3.1.2 DNA的粗提取与鉴定- 【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第1节 DNA的粗提取与鉴定 贺老师 第3章 基因工程 1 刑侦破案 DNA提取的应用 基因组测序 插入人胰岛素基因的大肠杆菌 基因工程 亲子鉴定 2 实验设计思路： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 思考： 1、从哪里提取DNA？ 2、如何从细胞中提取DNA，有哪些困难？ 细胞 细胞内成分复杂，且真核生物的DNA和蛋白质结合形成染色体，难以分离提纯。 3 DNA的粗提取与鉴定 1 实验原理 1．提取DNA的原理 2．鉴定DNA的原理 （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。 某种蛋白质的溶解度 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 4 DNA的粗提取与鉴定 2 材料用具 1．选材 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 （1）选什么样的材料实验更易成功？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 柠檬酸钠防止血液凝固的原理是通过与血液中的钙离子结合，形成可溶性的柠檬酸钙，从而减少血液中钙离子的浓度。钙离子在血液凝固过程中扮演着关键角色，它的减少有效地阻止了血液凝固。 5 DNA的粗提取与鉴定 2 材料用具 2．试剂 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺 试剂 蒸馏水 溶解并提取DNA 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 6 DNA的粗提取与鉴定 7 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 问题：如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？ 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。 研磨液成分 作用 SDS EDTA Tris-HCl缓冲液 称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 使蛋白质变性 抑制DNA酶 稳定DNA SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜和核膜，释放DNA；同时使蛋白质变性，便于后续分离。 EDTA（乙二胺四乙酸）：螯合金属离子（如Mg²⁺、Ca²⁺），抑制核酸酶活性，防止DNA被酶解。 Tris-HCl：维持溶液的pH稳定，通常调节至7.5-8.0。DNA对pH变化敏感，稳定的pH环境可防止DNA降解。 8 取材研磨 DNA析出 DNA鉴定 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 研磨效果好（有利于充分研磨） (4)研磨不宜太用力 (1)研磨的目的： (2)研磨时间不宜太长： (3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶 过 滤 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 9 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 方法一：在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ； 方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 纱布 上清液 上清液 问题1：过滤的纱布能用滤纸代替吗？ 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 问题2：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 10 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 问题1：此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题2：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 问题3：为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 在上清液中加入体积相等的 溶液,静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 预冷的酒精 白色丝状物 11 实验组 对照组 沸水浴加热 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加 入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 二苯胺 2mol/L的NaCl 12 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 1.提取出丝状物或沉淀物一定是白色的吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 3.本实验的检测结果蓝色较浅的原因可能是什么？ ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，二苯胺易被空气氧化，影响鉴定效果。 DNA的粗提取与鉴定 4 结果分析与评价 13 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 加2mol/L的NaCl溶液的目的： 加蒸馏水的目的： 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 DNA的粗提取与鉴定 5 进一步探究 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 14 1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 拓展探究： 以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 15 DNA粗提取与鉴定实验成功的关键 (1)破碎细胞应彻底充分。 (2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分 预冷后才能使用。 (3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并 沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。 (4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量 不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。 (5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 16 方法一： 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 方法二： 可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。 方法三： 由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 17 1.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题： (1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是__________________________ (用序号与箭头表示)。 (2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目的是 。 ③→②→①→④→⑤ 溶解DNA 巩固练习 18 (3)步骤①的目的是 ， 其依据的原理是 。 析出并获得DNA DNA不溶于酒精 (4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加 ________试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。 白 二苯胺 沸水浴加热 蓝色 巩固练习 (5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是_______________________________________________________。 猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核 19 附：以鸡血为实验材料的实验设计（参考方案）： 20 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $$