专题12 基因工程与胚胎工程（10年汇编）（全国通用）2017-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 专题11基因工程与胚胎工程高考真题汇编，覆盖2017-2026年考情，以科研情境和实验综合题为核心，突出技术应用与跨知识点整合。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |单选/不定项|约100题|基因工程（PCR、限制酶、载体构建等）、胚胎工程（体外受精、胚胎移植等）|基因工程以蛋白酶改造、CRISPR编辑为情境；胚胎工程结合濒危动物保护案例，注重实验操作与结果分析| |填空大题|约20题|基因表达载体构建、胚胎发育机制等|多维度设问，如“设计引物组合验证重组质粒”“分析激素对卵母细胞成熟的影响”，关联真题命题趋势|

专题11 基因工程与胚胎工程 考点分类 十年考情（2017-2026） 命题规律 考点01 基因工程 2026·广东 2022·甘肃 2026·河北 2021·上海 2025·重庆 2021·全国甲卷 2025·北京 2020·河北 2024·江苏 2020·安徽 2024·山东 2019·北京 2023·全国甲卷 2019·浙江 2022·湖南 2018·上海 2022·湖北 2017·上海 · 情境：以最新遗传科研内容为情境创设题干； · 考点：以PCR技术、基因工程步骤、DNA鉴定技术为必考核心，深挖易错概念； · 题型：单选 + 多选 + 填空大题组合，依托科研实验综合设问； · 综合：常结合常见细胞工程、遗传等知识点混搭出题。 考点02 胚胎工程 2026·山东 2022·安徽 2026·湖北 2021·海南 2025·山东 2021·湖南 2025·四川 2020·上海 2024·湖北 2020·江西 2024·贵州 2019·北京 2023·云南 2019·重庆 2023·广东 2017·浙江 2022·江苏 2017·上海 · 情境：以胚胎工程、人类疾病为素材； · 考点：体外受精、胚胎移植、胚胎发育等知识是考查主体； · 题型：单选 + 多选 + 填空大题组合，依托科研实验综合设问； · 综合：联动遗传等内容。 考点01 基因工程 1．（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 2．（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 3．（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（     ） A．来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B．不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C．外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D．调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 4．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 5．（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 6．（2025·全国卷·高考真题）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 7．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 8．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ）      A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 9.（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 10．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 11．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（    ） A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 12．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 13．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 14．（2024·黑龙江·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 15．（2023·福建·高考真题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验I中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验I中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 16．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 17．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 18．（2023·湖南·高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的 B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害 C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力 D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径 19．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 20．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 21．（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 22．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                    下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 23．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 24．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 25．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（    ） A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列 B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异 26．（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（    ） A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 27．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 28．（2021·山东·高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（    ） A．“引子”的彻底水解产物有两种 B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列 D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别 29．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 30．（2020·海南·高考真题）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料 B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐 C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解 D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色 31．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 32．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（    ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 33．（2019·江苏·高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是 A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 34．（2019·江苏·高考真题）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是 A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 35．（2026·江西·高考真题）不定项选择题 研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A．需在72℃条件下培养基因工程菌 B．添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C．可根据电泳结果初步评价T的纯度 D．可根据PCR产物的多少计算T的活性 36．（2025·河北·高考真题）不定项选择题 X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 37．（2025·江苏·高考真题）不定项选择题 图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 38．（2024·湖南·高考真题）不定项选择题 最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 39．（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： (1)科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 (2)将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。                    W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C (3)科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 40．（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是_______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是___________________________________________________________________________________。 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。 41．（2026·黑吉辽蒙卷·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 42．（2026·河南·高考真题）4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是________。 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________（答出一点即可）。 43．（2026·陕晋青宁卷·高考真题）研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的___________性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是___________(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于___________型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的___________酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是___________。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是___________或___________两种组合，原因是___________。 (4)为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是___________。可利用___________法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，___________(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 44．（2026·云南·高考真题）UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和________三步。 (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是________（答出2点）。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 (3)我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是________。 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加_________，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是________；在第二次筛选培养基中添加________。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是________（填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并________。 45．（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： (1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的______拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是______。 (2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的______（填下图字母）处。理由是______。 (3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为______。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的______中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是______。 46．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。    注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是________。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生_________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是________。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带________（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致________，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是________。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有________（答出1点即可）。 47．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。 48．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。    限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。    49．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： (1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是_________。 (2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内_________（填细胞结构名称）的改变。 (3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： _________。 (4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入_________序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 (5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是：_________。 (6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是：_______。 50．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 51．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-________-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 52．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 53．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路________。 54．（2025·北京朝阳·一模）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作，耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于__________性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是__________。该PCR体系从第__________个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为__________，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。__________ (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。____________。 55．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物______（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是______；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是______。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行______。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是______（至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是______。 56．（2021·上海·高考真题）酶的改造：利用DszC酶可以获得低硫石油，减少酸雨，以红球菌获得的天然DszC酶活性会受到产物的抑制。为此改造DszC酶如下： Ⅰ：将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒（图1）连接。 Ⅱ：将连接好的DNA分子导入受体细胞，接入含抗生素的培养基，筛选成功导入目的基因的受体细胞。 Ⅲ：培养受体细胞，并测DszC酶活性与其产物浓度关系（图2）。    (1)在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是______（填写编号）；Ⅱ筛选到的受体细胞会有基因______（填写编号）。 ①天然DszC酶基因    ②DszC突变基因    ③绿色荧光蛋白基因    ④抗性基因 (2)Ⅰ～Ⅲ中DszC基因表达的阶段是______。 (3)已知DszC基因长度为1254个碱基对，结合图2信息，通过比较不同酶的活性及产物抑制程度，分析DszCγ酶基因的长度，更可能是1257个碱基对还是303个碱基对？写出分析过程_________。 57．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要__________________。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________（A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有________功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与____________________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 58．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    59．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于_____微生物，在无氧条件下能进行_____发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是_____。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有_____和_____。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是___，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为_____。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路_____。 60．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是____________。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是____________。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有______________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________。 61．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测___________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是___________。检测NV酶活性时，需测定的指标是___________（答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与___________（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度___________（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是___________。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入___________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是___________。 62．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称_____（略）。 63．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可） 64．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 65．（2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 66．（2024·黑龙江·高考真题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 67．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。 68．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY基因的转基因菊花。重组Ti质粒的部分信息及实验流程如图1所示。启动子均为真核细胞启动子。 一、将重组Ti质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY转基因菊花。 (1)根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选____，步骤①培养过程一般____（填“需要”或“不需要”）光照，流程图中的Ⅰ是____。 (2)通过调整过程②和③中____的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY转基因菊花。 (3)以____为模板、选用与LFY基因特异性结合的引物，利用PCR技术鉴定菊花细胞是否存在LFY基因。再选用____技术检测转基因菊花的LFY蛋白的表达水平，进一步筛选LFY转基因菊花。 二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA的Ti质粒（如图2）培养转基因植物。 (4)已知Ti质粒携带双T-DNA时，每个T-DNA都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA上。请设计培育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY转基因菊花____。（写出实验思路即可） 69．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： (1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的___差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 (2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、___和___等。本研究中目的基因为___。 (3)PCR扩增时引物通过___原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的___组，样品2有特异性扩增产物，结果表明___。    (4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显___。同时，还需测定___以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。    (5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，___，最终促进胞内脂质合成。 (6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为___。（答出两点即可） 70．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于_____工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶     ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶     ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。    (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。    (5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 71．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 72．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。    回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于_____；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和_____，该过程还需要光照，其作用是_____。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的_____。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注_____。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是_____，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是_____，依据是_____。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是_____（答出2点即可）。 73．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 74．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。 75．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 76．（2023·全国乙卷·高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。    (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 77．（2023·全国甲卷·高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_____。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_____。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____。 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取_____进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_____。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_____ 78．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。 (1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和________，并在引物的________（5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。 (2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含___________（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。 (3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有__________的平板进行初步筛选。 (4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。 A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感 C．卡那霉素和链霉素都敏感 D．卡那霉素和链霉素都不敏感 (5)可采用__________技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。 79．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________________。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物_____________； ②PCR目的产物约为_____________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。 80．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是_______，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：____。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因：______ A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是_______。 81．（2022·海南·高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。 (5)该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。 82．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 83．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是______________________________。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。 84．（2022·全国乙卷·高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。 (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 (2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。 (3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。 (4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______。 85．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______ A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在______。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______。 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明______，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 86．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 回答下列问题。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。 (3)过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。 87．（2021·福建·高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。 (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。 88．（2021·辽宁·高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G PvitⅡ CAG↓CTG GTC↑GAC PstI CTGCA↓G G↑ACGTC KpnI GGTAC↓C C↑CATGG BamHI G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点 (3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中 (5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。 89．（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： (1)CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的________（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是________________________________________。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是__________。 (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A．24 h检测细胞内 B．24 h检测细胞外 C．0 h和24 h检测细胞内 D．0 h和24 h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射_____________；该实验结论是___________________________________________________________________________________________________。 90．（2026·广东·高考真题）疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因（MM-CP）按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： (1)构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于______________。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的____________与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 (2)研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为_____________。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是________________________________________________________________________。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。___________________________________________________________________________________________。 (3)基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊（如图）。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后______________________________________，使更多配子携带MM-CP。 (4)若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。_______________________________________________。 91．（2025·海南·高考真题）绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关，毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术，探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z，如图。质粒乙有4种限制酶的酶切位点，识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中，构建重组质粒乙用于研究，须用的限制酶是_____和_____。 限制酶 识别序列(5＇-3＇) EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞，可用_____（填“固体”或“液体”）培养基培养。在进行传代培养时，需使用胰蛋白酶并置于37℃环境中处理，理由是_____。 (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X，导入后测定不同时间的细胞数量，结果如图。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有_____作用，且随导入时间推移，增殖速率_____。 (4)siRNA是一种短的双链RNA，能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA，将其导入细胞X作为实验组，同时设置对照组，将_____导入细胞X。一段时间后，发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的_____对细胞X增殖的影响。 ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用，简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是：_____。 92．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： (1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素_____的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是_____色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 (2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子_____对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子_____用于该系统。 (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌_____（填选项）。 A．含质粒1和质粒2   B．只含质粒1   C．只含质粒2    D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：_____。 93．（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： (1)构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 (4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 94．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题： (1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是________，而PCR过程中解开双链的方法是________。 (2)PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有________。 (3)该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：________；②无扩增产物，原因是________；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是________。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 (4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果________。 95．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 96．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 97．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是_____。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_____，理由是___。 98．（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。 （3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。 （4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。 99．（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。 （2）操作③中使用的酶是_________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。 （3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。 （4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 100．（2021·广东·高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。 回答下列问题： （1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可） （2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可） （3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。 （4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 101．（2021·全国乙卷·高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： （1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段最好用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段最好用T4DNA连接酶连接。 （2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。 （3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。 （4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。 102．（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为____________________。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用__________。（举一例） 103．（2020·江苏·高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）： 请据图回答问题： （1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。 （2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。 （3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列） 已知序列 PCR引物 ①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′ （4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。 A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′ B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′ C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′ D． 5′- TTGATACGC----------CGAGTAC-3′ 104．（2020·山东·高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 （1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。 （2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。 （3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。 （4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。 105．（2019·海南·高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。 （1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。 （2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。 （3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。 106．（2019·江苏·高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题： （1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。 （2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。 （3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。    （4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。 107．（2019·全国I卷·高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。 （1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。 （2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。 （3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。 108．（2019·天津·高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。 据图回答： （1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。 A．含B基因的染色体缺失         B．DNA聚合酶失活 C．B基因发生基因突变            D．B基因的启动子无法启动转录 （2）从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。 （3）在过程①、②转化筛选时，过程______________中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________________在培养基中应加入卡那霉素。 （4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________。 A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交 B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交 C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交 D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光 （5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明_________________。 109．（2018·上海·高考真题）以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。 (1)获得目的基因的方法通常包括____和___。 (2)切割和连接DNA分子所使用的酶分别是_________。 (3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或_____，后者的形状呈_____。 (4)由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率________，所以在转化后通常需要进行___操作。 (5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和__序列上是相同的。 考点02 胚胎工程 1．（2026·贵州·高考真题）利用胚胎干细胞法构建转基因动物的流程如图。下列叙述错误的是（     ） A．甲可以通过将获能的精子和成熟的卵子共培养获得 B．可从嵌合体动物发绿色荧光的皮肤组织中分离胚胎干细胞 C．进行①过程后乙须在代孕动物体内正常孵化才能继续发育 D．可从嵌合体动物的后代中筛选出所需转基因动物个体 2．（2026·黑吉辽蒙卷·高考真题）为模拟胚胎发育过程中子宫的力学环境，科学家设计了水凝胶材料，小鼠囊胚在其内部生长，如下图。下列叙述正确的是（　　） A．囊胚置于水凝胶之前，已经历了桑葚胚阶段 B．胚胎培养时，物质分子由培养基至胚胎单向转移 C．水凝胶基质硬度越大，越有利于胚胎生长 D．囊胚孵化后，与水凝胶接触的部位由滋养层变为透明带 3．（2025·重庆·高考真题）为保护濒危哺乳动物甲，科研工作者将甲的近亲物种乙（种群数量多）进行了如图所示的研究，下列叙述正确的是（    ） A．克隆动物的核基因组来源于甲、乙 B．体外受精需用获能的精子与MI期的卵母细胞受精 C．囊胚①的内细胞团可发育为胎盘、个体 D．滋养层可影响内细胞团的发育 4．（2025·云南·高考真题）孕酮具有促进子宫内膜增生，为受精卵着床做准备的作用。某奶牛场发现一头高产奶量母牛生产两胎后重复配种均未成功妊娠，该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛。为获得该母牛的后代，下列说法正确的是（　　） A．运用体外受精或人工授精技术可提高该牛的妊娠率 B．使用外源促性腺激素处理该牛获得更多卵子进而可获得多枚胚胎 C．体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率 D．使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植可获得可育后代 5．（2025·江苏·高考真题）梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好，但自然杂交很难完成，人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用，可提高繁殖率，增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是（    ） A．采集的精液无需固定、稀释，即可用血细胞计数板检测精子密度 B．人工授精时，采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道 C．超数排卵处理时，常用含促性腺激素的促排卵剂 D．母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础 6．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作，获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。下列叙述错误的是（    ） A．为获取足够的卵子，需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理 B．为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致，需进行同期发情处理 C．受精卵发育至桑葚胚阶段，细胞数量和胚胎总体积均增加 D．对照组绵羊的选择需考虑年龄、性别等无关变量的影响 7．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是（    ） A．体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚 B．移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态 C．胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化 D．为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植 8．（2024·北京·高考真题）我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构（类囊胚），为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系（如图）。相关叙述错误的是（    ） A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能 B．实验过程中使用的培养基含有糖类 C．类囊胚的获得利用了核移植技术 D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育 9．（2024·甘肃·高考真题）甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 10．（2024·湖北·高考真题）波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是（    ） A．选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理 B．胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测 C．普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体 D．生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选 11．（2024·湖北·高考真题）研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如下表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是（    ） 甲的浓度（μg/mL） 卵母细胞（个） 第一极体排出（个） 成熟率（%） 卵裂数（个） 卵裂率（％） 0 106 70 66.0 28 40.0 1 120 79 65.8 46 58.2 10 113 53 46.9 15 28.3 100 112 48 42.8 5 10.4 A．实验结果说明甲抑制卵裂过程 B．甲浓度过高抑制第一极体的排出 C．添加1μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力 D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准 12．（2023·广东·高考真题）科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是（    ） A．超数排卵 B．精子获能处理 C．细胞核移植 D．胚胎培养 13．（2023·浙江·高考真题）在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术。下列叙述错误的是（    ） A．经获能处理的精子才能用于体外受精 B．受精卵经体外培养可获得早期胚胎 C．胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率 D．胚胎移植前需对受体进行选择和处理 14．（2022·江苏·高考真题）下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述正确的是（    ） A．通常采用培养法或化学诱导法使精子获得能量后进行体外受精 B．哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质 C．克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程 D．将小鼠桑葚胚分割成2等份获得同卵双胎的过程属于有性生殖 15．（2022·北京·高考真题）将黑色小鼠囊胚的内细胞团部分细胞注射到白色小鼠囊胚腔中，接受注射的囊胚发育为黑白相间的小鼠（Mc）。据此分析，下列叙述错误的是（　　） A．获得Mc的生物技术属于核移植 B．Mc表皮中有两种基因型的细胞 C．注射入的细胞会分化成Mc的多种组织 D．将接受注射的囊胚均分为二，可发育成两只幼鼠 16．（2021·浙江·高考真题）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（　　） A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液 B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达 EGFP的小鼠 C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠 D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎 17．（2020·山东·高考真题）经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是（    ） A．用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子 B．体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理 C．胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植 D．遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得 18．（2020·浙江·高考真题）下列关于利用胚胎工程培育优质奶牛的叙述，正确的是 A．从雄性奶牛中采集到的成熟精子遇到卵子即可进入卵子内 B．在体外完成受精后的受精卵，将其植入子宫即可完成着床 C．随着卵裂的进行，卵裂球细胞的体积变小，卵裂球的体积和有机物总量显著增加 D．在含有经辐射处理的胚胎成纤维细胞的培养体系中，胚胎干细胞不易发生分化 19．（2025·浙江·高考真题）某同学欲开展小鼠的排卵、受精以及观察受精卵发育的实验，其基本过程如下。 (1)制备垂体细胞提取液：取小鼠的垂体，加入少量的培养液，剪碎，___________，经处理制成垂体细胞悬液。取垂体细胞悬液，___________，制成某一浓度的垂体细胞悬液。将垂体细胞培养一段时间后，破碎，___________，取上清液，经处理获得提取液。 (2)采集精子：将人工采集的精子置于培养液中，培养一段时间。此过程可使精子获得___________。 (3)采集卵细胞：给成年雌鼠注射垂体细胞提取液，一段时间后，采集卵子。注射垂体细胞提取液可促进雌鼠排卵的原因是 ___________。 (4)受精：将精子和卵细胞混合培养。精子入卵后，会使卵子完成减数第二次分裂，排出________，形成雌原核。 (5)观察受精卵的发育：受精卵开始卵裂，其中的细胞体积___________，细胞数量增加，但胚胎的总体积变化 ___________。结果表明这一阶段胚胎细胞的细胞周期中，显著缩短的时期是___________。 20．（2022·全国甲卷·高考真题）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题， (1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是____________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是____________；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是___________（答出1点即可）。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到___________时才具备与精子受精的能力。 (2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有___________（答出3点即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。 (3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是___________。 21．（2020·全国III卷·高考真题）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。 （1）步骤①中需要使用的工具酶有________________。步骤②和③所代表的操作分别是________________和________________。步骤④称为________________。 （2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。 （3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。 （4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有_____________（答出2点即可）。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题12 基因工程与胚胎工程 答案版 考点01 基因工程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B D B C D A C A D B 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A A C B B B D B D 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 C B B D D C C A A B 31 32 33 34 35 36 37 D D A AB AB BD AC 38.【答案】(1)Bcl I和Xba I (2) 3+6 2500 (3) X 4 3和9 39.【答案】(1) 启动子 复制原点 (2)Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ (3) DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 (4)抗原-抗体杂交 40.【答案】(1) 人工合成法（化学合成法） T4 未插入目的基因的pPK2空质粒 A D 染色体DNA B (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 (3)安全性 41.【答案】(1) 复制原点 终止子 终止目的基因的转录 (2) XhoⅠ NcoⅠ (3) b 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 42.【答案】(1) 简并性 ③ (2) 诱导 RNA聚合 引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育 (3) EcoR I和Kpn I EcoR I和SaI I 从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变） (4) 增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触 农杆菌转化法 抑制 43.【答案】(1)延伸 (2)防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 (4) 庆大霉素 pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长 蔗糖 ② 电泳检测 44.【答案】(1) DNA序列 COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 (2) B B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录 (3) 外植体 染色体DNA 生长素和细胞分裂素 45.