4的突变体的早衰性状是隐性性状，即突变体的早衰性状是由隐性单基因控制的。 ③若突变为T-DNA插入引起，由于外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，则后代性状都会发生改变，即F2的早衰突变体全部具有bar基因；经检验，实验结果与预期相符，则bar基因应插入到衰老相关基因片段上，故可绘制图形如下： （3）PCR能够实现体外扩增DNA，分析题意，为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链（上面那条连扩增左半部分），再以a为引物合成互补链（结合右侧长单链结构与下侧图示顺序可知，且引物与模板的3'端结合），得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以bc为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 （4）植物生命活动的调控是基因、环境和激素共同影响的， 引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和基因的表达等。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！21 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 热点05 基因编辑 基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。早期的基因工程技术只能将外源或内源遗传物质随机插入宿主基因组，基因编辑则能定点编辑想要编辑的基因。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称"分子剪刀"，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑， 在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。 1.Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 2.CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。 其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 3.In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 （建议用时：40分钟） 一、选择题 1．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 2．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ） A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 3．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 4．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 5．（2024·北京丰台·二模）CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞通过基因工程改造，使其表达肿瘤嵌合抗原受体（CAR），大量扩增后输回患者体内以清除癌细胞。下列有关说法错误的是（　　） A．CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞 B．该疗法利用了细胞免疫和基因重组的基本原理 C．CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞坏死 D．CAR-T细胞上的CAR能够精准识别癌细胞 6．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。 下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 7．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ） A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 8．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ） A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 9．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 10．（2023·北京昌平·二模）转座子是基因组中可移动的DNA片段，玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座，Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时，才能从原位点切离并插入到新位点中。研究者利用玉米转座子系统构建烟草突变体，下列叙述错误的是（　　） A．推测Ds转座元件不具有编码转座酶功能 B．可构建同时含有Ac/Ds的基因表达载体 C．利用农杆菌转化法将基因表达载体导入烟草细胞 D．Ds与其被插入的基因间发生基因重组 二、非选择题 11．（2025·北京通州·模拟预测）平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。研究人员为开发特异性标记血管SMC的方法，开展了相关研究。 (1)与肌肉收缩相关的M蛋白在SMC中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，根本原因是 。 (2)为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠用于研究，研究人员进行了下列实验，如图1所示。 ①利用PCR技术获得CE，为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠M基因的 之后，获得小鼠A． ②构建含Stop和tdT的表达载体，导入 细胞，获得小鼠B．将A与B杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C（CE/+）。 ③在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。用药物T饲喂小鼠C后，可观察到 。 (3)为利用工具鼠研究血管SMC中S基因表达在主动脉瘤形成中的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠（flox/+）后，将其与C鼠作为亲本进行系列杂交（不考虑tdT的遗传情况），流程如图2所示。 已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为 ，经T诱导后，该小鼠 。从中筛选出能发出红色荧光的个体，观察血管SMC是否有改变。 (4)为评估血管SMC标记是否具有组织特异性和药物T的外源诱导性，需要做的检测有 。 12．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因 出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 （选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 （填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。 (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的端和端 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）， ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 13．（2024·北京房山·一模）肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的。科研人员利用基因工程技术，对小鼠肠道内相关菌株（B菌）进行改造，以期获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 (1)高脂饮食是引起高血脂症的一个主要原因，但脂质也是人体必要的物质，请写出属于脂质的2种化学物质 。 (2)工程菌的制备： ①X菌的筛选：16SrRNA基因是鉴定微生物的重要依据，其大小约为1500bp，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，其他菌株中只有一个。通过PCR→ → →观察，结果如图1，可知 （填图1中序号）为所选目的菌种。 ②表达载体的构建： 科研人员操作如图2，进行同源重组构建表达载体。 I.将NC质粒用相关的限制酶进行酶切。 Ⅱ.在X菌株BSH基因两侧分别添加一段与上述载体同源（碱基排列次序相同）的序列A、B。 Ⅲ.表达载体同源重组过程如图2所示。如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为 ，两者在5’-3’外切酶的作用下被降解，在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成 键，完成基因表达载体的构建。 ③科研人员将表达载体用电击法导入B菌，获得BS菌株。 (3)关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有________ A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 (4)用BS菌株给小鼠灌胃，同时给小鼠饲喂高脂饮食，对照组1不做处理，8周后检测小鼠肠道内容物，进行体外BSH活性检测，如图3所示，结果说明 。 (5)有人认为BS菌株适合开发为人体降脂的功能性菌剂，请辩证地评价该观点 。 14．（2024·北京石景山·一模）贝氏不动杆菌（A菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A菌的HGT能力检测结肠癌。 (1)通常用含蛋白胨的培养基培养A菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成 等物质（答出2个即可）。 (2)结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。 ①如图1所示，将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断 键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。 ②为验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，依据①中的原理，构建图2所示的表达载体，导入A菌中获得传感器A。将传感器A与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A在不同培养基中的生长情况。请从a～e中选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列 。 a．KRAS片段1 b．KRAS片段2 c．kanR d．specR（壮观霉素抗性基因） e．G12位点 能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是 。 (3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，并对图2所示表达载体进行进一步改造（如图3）。请分析其能检测出结肠癌的机理 。 15．（2024·北京丰台·一模）研究人员利用水稻突变体对相关基因进行研究。 (1)将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，获得水稻突变体库。该突变体库中包含株高、叶色、叶型、育性、分蘖数等明显性状改变，构建该突变体库的过程中，引起性状改变的原因可能有______ A．实验操作中其它微生物的污染 B．实验过程中偶然接触紫外线或化学药品 C．DNA复制过程中的DNA序列变化 D．外源T-DNA的插入导致DNA序列变化 E．组织培养过程中染色体的互换 (2)对突变体库进行自交和表型筛选获得纯合的早衰突变体。为研究早衰突变与T-DNA整合之间的关系，将纯合的早衰突变体与“中花11”回交之后，分析F2的性状分离情况和对bar基因的PCR检测结果： ①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，则突变体的早衰性状是由 控制的； ②若F2的所有植株中含bar基因与不含bar基因之比为3：1，则T-DNA是单个插入； ③若F2的 ，则该突变为T-DNA插入引起。 经检验，实验结果与预期相符。请在下图中标出bar基因（用表示）可能的位置 。 (3)为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，主要过程见下图。外源接头包括长单链接头和短单链接头，二者部分互补。以长单链接头的部分序列为引物a和b，根据T-DNA已知序列设计引物c、d、e、f。 实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链，再以 为引物合成互补链，得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以 为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 (4)引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和 等。该研究为延缓水稻衰老、提高水稻产量提供了理论依据。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！5 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$