第43讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题（复习课件）（4大考点+9大知识+科技前沿）（全国通用）2027年高考生物一轮复习讲练测

第十单元 大概念九 基因工程赋予生物新的遗传特性，生物技术在造福人类社会的同时有可能会带来安全性与伦理问题 2027年高考一轮复习讲练测 生物学 概念体系 大概念09 基因工程赋予生物新的遗传特性，生物技术在造福人类社会的同时有可能会带来安全性与伦理问题 细胞工程通过细胞水平上的操作，获得有用的生物体或其产品 第十单元 第43讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题 全国通用 2027年高考一轮复习讲练测 生物学 3 01命题透视·考情前瞻 对标素养，研判高考命题趋势 拆解核心考点，突破命题考向 溯源真题逻辑，感知高考考向 搭建知识框架，构建系统思维 目录 目录总览 路径指引 02知识建联·脉络梳理 03考点精讲·靶向突破 04真题溯源·考向感知 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点1 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 知识点2 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 深挖素材脉络，规范长句作答 05情境探究·素养拓展 知识解构 即时演练 高分破译 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点1 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识点2 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识点1 基因工程的应用 知识点2 蛋白质工程的原理和应用 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识点1 转基因产品的安全性 知识点2 关注生殖性克隆人 知识点3 禁止生物武器 命题透视·考情前瞻 对标素养，研判高考命题趋势 01 5 命题透视·考情前瞻 对标素养，研判高考命题趋势 考查概述 从命题题型和内容上看，常考查基因工程操作四部曲，涉及限制酶的选择、基因表达载体的构建、目的基因导入方法、目的基因的检测与鉴定，以及转基因生物的安全性。 考查形式 以非选择题为主，常考查基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶、载体（质粒等）的作用特点与选择，目的基因导入方法和检测，以及以转基因生物的培育为情境，结合转录翻译、细胞工程等知识进行综合考查。 课标要求 明确目标 1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。(生命观念) 2．掌握人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。(科学思维) 3．举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害以及转基因产品对人类生活的帮助。(社会责任) 高考前沿 1.基因工程的基本工具、操作程序和应用 2026·河南·T21；2026·江西·T14；2026·湖南·T7；2026·浙江1月·T24；2026·山东·T25；2025·山西·T21；2025·山东·T25；2024·黑吉辽·T25；2023·北京·T6　 2.蛋白质工程的原理和应用 2026·河南·T13；2026·江西·T2 3.DNA的粗提取与鉴定 2024·山东·T13；2024·安徽·T14　 6 知识建联·脉络梳理 搭建知识框架，构建系统思维 02 7 思维建模·脉络梳理 搭建知识框架，构建系统思维 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题 基因工程的概念及基本工具 生物技术的安全性与伦理问题 蛋白质工程的原理和应用 基因工程应用 核心实验技术（DNA提取与扩增） 基因工程的操作程序（四步曲） 基本概念：基因操作、重组DNA技术 4. 检测与鉴定（分子水平、个体水平） 3. 导入受体细胞（转化、显微注射等） 2. 基因表达载体的构建（核心工作） 组成：启动子、终止子、标记基因等 1. 目的基因的筛选与获取（基因文库、PCR技术等） 核心工具 理论基础：遗传学、分子生物学等 1. 转基因技术：成果（抗虫作物、转基因药物等）；争论（生态安全、人体健康、长期影响等）；态度：理性看待（科学评估、规范管理） 4. 其他领域：环境治理、能源 2. 医药卫生领域 疫苗、药物、诊断试剂等 3. 食品工业方面 益生菌、营养强化等 1. 农牧业方面 抗虫、抗病、优质品种等 2. DNA片段的扩增及电泳鉴定 技术：PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳 1. DNA的粗提取与鉴定 流程：细胞裂解、纯化、鉴定 3. 应用：改造酶、抗体、药物等 4. 与基因工程的对比：作用对象、技术手段不同于基因工程 2. 缘由：弥补传统方法的局限性 1. 原理：对蛋白质进行设计、改造（定向进化） 限制性核酸内切酶（限制酶）：切割DNA DNA连接酶：拼接DNA片段 其他与DNA有关的酶：如DNA聚合酶等 2. 克隆与试管婴儿：生殖性克隆人（面临生命尊严、伦理边界等伦理问题），试管婴儿 vs 设计试管婴儿（技术目的不同、伦理争议） 3. 生物武器：种类和特点（病毒、细菌、毒素等）应对态度(不能掉以轻心（加强防控、国际合作） 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，突破命题考向 03 9 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，归纳解题范式 自主研学·梳理教材 1.限制性内切核酸酶简称限制酶,主要从原核生物中分离纯化出来,作用是能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式,即黏性末端和平末端。 2.DNA连接酶的作用是将两个双链DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 3.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。 4.在基因工程中使用的载体除质粒外,还有噬菌体、动植物病毒等。 5.限制酶不剪切细菌本身的DNA的原因是生物在长期进化过程中,含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，归纳解题范式 自主研学·梳理教材 6.基因工程是一种重组DNA技术,需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 7.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 8.PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行,该溶液中一般要添加Mg2+,需提供DNA模板,分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶;同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 9.PCR过程:每次循环一般可以分为变性(当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链),复性(当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合)和延伸(当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链)。该过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成,完成以后,常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，归纳解题范式 自主研学·梳理教材 10.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子终止转录,位于基因的下游,是一段有特殊序列结构的DNA片段。 11.采用花粉管通道法将Bt基因导入棉花细胞。此种方法有多种操作方式。例如,可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 12.将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。 13.将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中,这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。