【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制 (2) 2 验证重组质粒是否构建成功 (3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻 (4) 目的基因发生突变 发酵条件优化 46.【答案】(1)mKate2蛋白或荧光 (2) 细菌计数板计数法 作为mKate2蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中 47.【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2) BamHI SmaI和EcoRV切割后均产生平末端，Spe1和Xba1切割后产生的粘性末端相同，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别 (3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 48.【答案】(1)电子显微镜 (2)细胞骨架 (3)防止细胞凋亡，有利于病毒的繁殖 (4)大肠杆菌复制原点 DNA (5)哺乳动物细胞的 RNA 聚合酶无法识别该病毒基因的启动子 (6)溶解该病毒的包膜，使病毒无法与宿主细胞膜上的受体结合 49.【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 50.【答案】(1) 4种脱氧核苷酸 延伸 (2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ (3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化 51.【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 52.【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌 (2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3) 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测 53.【答案】(1)隐性 (2) G、A 3 雄性不育株PCR产物发绿色荧光.育性正常株1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光 (3)甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 (4)应先引入甲。与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 54.【答案】(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 55.【答案】(1) ③④ ②④ (2)Ⅱ、Ⅲ (3)1257个碱基对。分析过程：据图2可知，在产物浓度为0时，DszCγ酶、其他改造酶和天然酶的活性虽然有所差异但是相差不大，说明突变改造后的DszCγ酶与底物结合以及在发挥催化活性的关键结构上没有发生改变，推测控制该酶的基因结构本身没有发生明显的改变；随着产物浓度的逐渐增加，天然酶和改造后的酶活性均受到产物抑制，但是与其他DszC酶活性相比，DszCγ酶仍然保持了较高的活性，说明该酶基因突变后极大地缓解了产物对DszCγ酶的抑制作用。根据DszCγ酶初始活力和该突变有效地解除了产物对DszCγ酶的抑制作用可知，其突变并不会显著改变酶本身的分子结构，如缩短酶分子的氨基酸数量，故DszCγ酶基因的长度更可能是1257个碱基对，而非是303个碱基对。 56.【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 (2)C (3) 预冷的体积分数为95%的酒精 D 调控 (4) 基因数据库/序列数据库 表达载体 57.【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 58.【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精 (2)新鲜水果表皮附着酵母菌 (3) 平板划线法 稀释涂布平板法 (4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D (5)从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 59.【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 60.【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 61.【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 62.【答案】(1) 胚乳特异表达基因的 终止转录 HindIII EcoRI (2) 农杆菌转化 r2HN是否转录 抗原抗体杂交 (3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4) 体液 细胞 (5)生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”） 63.【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 64.【答案】(1) 变性 氢键 (2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 (3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸 65.【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2) PCR技术扩增 人工合成 (3) RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因转录效率 (4)HygBR (5) F3 R2 (6)D 66.【答案】(1) 磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子 (2)A-T、U-A (3) 菌株B2的基因组DNA 无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染 67.【答案】(1) 转入LFY基因的菊花细胞 不需要 愈伤组织 (2)生长素和细胞分裂素 (3) 菊花染色体DNA 抗原-抗体杂交 (4)将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达FLY的转基因菊花 68.【答案】(1)溶解度 (2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME基因”） (3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） (4) 增加 细胞数量 (5)有氧呼吸生成的ATP增多 (6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 69.【答案】(1)蛋白质 (2)③ (3)② (4)标记基因 (5) 筛选导入目因的大肠杆菌 5.7 (6)逆转录 70.【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 71.【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2) 遗传特性 转基因标识 (3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 (5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 72.【答案】(1)外 (2)P1和P6 (3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） (4)4 73.【答案】(1)A/腺嘌呤 (2) N（Q） P(R） (3) Ce和Er基因融合 饲喂T (4)带标记的细胞大部分是单标记 74.【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 75.【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性 (4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达 76.【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖 (2) 筛选 RNA聚合酶 (3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段 (4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质 77.【答案】(1) 1 4 5＇ (2)XhoⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR 78.【答案】(1) 脂质和蛋白质 与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） (2) 溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' (3) a、b 1100 Q4 蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部 (4) 逆转录 32 79.【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 80.【答案】(1) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清 (2) PCR技术、人工合成法 终止子 RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质 (3)基因的选择性表达 (4)诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术 (5)基因工程、动物细胞培养 81.【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 82.【答案】(1) 氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA半保留复制 (3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间 83.【答案】(1)逆转录酶/反转录酶 (2) 特异性核苷酸序列 退火/复性 (3) 曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白） 84.【答案】(1) mRNA 蛋白M上不含tag标签 BC (2) 黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处或基因m的内部 (3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码） 85.【答案】(1)DNA连接酶 (2)感受态细胞法/Ca2+处理法 (3) 碱基互补配对 目标（目的）DNA（基因） (4) DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功 (5)表达Cas9蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA识别并结合目标DNA序列；引导Cas9蛋白切割目标DNA序列 86.【答案】(1)引物1和引物4 (2) EcoRV T4DNA 启动子 终止子 XhoI和PstI 钙 (3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 87.【答案】(1)逆转录 (2) EcoRI PvitⅡ T4DNA连接酶 (3)感受态 (4)3 (5)G2/M 88.【答案】(1) 抗体 使其在星形胶质细胞中特异性表达 KpnⅠ和BamHⅠ (2)C (3) 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 89.【答案】(1) 基因重组 反密码子 (2) 诱导型启动子 使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代 从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响）出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽 (3)以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复 (4)基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险 90.【答案】(1) EcoR Ⅰ Xho Ⅰ (2) 液体 使贴壁细胞分散为单个细胞，37℃是胰蛋白酶的最适温度 (3) 促进 增加 (4) 无靶向的siRNA 表达减少 a、提取实验组和对照组的mRNA，使用PCR技术进行扩增，对比检测Z基因的mRNA的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用； b、提取实验组和对照组的蛋白质，使用抗原-抗体杂交技术，对比检测Z基因表达蛋白质的含量，若实验组含量减少，则说明siRNA起作用） 91.【答案】(1) 卡那霉素和四环素 白 (2) C A (3) B 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌 92.【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4) 减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 93.【答案】(1) 解旋酶 高温变性 (2)引物、脱氧核苷三磷酸 (3) 作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 (4)提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性 94.【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 95.【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 (3) 划线分离 振荡培养 (4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 96.【答案】 SalI EcoRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 97.【答案】 基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 98.【答案】 ④②③① Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 病原菌的两条单链DNA 一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 99.【答案】 基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体杂交技术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列 100.【答案】 EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV 磷酸二酯键 自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 101.【答案】 多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌B菌 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 102.【答案】 限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B 103.【答案】 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 104.【答案】 mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基 105.【答案】 平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接 106.【答案】 基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 107.【答案】 D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚 108.【答案】 化学合成(人工合成) 从含目的基因的生物细胞分离 限制性核酸内切酶(限制酶)  DNA连接酶(连接酶) 质粒 小型环状(双链环状、环状) 低 筛选 氨基酸 考点02胚胎工程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B A D B C C C C B D 11 12 13 14 15 16 17 18 A C C C A B C D 19.【答案】(1) 用胰蛋白酶消化 用血细胞计数板在显微镜下计数，用培养液稀释 离心 (2)受精能力 (3)提取液中含有促性腺激素 (4)第二极体 (5) 变小 不明显 间期 20.【答案】(1) 冷冻保存 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力 肝素或钙离子载体A23187 MⅡ期 (2)维生素、氨基酸、核苷酸 (3)对受体母羊进行发情处理，合适的时间，将保存的囊胚移植入受体母羊的子宫 21.【答案】 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 性别、年龄 相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 体外受精、胚胎移植 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题11 基因工程与胚胎工程 考点分类 十年考情（2017-2026） 命题规律 考点01 基因工程 2026·广东 2022·甘肃 2026·河北 2021·上海 2025·重庆 2021·全国甲卷 2025·北京 2020·河北 2024·江苏 2020·安徽 2024·山东 2019·北京 2023·全国甲卷 2019·浙江 2022·湖南 2018·上海 2022·湖北 2017·上海 · 情境：以最新遗传科研内容为情境创设题干； · 考点：以PCR技术、基因工程步骤、DNA鉴定技术为必考核心，深挖易错概念； · 题型：单选 + 多选 + 填空大题组合，依托科研实验综合设问； · 综合：常结合常见细胞工程、遗传等知识点混搭出题。 考点02 胚胎工程 2026·山东 2022·安徽 2026·湖北 2021·海南 2025·山东 2021·湖南 2025·四川 2020·上海 2024·湖北 2020·江西 2024·贵州 2019·北京 2023·云南 2019·重庆 2023·广东 2017·浙江 2022·江苏 2017·上海 · 情境：以胚胎工程、人类疾病为素材； · 考点：体外受精、胚胎移植、胚胎发育等知识是考查主体； · 题型：单选 + 多选 + 填空大题组合，依托科研实验综合设问； · 综合：联动遗传等内容。 考点01 基因工程 1．（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 【答案】B 【详解】A、XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误； B、F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确； C、F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误； D、PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 2．（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 【答案】D 【详解】A、酶的活性依赖其特定的空间结构，第n位甲硫氨酸氧化会改变蛋白酶E的局部结构，进而改变E的空间结构，导致酶活性下降，A正确； B、蛋白质的氨基酸序列由编码它的基因的碱基序列决定，替换特定位置的氨基酸可通过蛋白质工程（即第二代基因工程）改造对应基因的碱基序列，再经表达获得改造后的蛋白酶，B正确； C、本次改造的目的是提高E对S的耐受性，因此判断改造效果的指标是经S处理后酶的活性保留情况，需用S处理一段时间后测定酶活性进行对比，C正确； D、酶的专一性由酶活性位点的结构决定，替换甲硫氨酸提高了E对S的耐受性，没有信息表明该替换改变了酶的活性位点结构，无法得出E的专一性降低的结论，D错误。 3．（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（     ） A．来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B．不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C．外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D．调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 【答案】B 【详解】A、所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确； B、重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误； C、外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 4．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 【答案】C 【详解】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 5．（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（    ） A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 【答案】D 【分析】限制酶酶切其基本原理是利用限制酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确； B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确； C、电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确； D、甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。 故选D。 6．（2025·全国卷·高考真题）蛋白质是结构和功能多样的生物大分子。下列叙述错误的是（    ） A．二硫键的断裂不会改变蛋白质的空间结构 B．改变蛋白质的空间结构可能会影响其功能 C．用乙醇等有机溶剂处理可使蛋白质发生变性 D．利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质 【答案】A 【分析】蛋白质的空间结构易受外界条件影响，空间结构破坏可导致蛋白质失去生物活性，二硫键很容易被还原而断裂，断裂后可以再次氧化重新形成二硫键。 