3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二生物同步优质备课（人教版2019选择性必修3）

第1节 重组DNA技术的基本工具 【本节聚焦】 1、重组DNA技术所需的三种基本工具是什么?它们的作用分别是什么? 2、基因工程载体需要具备什么条件? 第3章 基因工程 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 1 学习目标、重难点 核心素养 1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。 2.认同基因工程的说生和发展离不开理论研究和技本创新。 3.进行DNA的粗提取与鉴定。 1.生命观念：结合基因工程的基本原理，形成“基因工程赋予生物新的遗传特性”的生命观念。 2.科学探究：独立进行DNA的粗提取与鉴定实验，提升科学探究能力。 3.科学思维：通过了解科学的进步对重组DNA技术发展的促进作用认同科学和技术能够改善人们的生活，拓展人们的视野。 1.数学重点 (1)重组DNA技术所需的三种基本工具的作用 (2)DNA的粗提取与鉴定。 2.教学难点 (1)基因工程载体需要具备的条件。 (2)DNA的粗提取与鉴定。 2 我国是棉花的生产和消费大国，但棉花种植中易受虫害，其中以棉铃虫最为主，可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。 抗虫基因 转基因 基因工程 情境导入 杂交育种？ 同种生物之间进行 诱变育种？ 在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因 不定向 苏云金杆菌中存在一种毒蛋白基因（Bt基因），编码出的毒蛋白能杀死害虫。 苏云金杆菌 思考：如何培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢? 若使用农药不仅会提高生产成本，还会造成农产品和环境污染。 3 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 一、基因工程的理论基础 操作对象： 操作水平： 原理： 结果： 意义： 基因（DNA） DNA 分子水平 基因重组 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍 水母的绿色荧光蛋白基因 【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ 一、基因工程的理论基础 ①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸； ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。 ③都遵循碱基互补配对原则 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 DNA平面结构 DNA立体结构 一、基因工程的理论基础 【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 ②遗传信息的传递都遵循中心法则。 ③生物界共用一套遗传密码。 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。 一、基因工程的理论基础 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 转入 提取 思考： DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。如何获得抗虫棉?需要什么工具? 怎么做？ 剪下来的抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？ 不能。大多数生物会排斥外来的基因，若直接导入会被降解。 一、基因工程的理论基础 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 转入 提取 思考： DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。如何获得抗虫棉?需要什么工具? 怎么做？ “分子缝合针” “分子运输车” 与载体DNA拼接，再导入 抗虫棉 “分子手术刀” 准确切割DNA分子 “分子缝合针” “分子运输车” 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 一、基因工程的理论基础 ① ② 二、限制性内切核酸酶（限制酶） 1. 定义： 2. 来源： （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 3. 种类： 识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 数千种 4. 作用： 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。 主要是原核生物，可人工合成 （蛋白质） 根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ ？旁栏思考 主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的 为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 提示：原核细胞内DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 二、限制性内切核酸酶（限制酶） 5. 限制酶的识别序列 思考：四种限制酶识别的特定序列有何特点？ 大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6个核苷酸 特点1：都可以找到一条中心轴线； 特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 总结：能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列 拓展——限制酶的命名： 阅读72页资料卡“限制酶的命名”，说说EcoRⅠ各个字母的代表含义。 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一个限制酶 二、限制性内切核酸酶（限制酶） （1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割 *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 （2）实例2——SmaⅠ限制酶切割 *SmaⅠ识别序列为CCCGGG *SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键 平末端 6.切割结果 : 二、限制性内切核酸酶（限制酶） DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ________ GATC AATT AGCT GATC 思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？ 二、限制性内切核酸酶（限制酶） ①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。 【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】 ②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ） 【练习2】下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC CTTAAG B．GGGGCCCC CCCCGGGG C．CTGCAG GACGTC D．CTAAATC GATTTAG D 【练习3】右侧黏性末端是由______种限制酶作用产生的。 3 二、限制性内切核酸酶（限制酶） 不能，限制酶只能识别并切开双链DNA分子。 （2）限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端。要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 2 2 2 （1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 【练习4】请结合限制酶的作用特点，回答以下问题： 二、限制性内切核酸酶（限制酶） 要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。 【练习5】把两种来源不同的DNA分子进行拼接，应该怎样处理呢？ 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) T G A A T T C G A C T T A A G C A G A A T T C T T C T T A A G A 缺口怎么办 只能用同种酶切割吗？ 二、限制性内切核酸酶（限制酶） 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 DNA连接酶 — “分子缝合针” 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 二 DNA连接酶 ——“分子缝合针” 2. 作用： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 5′ 3′ T A C G T A C T G A A T 5′ 3′ 5′ 3′ C G C G C G 5′ 3′ C G C G C G 切口 切口 切口 C T 5′ 3′ 5′ 3′ T A G C A G A T T A 5′ 3′ 5′ 3′ C G C G C G C G C G C G 三、DNA连接酶 将两个双链DNA片段“连接”起来的酶 1. 概念： 注意： 1、DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA! 2、DNA连接酶作用没有特异性。 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ T4 DNA 连接酶 T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 3. 种类： 思考：E.coli DNA连接酶只能连接互补黏性末端的DNA片段？ 两种连接酶都可连接互补黏性末端与平末端， 但E.coli DNA连接酶连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶 三、DNA连接酶 【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 思考：T4 DNA连接酶只能连接平末端的DNA片段？ T4 DNA 连接酶 E.coli DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 三、DNA连接酶 【新旧衔接】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 三、DNA连接酶 拓展：几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间 的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 1.