原核生物作为受体细胞时,一般先用Ca2+处理该种细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，归纳解题范式 自主研学·梳理教材 14.分子水平检测目的基因:PCR等技术检测转基因作物的染色体DNA上是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA;从转基因作物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质。 15.科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起,通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中,由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后,可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物,这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 16.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求。 17.基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 考点精讲·靶向突破 拆解核心考点，归纳解题范式 自主研学·梳理教材 18.对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成。蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 19.在转基因研究工作中,科学家会采取很多方法防止基因污染。 20.生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官,用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官,从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。 21.我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识解构 即时演练 高分破译 情境导入·项目挑战 【情境背景】最近，广西来宾蔗区，主栽品种“桂糖42号”受甘蔗条螟危害。科研团队从苏云金芽孢杆菌中克隆Cry1Ac抗虫基因，构建表达载体，尝试培育抗条螟甘蔗新品系。由于桂中部分蔗区与桑园交错，家蚕也是鳞翅目昆虫，团队还需评价转基因甘蔗对家蚕的潜在影响。 核心问题： 怎样获取和扩增Cry1Ac基因？ 怎样构建能定向插入、正常表达的载体？ 怎样导入甘蔗并筛选？ 怎样从分子、个体和生态安全三个层次检测鉴定？ 若天然Bt蛋白毒力或专一性不理想，怎样用蛋白质工程改造？ 在蔗桑交错区如何防止基因污染、开展安全评价？ 考点一 重组DNA技术的基本工具 任务1：表达载体构建与限制酶选择 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】科研人员从苏云金芽孢杆菌中克隆到Cry1Ac抗虫基因，准备构建表达载体并导入甘蔗。应该用什么酶把Cry1Ac目的基因“切下来”？操作中应注意什么？为什么？ 知识落点： 选择原则 表达载体组成 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体 基因工程 优 点 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 1.基因工程 知识解构 即时演练 高分破译 基因工程 提供目的基因 表达目的基因 基因在受体 体内的表达 体外 分子水平 克服远缘杂交不亲和障碍、 生物性状。 供体 受体 基因重组 原理 本质 操作环境 操作水平 定向改造 ☞也叫重组DNA技术 按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 知识解构 即时演练 高分破译 一种生物的基因能拼接入另一种生物并表达的原因是？ 一种生物的基因能在另一种生物表达的基础： 不同生物的基因拼接的基础： ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界几乎共用一套遗传密码 重组DNA技术的基本工具 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体 G C G C G C 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 2.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 知识解构 即时演练 高分破译 来源： 特点： 结果： 主要是从原核生物中分离纯化来的 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ②产生平末端 ①产生黏性末端 专一性 黏性末端 G C A A T T T A T A C G 5' 3' 3' 5' G C T T A A A A T T C G 平末端 C G C C G G 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 知识解构 即时演练 高分破译 (1)【教材隐性知识】源于选择性必修3 P71“旁栏思考”: 原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 (2)【教材隐性知识】源于选择性必修3 P74“拓展应用”:限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 知识解构 即时演练 高分破译 任务：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamH Ⅰ: EcoRⅠ: Hind Ⅲ: Bgl Ⅱ: GATC AATT AGCT GATC 同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同 可能会相同 【提醒】（1）限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 （2）限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 （3）在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 3.DNA连接酶——“分子缝合针” 知识解构 即时演练 高分破译 作用： 类型： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 缝合黏性末端和平末端 缝合黏性末端和平末端 来源： 大肠杆菌 作用： 来源： 作用： T4噬菌体 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 思考：限制酶、DNA连接酶与DNA聚合酶的关系有什么区别？ 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 思考：限制酶、DNA连接酶与DNA聚合酶的关系有什么区别？ 知识解构 即时演练 高分破译 （1）限制酶与DNA连接酶的关系： （2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系： 相同点——作用位点都在磷酸二酯键 不同点—— DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶：单个核苷酸与DNA片段 DNA连接酶：DNA片段与DNA片段 DNA聚合酶需要模板，而DNA连接酶不需要 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 知识解构 即时演练 高分破译 【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 1.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 知识解构 即时演练 高分破译 作用： 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制 需具备的条件: ①有一个至多个限制酶切割位点 ②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 ③带有标记基因(常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光基因等 供外源DNA片段插入其中 便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在 便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功) 种类: 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 考点一 重组DNA技术的基本工具 任务1：表达载体构建与限制酶选择 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】科研人员从苏云金芽孢杆菌中克隆到Cry1Ac抗虫基因，准备构建表达载体并导入甘蔗。