第四章 实验4.3 叶绿体色素的提取分离及叶绿素含量的测定(无答案)-高中生物学合格考学案等级考预备（新教材必修 第2版）

· 155 · ① ② ③ ④ ⑤ 层析液 4mL 碳酸钙 脱脂棉 绿叶 无水乙醇 二氧化硅 实验 4.3 叶绿体色素的提取分离及叶绿素含量的测定 一、实验目的 学会提取和分离叶绿体色素的方法；探究叶绿体中有几种色素。 二、实验原理 植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素 a，叶绿素 b，胡萝卜 素和叶黄素组成，这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇，丙酮等有机溶剂提取。色素分 离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶 绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的 分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、实验材料、试剂和仪器 新鲜菠菜叶片、95%乙醇、石英砂、碳酸钙粉、层析液、研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、大试管 （带胶塞）、大头针、滤纸、天平、量筒、毛细管。 四、实验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）获取叶片：取植物新鲜叶片 1g，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。 （2）提取色素：研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，2～3mL 100%丙酮，研磨至糊状，再加 2～3mL 100%丙酮，过滤，即得色素提取液。 少量石英砂可以使研磨更加充分。研磨时，液泡破裂释放出呈酸性的细胞液，H ＋ 会取代 Mg 2＋ ，使叶 绿素成为褐色的去镁叶绿素。加入碳酸钙是为了调节 pH，以保护叶绿素。过滤获取色素滤液时，用脱脂 棉或单层尼龙布，而不用滤纸是因为色素分子较大，不容易透过滤纸；滤纸吸附能力强，会降低色素浓 度；叶绿体色素是脂溶性的，根据相似相溶原理，用脱脂棉可减少色素的流失。收集的叶绿体色素滤液 避光保存并及时使用，是为了防止光对叶绿素的破坏作用。 叶绿体色素提取和分离的操作过程及规范 2. 叶绿体色素的分离 （1）点样：取前端剪成梯形的滤纸条，用毛细管取叶绿素提取液，沿左下图虚线处划线，划完线后晾干， 再重复操作数次。 · 156 · （2）分离：在大试管中加入层析液（95%乙醇），然后将滤纸固定于胶 塞的小钩上，插入试管中，使尖端浸入溶剂内（绿野线要高于液面，滤纸 条边缘不可碰到试管壁），盖紧胶塞，直立于阴暗处层析。 3. 实验的结果：纸层析后在滤纸条上出现四条色素带，通过色素带的分布、宽窄程度、色素颜色可以 分析出色素的种类、含量和溶解度大小。具体结果如下： 色素种类 色素颜色 色素含量 溶解度 扩散速度 胡萝卜素 橙黄色 最少 最大 最大 叶黄素 黄色 较少 较大 较大 叶绿素 a 蓝绿色 最多 较小 较小 叶绿素 b 黄绿色 较多 最小 最小 4. 异常结果原因分析 （1）滤纸条上没有色素带的原因：提取液用的是极性溶剂；滤液细线没入层析液。 （2）色素带只有 2条的原因：材料是白化苗的叶（无叶绿素，只有两种类胡萝卜素）； 层析时间过 短（叶绿素未扩散）；滤液细线画得太粗（后 3条不易区分）。 （3）色素带只有 3条的原因：层析时间过短（叶绿素 a、b未分开）；层析时间过长（两条类胡萝卜 素带在滤纸条顶端合并）；滤液细线过粗，或滤液未干就重复划滤液细线（使叶绿素 a、b不能分开）。 （4）色素带不整齐的原因：滤液细线不齐；滤纸条没有作干燥处理；（使滤纸条上水分分布不均匀）滤 纸条贴及大试管壁；滤纸条的末端未剪去两角（使色素扩散起点不一致）；滤纸条没有一次性放平稳等。 （5）叶绿素带绿色很淡的原因：实验材料本身的绿色不浓；研磨不充分或未加入石英砂；提取液加 入太多，使滤液过稀；未分步加入提取液，使溶解的色素少；未用脱脂棉过滤，而是用滤纸过滤；没有 重复划滤液细线或没有待滤液干燥后就重复划。 （6）叶绿素带颜色异常的原因：滤液放置过久而被氧化；滤液置于光下较长时间；未加入 CaCO3或加 入的量过少（呈褐色的去镁叶绿素）。 五、注意的事项 过程 注意事项 操作目的 提取色素 ① 选颜色深绿色的叶片 保证含有较多的光合色素 ② 研磨时加入 2～3mL95%的乙醇 溶解叶片中的色素 ③ 研磨时加入少许的 SiO2 和 CaCO3 研磨充分和保护色素 ④ 迅速、充分研磨 防止溶剂挥发，并充分溶解色素 ⑤ 盛放滤液的小试管管口加棉塞 防止溶剂挥发和色素分子的氧化 分离色素 ⑥ 滤纸事先干燥处理 使层析液在滤纸条上的扩散速度快 ⑦ 滤液细线要直、细、齐 使分离的色素带平整、不重叠 ⑧ 画滤液细线要重复 2～3次 增加色素的含量，使实验现象明显 ⑨ 滤液细线不能接触到层析液 防止色素直接溶解到试管内的层析液中 层析液 培养皿盖 插入滤纸 胡萝卜素（橙黄色） 叶黄素（黄色） 叶绿素 a（蓝绿色） 叶绿素 b（黄绿色） 1.5cm 18cm 0.5cm 画滤液线处 2cm · 157 · 六、本实验可用其他的目的 1. 色素其他研究：了解叶绿体色素的种类、色素带的数目；大致的含量比例；色素带的宽窄；有关 物理性质；肉眼不能直接看到吸收光谱，颜色，溶解特性（色素带的位置反映其在层析液中的溶解度）。 2. 粗略比较不同材料的叶绿素含量：若一次实验，选用不同材料，如：不同植物的叶片，同一植物不 同发育阶段的叶片，不同季节的叶片等，提取并分离色素。如要准确测定叶绿素的绝对含量，则还需特定 仪器。 例 1 提取光合色素，进行纸层析分离，下列对该实验中各种现象的解释中，正确的是（ ）。 A．未见色素带，说明材料可能为黄化叶片 B．色素始终在滤纸上，是因为色素不溶于层析液 C．提取液呈绿色是由于含有叶绿素 a和叶绿素 b D．胡萝卜素处于滤纸最前方，是因为其在提取液中的溶解度最高 例 2 在进行“叶绿体中色素的提取和分离”的实验时，不能让层析液没及滤液细线的原因是（ ）。 A. 滤纸条上几种色素会扩散不均匀而影响结果 B. 滤纸条上滤液细线会变粗而使色素太分散 C. 色素会溶解在层析液中而使结果不明显 D. 滤纸条上的几种色素会混合起来 例 3 在“绿叶中色素的提取与分离”实验中得到的色素颜色较淡，分析其原因可能是（ ）。 ①加入的丙酮太多 ②用无水乙醇代替丙酮 ③层析液没及滤液细线 ④研磨时没有加入 CaCO3 ⑤研磨时没有加入 SiO2 ⑥取的叶片的叶脉过多，叶肉细胞过少 A．①③ B．②④⑤ C．①③④⑤⑥ D．③④⑤⑥ 例 4 下列关于叶绿体中色素的提取和分离实验的操作中，正确的是（ ）。 A．使用定性滤纸过滤研磨液 B．将干燥处理过的定性滤纸条用于层析 C．在划出一条滤液细线后紧接着重复划线 2～3次 D．研磨叶片时，用体积分数为 70%的乙醇溶解色素 例 5 下列关于“光合色素的提取与分离”的实验描述中，不属于实验要求的是（ ）。 A. 提取高等植物叶绿体中的色素 B. 用纸层析法分离色素 C. 了解各种色素的吸收光谱 D. 验证叶绿体中所含色素的种类 例 6 在“光合色素的提取与分离”实验中，要使色素带清晰且整齐，应采取的措施是（ ）。 ①定性滤纸要干燥 ②剪去滤纸条一端的两个角 ③滤液细线画得细而直 ④重复画线 ⑤棉塞塞紧试管口 A. ①②③④ B. ②③④⑤ C. ①③④⑤ D. ①②④⑤ 例 7 用纸层析法分离叶绿体中的色素实验中，四种色素的扩散速度中最快和最慢的分别是（ ）。 A. 叶绿素 a；胡萝卜素 B. 叶绿素 b；胡萝卜素 C. 胡萝卜素；叶绿素 a D. 胡萝卜素；叶绿素 b · 158 · 例 8 某同学提取得到叶绿体色素溶液后，取一圆形滤纸，在滤纸中央滴一滴色素提取液，再滴一滴层 析液，色素随层析液扩散得到右图结果，则 1、2、3、4四条色带依次表 示（ ）。 