专题15 基因工程（3大考向）（专项训练）（全国通用）2026年高考生物真题题源解密

**基本信息** 聚焦基因工程工具-操作-应用全链条，以真题研析为核心，融合科学思维与社会责任素养，构建"考向-方法-素养"三维训练体系。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |高频考点|5大考点|限制酶双酶切选择原则、PCR扩增计算模型、载体构建逻辑推导|从分子工具（限制酶/连接酶/载体）到操作程序（获取-构建-导入-检测），形成"结构-功能-应用"递进链条| |考向真题|3考向15题|质粒图谱分析三步法、电泳迁移速率判断技巧、基因编辑伦理评价框架|以DNA扩增/操作程序/蛋白质工程为载体，整合科学探究（实验设计）与生命观念（结构与功能观）|

专题15 基因工程 内容导览 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2026年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近3年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 题目 1.高频考点： ①基因工程三大工具：限制酶、DNA 连接酶、运载体（质粒、λ 噬菌体、动植物病毒）； ②基因工程基本操作：目的基因获取→基因表达载体构建（核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 ③PCR 技术原理、过程、条件、扩增计算；DNA 复制与 PCR 对比 ④导入受体细胞方法：植物（农杆菌转化）、动物（显微注射）、微生物（感受态细胞 Ca²⁺处理） ⑤基因工程应用：转基因作物、基因工程药物、基因治疗、蛋白质工程、基因编辑 2．素养考向 （1）生命观念：结构与功能观，DNA 碱基互补配对是切割、连接、扩增、杂交的基础； （2）科学思维：限制酶切割图谱计算、PCR 扩增指数计算、载体构建逻辑推导； （3）科学探究：重组质粒构建实验设计、导入与检测对照实验、引物设计逻辑 （4）社会责任：转基因食品安全、基因治疗伦理、基因编辑技术规范。 考向1 DNA片段的扩增与电泳鉴定 2026湖南T5；2025福建卷，6、15；2025新课标卷，6；2024海南卷，15；2024浙江6月选考，20； 考向2基因工程的基本操作程序 2026贵州T21　2025陕晋宁青卷，21；2025黑吉辽蒙卷，25；2025安徽卷，15；2025河北卷，22；2025江西卷，11；2025湖南卷，21；2024重庆卷，19；2024湖南卷，21 考向3 基因工程的应用和蛋白质工程 2026 北京 T13；2025贵州卷，18；2024天津卷，5 2026年命题特点：选择题、流程图综合大题必考；选择题侧重工具酶功能、PCR 条件、导入方法区分；非选择题以质粒图谱、电泳图、PCR 扩增曲线为载体综合设问；计算类：PCR 产物数量、限制酶切割片段数为高频考点； 2027年命题预测：CRISPR 基因编辑、单碱基编辑、基因治疗（体外/体内）、PCR 引物设计、多酶切质粒图谱分析、转基因生物安全评价为热点；结合生物医药、抗虫抗逆作物、遗传病治疗新情境命题。 考向一 DNA片段的扩增与电泳鉴定 1.（2026·湖南·高考真题）关于表中生物学实验的相关叙述，错误的是（     ） 选项 实验名称 相关叙述 A 低温诱导植物细胞染色体数目的变化 低温能抑制洋葱根尖分生区细胞中纺锤体的形成，引起细胞内染色体数目加倍 B 绿叶中色素的提取和DNA的粗提取 绿叶中的色素不溶于无水乙醇，DNA易溶于无水乙醇 C 探究酵母菌细胞呼吸的方式 细胞呼吸产物的产生情况是因变量，温度是无关变量 D 模拟生物体维持pH的稳定 可设置HCO3-/H2CO3缓冲液或HPO42-/H2PO4-缓冲液作为对照组 A．A B．B C．C D．D 命题立意 本题以表格形式综合考查四个经典生物学实验，涵盖染色体变异实验、色素与DNA提取实验、酵母菌呼吸探究实验、pH 稳态模拟实验，全面考查实验原理、试剂作用、变量控制，落实科学探究核心素养 A 正确选项 低温诱导染色体数目加倍的原理是低温抑制有丝分裂前期纺锤体形成；着丝粒分裂后子染色体无法移向两极，导致细胞内染色体数目加倍；洋葱根尖分生区细胞分裂旺盛，是该实验的理想材料 B 错误选项 绿叶中色素为脂溶性有机物，易溶于无水乙醇，可用无水乙醇提取；但 DNA 不溶于无水乙醇，DNA 粗提取实验中利用 95% 冷酒精使 DNA 析出，而非溶解提取，二者试剂作用完全不同。 C 正确选项 探究酵母菌细胞呼吸方式实验中，自变量为氧气的有无，因变量为呼吸产物产生情况；温度、培养液用量、酵母菌初始数量等均为无关变量，需保持相同且适宜，排除干扰。 D 正确选项 模拟生物体维持 pH 稳定实验中，清水组、缓冲液组为对照组，分别代表无缓冲能力和人工缓冲体系；生物材料组为实验组，用于验证生物材料具有类似缓冲液的 pH 调节能力。 考向二 基因工程的基本操作程序 2．（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。 W试剂：识别G； X试剂：识别G、A； Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 考向三 基因工程的应用和蛋白质工程 3.（2026·北京·高考真题）MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（     ） A．温度和pH会影响MT的催化活性 B．第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C．为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D．对MT结构的改造属于蛋白质工程 命题立意 本题以蛋白质工程改造酶热稳定性的工业应用为情境，综合考查酶活性影响因素、酶专一性、蛋白质工程原理与筛选方法，整合酶与蛋白质工程两大模块，落实结构与功能观及社会责任素养 A 正确选项 酶的催化活性受温度、pH 等因素影响；MT 本质为蛋白质类酶，温度过高会导致空间结构破坏失活，pH 偏离最适值也会影响酶活性。 B 错误选项 将第 216 位丙氨酸替换为苏氨酸后，MT 热稳定性显著提高，但催化功能未改变，仍可催化海藻糖合成；说明该位点氨基酸与热稳定性相关，与酶的专一性无关。 C 正确选项 热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高催化活性；因此筛选热稳定性高的 MT 突变体时，应在较高温度下测定酶活性，活性高者即为目标突变体。 D 正确选项 通过定点改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，获得符合人类需求的新功能蛋白质，该技术属于蛋白质工程范畴。 一、基因工程的基本工具 1、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” （1）主要来源：原核生物 （2）作用：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （3）识别序列的组成：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量。 （4）切割产生的末端形式：在识别序列的中心轴线两侧切开，产生的是黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开，产生的是平末端。 （5）限制酶的选择原则：不破坏目的基因原则；保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则； 确保出现相同黏性末端原则；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，可使用双酶切法。 2、DNA连接酶——“分子缝合针” （1）作用：能将两个DNA片段重新连接起来的酶。 （2）类型：一类从大肠杆菌中分离得到，称为E.coliDNA连接酶；一类从T4噬菌体中分离得到，称为T4DNA连接酶。E.coliDNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4DNA连接酶。 3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）类型：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 （2）作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。 （3）通常是用质粒作为载体。 ①概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②质粒作为载体具备的三个条件： a.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入； b.能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； c.含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 二、利用PCR获取和扩增目的基因 获取目的基因的方法：①人工合成目的基因 ②PCR获取和扩增目的基因 ③通过构建基因文库获取 （1）PCR（聚合酶链式反应）：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）PCR反应的条件：一定的缓冲溶液（一般要添加Mg2+）、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 （3）PCR反应的过程 变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为两条单链。 复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （4）PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 [提醒]①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。可以是DNA单链，也可以是RNA单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。②引物的作用：使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③引物结合在DNA模板链的 3'端。④在PCR过程中实际加入的是dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP），既可作合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 三、蛋白质工程与基因工程的异同 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 考向一 DNA片段的扩增与电泳鉴定 1．（2025·天津·高考真题）老师检查同学们的生物实验报告时，发现其中有误的是（    ） A．电泳分离DNA片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶 B．检测酵母是否产生酒精时，需向培养液滤液中加入酸性重铬酸钾 C．提取和分离菠菜叶中的色素时，用层析液进行提取，用无水乙醇进行分离 D．为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定 2．（2025·四川·高考真题）下列以土豆为材料的实验描述，错误的是（    ） A．土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色 B．向土豆匀浆中加入一定量的碘液后，溶液会呈蓝色 C．利用土豆匀浆制备的培养基，可用于酵母菌的培养 D．土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH对酶活性的影响 3．（2025·湖南·高考真题）用替代的实验材料或者试剂开展下列实验，不能达成实验目的的是（　　） 选项 实验内容 替代措施 A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片” B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞” C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液” D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液” A．A B．B C．C D．D 4．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 5．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 考向二 基因工程的应用和蛋白质工程 6．（2026·湖北·高考真题）将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是（     ） A．选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B．为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C．工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 D．树突状细胞将肿瘤新抗原加工后呈递给辅助性T细胞，激活特异性免疫 7．（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（     ） A．来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B．不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C．外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D．调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 8．（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 9．（2026·河南·高考真题）胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A．甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B．胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C．第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D．由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 10．（2026·云南·高考真题）内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A．构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B．内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C．不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D．为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 考向三 基因工程的基本操作程序 11．（2026·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 合成生物学助力尿酸代谢平衡 尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。 为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体（见下图），右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加（如下图）。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 （1）表达载体中__________的功能是驱动目的基因的转录。 （2）由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者__________结合蛋白。 （3）为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码__________的U酶。 （4）对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是__________。 （5）利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找__________。 12．（2026·湖北·高考真题）L基因编码一种水解酶，对人体消化营养物质非常重要。为研究L基因在染色体上的定位，科研人员进行了如下实验。 实验一：通过PCR技术从人—鼠融合细胞A～F（每个细胞保留了部分人染色体）中检测L基因，结果如图1。通过染色体分析确定了融合细胞中所含人染色体信息，结果如图2。 实验二：用荧光探针（特异性检测L基因的模板链）检测人细胞中L基因在染色体上的定位，结果如图3。 回答下列问题： （1）可用化学试剂________诱导人细胞和鼠细胞融合。 （2）据图1可知，L基因存在于_______（填A～F标号）融合细胞中。 （3)据图1、图2推测L基因定位在人________号染色体上。 （4）实验二中，应选择有丝分裂________期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点的原因是________________。 （5）随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种遗传现象属于________。 13．（2026·湖南·高考真题）株高是影响水稻产量的重要性状，探究株高相关基因的遗传机制对水稻育种有重要意义。回答下列问题： （1）为阐明纯合品系甲（株高100 cm）株高由几对基因控制和显隐性等遗传机制，将其与纯合野生品系（株高140 cm）杂交后，株高均为140 cm，F2中株高140 cm和100 cm的数量比约为3∶1，推测品系甲株高的遗传机制为___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 （2）品系甲是野生型的某株高基因发生突变所致，其转录产物编码序列的第796位突变，野生型及突变型基因转录模板链的部分碱基序列如图所示。 野生型： 突变型： ①该突变体第_____位氨基酸突变为_____（部分密码子及对应氨基酸：GCU丙氨酸，CUU亮氨酸，UUC苯丙氨酸，UCG丝氨酸）。 ②拟设计PCR引物扩增该株高基因片段，以检测其他水稻是否发生该突变，应选择引物_____（填序号）。 Ⅰ． Ⅱ． Ⅲ． Ⅳ． （3）某纯合品系乙（株高75 cm）与纯合品系甲（株高100 cm）杂交后，株高均为100 cm，中株高100 cm的347株，株高75 cm的114株，用（2）中的引物和方法检测品系乙的该株高基因： ①若发现与品系甲有相同突变，推测乙的基因型为_____（用A、a；B、b；C、c……表示基因）。将品系乙与纯合野生品系（株高140 cm）杂交，其表现为株高140 cm，中株高140 cm、100 cm和75 cm三种表型的数量比约为9∶6∶1，推测所涉及基因的位置关系是_____________________________________。 ②若发现与品系甲无相同突变，则品系乙形成的原因是__________________________________________。 14．（2026·广东·高考真题）玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异（图a），且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： （1）将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为__________性状。 （2）根据这对基因的序列设计了3种引物（图a），便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶（延伸速度约为1000 bp/min）、缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核苷酸和__________，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤（图c）中泳道_______________的带型。 （3）基于品系W构建了针对VW基因的RNAi（可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达）转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株_______________进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果（胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同）： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为_________________； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为____________________________。 （4）已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：_____________________________________是产生品系A粉质胚乳的原因。 15．（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的________（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是________________________________________。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是__________。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A．24 h检测细胞内 B．24 h检测细胞外 C．0 h和24 h检测细胞内 D．0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射_____________；该实验结论是___________________________________________________________________________________________________。 1．（2026·湖南长沙·三模）现有一长度为3000碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制性内切核酸酶酶切后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如下图1。用酶B单独酶切，结果如下图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如下图3。下列相关叙述正确的是（     ） A．酶H有2个识别位点和切割位点 B．酶B和酶H同时酶切时，有3个识别位点和切割位点 C．酶B和酶H同时酶切时，能产生完全相同的酶切片段 D．酶B和酶H有相同的识别位点和切割位点 2．（2026·辽宁营口·三模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对农作物同样具有杀伤作用。为培育抗草甘膦的玉米（单子叶植物），科研人员将外源EPSP合酶基因（其表达产物能与草甘膦竞争作用位点）导入玉米细胞并成功表达，下列相关叙述正确的是（    ） A．构建基因表达载体时，常选取原核细胞拟核中的DNA分子作为天然质粒 B．采用抗原－抗体杂交技术鉴定抗草甘膦玉米中EPSP合酶的存在 C．质粒上的抗生素合成基因可用于重组DNA分子的筛选 D．将已转化的玉米愈伤组织移至田间，观察其抗草甘膦能力 3．（2026·湖北十堰·三模）AlphaFold的核心作用是利用人工智能，根据蛋白质的氨基酸序列，高精度地预测其空间结构。研究发现，某种酶在常温下具有催化活性，高温处理后失去活性，但其氨基酸序列并未改变。若该酶的基因发生了一个碱基替换突变，则用AlphaFold对这种新酶进行结构预测时，应首先重点分析（　　） A．高温处理是否破坏了该酶的肽键 B．这种突变是否提高了该酶在高温下的稳定性 C．该酶在高温下失去活性是否因其氨基酸序列发生了改变 D．突变位点对应的氨基酸的性质变化如何影响局部空间构象 4．（2026·甘肃嘉峪关·二模）某研究团队利用CRISPR/Cas9技术培育抗条锈病小麦，在sgRNA的引导下，利用Cas9蛋白精准编辑小麦的TaCIPK14基因，在不影响产量性状的前提下使条锈病严重度降低了13%，为作物抗病改良提供了新思路。下列关于该技术的叙述，正确的是（　　） A．sgRNA与TaCIPK14基因的结合遵循碱基互补配对原则 B．培育抗条锈病小麦过程Cas9蛋白可在任意位点切割DNA双链，实现精准编辑 C．利用该技术可以精准替换DNA分子中的核糖核苷酸 D．利用该技术培育的小麦抗病性状属于不可遗传的变异 5．（2026·河北·二模）miRNA是细胞中的一类非编码小分子RNA，其与有关蛋白形成沉默复合体RISC后，通过与靶mRNA结合调控基因的表达，具体机理如图。miR­150为miRNA家族成员之一，在多种肿瘤细胞中均异常表达。研究人员将miR­150过表达质粒及其阴性对照质粒miR­NC分别导入宫颈癌Hela细胞后，检测细胞凋亡率和FOXO4蛋白表达量，结果如图。下列叙述不正确的是（     ） A．miRNA与靶mRNA部分互补，碱基配对方式与miRNA基因转录过程完全不同 B．RISC中的miRNA与靶mRNA的5′端结合，通过阻止核糖体移动阻止翻译的进行 C．对照质粒miR­NC可排除其他无关变量对宫颈癌细胞凋亡率的影响 D．miR­150可能通过上调FOXO4基因表达来促进宫颈癌细胞的生长和存活 6．（2026·辽宁营口·三模）某植物基因D位于6号染色体上，基因d由基因D突变产生，仅含基因d时会造成花粉不育。现将一个基因D插入基因型为Dd的植株9号染色体上，让该植株自交得子一代，对子一代的基因D和d进行PCR扩增及电泳鉴定，所用引物和扩增产物的电泳结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．基因D插入植株9号染色体属于基因重组 B．应选择引物S1和R2、T1和W2对子一代进行PCR扩增 C．若只看基因D和d，该植株产生的可育花粉中不含基因d的占比为1/2 D．子一代中电泳结果为类型Ⅱ的植株占比为1/3 7．（2026·湖南长沙·一模）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（　　） A．①中 Ti质粒应该包含标记基因、复制原点等元件 B．②的构建需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶等 C．③侵染植物细胞后，重组 Ti质粒会整合到④的染色体 D．④的染色体上 Bt抗虫基因表达，⑤可表现出抗盲蝽、红蜘蛛、棉铃虫等抗虫性状 8．（2026·湖南长沙·三模）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 （1）纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________。 （2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0mo1/L的目的是__________。PCR扩增时，需在__________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamHⅠ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__________。 （4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。 9．（2026·北京大兴·三模）为研究beclin1基因与人类癌症的发生是否有关，研究人员构建了beclin1基因杂合子小鼠（beclin1+/-）并进行了一系列实验。 （1）研究人员获得了小鼠beclin1 cDNA部分序列后，利用_____技术获取该基因全部碱基序列。 （2）将靶向敲除一个beclin1基因的胚胎干细胞注射到小鼠_____中，获得嵌合体小鼠。将嵌合体雄鼠与野生型雌鼠交配，利用DNA分子杂交技术对F1代小鼠DNA进行分析，从而验证突变基因可以进行传递。beclin1+/-小鼠相互交配，获得156只野生型小鼠（beclin1+/+）和298只beclin1+/-小鼠，说明_____。 （3）利用BrdU掺入染色法对5周龄beclin1⁺/⁻雌性小鼠乳腺发育过程中上皮细胞的增殖情况进行了定量分析。 ①BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，可代替胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的_____中。掺入的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体进行检测，从而判断细胞的增殖能力，结果如图所示。 ②上图显示，beclin1+/-小鼠乳腺上皮细胞中BrdU阳性细胞所占比例_____，表明beclin1基因缺陷可导致_____。 （4）依据上述实验结果，有人提出beclin1基因是一个“单倍体”不足的_____基因（选填“原癌基因”“抑癌基因”），即当一个beclin1基因失活，另一个基因正常时，beclin1基因就可以促进肿瘤的发生。为支持该推测，科研人员从DNA分子和蛋白质水平寻找证据： ①DNA分子水平：检测beclin1+/-小鼠体内癌细胞中_____，如正常，则支持； ②蛋白质水平：_____，则支持。 10．（2026·河北邢台·三模）胡萝卜细胞中β-胡萝卜素（维生素A前体）的合成依赖PSY、LCYb这两种酶，将合成这两种酶的基因导入小麦细胞中，可获得富含β-胡萝卜素的黄金小麦，用于改善维生素A缺乏症。科学家先用重叠延伸PCR技术构建出能合成PSY、LCYb这两种酶的融合基因，过程如图1所示。再将融合基因导入小麦细胞，该过程所用的质粒及相关限制酶识别序列如图2所示。请回答下列问题： （1）据图1可知，PCR1和PCR2需要分开单独进行，原因是________。PCR过程中，除了向反应体系中添加模板DNA、引物，还需添加________（至少答出两种）。 （2）为保证融合基因能正确插入质粒，利用PCR扩增融合基因时，需在图1的引物________（从“A”“B”“C”“D”中选填）的5'端分别添加限制酶________的识别序列。已知融合基因的甲链的序列为5'-CGCTAC……GTAGAT-3′。利用PCR技术扩增融合基因时，某同学设计了如下的引物，引物对应的序列分别为________（填标号）。 A．5'-CAATTGCGCTAC-3'            B．5'-GGATCCATCTAC-3' C．5'-GAATTCCGCTAC-3'            D．5'-TGATCAATCTAC-3' （3）据图2分析筛选转化细胞的过程：第一次在培养基中添加________筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，第二次在培养基中添加________筛选染色体DNA上整合T-DNA的胡萝卜愈伤组织细胞。 11．（2026·西藏昌都·二模）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 （1）质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见下表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是________和________。 限制酶 识别序列（5'-3'） EcoR I GAATTC Sal I GTCGAC Bgl Ⅱ AGATCT Xho I CTCGAG （2）细胞X是一种贴壁细胞，可用________（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是________。 （3）将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如下图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有________作用，且随导入时间推移，增殖速率________。 12．（2026·湖南衡阳·三模）副猪格拉瑟菌（GPS）是生活于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶（OppA）在免疫学上具有较高的研究价值。为增加OppA基因表达量，研究人员利用强启动子等构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA基因如图所示。请回答下列问题： （1）构建OppA基因过表达载体时，应该选择限制酶________切割质粒。为便于与质粒连接，需在2个引物的5'端添加限制酶________的识别序列。 （2）据图分析，利用PCR扩增OppA基因时所需的引物组合是________。PCR反应缓冲液中添加的Mg2+的作用是________。 （3）已知OppA基因的转录方向是从左向右，OppA基因甲链的碱基序列为5'-TTACAG……CGCTCC-3′，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3′，则转录的模板链是_______（填“甲”或“乙”）链。请写出OppA基因上游引物的13个碱基序列：5'-________-3'。 （4）为了筛选出正确串联了强启动子、OppA基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型d加入的抗生素是________，得到M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示（+表示生长，－表示不生长）。根据表中结果判断，符合要求的菌落是_________（填“M”“N”或“O”）类。 平板类型 菌落类型 M N O a.无抗生素 + + + b. - + + c.氨苄西林 - + - d. - + - 13．（2026·甘肃嘉峪关·二模）水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种蛋白质，具有良好的抗凝血作用。已知天然的水蛭素抗凝血活性较低，产量和来源有限。研究发现，若将其第47位天冬酰胺替换成赖氨酸，可以提高其抗凝血活性。某科研团队拟通过不同的生物技术获得活性高、产量大的重组水蛭素。回答下列问题： （1）图1所示运用____________工程得到凝血活性更高的水蛭素，该技术的直接操作对象是__________。在生产过程中，物质b的碱基序列可能不同，却合成了相同的物质a，这是因为____________。 （2）基因工程中常利用PCR获取和扩增目的基因。PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种dNTP、____________、____________及缓冲液，4种dNTP的作用是____________。 （3）利用基因工程生产水蛭素时，依据图2信息构建基因表达载体，为使水蛭素基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是____________。若采用大肠杆菌作为受体细胞，需要在培养基中加入____________以筛选转化成功的工程菌，并选择颜色为____________的大肠杆菌菌落进一步培养。 注：neor为新霉素抗性基因；malcZ的表达产物会使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色。 （4）工业生产中，还可利用制备乳腺生物反应器来生产高抗凝血活性的水蛭素，但制备时需将高抗凝血活性的水蛭素基因与乳腺中特异表达的基因的_________等调控元件重组在一起。某研究小组大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的____________（答1点）的限制。 14．（2026·山东聊城·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题： （1）Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的______。 （2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是______；解决措施是______。 （3）为了实现某基因的特异性敲除，如图所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。 注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I—SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。 理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建如图所示重组质粒的优势：______（答出两点）。 15．（2026·陕西西安·三模）RCA是一种核基因（rca）编码的光合作用相关的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种，如图1所示，①~⑥表示相关过程。请分析回答： （1）过程①通常从大豆的___________细胞中提取总RNA，参与①过程的酶有___________，其产物中___________（填“含有”或“不含有”）启动子、终止子和内含子序列。PCR通过变性、复性、延伸三步，反复循环，可实现rca基因片段的___________。 （2）已知①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，反义rca基因的___________（填“N端”或“M端”）接在C4pdk启动子的后面。依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，写出引物1的碱基序列5′____________3′（只写出前9个碱基即可）。 （3）过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是___________，过程③rac基因反向插入的目的是___________，从而达到基因沉默的作用。⑤过程后可用含___________的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。分子水平上转基因大豆培育成功的标志是___________。 （4）科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2.据图分析，RCA主要是通过___________来___________（填“促进”或“抑制”）大豆的光合作用。 1/11 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 内容导览 考情概览：解读近年命题思路和内容要求，统计真题考查情况。 2026年真题研析：探寻常考要点，真题分类精讲，归纳串联解题必备知识。 近3年真题精选：分类精选近年真题，把握命题趋势。 名校模拟探源：精选适量名校模拟题，发掘高考命题之源。 命题解读 考向 题目 1.高频考点： ①基因工程三大工具：限制酶、DNA 连接酶、运载体（质粒、λ 噬菌体、动植物病毒）； ②基因工程基本操作：目的基因获取→基因表达载体构建（核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 ③PCR 技术原理、过程、条件、扩增计算；DNA 复制与 PCR 对比 ④导入受体细胞方法：植物（农杆菌转化）、动物（显微注射）、微生物（感受态细胞 Ca²⁺处理） ⑤基因工程应用：转基因作物、基因工程药物、基因治疗、蛋白质工程、基因编辑 2．素养考向 （1）生命观念：结构与功能观，DNA 碱基互补配对是切割、连接、扩增、杂交的基础； （2）科学思维：限制酶切割图谱计算、PCR 扩增指数计算、载体构建逻辑推导； （3）科学探究：重组质粒构建实验设计、导入与检测对照实验、引物设计逻辑 （4）社会责任：转基因食品安全、基因治疗伦理、基因编辑技术规范。 考向1 DNA片段的扩增与电泳鉴定 2026湖南T5；2025福建卷，6、15；2025新课标卷，6；2024海南卷，15；2024浙江6月选考，20； 考向2基因工程的基本操作程序 2026贵州T21　2025陕晋宁青卷，21；2025黑吉辽蒙卷，25；2025安徽卷，15；2025河北卷，22；2025江西卷，11；2025湖南卷，21；2024重庆卷，19；2024湖南卷，21 考向3 基因工程的应用和蛋白质工程 2026 北京 T13；2025贵州卷，18；2024天津卷，5 2026年命题特点：选择题、流程图综合大题必考；选择题侧重工具酶功能、PCR 条件、导入方法区分；非选择题以质粒图谱、电泳图、PCR 扩增曲线为载体综合设问；计算类：PCR 产物数量、限制酶切割片段数为高频考点； 2027年命题预测：CRISPR 基因编辑、单碱基编辑、基因治疗（体外/体内）、PCR 引物设计、多酶切质粒图谱分析、转基因生物安全评价为热点；结合生物医药、抗虫抗逆作物、遗传病治疗新情境命题。 考向一 DNA片段的扩增与电泳鉴定 1.（2026·湖南·高考真题）关于表中生物学实验的相关叙述，错误的是（     ） 选项 实验名称 相关叙述 A 低温诱导植物细胞染色体数目的变化 低温能抑制洋葱根尖分生区细胞中纺锤体的形成，引起细胞内染色体数目加倍 B 绿叶中色素的提取和DNA的粗提取 绿叶中的色素不溶于无水乙醇，DNA易溶于无水乙醇 C 探究酵母菌细胞呼吸的方式 细胞呼吸产物的产生情况是因变量，温度是无关变量 D 模拟生物体维持pH的稳定 可设置HCO3-/H2CO3缓冲液或HPO42-/H2PO4-缓冲液作为对照组 A．A B．B C．C D．D 【答案】B 【解析】 命题立意 本题以表格形式综合考查四个经典生物学实验，涵盖染色体变异实验、色素与DNA提取实验、酵母菌呼吸探究实验、pH 稳态模拟实验，全面考查实验原理、试剂作用、变量控制，落实科学探究核心素养 A 正确选项 低温诱导染色体数目加倍的原理是低温抑制有丝分裂前期纺锤体形成；着丝粒分裂后子染色体无法移向两极，导致细胞内染色体数目加倍；洋葱根尖分生区细胞分裂旺盛，是该实验的理想材料 B 错误选项 绿叶中色素为脂溶性有机物，易溶于无水乙醇，可用无水乙醇提取；但 DNA 不溶于无水乙醇，DNA 粗提取实验中利用 95% 冷酒精使 DNA 析出，而非溶解提取，二者试剂作用完全不同。 C 正确选项 探究酵母菌细胞呼吸方式实验中，自变量为氧气的有无，因变量为呼吸产物产生情况；温度、培养液用量、酵母菌初始数量等均为无关变量，需保持相同且适宜，排除干扰。 D 正确选项 模拟生物体维持 pH 稳定实验中，清水组、缓冲液组为对照组，分别代表无缓冲能力和人工缓冲体系；生物材料组为实验组，用于验证生物材料具有类似缓冲液的 pH 调节能力。 考向二 基因工程的基本操作程序 2．（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。 W试剂：识别G； X试剂：识别G、A； Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 【答案】(1)Bcl I和Xba I (2) 3+6 2500 (3) X 4 3和9 【解析】（1）若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列（5'-GGATCC-3'），切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 （2）在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 （3）启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'（共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10），互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断（即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断）。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组：条带位置对应 C/T位点一Y试剂（识别C、T）；2组：条带位置仅对应C位点一Z试剂（识别C）；3组：条带位置对应A/G位点X试剂（识别G、A）；4组：条带位置仅对应G位点一W试剂（识别G）。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y）和2(Z）的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 考向三 基因工程的应用和蛋白质工程 3.（2026·北京·高考真题）MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（     ） A．温度和pH会影响MT的催化活性 B．第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C．为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D．对MT结构的改造属于蛋白质工程 【答案】B 【解析】 命题立意 本题以蛋白质工程改造酶热稳定性的工业应用为情境，综合考查酶活性影响因素、酶专一性、蛋白质工程原理与筛选方法，整合酶与蛋白质工程两大模块，落实结构与功能观及社会责任素养 A 正确选项 酶的催化活性受温度、pH 等因素影响；MT 本质为蛋白质类酶，温度过高会导致空间结构破坏失活，pH 偏离最适值也会影响酶活性。 B 错误选项 将第 216 位丙氨酸替换为苏氨酸后，MT 热稳定性显著提高，但催化功能未改变，仍可催化海藻糖合成；说明该位点氨基酸与热稳定性相关，与酶的专一性无关。 C 正确选项 热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高催化活性；因此筛选热稳定性高的 MT 突变体时，应在较高温度下测定酶活性，活性高者即为目标突变体。 D 正确选项 通过定点改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，获得符合人类需求的新功能蛋白质，该技术属于蛋白质工程范畴。 一、基因工程的基本工具 1、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” （1）主要来源：原核生物 （2）作用：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （3）识别序列的组成：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量。 （4）切割产生的末端形式：在识别序列的中心轴线两侧切开，产生的是黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开，产生的是平末端。 （5）限制酶的选择原则：不破坏目的基因原则；保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则； 确保出现相同黏性末端原则；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，可使用双酶切法。 2、DNA连接酶——“分子缝合针” （1）作用：能将两个DNA片段重新连接起来的酶。 （2）类型：一类从大肠杆菌中分离得到，称为E.coliDNA连接酶；一类从T4噬菌体中分离得到，称为T4DNA连接酶。E.coliDNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4DNA连接酶。 3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）类型：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 （2）作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。 （3）通常是用质粒作为载体。 ①概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②质粒作为载体具备的三个条件： a.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入； b.能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； c.含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 二、利用PCR获取和扩增目的基因 获取目的基因的方法：①人工合成目的基因 ②PCR获取和扩增目的基因 ③通过构建基因文库获取 （1）PCR（聚合酶链式反应）：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）PCR反应的条件：一定的缓冲溶液（一般要添加Mg2+）、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。 （3）PCR反应的过程 变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为两条单链。 复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （4）PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 [提醒]①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。可以是DNA单链，也可以是RNA单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。②引物的作用：使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③引物结合在DNA模板链的 3'端。④在PCR过程中实际加入的是dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP），既可作合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 三、蛋白质工程与基因工程的异同 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 考向一 DNA片段的扩增与电泳鉴定 1．（2025·天津·高考真题）老师检查同学们的生物实验报告时，发现其中有误的是（    ） A．电泳分离DNA片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶 B．检测酵母是否产生酒精时，需向培养液滤液中加入酸性重铬酸钾 C．提取和分离菠菜叶中的色素时，用层析液进行提取，用无水乙醇进行分离 D．为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定 【答案】C 【解析】A、电泳分离 DNA 片段时，缓冲液可维持电泳环境的 pH 稳定，保证 DNA 片段正常分离，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶，A正确； B、酸性重铬酸钾与酒精反应会由橙色变为灰绿色，检测酵母是否产生酒精时，需向抽取的培养液滤液中加入酸性重铬酸钾，B正确； C、提取菠菜叶中的色素时用无水乙醇，分离色素时用层析液，C错误； D、有丝分裂旺盛的根尖细胞便于观察有丝分裂过程，卡诺氏液可固定细胞形态，为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定，D正确。 故选C。 2．（2025·四川·高考真题）下列以土豆为材料的实验描述，错误的是（    ） A．土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色 B．向土豆匀浆中加入一定量的碘液后，溶液会呈蓝色 C．利用土豆匀浆制备的培养基，可用于酵母菌的培养 D．土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH对酶活性的影响 【答案】A 【解析】A、DNA 不溶于酒精，A错误； B、碘液可以将淀粉染成蓝色，所以向土豆匀浆中加入一定量的碘液后，溶液会呈蓝色，B正确； C、利用土豆匀浆制备的培养基，含有碳源、氮源、水、无机盐和其他酵母菌生长需要的物质，所以可用于酵母菌的培养，C正确； D、过氧化氢酶的活性受到pH的影响，所以土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH对酶活性的影响，D正确。 故选A。 3．（2025·湖南·高考真题）用替代的实验材料或者试剂开展下列实验，不能达成实验目的的是（　　） 选项 实验内容 替代措施 A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片” B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞” C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液” D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液” A．A B．B C．C D．D 【答案】B 【解析】A、藓类叶片薄，只有一层细胞，可直接用于观察叶绿体，菠菜叶由多层细胞构成，但可用菠菜叶稍带些叶肉的下表皮细胞来观察叶绿体，因为叶肉细胞中有叶绿体，所以能用“菠菜叶”替代“藓类叶片”进行高倍显微镜观察叶绿体的实验，A正确； B、猪是哺乳动物，猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，也就不含DNA，而猪肝细胞含有细胞核和线粒体等含有DNA的结构，所以不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验，B错误； C、醋酸洋红液和甲紫溶液都属于碱性染料，都能使染色体着色，所以在观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂实验中，能用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”，C正确； D、肝脏研磨液中含有过氧化氢酶，所以在比较过氧化氢在不同条件下的分解实验中，能用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”，D正确。 故选B。 4．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【解析】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 5．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 考向二 基因工程的应用和蛋白质工程 6．（2026·湖北·高考真题）将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是（     ） A．选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B．为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C．工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 D．树突状细胞将肿瘤新抗原加工后呈递给辅助性T细胞，激活特异性免疫 【答案】C 【解析】A、益生菌是对人体有益的微生物，对人体无毒性，具备天然安全性，适合作为表达新抗原的工程菌受体，A正确； B、不同患者的肿瘤细胞特有的新抗原存在差异，个性化免疫治疗需要针对患者筛选其特有的肿瘤新抗原，才能精准激活针对该患者肿瘤的特异性免疫，B正确； C、工程菌属于外来异物，进入人体后会被免疫系统识别并清除，无法在体内长期存活；且免疫监视是人体免疫系统的功能，并非工程菌的功能，C错误； D、树突状细胞属于抗原呈递细胞，可将肿瘤新抗原摄取、加工后呈递给辅助性T细胞，进而激活体液免疫和细胞免疫，即激活特异性免疫过程，D正确。 7．（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（     ） A．来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B．不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C．外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D．