(2022·天津耀华中学高二期中)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ） 考点突破 A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 如何将外源基因运入细胞呢？ 三、DNA连接酶 ①④是由同一种限制酶切割而成的 C G DNA连接酶 D 质粒: 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 1.作用： 动植物病毒: 噬菌体: 2.种类： 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 动物病毒 噬菌体 四、基因进入受体细胞的载体 是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我 能力的环状双链DNA分子。 复制 问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？ 问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 条件①：具有一个或多个限制酶切割位点； 条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制； 条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。 【探究】分析归纳载体需要具备的条件 四、基因进入受体细胞的载体 有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。 不能被酶切破坏 便于重组DNA筛选与鉴定 DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点（酶切位点） 4、最常用的载体——质粒： 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 改造的。 人工 四、基因进入受体细胞的载体 终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。 终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。 质粒DNA分子质量一般为拟核的0.5%~3% 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 探究‧ 活动二、P73思考讨论 重组DNA分子的模拟操作 四、基因进入受体细胞的载体 Hind III 和 BamH I 1.用图中外源DNA和质粒构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割， 原因是 。 2.使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，而不用EcoR Ⅰ一种限制酶切割，是为了防止 。 Sma Ⅰ会破坏抗性基因和外源DNA中的目的基因 目的基因、质粒自身环化及反向连接 5、下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ a、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点； b、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因 选择酶切位点的原则： 四、基因进入受体细胞的载体 图1 图2 30 6、标记基因的筛选原理： 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。（据图请尝试描述筛选的过程） 关键点拨 培养基中有几种类型的大肠杆菌？ 什么样的大肠杆菌能够 在该培养基上存活并繁殖？ 四、基因进入受体细胞的载体 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 取出 转移 思考：通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？ 四、基因进入受体细胞的载体 2.某实验小组利用下图所示质粒和目的基因来构建基因表达载体,将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述正确的是( ) A. 图中的质粒用酶A切割后,会产生8个游离的磷酸基团 B. 在构建重组质粒时,可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C. 成功导入目的基因的大肠杆菌可在含四环素的培养基中生长 D. 若用酶B和酶C切割,可以避免质粒的自身环化 D 趁热打铁 限制酶 DNA连接酶 载体 ①能自我复制或能整合到宿主DNA上 ②有一个至多个限制酶切割位点 ③有特殊的标记基因 ④对受体细胞无害 质粒、 噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 （能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） 课堂小结 实验：DNA的粗提取与鉴定 1、实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异， 可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA不溶于酒精溶液 但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） (1)选材： (2)试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 2、材料用具 实验：DNA的粗提取与鉴定 实验：DNA的粗提取与鉴定 称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。 破碎细胞 目的：裂解细胞，释放DNA 过滤 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。 问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 3、实验步骤 破碎细胞 过滤 DNA的析出 在上清液中加入体积相等的预冷的酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。 问题3:此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题4：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 实验：DNA的粗提取与鉴定 3、实验步骤 破碎细胞 过滤 DNA的析出 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 问题5：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 析出DNA 实验：DNA的粗提取与鉴定 3、实验步骤 实验组 对照组 水浴加热 破碎细胞 过滤 DNA的析出 DNA的鉴定 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 评价结果： （1）DNA纯度 看提取物颜色 （2）DNA的量 看与二苯胺反应颜色的深浅 现配现用！ 实验：DNA的粗提取与鉴定 3、实验步骤 （1）你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 （2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 4、结果分析与评价 实验：DNA的粗提取与鉴定 实验组 水浴加热5min，冷却后 对照组 蓝色 课后训练 1．(2024·鞍山期中)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是(　　) A．用限制酶剪切获得一个目的基因时产生两个切口，有四个磷酸二酯键被断开 B．在使用限制酶的同时，必须用解旋酶解开DNA的双螺旋结构 C．DNA连接酶可以连接两个肽链片段 D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接 　 A 课后训练 2．质粒是基因工程中最常用的载体，它的主要特点是(　　) ①能自主复制　②不能自主复制　③结构很小  ④成分为蛋白质　⑤环状RNA　⑥环状DNA  ⑦能“友好”地“借居” A．①③⑤⑦    B．②④⑥ C．①③⑥⑦    D．②③⑥⑦ C 课后训练 3．从目标生物提取分离DNA是进行基因工程操作的基础。以洋葱为材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．将蒸馏水加入切碎的洋葱中充分研磨以释放核DNA B．洋葱研磨后应该使用垫有滤纸的漏斗进行过滤 C．将滤液静置后，取下层溶液加入95%的冷酒精 D．将粗提取的DNA用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色 D 课后训练 4．限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术中常用的工具酶，限制酶可将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可连接带有黏性末端的DNA片段。据图分析错误的是(　　) A．图示三个黏性末端一定由两种不同的限制酶切割产生 B．图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端为同一种 C．a处核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，b处核苷酸之间通过氢键连接 D．催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子 A 课后训练 5．根据基因工程的有关知识，回答下列问题。 (1)限制性内切核酸酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有____________和____________。 (2)用EcoR Ⅰ切割质粒运载体后产生的片段如下：AATTC…G 　　　　　　G…CTTAA 为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是________________________________________________________________。 (3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。 (4)基因工程中除质粒外，______________和______________也可作为载体。 平末端 黏性末端 切割产生的DNA片段黏性末端与EcoR Ⅰ切割产生的相同 T4 E·coli 动植物病毒 噬菌体 Lavf55.48.100 Lavf55.48.100 Lavf58.20.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.3.79 $$