A. 胡萝卜素、叶黄素、叶绿素 a、叶绿素 b B. 叶黄素、胡萝卜素、叶绿素 a、叶绿素 b C. 叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素、叶黄素 D. 叶绿素 b、叶绿素 a、胡萝卜素、叶黄素 例 9 叶绿体色素分离的结果如右图所示，关于该实验的下列叙述中正确的是（多选）（ ）。 A. 实验中不加 CaCO3，色素丙易被破坏 B. 色素带过粗，叶绿素 a、b的色素线容易重叠 C. 丁呈黄色，甲呈橙黄色 D. 使用 50%酒精做提取液，甲的提取量会增加 E．甲为叶绿素 a，乙为叶绿素 b，丙和丁主要吸收红光 F．色素带浸入层析液中而分离为甲、乙、丙、丁四种色素 G．深秋落叶中色素含量（甲＋乙）＜（丙＋丁） 例 10 某班学生以新鲜菠菜叶为材料进行叶绿体中色素的提取和分离的实验时，由于各组操作不同， 出现了如图所示的四种不同的层析结果。对此的下列分析中最不合理的是（ ）。 A．甲可能误用蒸馏水做提取液和层析液 B．乙可能是因为研磨时未加入 SiO2 C．丙是正确操作得到的理想结果 D．丁可能是因为研磨时未加入 CaCO3 例 11 分别在①、②、③三个研钵中加 2克剪碎的新鲜菠菜绿叶，并按下表添加试剂。经研磨、过滤 得到三种不同颜色的溶液，即：深绿色、黄绿色（或褐色）、几乎无色。（注：“＋”表示加；“－”表示 不加。）①②③处理得到的溶液的颜色依次是（ ）。 A．深绿色、黄绿色（或褐色）、几乎无色 B．黄绿色（或褐色）、深绿色、几乎无色 C．几乎无色、深绿色、黄绿色（或褐色） D．黄绿色（或褐色）、几乎无色、深绿色 处理 ① ② ③ SiO2（少量） ＋ ＋ ＋ CaCO3（少量） － ＋ ＋ 95%乙醇（10毫升） ＋ － ＋ 蒸馏水（10毫升） － ＋ － 色素相对含量 色素相对含量 色素相对含量 色素相对含量 点样处 点样处 点样处 点样处 甲 乙 丙 丁 扩散距离 甲 乙 丁 丙 色 素 含 量 · 159 · 例 12 某学生做“光合色素的提取与分离”活动，有以下步骤： ①将 5g新鲜菠菜叶片放在研钵中，加入少许 SiO2 和 CaCO3，再加入 2mL蒸馏水，进行迅速充分研磨 ②在预备好的滤纸条上，距一端 1cm处用铅笔画一条横线 ③用毛细吸管吸取少量滤液，沿横线处中心均匀地画出一条滤液细线，紧接着重复三到四次 ④将层析液倒入试管中，然后，将滤纸条画有滤液细线的一端朝下，轻轻插入到层析液中，注意， 一定要让层析液没及滤液细线 这位同学在操作过程中所犯的错误有（ ）。 A．1处 B．2处 C．3处 D．4处 例 13 下图表示绿叶中色素的提取和分离实验的部分材料和用具，下列有关叙述中错误的是（ ）。 A．图①加入研钵内的物质有无水乙醇、SiO2、CaCO3 B．将糨糊状研磨液倒入②中，漏斗基部应放一块单层尼龙布 C．③画滤液细线的要求是细、齐、直 D．④层析结果色素带最宽的是叶绿素 b，扩散最快的是叶黄素 例 14 两位学生的叶绿体色素提取和分离实验的结果如下图，则关于这两种结果的下列分析中正确的 是（ ）。 A. 甲学生可能绿叶研磨不够充分 B. 甲学生选用的材料可能叶片较薄 C. 乙学生将滤纸色素线部分浸在层析液中 D. 乙学生研磨时加入的酒精浓度过高 例 15 为研究强光照对移栽幼苗光合色素的影响，某同学用乙醇提取叶绿体色素，用石油醚进行纸层 析，右图为滤纸层析结果(Ⅰ～Ⅳ为色素条带)。下列叙述中正确的是（ ）。 A. 强光照导致了该植物叶绿素含量升高 B. 画滤液线时，滤液在点样线上只能画一次 C. 色素 I、Ⅳ吸收光谱的吸收峰波长无差异 D. 与正常光源相比较，强光照下类胡萝卜素含量升高 E．四种色素在层析液中溶解度大小是 I＜Ⅱ＜Ⅲ＜Ⅳ F．色素分离过程中如果滤液线触及石油醚，会缩短得到四条色素带的时间 甲学生 乙学生 色素量 色素量 色素线原点 色素离原点距离 色素线原点 色素离原点距离 I II II IV 点样线 强光源 正常光源