调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 【答案】B 【解析】A、所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确； B、重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误； C、外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 8．（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 【答案】D 【解析】A、酶的活性依赖其特定的空间结构，第n位甲硫氨酸氧化会改变蛋白酶E的局部结构，进而改变E的空间结构，导致酶活性下降，A正确； B、蛋白质的氨基酸序列由编码它的基因的碱基序列决定，替换特定位置的氨基酸可通过蛋白质工程（即第二代基因工程）改造对应基因的碱基序列，再经表达获得改造后的蛋白酶，B正确； C、本次改造的目的是提高E对S的耐受性，因此判断改造效果的指标是经S处理后酶的活性保留情况，需用S处理一段时间后测定酶活性进行对比，C正确； D、酶的专一性由酶活性位点的结构决定，替换甲硫氨酸提高了E对S的耐受性，没有信息表明该替换改变了酶的活性位点结构，无法得出E的专一性降低的结论，D错误。 9．（2026·河南·高考真题）胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A．甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B．胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C．第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D．由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 【答案】D 【解析】A、蛋白质工程从预期蛋白质功能出发，经结构设计、氨基酸序列推导最终改造对应基因，再通过基因表达获得改造蛋白，整个过程遵循中心法则即遗传信息传递的一般规律，A正确； B、酶的专一性指酶只能催化一种或一类化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后的甲无其可作用的位点因此不能被水解，体现了酶的专一性，B正确； C、改造后甲仍保持抗体活性，第96位精氨酸未被替换，推测该位点可能与抗体的功能密切相关，替换后可能导致抗体活性丧失，C正确； D、密码子简并性是指同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发生改变，D错误。 10．（2026·云南·高考真题）内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A．构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B．内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C．不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D．为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 【答案】C 【解析】A、题干中X+Y融合蛋白由两个独立基因表达后经自我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合基因，构建X+Y融合蛋白基因，也不存在碱基序列相互影响问题，A错误； B、从图中可以看到，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内，而是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋白功能结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误； C、从图中过程可以看出，内含肽的IntAN与IntAᶜ、IntBᶜ与IntBᴺ通过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切除和连接作用，C正确； D、由图可知，内含肽在反应后被完全切除，得到的X+Y融合蛋白不含内含肽结合部位，所以再为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，也不能实现自我切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X+Y融合蛋白新的结构，D错误。 考向三 基因工程的基本操作程序 11．（2026·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 合成生物学助力尿酸代谢平衡 尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。 为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体（见下图），右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加（如下图）。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 （1）表达载体中__________的功能是驱动目的基因的转录。 （2）由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者__________结合蛋白。 （3）为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码__________的U酶。 （4）对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是__________。 （5）利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找__________。 【答案】(1）启动子 （2）竞争 （3）分泌到细胞外 （4）减少串联的cH数目 （5）一种能与葡萄糖特异性结合的蛋白（类似R蛋白的功能） 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，功能就是驱动下游目的基因的转录，表达载体中启动子的功能是驱动目的基因的转录。 （2）R蛋白既可以和尿酸可逆结合，也可以和cH序列可逆结合，尿酸浓度低时R更多结合cH，尿酸浓度高时R更多结合尿酸、从cH上脱离，说明尿酸和cH序列会竞争结合R蛋白。 （3）实验目的是降解血液中的尿酸而非细胞内的尿酸，因此改造后的sU基因编码的U酶需要被分泌到细胞外，才能进入血液发挥降解尿酸的作用。 （4）“相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少”，现在要进一步降低小鼠血液尿酸浓度，就需要让sU（U酶）的表达量更高，因此可以减少sU表达载体上串联的cH序列的数量，降低R蛋白对sU转录的抑制作用，提升U酶的合成量，增强尿酸降解效果。 （5）该尿酸调控系统的核心是“能响应目标代谢物（尿酸）、同时可结合对应调控DNA序列的双功能R蛋白+R蛋白的结合靶序列cH”，要助力血糖稳态的维持，关键是寻找一种能与葡萄糖特异性结合的蛋白（类似R蛋白的功能）。 12．（2026·湖北·高考真题）L基因编码一种水解酶，对人体消化营养物质非常重要。为研究L基因在染色体上的定位，科研人员进行了如下实验。 实验一：通过PCR技术从人—鼠融合细胞A～F（每个细胞保留了部分人染色体）中检测L基因，结果如图1。通过染色体分析确定了融合细胞中所含人染色体信息，结果如图2。 实验二：用荧光探针（特异性检测L基因的模板链）检测人细胞中L基因在染色体上的定位，结果如图3。 回答下列问题： （1）可用化学试剂________诱导人细胞和鼠细胞融合。 （2）据图1可知，L基因存在于_______（填A～F标号）融合细胞中。 （3)据图1、图2推测L基因定位在人________号染色体上。 （4）实验二中，应选择有丝分裂________期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点的原因是________________。 （5）随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种遗传现象属于________。 【答案】(1）聚乙二醇/PEG (2)A、C、F (3)2 （4） 中 有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体 （5）表观遗传 【解析】（1）诱导动物细胞融合的化学试剂是聚乙二醇（PEG），所以可用化学试剂聚乙二醇（PEG）诱导人细胞和鼠细胞融合。 （2）观察图1，其中显示了人细胞、鼠细胞以及人-鼠融合细胞A-F中L基因的检测结果，根据图1可知，人－鼠融合细胞的A、C、F中含有对应的条带，所以L基因存在于A、C、F融合细胞中。 （3）结合图1中L基因存在的融合细胞以及图2中融合细胞含有人染色体情况，通过对两者信息的分析推测，L基因定位在人2号染色体上，原因是含L基因的A、C、F融合细胞均含有人2号染色体，不含L基因的B、D、E融合细胞均不含人2号染色体。 （4）实验二中，因为有丝分裂中期染色体形态固定、数目清晰，便于观察，所以应选择有丝分裂中期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点，是由于DNA进行了复制，形成了姐妹染色单体，使得每条染色体上有两个DNA分子，即有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体，从而与荧光探针结合出现两个信号点。 （5）随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种仅由基因甲基化修饰等引起的性状改变，遗传物质未发生改变的遗传现象属于表观遗传。 13．（2026·湖南·高考真题）株高是影响水稻产量的重要性状，探究株高相关基因的遗传机制对水稻育种有重要意义。回答下列问题： （1）为阐明纯合品系甲（株高100 cm）株高由几对基因控制和显隐性等遗传机制，将其与纯合野生品系（株高140 cm）杂交后，株高均为140 cm，F2中株高140 cm和100 cm的数量比约为3∶1，推测品系甲株高的遗传机制为___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 （2）品系甲是野生型的某株高基因发生突变所致，其转录产物编码序列的第796位突变，野生型及突变型基因转录模板链的部分碱基序列如图所示。 野生型： 突变型： ①该突变体第_____位氨基酸突变为_____（部分密码子及对应氨基酸：GCU丙氨酸，CUU亮氨酸，UUC苯丙氨酸，UCG丝氨酸）。 ②拟设计PCR引物扩增该株高基因片段，以检测其他水稻是否发生该突变，应选择引物_____（填序号）。 Ⅰ． Ⅱ． Ⅲ． Ⅳ． （3）某纯合品系乙（株高75 cm）与纯合品系甲（株高100 cm）杂交后，株高均为100 cm，中株高100 cm的347株，株高75 cm的114株，用（2）中的引物和方法检测品系乙的该株高基因： ①若发现与品系甲有相同突变，推测乙的基因型为_____（用A、a；B、b；C、c……表示基因）。将品系乙与纯合野生品系（株高140 cm）杂交，其表现为株高140 cm，中株高140 cm、100 cm和75 cm三种表型的数量比约为9∶6∶1，推测所涉及基因的位置关系是_____________________________________。 ②若发现与品系甲无相同突变，则品系乙形成的原因是__________________________________________。 【答案】(1）由一对等位基因控制，株高140 cm为显性性状，100cm隐性性状 (2) 266 苯丙氨酸 Ⅱ和Ⅲ （3） aabb 两对等位基因位于两对同源染色体上 甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 【解析】（1）根据题意，纯合品系甲（株高100cm）和纯合野生品系（株高140cm）杂交后，F1株高全为140cm，说明株高140 cm为显性性状，株高100 cm为隐性性状；F2两种表型比约为3:1，符合一对等位基因的分离定律， 因此推测品系甲株高的遗传机制由一对等位基因控制，株高140cm为显性性状，100cm为隐 性性状。 （2）根据题干信息可知，品系甲是野生型的转录产物编码序列第796位突变导致的，对比野生型和突变型甲的转录模板链部分序列可知，是模板链对应的位点碱基发生了“G→A”的替换，由突变基因模板链转录形成的mRNA方向是5'→3'，对应模板链方向是3'→5'，由于mRNA上每3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基叫作1个密码子，转录产物编码序列第796位突变，796÷3=265……1，则266号的模板链序列是796G、797A、798G，对应密码子为5'-CUC-3'，突变后对应密码子为5'-U UC-3'，编码苯丙氨酸。PCR 扩增需要一对引物，引物的作用是使 DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此引物序列应与DNA 两条链3'端互补，为检测其他水稻是否发生该突变，引物序列中应包含突变位点，根据突变型基因转录模板链部分碱基序列的两端可知，有一个引物为5′−⋯GCTTCG−3′，符合此条件的是引物Ⅱ， 另一引物的序列为5′−⋯GGTGTC−3′，符合此条件的是引物Ⅲ，故选引物Ⅱ和Ⅲ。 （3）假设品系甲的突变基因为a，若甲、乙有同一基因突变（a 基因），纯合甲与纯合乙杂交，F2出现3:1的表型比，两者有一对基因是相同的（aa），说明两者表型差异必然涉及另一对等位基因，推测乙的基因型为aabb，品系乙（aabb）x野生型（AABB） ， F1全为140 cm(AaBb），F2出现了9:6:1的分离比，推测表型和基因型对应如下： A-B-140cm 、A-bb和aaB-100cm 、aabb75m，满足两对等位基因独立遗传的特点，说明两对等位基因位于两对同源染色体，遵循基因的自由合定律。若发现品系乙与品系甲无相同突变，纯合品系乙与纯合品系甲杂交后，F2出现3:1的表型比，说明甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 14．