应该用什么酶把Cry1Ac目的基因“切下来”？操作中应注意什么？为什么？ 知识落点： 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 3.DNA的粗提取与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 (1)实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 a.粗提取DNA的原理 b.鉴定DNA的原理 ①在酒精溶液中的溶解性： ②在NaCl溶液中的溶解性： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 (2)材料用具 知识解构 即时演练 高分破译 a.选材： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 【思考】能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？ 哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 为什么能选用鸡血细胞？ 能 鸡是鸟类动物 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 （3）方法步骤 a.取材、研磨： 称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨 研磨目的？ 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 b.去除滤液中的杂质 方案一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 低温放置几分钟的作用？ 低温放置：抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。 方案二：也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 c.DNA的析出 知识解构 即时演练 高分破译 方案一:在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 搅拌时应轻缓、并沿一个方向？ 方案二:或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂， 导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 考点一 重组DNA技术的基本工具 知识点02 基因进入受体细胞的载体和DNA的粗提取与鉴定 d.DNA的鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 水浴加热 考点一 重组DNA技术的基本工具 回归教材·易错辨析 判断以下表述是否正确： （1）限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取。（ ✔ ） （2）不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端。（ ✔ ） （3）DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键。（ ✘ ） （4）E.coli DNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来。（ ✘ ） （5）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。（ ✔ ） （6）构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代。（ ✔ ） （7）一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构。（ ✘ ） 知识解构 高分破译 即时演练 ✔️ ✘️ ✘️ 提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。 ✔️ 提示：基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。 ✔️ ✔️ ✘️ 考点一 重组DNA技术的基本工具 回归教材·易错辨析 判断以下表述是否正确： （8）因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质。（ ✘ ） （9）两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中。（ ✔ ） 知识解构 高分破译 即时演练 ✔️ ✘️ 提示：因DNA不溶于酒精但某些蛋白质溶于酒精，因而可分离DNA与蛋白质。 1.图1表示某种DNA分子上的多种限制酶切割位点，图2表示EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ三种限制酶识别序列和切割位点，下列相关叙述错误的是(　　) A．获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 进行酶切 B．图2所示的三种限制酶使特定碱基序列的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 C．可以用Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ酶切该DNA分子，产生不同的黏性末端 D．能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ识别的碱基序列不同，酶切目的基因产生的黏性末端相同，但是目的基因内部含有Sau3A Ⅰ识别的序列，所以不能使用Sau3A Ⅰ切割该DNA来获取目的基因，C错误； C EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点位于目的基因的两侧，获取该目的基因可采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，A正确； 限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，B正确； 知识解构 高分破译 即时演练 Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ识别的碱基序列不同，BamH Ⅰ识别的序列中包含Sau3A Ⅰ识别的序列，但Sau3A Ⅰ识别的序列BamH Ⅰ不一定能识别，所以能被Sau3A Ⅰ切割的序列不一定能被BamH Ⅰ切割，D正确。 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向01 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 2.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．T4 DNA连接酶只能连接黏性末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来所以也能剪切自身的DNA T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，C项错误； B 限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确； DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误 知识解构 高分破译 即时演练 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。 细菌 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向02 载体和DNA的粗提取与鉴定 1．某细菌质粒如下图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　) ③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因被破坏而四环素抗性基因正常表达，故插入点为a。 A ②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因正常表达而四环素抗性基因被破坏，故插入点为b； ①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏，所以插入点是c； 知识解构 高分破译 即时演练 A．