【详解】A、二硫键是连接不同半胱氨酸残基的化学键，属于蛋白质一级结构的一部分。若二硫键断裂，会破坏蛋白质的空间结构，导致其功能丧失，A错误； B、蛋白质的功能依赖其特定的空间结构，若空间结构改变（如高温、强酸强碱导致的变性），其功能通常也会受到影响，B正确； C、乙醇等有机溶剂可破坏蛋白质分子中的氢键，导致其空间结构改变而变性，C正确； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，因此利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质，D正确。 故选A。 7．（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（    ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。 故选C。 8．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是（    ）      A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法； （4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】 A、图示表明，可以从酿酒酵母S中通过PCR分离得到目的基因gadB，A正确。 B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误； C、E．coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误； D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。 故选A。 9．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 10．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（    ） A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 【答案】B 【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。 【详解】A、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误； B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C、将配制的酵母培养基高压灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误； D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。 故选B。 11．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 【答案】D 【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 故选D。 12．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 13．（2024·黑龙江·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 14．（2023·福建·高考真题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列相关叙述正确的是（    ） A．实验I中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B．实验I中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、实验Ⅰ中，PCR实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，A错误； B、实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B错误； C、实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，由于DNA不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA，C正确； D、实验Ⅱ中，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用于鉴定DNA，D错误。 故选C。 15．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 【答案】B 【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。 故选B。 16．（2023·辽宁·高考真题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（    ）    A．CD163基因中编码起始密码子的序列 B．CD163基因中编码终止密码子的序列 C．RFP基因中编码起始密码子的序列 D．RFP基因中编码终止密码子的序列 【答案】B 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。 【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 17．（2023·湖南·高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（    ）    A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的 B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害 C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力 D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径 【答案】B 【分析】分析题图：AT1蛋白通过抑制PIP2s蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1蛋白缺陷，可以提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。 【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确； B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误； C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确； D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。 故选B。 18．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。 【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选D。 19．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】B 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 20．（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（    ） A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确； B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确； C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确； D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 故选D。 21．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                    下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【答案】C 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。 （2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误； B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误； C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确； D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 故选C。 22．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 【答案】B 【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误； B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确； C、延伸过程需引物参与，C错误； D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误； 故选B。 23．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 故选B。 24．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（    ） A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列 B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异 【答案】D 【分析】将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确； B、该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确； C、通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的，只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确； D、获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。 故选D。 25．（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（    ） A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 【答案】D 【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。 【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误； BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误； D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。 故选D。 26．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（    ） A．6 B．250 C．4000 D．24000 【答案】C 【分析】限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯键。 【详解】据图可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。 故选C。 27．（2021·山东·高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（    ） A．“引子”的彻底水解产物有两种 B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列 D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别 【答案】C 【分析】根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来”，所以可以推测“因子”是一段单链DNA序列，根据碱基互补配对的原则去探测古人类DNA中是否有与该序列配对的碱基序列。 【详解】A、根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共6种产物，A错误； B、由于线粒体中也含有DNA，因此设计“引子”的 DNA 序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误； C、根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列，C正确； D、土壤沉积物中的古人类双链 DNA 需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，而不能直接与引子结合，D错误。 故选C。 28．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确； B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误； C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误； D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 故选A。 29．（2020·海南·高考真题）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料 B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐 C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解 D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色 【答案】A 【分析】1.DNA粗提取与鉴定的原理1.DNA的溶解性： （1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的； （2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离； 2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响； 3.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误； B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确； C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确； D、由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。 故选A。 30．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 31．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（    ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 【答案】D 【分析】基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。 【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误； B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误； C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误； D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。 故选D。 32．（2019·江苏·高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是 A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 【答案】D 【分析】转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异。 基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 【详解】将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。故选D。 33．（2019·江苏·高考真题）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是 A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 【答案】A 【分析】DNA粗提取选材的标准：DNA含量高，并且材料易得．由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不采用哺乳动物的血液。DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白后是非常容易断裂的,如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大。如果用热的95%酒精会提高DNA的溶解度,不能完全使DNA沉淀，C正确；将析出的DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D正确。 34．（2026·江西·高考真题）不定项选择题 研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A．需在72℃条件下培养基因工程菌 B．添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C．可根据电泳结果初步评价T的纯度 D．可根据PCR产物的多少计算T的活性 【答案】AB 【知识点】PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、电泳鉴定 【详解】A、该基因工程菌为大肠杆菌，培养大肠杆菌的适宜温度为37℃左右；72℃是该DNA聚合酶T催化PCR反应延伸时的适宜温度，不是培养工程菌的温度，72℃条件下大肠杆菌无法存活，A错误； B、诱导物浓度并非越高越好，高浓度诱导物通常会对工程菌的生长产生毒害，反而会抑制目的蛋白的表达，降低T酶的产量，B错误； C、蛋白质电泳可根据条带数目初步判断蛋白质的纯度：若仅出现目的条带说明纯度高，出现多条杂带说明杂质多，C正确； D、T酶的活性是其催化PCR合成DNA的能力，相同反应条件下，T酶活性越高，单位时间内扩增得到的PCR产物量越多，因此可以根据PCR产物的多少计算T酶的活性，D正确。 35．（2025·河北·高考真题）不定项选择题 X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是（    ） 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 【答案】AB 【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。 【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比为2×1/3500×3499/3500，A错误； B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误； C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确； D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 故选AB。 36．（2025·江苏·高考真题）不定项选择题 图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【分析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。 【详解】A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误； B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误； D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。 故选BD。 37．（2024·湖南·高考真题）不定项选择题 最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【分析】1、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确； B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误； C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确； D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 故选AC。 38．（2026·贵州·高考真题）高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： (1)科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 (2)将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。                    W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C (3)科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 【答案】(1)Bcl I和Xba I (2) 3+6 2500 (3) X 4 3和9 【详解】（1）若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 （2）在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 （3）启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 39．（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是_______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是___________________________________________________________________________________。 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。 