（2026·广东·高考真题）玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异（图a），且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： （1）将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为__________性状。 （2）根据这对基因的序列设计了3种引物（图a），便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶（延伸速度约为1000 bp/min）、缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核苷酸和__________，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤（图c）中泳道_______________的带型。 （3）基于品系W构建了针对VW基因的RNAi（可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达）转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株_______________进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果（胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同）： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为_________________； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为____________________________。 （4）已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：_____________________________________是产生品系A粉质胚乳的原因。 【答案】(1）显性 （2） 模板DNA/玉米基因组DNA ① （3） （胚乳的）RNA 粉质 粉质：硬质=3:1 （4）VA基因表达量低，编码的催化酶合成不足，无法有效催化非极性胡萝卜素转化为下游产物；非极性胡萝卜素积累，导致形成粉质胚乳 【解析】（1）粉质品系 A、硬质品系 W 为纯合品系，正反交F1籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉质，硬质为显性性状。 （2）PCR反应体系除引物、Taq酶、缓冲液、脱氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。品系W是纯合VWVW，Taq DNA聚合酶延伸速度约为1000 bp/min，引物1与引物2可扩增出100+196=296bp（约300bp）的片段，引物3延伸的子链至多延伸500bp，不能再作为引物1结合的模板，因此扩增产物对应图c的泳道①。 （3）要检测VW的表达是否受影响，需要检测转录产物，因此提取胚乳的RNA，通过逆转录PCR检测。 已知VW高表达对应硬质，低表达对应粉质。 ①纯合转基因植株的VW表达被RNAi显著降低，因此胚乳性状为粉质。 ②杂合转基因植株（V+V−，V+为正常VW，V−为表达被敲低的VW）自交，胚乳由两个基因型相同的极核+一个精子发育而来，仅纯合的VWVW表现为硬质，杂合转基因植株中VW表达被敲低，因此性状比例为粉质：硬质=3:1。 （4）据题干信息可知，VW编码的酶催化非极性胡萝卜素转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足，因此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚乳的原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突变，非极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为硬质。 15．（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的________（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是________________________________________。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是__________。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A．24 h检测细胞内 B．24 h检测细胞外 C．0 h和24 h检测细胞内 D．0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射_____________；该实验结论是___________________________________________________________________________________________________。 【答案】(1) 抗体 使其在星形胶质细胞中特异性表达 KpnⅠ和BamHⅠ (2)C （3） 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 【解析】（1）实验目的是形成CAR-A细胞（嵌合抗原受体基因），并鉴定这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力，所以表达产物需要与Aβ聚集体特异性结合，所以胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列。 要使其在星形胶质细胞中特异性表达，所以需要选择特异性启动子。 为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，需要将CAR基因编码序列和特异性启动子导入病毒载体中，分析目的基因和载体，可以选择KpnⅠ和BamHⅠ切割目的基因和病毒载体，可以保证目的基因插入病毒载体中，依次形成特异性启动子、CAR表达载体、GFP基因和终止子的表达载体。 （2）要证明细胞具有“吞噬”和“降解”Aβ聚集体的能力，必须检测Aβ是否进入了细胞内部以及其含量的变化。在0 h（更换培养基前）和24 h（更换培养基继续培养后）分别检测细胞内的Aβ聚集体含量，如果24 h时细胞内Aβ含量显著低于0 h，则能确凿地证明CAR-A细胞不仅吞噬了Aβ，还在细胞内将其降解了，C正确，ABD错误。 （3）为检测效果，实验组6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，对照组选择6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒，由于3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降，说明了在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 1．（2026·湖南长沙·三模）现有一长度为3000碱基对（bp）的线性DNA分子，用限制性内切核酸酶酶切后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如下图1。用酶B单独酶切，结果如下图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如下图3。下列相关叙述正确的是（     ） A．酶H有2个识别位点和切割位点 B．酶B和酶H同时酶切时，有3个识别位点和切割位点 C．酶B和酶H同时酶切时，能产生完全相同的酶切片段 D．酶B和酶H有相同的识别位点和切割位点 【答案】B 【解析】A、由题图1可知，酶H单独切割，能产生两个DNA片段，说明酶H有1个识别位点和切割位点，A错误； B、根据题图3可知，用酶B和酶H同时切割，有四个片段，1个1400bp，2个600bp，1个400bp的片段，说明两种酶同时使用时有3个切割位点，B正确； C、酶B和酶H同时切割，能产生长度相同的酶切片段，但是碱基序列是否相同则不能确定，C错误； D、根据前面的分析可知，酶H有1个识别位点和切割位点，据图2可知酶B有2个识别位点和切割位点，两种酶同时使用时有3个切割位点，说明酶B和酶H没有相同的识别位点和切割位点，D错误。 2．（2026·辽宁营口·三模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对农作物同样具有杀伤作用。为培育抗草甘膦的玉米（单子叶植物），科研人员将外源EPSP合酶基因（其表达产物能与草甘膦竞争作用位点）导入玉米细胞并成功表达，下列相关叙述正确的是（    ） A．构建基因表达载体时，常选取原核细胞拟核中的DNA分子作为天然质粒 B．采用抗原－抗体杂交技术鉴定抗草甘膦玉米中EPSP合酶的存在 C．质粒上的抗生素合成基因可用于重组DNA分子的筛选 D．将已转化的玉米愈伤组织移至田间，观察其抗草甘膦能力 【答案】B 【解析】A、质粒是存在于原核生物细胞质中的小型环状DNA分子，不是拟核中的DNA，且天然质粒难以直接满足载体需求，通常需要人工改造后使用，A错误； B、EPSP合酶是目的基因表达的蛋白质，抗原－抗体杂交技术可特异性检测目标蛋白质的存在，因此可采用该技术鉴定EPSP合酶是否成功合成，B正确； C、质粒上作为标记基因的是抗生素抗性基因，而非抗生素合成基因，抗性基因可使受体细胞在含对应抗生素的培养基上存活，以此完成重组DNA分子的筛选，C错误； D、已转化的玉米愈伤组织需要先经过植物组织培养诱导再分化形成完整植株，之后才可喷施草甘膦检测其抗草甘膦能力，不能直接将愈伤组织移至田间，D错误。 3．（2026·湖北十堰·三模）AlphaFold的核心作用是利用人工智能，根据蛋白质的氨基酸序列，高精度地预测其空间结构。研究发现，某种酶在常温下具有催化活性，高温处理后失去活性，但其氨基酸序列并未改变。若该酶的基因发生了一个碱基替换突变，则用AlphaFold对这种新酶进行结构预测时，应首先重点分析（　　） A．高温处理是否破坏了该酶的肽键 B．这种突变是否提高了该酶在高温下的稳定性 C．该酶在高温下失去活性是否因其氨基酸序列发生了改变 D．突变位点对应的氨基酸的性质变化如何影响局部空间构象 【答案】D 【解析】蛋白质的空间结构由氨基酸的序列、氨基酸R基的性质等决定，一个碱基替换突变可能导致突变位点对应的氨基酸种类改变，因此首先分析突变位点氨基酸的性质变化对局部空间构象的影响，是利用AlphaFold预测新酶结构的前提，D正确，ABC错误。 4．（2026·甘肃嘉峪关·二模）某研究团队利用CRISPR/Cas9技术培育抗条锈病小麦，在sgRNA的引导下，利用Cas9蛋白精准编辑小麦的TaCIPK14基因，在不影响产量性状的前提下使条锈病严重度降低了13%，为作物抗病改良提供了新思路。下列关于该技术的叙述，正确的是（　　） A．sgRNA与TaCIPK14基因的结合遵循碱基互补配对原则 B．培育抗条锈病小麦过程Cas9蛋白可在任意位点切割DNA双链，实现精准编辑 C．利用该技术可以精准替换DNA分子中的核糖核苷酸 D．利用该技术培育的小麦抗病性状属于不可遗传的变异 【答案】A 【解析】A、sgRNA是单链RNA，TaCIPK14基因是DNA片段，二者结合时遵循RNA与DNA链的碱基互补配对原则（A-U、T-A、G-C、C-G），A正确； B、Cas9蛋白需要在sgRNA的引导下定位到特定的DNA位点进行切割，并非可以在任意位点切割DNA，才能实现精准编辑，B错误； C、DNA分子的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸是RNA的基本组成单位，该技术编辑的是DNA，替换的是脱氧核糖核苷酸，C错误； D、该技术改变了小麦的基因序列，遗传物质发生改变，因此获得的抗病性状属于可遗传的变异，D错误。 5．（2026·河北·二模）miRNA是细胞中的一类非编码小分子RNA，其与有关蛋白形成沉默复合体RISC后，通过与靶mRNA结合调控基因的表达，具体机理如图。miR­150为miRNA家族成员之一，在多种肿瘤细胞中均异常表达。研究人员将miR­150过表达质粒及其阴性对照质粒miR­NC分别导入宫颈癌Hela细胞后，检测细胞凋亡率和FOXO4蛋白表达量，结果如图。下列叙述不正确的是（     ） A．miRNA与靶mRNA部分互补，碱基配对方式与miRNA基因转录过程完全不同 B．RISC中的miRNA与靶mRNA的5′端结合，通过阻止核糖体移动阻止翻译的进行 C．对照质粒miR­NC可排除其他无关变量对宫颈癌细胞凋亡率的影响 D．miR­150可能通过上调FOXO4基因表达来促进宫颈癌细胞的生长和存活 【答案】ABD 【解析】A、miRNA与靶mRNA部分互补，配对方式为A-U、G-C、C-G、U-A，miRNA 基因转录过程中配对方式为A-U、G-C、C-G、T-A，因此碱基配对方式有相同的地方，也有不同的地方，A错误； B、翻译的方向（核糖体的移动方向）从mRNA的5'端→3'端，图中显示核糖体的移动方向是从左至右，所以，RISC中的miRNA与靶mRNA的3'端结合，通过阻止核糖体移动阻止翻译的进行，B错误； C、阴性对照质粒miR-NC可排除其他无关变量对宫颈癌细胞凋亡率的影响，C正确； D、实验表明，miR-150组FOXO4的蛋白条带较细，说明蛋白含量较少，而miR-150组细胞凋亡率较低，说明细胞生存较好，因此miR-150可能通过靶向下调FOXO4基因表达来促进宫颈癌细胞的生长和存活，D错误。 6．（2026·辽宁营口·三模）某植物基因D位于6号染色体上，基因d由基因D突变产生，仅含基因d时会造成花粉不育。现将一个基因D插入基因型为Dd的植株9号染色体上，让该植株自交得子一代，对子一代的基因D和d进行PCR扩增及电泳鉴定，所用引物和扩增产物的电泳结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．基因D插入植株9号染色体属于基因重组 B．应选择引物S1和R2、T1和W2对子一代进行PCR扩增 C．若只看基因D和d，该植株产生的可育花粉中不含基因d的占比为1/2 D．子一代中电泳结果为类型Ⅱ的植株占比为1/3 【答案】AD 【解析】A、将外源基因D插入到9号染色体上，属于广义的基因重组（基因工程的原理就是基因重组），A正确； B、PCR扩增需要一对引物分别结合目的片段两条链的两端，且扩增方向为5'到3'，引物延伸方向需相向才能扩增出目的片段：扩增基因D（850bp）需要左引物S1+右引物R2，扩增基因d（790bp）需要左引物W1+右引物T2，符合要求，B错误； C、亲本染色体：6 号D、d，9 号D'。 