①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向02 载体和DNA的粗提取与鉴定 2.在基因工程中，筛选含有目的基因的受体细胞过程特别重要。下图中pUC18是一种常用质粒，其中ori为复制原点，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，LacZ基因能合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色。已知目的基因插入的位置如图所示，为快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，平板培养基内除了大肠杆菌生长所必需的营养物质和琼脂外，还必须加入(　　) A．氨苄青霉素 B．无色染料X-gal C．氨苄青霉素和无色染料X-gal D．氨苄青霉素或无色染料X-gal 插入的目的基因破坏了LacZ基因，不能合成将无色染料X-gal变成蓝色的酶，但没有破坏氨苄青霉素抗性基因，能在含氨苄青霉素和无色染料X-gal的培养基中生存且不会将无色染料X-gal变成蓝色的菌落即为含有目的基因的大肠杆菌。 C 知识解构 高分破译 即时演练 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向02 载体和DNA的粗提取与鉴定 知识解构 高分破译 即时演练 题后归纳：双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 （2）筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含空载质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 考点一 重组DNA技术的基本工具 考向02 载体和DNA的粗提取与鉴定 3.(2024·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 鉴定过程中的水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误。 A 研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确，B错误。 知识解构 高分破译 即时演练 该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照组，D错误。 考点二 基因工程的基本操作程序 任务2：目的基因获取与PCR扩增 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】科研人员已知道Cry1Ac基因两端序列，但不知道全部序列，能否用PCR扩增？引物应怎样设计？PCR体系包括哪些成分？ 知识落点： PCR产物鉴定 PCR原理 PCR条件 引物 引物设计 温度 DNA连接酶 载体 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 1.基因工程的基本操作程序 知识解构 即时演练 高分破译 目的基因的 筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因是什么呢?来源？ 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 （1）目的基因来源 知识解构 即时演练 高分破译 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 a.原核生物基因 终止子：终止转录 非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号 终止子：终止RNA的合成 编码区：编码蛋白质的合成 信使RNA 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 b.真核生物基因 终止子：终止转录 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 1 2 3 4 5 转 录 剪切、拼接 不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时为什么还要转录？？ 不同外显子拼接，RNA不完全相同，基因的选择性表达体现。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 (2)目的基因的筛选与获取 知识解构 即时演练 高分破译 a.目的基因： 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因； 主要是编码特定蛋白质的基因 结构和功能清晰 b.目的基因的筛选方法： ②利用 和序列比对工具进行筛选。 ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 序列数据库 c.获取目的基因的方法 ①通过构建基因文库来获取目的基因 ②人工合成目的基因 ③利用PCR特异性地快速扩增目的基因 基因组文库 部分基因文库（主要是cDNA文库） 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 ①从基因文库中直接获取： 知识解构 即时演练 高分破译 与载体连接 导入受体菌群 用适当 限制酶切割 基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 许 多 DNA片段 该生物 基因组文库 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 mRNA逆转录形成 (cDNA文库) 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子。cDNA文库中的基因不含以上结构 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 ②人工合成目的基因 a.前提： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 b.方法： ③利用PCR特异性地快速扩增目的基因 提取 苏云金芽孢杆菌 抗虫基因 ？ 快速获得大量抗虫基因 PCR(聚合酶链式反应)是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 各种组分 反应条件 体外 引物是一小段能与__________的一段碱基序列_________的______________. 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 a.DNA复制所需的基本条件: 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双链 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 （体外用耐高温的DNA聚合酶） （体外用高温代替） （2种,一对） DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 b.引物的作用: 知识解构 即时演练 高分破译 3′ 5′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模 板 链 子链 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端 子链的延伸方向是5 ′→3 ′ 子链延伸 子链延伸 -5 ′ 3′- 引物 5′- -3′ 5′- -3′ 引物 3′- -5′ 2种 引物使DNA聚合酶能够从引物的3’ 端开始连接脱氧核苷酸。 (DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 引物是决定PCR特异性的关键。 （长度通常为20-30个核苷酸） 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 c.利用PCR特异性地快速扩增目的基因的条件 条件 DNA模板： 引物(2种): 四种脱氧核苷酸： 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 (dNTP) 提供DNA复制的模板 合成子链DNA的原料 Taq DNA聚合酶: 缓冲溶液: 一般添加Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯键) 也能为DNA合成提供能量 引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链 在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 高温： 在体外代替解旋酶打开 双链 反应还需要其他条件，如控温系统、缓冲液（一般添加Mg2+）---能够调节PH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 b.PCR反应过程： 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA链。 注意：复性温度过高会破坏引物与模板碱基互补配对。 过低，会造成引物与模板结合位点增加，导致非特异性产物增加。 注意：复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，当长度相同，但G-C含量高，需更高温度。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 e.PCR相关计算 知识解构 即时演练 高分破译 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 引物A 引物B 扩增一次 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 e.PCR相关计算 知识解构 即时演练 高分破译 扩增二次 2 中长链-短链DNA____个 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 e.PCR相关计算 知识解构 即时演练 高分破译 4 2 7 7 2 出现完整的目的基因 扩增三次 短链-短链DNA______个 中长链-短链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 长链-中长链DNA____个 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 e.PCR相关计算 知识解构 即时演练 高分破译 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 每次循环后目的基因的量增加一倍,即成_______形式扩增(约为2n) 指数 PCR的结果： 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 f.产物进行鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 PCR过程可以在______________中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 PCR扩增仪 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 （3）基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 注意：启动子≠密码子 思考：目的基因该插入什么位置？ 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 思考：目的基因该插入什么位置？ 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 诱导型启动子： 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译  项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学 成分 位置 作用 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 启动子与终止子位于DNA分子中，起始和终止转录过程。 不编码氨基酸 编码氨基酸 启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，起始和终止翻译过程。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 a.基因表达载体的构建(核心思路) 知识解构 即时演练 高分破译 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子(重组质粒) 同一种 思考：使用一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？ :用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 即时演练 高分破译 b.单酶切 启动子 方向 目的基因转录方向 限制酶切割 a b c d DNA连接酶 连接 a、b、c、d四个黏性末端相同 思考：目的基因和质粒混合后加DNA连接酶一定是质粒+目的基因的正确连接吗？ 自身环化 目的基因自身环化 质粒自身环化 质粒与目的基因反向连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 自身连接 正向连接 反向连接 质粒 目的基因 思考: 怎么改进解决以上问题？ 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 c.双酶切 知识解构 即时演练 高分破译 :用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。 限制酶a切割 a b DNA连接酶 连接 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 a b 双酶切的优点: (1)防止质粒自身环化，防止目的基因自身环化 (2)防止质粒与目的基因反向连接 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 c.载体与基因表达载体的辨析 知识解构 即时演练 高分破译 载体 相同点:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 不同点: 基因表达载体在载体基础上增加了启动子, 目的基因, 终止子 思考：启动子, 目的基因, 终止子怎么插入载体？ 考点二 基因工程的基本操作程序 高分破译 限制酶的选择技巧 知识解构 即时演练 高分破译 1.限制酶如何选择： ①应选择切割位点位于 目的基因两端 的限制酶，如图甲可选择PstⅠ； ②不能选择切割位点位于 的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ； ③为避免目的基因和质粒的 ，也可使用不同的限制酶切割目的 ，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点) 目的基因两端 目的基因内部 自身环化和随意连接 基因和质粒 考点二 基因工程的基本操作程序 高分破译 限制酶的选择技巧 知识解构 即时演练 高分破译 1.限制酶如何选择： ④选择限制酶切割位点的基本原则： a.切割目的基因时：不破坏目的基因。 b.切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选。 c.切割目的基因和质粒时：最好选用不同的限制酶切割 理由：防止目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接 考点二 基因工程的基本操作程序 高分破译 限制酶的选择技巧 知识解构 即时演练 高分破译 2.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 图中 Ti质粒均不宜选取，而 Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： 甲、乙、丁 丙 考点二 基因工程的基本操作程序 任务2：目的基因获取与PCR扩增 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】科研人员已知道Cry1Ac基因两端序列，但不知道全部序列，能否用PCR扩增？引物应怎样设计？PCR体系包括哪些成分？ 知识落点： 答案要点：可以扩增，因为PCR只需知道目的基因两端一段已知序列来设计两种引物。引物5′端分别添加XbaⅠ、BamHⅠ识别序列，便于后续双酶切。PCR体系加模板、2种引物、4种dNTP、Taq酶、含Mg²⁺缓冲液。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。 考点二 基因工程的基本操作程序 任务3：导入甘蔗受体细胞与筛选 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】甘蔗是单子叶植物，用农杆菌转化法需要注意什么？目的基因最终整合到哪里？ 知识落点： 花粉管通道法 显微注射法 农杆菌转化法 转化 Ca2＋处理法 病毒介导法 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 (4)将目的基因导入受体细胞 知识解构 即时演练 高分破译 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞（感受态）→基因表达载体导入细胞中 能发育成完整个体 繁殖快、单细胞、遗传物质少 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 a.