【答案】(1) 启动子 复制原点 (2)Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ (3) DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 (4)抗原-抗体杂交 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 （2）要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ 。 （3）由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 （4）检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 40．（2026·黑吉辽蒙卷·高考真题）平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 【答案】(1) 人工合成法（化学合成法） T4 未插入目的基因的pPK2空质粒 A D 染色体DNA B (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 (3)安全性 【详解】（1）已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV切割产生平末端，T4 DNA连接酶可以连接平末端，连接效率高于EcolDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamHI/EcoRI酶切得到0.7kb+6.1kb（6.8−0.7=6.1）；HindIII/EcoRI酶切得到1.1kb+5.7kb（6.8−1.1=5.7），因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。 （2）根据题干和表格数据，转入Tps基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50​更短，最终第7天死亡率更高。 （3）转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 41．（2026·河南·高考真题）4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是________。 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________（答出一点即可）。 【答案】(1) 复制原点 终止子 终止目的基因的转录 (2) XhoⅠ NcoⅠ (3) b 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 【详解】（1）载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点（DNA复制的起始位点）。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 （2）结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 （3）根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 （4）工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 42．（2026·陕晋青宁卷·高考真题）研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的___________性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是___________(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于___________型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的___________酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是___________。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是___________或___________两种组合，原因是___________。 (4)为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是___________。可利用___________法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，___________(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 【答案】(1) 简并性 ③ (2) 诱导 RNA聚合 引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育 (3) EcoR I和Kpn I EcoR I和SaI I 从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变） (4) 增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触 农杆菌转化法 抑制 【详解】（1）由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因（J*），这样能避免转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符，需要对其进行测序并序列比对，所以选③。 （2）因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗虫棉，所以在该载体中，启动子P属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达。之后检测到J*蛋白在细胞外积累，说明S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育。 （3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是EcoR I和Kpn I或EcoR I和SaI I两种组合，原因是根据图中信号肽序列的核苷酸数量，从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变）。 （4）为获得足够的重组质粒，对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触。将融合基因导入棉花茎尖细胞，可利用农杆菌转化法。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，使组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 43．（2026·云南·高考真题）UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和________三步。 (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是________（答出2点）。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 (3)我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是________。 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加_________，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是________；在第二次筛选培养基中添加________。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是________（填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并________。 【答案】(1)延伸 (2)防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 (4) 庆大霉素 pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长 蔗糖 ② 电泳检测 【详解】（1）PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 （2）构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接。 （3）在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此类设计的主要目的是防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染。 （4）据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活；筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是②，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并电泳检测来鉴定。 44．（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： (1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的______拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是______。 (2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的______（填下图字母）处。理由是______。 (3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为______。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的______中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是______。 【答案】(1) DNA序列 COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 (2) B B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录 (3) 外植体 染色体DNA 生长素和细胞分裂素 【分析】核心思路：通过 “蛋白质工程” 思路，将决定蛋白质细胞内定位的特定肽链与绿色荧光蛋白（GFP）“嫁接”，利用 GFP 的荧光标记，在显微镜下观察线粒体形态变化。知识融合：蛋白质工程：需通过改造基因（DNA 片段）实现肽链 “嫁接”，利用特定肽链（如 COXⅣ 的肽链序列X）的细胞定位功能，引导 GFP 标记线粒体。基因工程：借助农杆菌转化法，将目的序列插入 Ti 质粒的T - DNA（可转移至植物细胞并整合到染色体 DNA 上）。植物组织培养：涉及外植体（离体的器官、组织或细胞）、目的基因整合位置（番茄细胞的染色体 DNA），以及诱导期所需的植物激素（生长素和细胞分裂素，调控细胞脱分化与再分化）。 【详解】（1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X决定了 COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X的定位功能，使GFP标记线粒体）。 （2）拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B处。B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。 45．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。    注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是________。 (2)采用EcoRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生_________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是________。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带________（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致________，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是________。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有________（答出1点即可）。 【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制 (2) 2 验证重组质粒是否构建成功 (3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻 (4) 目的基因发生突变 发酵条件优化 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。 （2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。 （3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 46．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。 (3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。 【答案】(1)mKate2蛋白或荧光 (2) 细菌计数板计数法 作为mKate2蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，快速生长期合成的阻遏蛋白XC-末端带SsrA短肽，会被降解，在启动子Px的作用下合成酶A，催化莽草酸形成；将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后B基因停止转录，酶B合成停止，减少对莽草酸的转化，将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株，保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。 47．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是______。将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是______。    限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是______，随后在含______和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______。    【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2) BamHI SmaI和EcoRV切割后均产生平末端，Spe1和Xba1切割后产生的粘性末端相同，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别 (3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合（如maI和EcoRV或Spe1和Xba1）和T4DNA连接酶重复上述实验，两种情况均会导致部分cg反向链接，新的序列无法被原有酶识别，获得的部分重组质粒分子大小符合预期。 （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 48．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： (1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是_________。 (2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内_________（填细胞结构名称）的改变。 (3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： _________。 (4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入_________序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 (5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是：_________。 (6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是：_______。 【答案】(1)电子显微镜 (2)细胞骨架 (3)防止细胞凋亡，有利于病毒的繁殖 (4)大肠杆菌复制原点 DNA (5)哺乳动物细胞的 RNA 聚合酶无法识别该病毒基因的启动子 (6)溶解该病毒的包膜，使病毒无法与宿主细胞膜上的受体结合 【分析】病毒的结构较为简单，无细胞结构，主要由核酸（DNA 或 RNA）和蛋白质外壳组成。有些病毒在核衣壳之外还有包膜结构。核酸是病毒的遗传物质，储存着病毒的遗传信息，控制着病毒的繁殖、变异等生命活动。蛋白质外壳则起到保护核酸的作用，同时还能介导病毒与宿主细胞的识别与结合。具有包膜的病毒，其包膜一般来源于宿主细胞膜或核膜，包膜上镶嵌着一些糖蛋白刺突，这些刺突有助于病毒吸附和侵入宿主细胞。 【详解】（1）病毒个体极其微小，普通光学显微镜无法清晰观察其形态结构，需要使用电子显微镜才能清楚观察病毒的形态结构。 （2）细胞骨架对于维持细胞的形态具有重要作用，体外培养的梭形昆虫细胞被病毒感染后转变为圆球形，很可能是病毒感染引起了昆虫细胞内细胞骨架的改变。 （3）病毒需要在宿主细胞内进行生存和繁殖，细胞凋亡会导致宿主细胞死亡，不利于病毒的生存和繁殖。病毒基因组中含有的抗细胞凋亡基因可以抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 。 （4）要使病毒 DNA 能在大肠杆菌中复制，需要在病毒 DNA 中插入大肠杆菌复制原点序列，这样才能利用大肠杆菌细胞内的复制系统进行复制。 （5）转录需要特定的酶等条件，该病毒 DNA 能进入哺乳动物细胞，但无对应的转录产物，可能是因为病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子。 （6）该病毒具有包膜结构，包膜的主要成分是脂质等，脂溶剂可以溶解病毒的包膜，蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内。 49．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是_____和_____。模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_____。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加_____（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成_____键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_____，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_____。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是_____和_____。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 50．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'-________-3'，切割载体时应选用的两种限制酶是________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到________，抗性基因________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】(1) 4种脱氧核苷酸 延伸 (2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ (3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化 【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 【详解】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 （3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 51．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)可从________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】(1) 序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 52．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路________。 【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌 (2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3) 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测 【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了分离能对该致病菌有抑制作用的内生放线菌。 （2）PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。 （3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 53．（2025·北京朝阳·一模）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作，耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于__________性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是__________。该PCR体系从第__________个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为__________，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。__________ (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。____________。 【答案】(1)隐性 (2) G、A 3 雄性不育株PCR产物发绿色荧光.育性正常株1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光 (3)甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 (4)应先引入甲。