减数分裂产生花粉（雄配子）4 种：D、d、DD'、dD'，已知只含 d 的花粉不育，可育花粉：D、DD'、dD'（3 种，全带 D）。 可育花粉共3份：不含 d：D、DD'（2 份） ，含 d：dD'（1 份）， 不含d 占比2/3，C错误； D、雄配子（可育）： D：DD′ ：dD′=1:1:1 （3 种可育） ，雌配子（全可育，4 种： D：d：DD′ ：dD′ =1:1:1:1 ）。 只有雄配子不带 d（D、DD'）+ 雌配子不带 d（D、DD'）→子代无 d（类型 Ⅱ，电泳只有850bpD条带）： 雄不含d：2/3(D、DD′ ) ；雌不含d：1/2 (D、DD′) ，类型 Ⅱ 比例 = 2/3​ × 1/2 ​=1/3​ ，D正确。 故选AD。 7．（2026·湖南长沙·一模）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（　　） A．①中 Ti质粒应该包含标记基因、复制原点等元件 B．②的构建需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶等 C．③侵染植物细胞后，重组 Ti质粒会整合到④的染色体 D．④的染色体上 Bt抗虫基因表达，⑤可表现出抗盲蝽、红蜘蛛、棉铃虫等抗虫性状 【答案】AB 【解析】A、①中Ti 质粒作为运载体，必须含复制原点、标记基因、启动子、终止子等，A正确； B、②构建重组质粒需要限制酶切割、DNA连接酶连接，前者是基因工程的剪刀，后者是针线，B正确； C、③农杆菌侵染后，Ti质粒的T-DNA整合到植物细胞染色体DNA，并非整个Ti质粒，C错误； D、④的染色体上的抗虫基因一般只针对特定鳞翅目害虫，不能抵抗所有害虫，D错误。 8．（2026·湖南长沙·三模）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 （1）纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________。 （2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0mo1/L的目的是__________。PCR扩增时，需在__________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamHⅠ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__________。 （4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。 【答案】(1）参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心 （2） 溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' （3） a、b 1100 Q3 X蛋白参与中心体的形成 (4) 逆转录 32 【解析】（1）中心体与有丝分裂有关，决定了有丝分裂的方向，中心体主要存在于低等植物和动物细胞中。 （2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，因为DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，低于或高于该浓度溶解度均升高，2.0mol/L的NaCl溶液中DNA溶解度较高，可使DNA溶解，可见实验过程中添加NaCl至2.0mo1/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamHⅠ的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有Hind Ⅲ和BamHⅠ识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明X蛋白参与中心体的形成。 （4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，健康人初始模板量是病人的25=32倍，扩增20个循环后产物量的比值等于初始模板量的比值，因此，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的32倍。 9．（2026·北京大兴·三模）为研究beclin1基因与人类癌症的发生是否有关，研究人员构建了beclin1基因杂合子小鼠（beclin1+/-）并进行了一系列实验。 （1）研究人员获得了小鼠beclin1 cDNA部分序列后，利用_____技术获取该基因全部碱基序列。 （2）将靶向敲除一个beclin1基因的胚胎干细胞注射到小鼠_____中，获得嵌合体小鼠。将嵌合体雄鼠与野生型雌鼠交配，利用DNA分子杂交技术对F1代小鼠DNA进行分析，从而验证突变基因可以进行传递。beclin1+/-小鼠相互交配，获得156只野生型小鼠（beclin1+/+）和298只beclin1+/-小鼠，说明_____。 （3）利用BrdU掺入染色法对5周龄beclin1⁺/⁻雌性小鼠乳腺发育过程中上皮细胞的增殖情况进行了定量分析。 ①BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，可代替胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的_____中。掺入的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体进行检测，从而判断细胞的增殖能力，结果如图所示。 ②上图显示，beclin1+/-小鼠乳腺上皮细胞中BrdU阳性细胞所占比例_____，表明beclin1基因缺陷可导致_____。 （4）依据上述实验结果，有人提出beclin1基因是一个“单倍体”不足的_____基因（选填“原癌基因”“抑癌基因”），即当一个beclin1基因失活，另一个基因正常时，beclin1基因就可以促进肿瘤的发生。为支持该推测，科研人员从DNA分子和蛋白质水平寻找证据： ①DNA分子水平：检测beclin1+/-小鼠体内癌细胞中_____，如正常，则支持； ②蛋白质水平：_____，则支持。 【答案】(1)PCR和测序技术 （2） 囊胚（早期胚胎） 纯合基因敲除小鼠（beclin1-/-小鼠）的胚胎死亡 （3） DNA 显著增加（高于野生型） （DNA合成显著增加）乳腺上皮细胞异常增殖 （4） 抑癌 野生型基因的碱基序列 癌细胞中beclin1蛋白含量低于正常细胞 【解析】（1）已知基因的部分序列，可以根据序列设计引物，通过PCR和测序技术获得该基因的全部序列。 （2）构建嵌合体小鼠时，需要将改造后的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚（早期胚胎）中，胚胎干细胞可参与发育形成个体组织；beclin1⁺/⁻杂合小鼠相互交配，理论后代基因型及比例为beclin1⁺/⁺:beclin1⁺/⁻:beclin1⁻/⁻=1:2:1，实际后代只有野生型beclin1⁺/⁺和杂合子，且比例接近1:2，说明纯合基因敲除小鼠（beclin1-/-小鼠）的胚胎死亡。 （3）①胸腺嘧啶是DNA合成的原料，因此胸腺嘧啶类似物BrdU会掺入新合成的DNA中。②从柱形图可以看出，beclin1⁺/⁻小鼠的BrdU阳性细胞比例显著增加（高于野生型）；BrdU阳性代表细胞正在进行DNA复制（增殖），因此说明beclin1基因缺陷会使（DNA合成显著增加）乳腺上皮细胞异常增殖。 （4）抑癌基因抑制细胞增殖，抑癌基因的单倍体不足效应指：一个等位基因失活，剩余的一个正常等位基因表达的产物不足，无法发挥抑癌作用，促进肿瘤发生，因此beclin1是抑癌基因。若要证明该推测：DNA水平需要检测癌细胞中留存的野生型基因的碱基序列是否正常，如果野生型基因本身没有突变，支持单倍体不足的推测；蛋白质水平，若检测到癌细胞中beclin1蛋白含量低于正常细胞，说明一个失活后表达量不足，支持推测。 10．（2026·河北邢台·三模）胡萝卜细胞中β-胡萝卜素（维生素A前体）的合成依赖PSY、LCYb这两种酶，将合成这两种酶的基因导入小麦细胞中，可获得富含β-胡萝卜素的黄金小麦，用于改善维生素A缺乏症。科学家先用重叠延伸PCR技术构建出能合成PSY、LCYb这两种酶的融合基因，过程如图1所示。再将融合基因导入小麦细胞，该过程所用的质粒及相关限制酶识别序列如图2所示。请回答下列问题： （1）据图1可知，PCR1和PCR2需要分开单独进行，原因是________。PCR过程中，除了向反应体系中添加模板DNA、引物，还需添加________（至少答出两种）。 （2）为保证融合基因能正确插入质粒，利用PCR扩增融合基因时，需在图1的引物________（从“A”“B”“C”“D”中选填）的5'端分别添加限制酶________的识别序列。已知融合基因的甲链的序列为5'-CGCTAC……GTAGAT-3′。利用PCR技术扩增融合基因时，某同学设计了如下的引物，引物对应的序列分别为________（填标号）。 A．5'-CAATTGCGCTAC-3'            B．5'-GGATCCATCTAC-3' C．5'-GAATTCCGCTAC-3'            D．5'-TGATCAATCTAC-3' （3）据图2分析筛选转化细胞的过程：第一次在培养基中添加________筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，第二次在培养基中添加________筛选染色体DNA上整合T-DNA的胡萝卜愈伤组织细胞。 【答案】(1) 引物②和引物③部分碱基会互补配对，影响子链的合成 耐高温的DNA聚合酶、含Mg2+的缓冲液、4种脱氧核苷酸 (2) B、C BamHI、MunI BA （3） 卡那霉素 潮霉素 【解析】（1）要构建融合基因，需利用能够发生碱基互补配对的引物，使两个不同的基因能够通过PCR融合成一个完整基因。分析图1可知，PCR1和PCR2是分别利用引物①②和③④扩增出PSY和LCYb基因，其中引物②和引物③有一段碱基序列能发生碱基互补配对，会影响子链的合成，故PCR1和PCR2需分开单独进行。PCR过程中，反应体系中需添加模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、含Mg2+的缓冲液、4种脱氧核苷酸。 （2）PCR扩增融合基因时子链延伸的方向是5′→3′，故利用PCR扩增融合基因时，需在引物B、C的5'端分别添加相关限制酶的识别序列。据图1、2可知，质粒上适合的酶切位点上游端是BclI，下游端是EcoRI，而融合基因序列中有BclI和EcoRI的识别位点，若用这两种酶切割融合基因，将破坏该融合基因，因此应选择对应的同尾酶（指识别序列不同，但切割后产生相同黏性末端的酶），故为保证构建的融合基因能正确插入载体中，结合融合基因的转录方向可知，应该分别在引物C的5'端添加MunI的识别序列，引物B的5'端添加BamHI的识别序列。已知融合基因甲链的序列为5'-CGCTAC……GTAGAT-3'，甲链与乙链碱基互补，则乙链的序列为5'-ATCTAC……GTAGCG-3'，引物是与模板链的3'端结合，引物C结合的单链是乙链，同时在引物C的5′端添加限制酶MunI的识别序列。根据给出的序列和PCR引物的设计原则，可以判断引物C的序列应为5'-CAATTGCGCTAC-3'，而引物B结合的单链是甲链，同时在引物B的5′端添加限制酶BamHI的识别序列，故可以判断引物B的序列应为5'-GGATCCATCTAC-3'，故选BA。 （3）第一次是筛选导入重组Ti质粒的农杆菌菌株，故需要在培养基中添加卡那霉素；第二次是筛选染色体DNA上整合T-DNA的胡萝卜愈伤组织细胞，由于只有T-DNA可以转移整合，故第二次需要在培养基上添加潮霉素。 11．（2026·西藏昌都·二模）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 （1）质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见下表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是________和________。 限制酶 识别序列（5'-3'） EcoR I GAATTC Sal I GTCGAC Bgl Ⅱ AGATCT Xho I CTCGAG （2）细胞X是一种贴壁细胞，可用________（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是________。 （3）将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如下图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有________作用，且随导入时间推移，增殖速率________。 【答案】(1) EcoR Ⅰ Xho Ⅰ （2） 液体 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度 （3） 促进 增加 【解析】（1）需选择质粒甲和质粒乙共有的限制酶切割，保证目的基因和质粒产生相同黏性末端。质粒甲的目的基因两端有EcoRⅠ和Xho Ⅰ的酶切位点（对应质粒乙的酶切位点），因此用EcoRⅠ和Xho Ⅰ。 （2）动物细胞培养使用液体培养基；胰蛋白酶在37℃（人体/ 动物细胞适宜温度）下活性高，可分解细胞间的蛋白质，使贴壁细胞分散成单个细胞，便于传代培养。 （3）从曲线可知：导入重组质粒Z（含基因Z）的细胞数量始终多于空质粒组，说明基因Z的表达对细胞增殖有促进作用；且随着导入时间增加，两组细胞数量的差值越来越大，说明细胞增殖速率加快（提高）。 12．（2026·湖南衡阳·三模）副猪格拉瑟菌（GPS）是生活于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶（OppA）在免疫学上具有较高的研究价值。为增加OppA基因表达量，研究人员利用强启动子等构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA基因如图所示。请回答下列问题： （1）构建OppA基因过表达载体时，应该选择限制酶________切割质粒。为便于与质粒连接，需在2个引物的5'端添加限制酶________的识别序列。 （2）据图分析，利用PCR扩增OppA基因时所需的引物组合是________。PCR反应缓冲液中添加的Mg2+的作用是________。 （3）已知OppA基因的转录方向是从左向右，OppA基因甲链的碱基序列为5'-TTACAG……CGCTCC-3′，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3′，则转录的模板链是_______（填“甲”或“乙”）链。请写出OppA基因上游引物的13个碱基序列：5'-________-3'。 （4）为了筛选出正确串联了强启动子、OppA基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型d加入的抗生素是________，得到M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示（+表示生长，－表示不生长）。根据表中结果判断，符合要求的菌落是_________（填“M”“N”或“O”）类。 平板类型 菌落类型 M N O a.无抗生素 + + + b. - + + c.氨苄西林 - + - d. - + - 【答案】(1) BamHI、SalI BamHI、XhoI （2） ②③ 激活耐高温的DNA聚合酶 (3) 乙 GGATCCCATGCTT （4） 卡那霉素和氨苄青霉素 O 【解析】（1）HindⅢ在卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因这两种标记基因上都有酶切位点，会破坏质粒上的全部标记基因，所以选择HindⅢ进行酶切不合适。可以选择BamHI、SalI这两种限制酶切割质粒。SalI在OppA基因内部有酶切位点，不能使用SalI切割OppA基因，而SalI与XhoI切割后能产生相同的黏性末端，故应在2个引物的5'端添加BamHI、XhoI的识别序列。 （2）PCR扩增时需要一对方向相对的引物，子链DNA的延伸方向是5′→3′，引物的3'端必须指向待扩增的DNA区域内部，以保证DNA聚合酶能向模板中间合成新链。引物与碱基互补配对的链方向相反，图中①、②、③、④的3'端指向依次是向左、向右、向左、向右，只有②、③的3'端指向OppA基因区域内部，即为所需的引物组合。PCR反应缓冲液中一般需要添加Mg2+，其作用是激活耐高温的DNA聚合酶。 （3）转录方向沿DNA模板链的3′→5′方向进行，新合成的RNA链则沿5′→3′方向延伸，OppA基因的转录方向从左向右，故OppA基因的转录方向是沿乙链的3′→5′方向进行。已知OppA基因甲链的部分碱基序列为5′-TTACAG-3′，则OppA基因乙链的相应碱基序列为3′-AATGTC-5′，上游引物（即图中的②）5'端与OppA基因乙链的相应碱基序列能进行碱基互补配对，且方向相反，为5′-TTACAG-3′（与甲链的碱基序列相同），再在其5'端加上BamHI识别序列（5′-GGATCC-3′）和强启动子的碱基序列（5′-CATGC-3′），因此OppA基因上游引物的13个碱基序列：5′-GGATCCCATGCTT-3′。 （4）在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI切割质粒，它们破坏了质粒上的氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏卡那霉素抗性基因，则导入重组质粒的微生物不能在含有氨苄青霉素的培养基上生存，能在含有卡那霉素的培养基上生存。表中平板类型b和d加入的抗生素分别是卡那霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。M只能在无抗生素的培养基上生长，证明它是未导入质粒的菌落；N能在添加了卡那霉素和氨苄青霉素的培养基上生长，证明它是导入了空载质粒的菌落；O只能在无抗生素和添加了卡那霉素的培养基上生长，证明它是导入了重组质粒的菌落；根据表中结果判断，应选择的菌落是O。 13．（2026·甘肃嘉峪关·二模）水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种蛋白质，具有良好的抗凝血作用。已知天然的水蛭素抗凝血活性较低，产量和来源有限。研究发现，若将其第47位天冬酰胺替换成赖氨酸，可以提高其抗凝血活性。某科研团队拟通过不同的生物技术获得活性高、产量大的重组水蛭素。回答下列问题： （1）图1所示运用____________工程得到凝血活性更高的水蛭素，该技术的直接操作对象是__________。在生产过程中，物质b的碱基序列可能不同，却合成了相同的物质a，这是因为____________。 （2）基因工程中常利用PCR获取和扩增目的基因。PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种dNTP、____________、____________及缓冲液，4种dNTP的作用是____________。 （3）利用基因工程生产水蛭素时，依据图2信息构建基因表达载体，为使水蛭素基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是____________。若采用大肠杆菌作为受体细胞，需要在培养基中加入____________以筛选转化成功的工程菌，并选择颜色为____________的大肠杆菌菌落进一步培养。 注：neor为新霉素抗性基因；malcZ的表达产物会使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色。 （4）工业生产中，还可利用制备乳腺生物反应器来生产高抗凝血活性的水蛭素，但制备时需将高抗凝血活性的水蛭素基因与乳腺中特异表达的基因的_________等调控元件重组在一起。某研究小组大胆推测，用类似方法制备膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的____________（答1点）的限制。 【答案】(1) 蛋白质 基因 密码子的简并性 （2） 引物 TaqDNA聚合酶 为PCR提供原料和能量 (3) XmaI和BglII 新霉素 白色 （4） 启动子 性别或生理状态 【解析】（1）图1所示运用蛋白质工程得到凝血活性更高的水蛭素，该技术的直接操作对象是基因，因为蛋白质的结构由基因决定，改造基因才能定向改变蛋白质的结构和功能。在生产过程中，物质b的碱基序列可能不同，却可合成相同的多肽链 a，原因是密码子的简并性，即不同的密码子可以编码同一种氨基酸。 （2） PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种dNTP、引物、TaqDNA聚合酶及缓冲液，4种dNTP的作用是为PCR提供原料和能量。 （3）由图可知，限制酶XmaI和BglII切割产生的黏性末端分别与目的基因两端的黏性末端相同，能使目的基因与质粒高效连接，应选用的限制酶是XmaI和BglII。malcZ的表达产物会使菌落呈蓝色，否则菌落呈白色，由于XmaI和BglII破坏malcZ基因，所以重组质粒中malcZ基因被破坏，但含有新霉素抗性基因，因而需要在培养基中加入新霉素，并选择颜色为白色的大肠杆菌菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良水蛭素的工程菌株。 （4） 制备乳腺生物反应器时，需将高抗凝血活性的水蛭素基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，这样目的基因才能在乳腺细胞中特异性表达。 膀胱生物反应器比乳腺生物反应器更有优势，因为它可以不受转基因动物的性别或生理状态（如是否泌乳、年龄等）的限制，无论雌雄、任何生理阶段都能从尿液中获取产物。 14．（2026·山东聊城·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题： （1）Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于______酶，该过程体现了酶具有______性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的______。 （2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，sgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是______；解决措施是______。 （3）为了实现某基因的特异性敲除，如图所示，科学家将含有3个不同的但靶向相同基因的sgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。 注：eflap是能够驱动基因广泛表达的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I—SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中。 理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建如图所示重组质粒的优势：______（答出两点）。 【答案】(1) 限制 专一 碱基互补配对 （2） sgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶 适当增加sgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性 （3）只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选 【解析】（1）Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，Cas9在功能上属于限制酶，该过程体现了酶具有专一性；此外，Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的碱基互补配对。 （2） sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。由于sgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶，可以通过适当增加sgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性来解决这个问题。 （3）由图可知，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I-SecI是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中，理论上，一个sgRNA便能实现靶基因的敲除，构建图中所示重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选等。 15．（2026·陕西西安·三模）RCA是一种核基因（rca）编码的光合作用相关的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种，如图1所示，①~⑥表示相关过程。请分析回答： （1）过程①通常从大豆的___________细胞中提取总RNA，参与①过程的酶有___________，其产物中___________（填“含有”或“不含有”）启动子、终止子和内含子序列。PCR通过变性、复性、延伸三步，反复循环，可实现rca基因片段的___________。 （2）已知①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，反义rca基因的___________（填“N端”或“M端”）接在C4pdk启动子的后面。依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，写出引物1的碱基序列5′____________3′（只写出前9个碱基即可）。 （3）过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是___________，过程③rac基因反向插入的目的是___________，从而达到基因沉默的作用。⑤过程后可用含___________的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。分子水平上转基因大豆培育成功的标志是___________。 （4）科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2.据图分析，RCA主要是通过___________来___________（填“促进”或“抑制”）大豆的光合作用。 【答案】(1) 叶肉 反（逆）转录酶、耐高温的DNA聚合酶 不含有 指数形式扩增 (2) N端 5′-AGATCTGTT-3′ （3） C4pdk启动子是受光诱导的强启动子，光诱导下可驱动目的基因在大豆叶肉细胞中特异性表达 反向连接的rca基因在大豆叶肉细胞中转录后产生的RNA与rca基因转录形成的mRNA互补，两者结合后形成双链RNA，从而阻止翻译过程，RCA不能合成，进而使基因沉默 潮霉素 RCA表达量减少 （4） 提高Rubisco活力 促进 【解析】（1） RCA是叶绿体蛋白，其基因在叶肉（含叶绿体的）细胞中表达，故从大豆叶肉细胞提取总RNA；过程①是反转录PCR，反（逆）转录酶、TaqDNA聚合酶；cDNA由mRNA反转录而来，不含有启动子、终止子和内含子序列。PCR通过变性、复性、延伸三步，反复循环，可实现rca基因片段的指数形式扩增。 （2）①过程rca基因的a链和获取它的模板mRNA互补，则a链是模板链，反义rca基因需要转录出和rcamRNA互补的RNA，所以它的模板链要和原rca的模板链相反，也就是用b链作为反义基因的模板链（这样转录出的RNA才会和原mRNA互补）。启动子驱动基因从5'到3'转录。原rca基因的N端是转录的起始端（靠近启动子的一端），要构建反义基因，需要把N端接在C4pdk启动子后面，这样转录出的RNA才能和原rca的mRNA反向互补，发挥沉默作用。质粒上用BamHI和SalI切割，rca基因用BglⅡ（与BamHI属于同尾酶）和XhoI（与SalI产生相同的黏性末端）切割，由于目的基因是反向接入，所以目的基因M端连接XhoI识别序列，N端连接BglⅡ识别序列。引物1需与模板链互补，且要引入限制酶识别位点，结合图中引物1的设计区域碱基序列和BglⅡ的识别序列可知，引物1的碱基序列应该是5´-AGATCTGTT-3´。 （3） C4pdk启动子是光诱导的叶肉细胞特异性启动子，替换后可驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达；表达载体含潮霉素抗性基因，故用含潮霉素的培养基筛选；分子水平上，转基因成功的标志是rca基因沉默，即RCA表达量减少。 （4）转基因大豆（rca基因沉默）的光合速率、Rubisco活力均低于野生型，据图分析，说明RCA主要通过提高Rubisco活力来促进光合作用。 1/11 学科网（北京）股份有限公司 $