花粉管通道法 知识解构 即时演练 高分破译 (我国科学家独创的一种方法) 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 b.农杆菌转化法 知识解构 即时演练 高分破译 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 与肺炎链球菌转化实验实质相同，都是基因重组。 任务:请用一句话描述 你看到的农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 思考：为什么要选用农杆菌用于转化，有何特点？ 知识解构 即时演练 高分破译 (2)农杆菌细胞内含有_______，当它侵染植物细胞 后，能将________上的______________ （__________） 转移到被侵染的细胞，并且将其_________________ ____________________。 (1)能在自然条件下侵染___________和___________， 而对大多数___________没有侵染能力； 双子叶植物 裸子植物 单子叶植物 Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 可转移的DNA 整合到该细胞的染色体DNA上 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 辨析：①农杆菌转化法小结： 该过程经过____次拼接、____次导入？ (1)第一次拼接______________________________________ (2)第二次拼接______________________________________ (3)第一次导入______________________________________ (4)第二次导入______________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 Ti质粒 目的基因 构建 基因表达载体 转入 农杆菌 导入 植物细胞 T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中 表达 新性状 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 c.显微注射法 知识解构 即时演练 高分破译 表达载体提纯 受精卵 胚胎 雌性动物的输卵管或子宫内 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 新性状的动物 发育 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 d.病毒介导法（主要用于导入动物细胞） 知识解构 即时演练 高分破译 科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 e.Ca2+处理法 知识解构 即时演练 高分破译 Ca2+ 用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。 感受态细胞 吸收 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 表达载体 缓冲液 溶于 吸收DNA，完成转化 使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态 考点二 基因工程的基本操作程序 任务3：导入甘蔗受体细胞与筛选 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】甘蔗是单子叶植物，用农杆菌转化法需要注意什么？目的基因最终整合到哪里？ 知识落点： 可用农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织，但需优化条件。T-DNA携带Cry1Ac整合到甘蔗染色体DNA上。用抗生素筛选转化愈伤组织，再经组织培养获得植株。 考点二 基因工程的基本操作程序 任务4：分子水平与个体水平检测鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】如何证明Cry1Ac已插入、已转录、已翻译？如何证明转基因甘蔗真的抗条螟？ 知识落点： 思考： 个体水平 检测插入 检测转录 检测翻译 电泳 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 思考：为什么电泳可以对PCR产物进行鉴定？ 知识解构 即时演练 高分破译 PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 DNA片段电泳鉴定的原理： 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 (4)目的基因的检测与鉴定 思考1：检测甘蔗染色体DNA上是否插入了目的基因或检测是否有目的基因？ 思考2：检测目的基因是否翻译出mRNA？ 思考3：检测目的基因是否翻译？ 思考4：检测目的基因翻译出的蛋白质对个体有用？ 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 a.分子水平检测 知识解构 即时演练 高分破译 ①检测目的基因是否导入 ——通过PCR等技术检测 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系； 电泳操作 抗虫甘蔗 PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 ②检测目的基因是否转录 提取mRNA PCR操作 是否扩增出目的基因 对扩增产物进行检测 抗虫甘蔗 10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录 逆转录 产生DNA 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 a.分子水平检测 ——通过DNA分子杂交技术检测 探针 目的基因 原理：碱基互补配对 带标记(荧光、放射性同位素)的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 ③检测目的基因是否导入/转录 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 ④检测目的基因是否翻译 a.分子水平检测 ——通过抗原-抗体杂交检测 思考：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性？ 苏云金芽孢杆菌 提取 Cry1Ac抗虫毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 抗虫甘蔗 考点二 基因工程的基本操作程序 知识点02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 b.个体水平检测 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未侵染上病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 考点二 基因工程的基本操作程序 任务4：分子水平与个体水平检测鉴定 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】如何证明Cry1Ac已插入、已转录、已翻译？如何证明转基因甘蔗真的抗条螟？ 知识落点： 思考： 答案要点：PCR检测Cry1Ac是否插入甘蔗染色体DNA；RT-PCR检测是否转录；抗原—抗体杂交检测Bt蛋白；个体水平用条螟幼虫做抗虫接种实验。提取DNA时可用甘蔗幼叶，经研磨、冷酒精析出、2 mol/L NaCl溶解、二苯胺沸水浴鉴定。 判断以下表述是否正确： (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。（ ✘ ） (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。（ ✔ ） (3)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。（ ✘ ） (4)表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。（ ✘ ） (5)外源DNA必须位于重组质粒的启动子上游或终止子的下游才能进行表达。（ ✘ ） 考点二 基因工程的基本操作程序 回归教材·易错辨析 知识解构 高分破译 即时演练 ✔️ ✘️ 提示：周期性为了变性、复性和延伸。 提示：DNA聚合酶不一定要从受体细胞中获得，具有热稳定性即可。 ✘️ ✘️ 提示：目的基因的表达的启动是启动子。 提示：位于启动子的下游和终止子的上游。 ✘️ 考点二 基因工程的基本操作程序 考向01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 1.