与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 【分析】基因工程四步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达。分析题图可知，过程①为逆转录，过程②为限制性核酸内切酶切割，过程③为目的基因扩增，过程④为将目的基因导入受体细胞，过程⑤为目的基因的检测鉴定。 【详解】（1）甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常，说明不育为隐性性状。 （2）①引物I和引物II分别与野生型和突变型S型基因结合，相对于野生型的S基因，突变型的S基因中增加一个碱基对A-T，引物与模板链互补配对，且从子链（引物）的3'端开始延伸，为了更好地区分突变型和野生型的S基因，因此在引物I和引物II的3'末端碱基分别是G、A；该PCR体系同时含3种引物和4种探针，是一种竞争性等位基因特异性PCR，第1次循环以基因为模板，引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增S基因，第一轮PCR结束后加入的引物I或II在子链中，第二次PCR引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增第一次复制得到的S基因，第二轮PCR结束后可以得到引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ的子链，第三轮PCR开始，探针1或探针3（不是引物I或引物II）会特异性地与含有引物I或引物II互补序列的模板链结合，而带有荧光基团的探针是引物的一部分，因此该PCR体系从第3个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，探针1与探针2分离，去与互补序列结合，荧光基团脱离淬灭基团，所以才发荧光。 ②F1自交（假设用A表示野生型S基因，a表示突变型S基因），F2中216株育性正常（1/3AA、2/3Aa），68株雄性不育（1/3aa），若雄性不育性状是由S基因编辑导致的，则用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，雄性不育株（仅含突变型S基因，只能与探针3结合）PCR产物发绿色荧光，育性正常株（均为野生型S基因，只与探针1结合）1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光（含有野生型S基因和突变型S基因，既可以与红色探针结合，也可以与绿色探针结合）。 （3）研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因连锁，用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙，甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 （4）甲花粉不成活，应先引入甲，与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 54．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物______（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是______；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是______。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行______。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是______（至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是______。 【答案】(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 55．（2021·上海·高考真题）酶的改造：利用DszC酶可以获得低硫石油，减少酸雨，以红球菌获得的天然DszC酶活性会受到产物的抑制。为此改造DszC酶如下： Ⅰ：将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒（图1）连接。 Ⅱ：将连接好的DNA分子导入受体细胞，接入含抗生素的培养基，筛选成功导入目的基因的受体细胞。 Ⅲ：培养受体细胞，并测DszC酶活性与其产物浓度关系（图2）。    (1)在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是______（填写编号）；Ⅱ筛选到的受体细胞会有基因______（填写编号）。 ①天然DszC酶基因    ②DszC突变基因    ③绿色荧光蛋白基因    ④抗性基因 (2)Ⅰ～Ⅲ中DszC基因表达的阶段是______。 (3)已知DszC基因长度为1254个碱基对，结合图2信息，通过比较不同酶的活性及产物抑制程度，分析DszCγ酶基因的长度，更可能是1257个碱基对还是303个碱基对？写出分析过程_________。 【答案】(1) ③④ ②④ (2)Ⅱ、Ⅲ (3)1257个碱基对。分析过程：据图2可知，在产物浓度为0时，DszCγ酶、其他改造酶和天然酶的活性虽然有所差异但是相差不大，说明突变改造后的DszCγ酶与底物结合以及在发挥催化活性的关键结构上没有发生改变，推测控制该酶的基因结构本身没有发生明显的改变；随着产物浓度的逐渐增加，天然酶和改造后的酶活性均受到产物抑制，但是与其他DszC酶活性相比，DszCγ酶仍然保持了较高的活性，说明该酶基因突变后极大地缓解了产物对DszCγ酶的抑制作用。根据DszCγ酶初始活力和该突变有效地解除了产物对DszCγ酶的抑制作用可知，其突变并不会显著改变酶本身的分子结构，如缩短酶分子的氨基酸数量，故DszCγ酶基因的长度更可能是1257个碱基对，而非是303个碱基对。 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1所示的质粒上含有绿色荧光蛋白基因和抗性基因。将三种DszC突变基因用SpeI和EcoRI切割，分别与质粒连接，则将连接好的DNA分子，均含有绿色荧光蛋白基因和抗性基因，其中有的分别含有三种DszC突变基因（构建的重组质粒），有的为空载质粒（不含目的基因），因此在Ⅱ中，培养基上发出绿色荧光的受体细胞中，一定含有的基因是③绿色荧光蛋白基因和④抗性基因；Ⅱ筛选到的受体细胞为成功导入分别含有三种DszC突变基因（目的基因）的受体细胞，而且对培养基中含有的抗生素具有抗性，所以会有②DszC突变基因和④抗性基因。 （2）由题意可知：DszC基因表达的产物是DszC酶。Ⅰ是构建基因表达载体，Ⅱ是将构建的基因表达载体导入受体细胞并筛选成功导入目的基因的受体细胞，Ⅲ是培养受体细胞并进行DszC酶活性与其产物浓度关系的检测，因此在Ⅰ～Ⅲ中，DszC基因表达的阶段是Ⅱ和Ⅲ。 （3）据图2可知，在产物浓度为0时，DszCγ酶、DszC β酶、DszCα酶和天然DszC酶的活性虽然有所差异但是相差不大，说明突变改造后的DszCγ酶与底物结合以及发挥催化活性的关键结构上没有发生明显改变，而酶蛋白是由基因表达即转录和翻译产生的，由此推测DszCγ酶基因的结构本身没有发生明显变化，这样转录出的mRNA的碱基序列和翻译出的酶蛋白的氨基酸序列才不会发生明显改变。随着产物浓度的增加，天然DszC酶和改造后的DszC酶活性均受到产物抑制，但是与其他DszC酶活性相比，DszCγ酶仍然保持了较高的活性，说明该酶基因突变后极大地缓解了产物对DszCγ酶的抑制作用。根据DszCγ酶初始活力和该突变有效地解除了产物对DszCγ酶的抑制作用可知，其突变并不会显著改变酶蛋白本身的分子结构，如缩短酶分子的氨基酸数量，故DszCγ酶基因的长度更可能是1257个碱基对，而非是303个碱基对。 56．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要__________________。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________（A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有________功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与____________________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 (2)C (3) 预冷的体积分数为95%的酒精 D 调控 (4) 基因数据库/序列数据库 表达载体 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C符合题意； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2序列位于模板链上，从左向右为5’→3’，引物P3与P4的序列从右向左为5’→3’， 以环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P2和P3，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 57．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 58．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于_____微生物，在无氧条件下能进行_____发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是_____。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有_____和_____。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是___，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为_____。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路_____。 【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精 (2)新鲜水果表皮附着酵母菌 (3) 平板划线法 稀释涂布平板法 (4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D (5)从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 【分析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。 【详解】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。 （3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单菌落。 （4）菌株B导入不含FLO基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根据题干可知，FLO基因表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO基因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。 （5）菌株E中无单独的X和Y基因，菌株A含有X和Y基因，需要先利用限制酶从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 59．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是____________。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是____________。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有______________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 60．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测___________诱导了NV基因表达。NV酶的作用是___________。检测NV酶活性时，需测定的指标是___________（答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与___________（选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度___________（选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是___________。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入___________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是___________。 【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 61．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称_____（略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 细胞分化 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 分化是基因选择性表达的结果 基因表达 包括转录和翻译 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下： 。 62．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。 (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可） 【答案】(1) 胚乳特异表达基因的 终止转录 HindIII EcoRI (2) 农杆菌转化 r2HN是否转录 抗原抗体杂交 (3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4) 体液 细胞 (5)生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”） 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的类型的判断 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动转录 载体中可人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 将r2HN基因导入水稻愈伤组织的方法 可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞 水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；可利用显微注射技术将目的基因导入动物细胞 病毒进入体内发生的免疫 特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫 根据图示，抗体和T细胞的数量都增加了，说明病毒进入体内既引发了体液免疫又引发了细胞免疫 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳特异表达基因的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测r2HN是否转录，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。 （4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 （5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）等优点。 63．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 64．（2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 【答案】(1) 变性 氢键 (2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 (3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 PCR过程打开成为单链的阶段 PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段 PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中变性时高温解旋，DNA双链打开成为单链的阶段是变性 双酶切的优点 基因工程的基本工具 双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化 感受态细胞的特点 目的基因导入受体细胞的方法 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。 （2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。 （3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 （4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。 65．（2024·黑龙江·高考真题）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______和______。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】(1) 除去蛋白质杂质 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2) PCR技术扩增 人工合成 (3) RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因转录效率 (4)HygBR (5) F3 R2 (6)D 【分析】（1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶 酶具有专一性 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精 DNA在冷酒精中溶解度较低 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是除去蛋白质杂质。研磨液中的SDS能使蛋白质变性，因此无需担心DNA酶水解DNA。但即使有蛋白质变性剂使蛋白质变性改变其理化性质，仍然有可溶性、不溶性的蛋白质杂志通过沉淀、过滤等物理方式难以去除，因此为了获得较纯的DNA，保证提取的DNA作为PCR模板的品质，需要加入蛋白酶。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 （2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因转录效率。 （4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 （6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。 ABC不符合题意，D符合题意。 故选D。 66．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。 【答案】(1) 磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子 (2)A-T、U-A (3) 菌株B2的基因组DNA 无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对 RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A 利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆 产生废气少，分解后剩余的无机盐留在土壤中 实现废物利用，减少环境污染 【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子，保证N基因正常发表达。 （2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。 （3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组DNA；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3对应的模板序列未插入B1的基因组，实验结果是无扩增产物。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是实现废物利用，减少环境污染。 67．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY基因的转基因菊花。重组Ti质粒的部分信息及实验流程如图1所示。启动子均为真核细胞启动子。 一、将重组Ti质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY转基因菊花。 (1)根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选____，步骤①培养过程一般____（填“需要”或“不需要”）光照，流程图中的Ⅰ是____。 (2)通过调整过程②和③中____的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY转基因菊花。 (3)以____为模板、选用与LFY基因特异性结合的引物，利用PCR技术鉴定菊花细胞是否存在LFY基因。再选用____技术检测转基因菊花的LFY蛋白的表达水平，进一步筛选LFY转基因菊花。 二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA的Ti质粒（如图2）培养转基因植物。 (4)已知Ti质粒携带双T-DNA时，每个T-DNA都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA上。请设计培育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY转基因菊花____。（写出实验思路即可） 【答案】(1) 转入LFY基因的菊花细胞 不需要 愈伤组织 (2)生长素和细胞分裂素 (3) 菊花染色体DNA 抗原-抗体杂交 (4)将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达FLY的转基因菊花 【分析】1、基因工程的基本工具：分子手术刀”是指限制性核酸内切酶（限制酶）、“分子缝合针”是指DNA连接酶、“分子运输车”是指载体。 2、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 3、标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 【详解】（1）重组质粒中含有潮霉素抗性基因，能表达出潮霉素抗性物质，故本实验中潮霉素的作用是筛选转入LFY基因的菊花细胞。步骤①为脱分化形成愈伤组织过程，一般不需要光照，图中Ⅰ为愈伤组织。 （2）步骤②和步骤③为再分化形成根和芽的过程，愈伤组织分化的方向与生长素和细胞分裂素的浓度和比例有关，故调整步骤②和步骤③培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例可诱导菊花芽或根的形成。 （3）利用农杆菌转化法转化时，其LFY基因与菊花染色体DNA进行了重组，故以菊花染色体DNA为模板，选用LFY基因特异性引物，用PCR检测LFY基因是否导入菊花细胞中。检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。因此，可用抗原-抗体杂交方法检测转基因菊花中LFY蛋白的表达水平，进一步筛选转基因菊花。 （4）将两个Ti质粒存在双T-DNA独立整合进植物细胞染色体DNA中制备转基因菊花，最后根据是否表达FLY来筛选转基因菊花。具体方案为：将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达FLY的转基因菊花。 68．（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： (1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的___差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 (2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、___和___等。本研究中目的基因为___。 (3)PCR扩增时引物通过___原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的___组，样品2有特异性扩增产物，结果表明___。    (4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显___。同时，还需测定___以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。    (5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，___，最终促进胞内脂质合成。 (6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为___。（答出两点即可） 【答案】(1)溶解度 (2) 启动子 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序） 苹果酸酶基因（或“ME基因”） (3) 碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） (4) 增加 细胞数量 (5)有氧呼吸生成的ATP增多 (6)节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 【分析】1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、PCR原理：DNA半保留复制。 3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。 【详解】（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。 （2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。 （3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。 （4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。 （5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。 69．（2023·辽宁·高考真题）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于_____工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶     ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶     ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。    (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。    (5)目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 【答案】(1)蛋白质 (2)③ (3)② (4)标记基因 (5) 筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7 (6)逆转录 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。 （2）PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 （3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。 （4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 （5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。 （6）转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 70．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 71．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。    回答下列问题。 (1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于_____；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和_____，该过程还需要光照，其作用是_____。 (2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的_____。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注_____。 (3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____。 (4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是_____，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是_____，依据是_____。 (5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是_____（答出2点即可）。 【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2) 遗传特性 转基因标识 (3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 (5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。 【详解】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。 （2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。 （3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。 （4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。 （5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。 72．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 【答案】(1)外 (2)P1和P6 (3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） (4)4 【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 （2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 （3）①URA3 作为标记基因，其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿密啶，无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及 URA3 的受体细胞。 ②如题图所示，方式1中URA3 两侧C、C’是反向同源序列，方式2中URA3 两侧C、C’是同向同源序列。在发生同源重组时，方式1只是导致URA3序列倒位，但不会切除 URA3；而方式2将导致 URA3 以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式 2。由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 （4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。 73．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。 【答案】(1)A/腺嘌呤 (2) N（Q） P(R） (3) Ce和Er基因融合 饲喂T (4)带标记的细胞大部分是单标记 【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。 【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。 （2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现标记，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，出现双标记，据图可知，加入EdU后再加入BrdU时间隔的时间越长，双标记细胞占EdU标记细胞的百分比越低，若在DNA复制开始时加入BrdU，双标记细胞可达到100%，当DNA复制结束时加入BrdU，双标记细胞占比为0，DNA复制所需时长的是从N（Q）点到P（R）点。　 （3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。 （4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程细胞周期长，DNA复制一次，2t2时间后不会进行DNA复制，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即带标记的细胞大部分是单标记。 74．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 75．（2023·全国乙卷·高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。    (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性 (4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达 【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握： ①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。 ②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。 ③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。 【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。 （3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。 （4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。 76．（2023·全国甲卷·高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_____。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_____。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____。 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取_____进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_____。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_____ 【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖 (2) 筛选 RNA聚合酶 (3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段 (4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质 【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。 （2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。 RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。 （3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。 基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。 （4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。 77．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。 (1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和________，并在引物的________（5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。 (2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含___________（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。 (3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有__________的平板进行初步筛选。 (4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。 A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感 C．卡那霉素和链霉素都敏感 D．卡那霉素和链霉素都不敏感 (5)可采用__________技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。 【答案】(1) 1 4 5＇ (2)XhoⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别序列。 （2）据图可知，载体4中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoⅠ酶识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。 （3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。 （4）据题意可知，载体5导入的是链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。 故选B。 （5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。 78．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________________。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物_____________； ②PCR目的产物约为_____________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。 【答案】(1) 脂质和蛋白质 与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） (2) 溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' (3) a、b 1100 Q4 蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部 (4) 逆转录 32 【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质组成。中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。 （2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0mol/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据EcoR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部。 （4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。 79．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是_______。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是_______，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：____。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因：______ A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后_______造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是_______。 【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 80．（2022·海南·高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。 (5)该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。 【答案】(1) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清 (2) PCR技术、人工合成法 终止子 RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质 (3)基因的选择性表达 (4)诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术 (5)基因工程、动物细胞培养 【分析】胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。 【详解】（1）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 （2）OSNL为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 （3）据图可知，由iPS细胞诱导形成iPGCs细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。 （4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。 （5）由图可知，该实验流程中将OSNL基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。 81．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。 【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 82．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是______________________________。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。 【答案】(1) 氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性 (2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA半保留复制 (3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间 【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列； 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA半保留复制。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。 （4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。 83．（2022·全国乙卷·高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。 (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 (2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。 (3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。 (4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______。 【答案】(1)逆转录酶/反转录酶 (2) 特异性核苷酸序列 退火/复性 (3) 曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白） 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。 （2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。 （3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。 （4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。 84．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______ A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规P$