用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如下图所示。经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是(　　) A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各1个 B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各1个 C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因 D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D 知识解构 高分破译 即时演练 “第四轮循环得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，2个③复制得到2个③和2个⑤，2个④复制得到2个④和2个⑤，2个⑤复制得到4个⑤，故第四轮循环得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。 （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的______________对质粒进行酶切。 考点二 基因工程的基本操作程序 考向01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 2.（2026·贵州·T21） 高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： Bcl I和Xba I 知识解构 高分破译 即时演练 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为________bp。 W试剂：识别G；X试剂：识别G、A； Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C 2500    3+6 （1）若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 （2）在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 考点二 基因工程的基本操作程序 考向01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列5’-ATCGCGAACG-3’的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的5’末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的3’端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从5’端到3’端第___________位核苷酸发生了甲基化。 3和9 知识解构 高分破译 即时演练 X 4 考点二 基因工程的基本操作程序 考向01 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建 知识解构 高分破译 即时演练 （3）启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 考点二 基因工程的基本操作程序 考向02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 1.为增加玉米抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交检测后，进一步筛选出抗旱的转基因玉米。下列相关叙述错误的是(　　) A．提取该微生物的mRNA逆转录为cDNA，通过PCR获得大量目的基因 B．重组Ti质粒进入玉米幼胚组织细胞后表达出抗旱性状不可遗传，后代需再次导入重组Ti质粒 C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞后，可经组织培养获得转基因植株 D．用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状 B 知识解构 高分破译 即时演练 重组Ti质粒进入玉米幼胚组织细胞后会将E基因整合到染色体DNA上，并通过细胞增殖遗传给后代，无需再次导入，B错误； 考点二 基因工程的基本操作程序 考向02 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 2.下图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述错误的是(　　) A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA整合到④的染色体DNA分子上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 C 知识解构 高分破译 即时演练 ④的染色体上若含抗虫基因目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C项错误； 考点二 基因工程的基本操作程序 典型例题 1.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) D SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 知识解构 即时演练 高分破译 A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 考点二 基因工程的基本操作程序 典型例题 2.研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是(　　) A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶 B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态 C．按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因 D．在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落 C 重组质粒含有LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，故在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可使菌落呈蓝色，D正确。 知识解构 即时演练 高分破译 按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误； 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 任务5：基因工程应用拓展 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】除抗虫甘蔗外，基因工程在广西甘蔗产业还可怎样应用？ 知识落点： 农牧业、食品工业 生产生物能源 基因工程菌生产干扰素 知识点01 基因工程的应用 1.基因工程在农牧业方面的应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 (1)培养抗性植物： 转基因抗虫植物： 转基因抗病植物： 转基因抗除草剂植物： 转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等 ①方法： ②成果： 科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物 转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等 将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种 转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等 ①方法： ②成果： ①方法： ②成果： 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物 知识点01 基因工程的应用 1.基因工程在农牧业方面的应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 (2)改良植物的品质： 我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛，呈现出自然界中没有的颜色变异，大大提高了观赏价值。 将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导人植物中,可以提高这种氨基酸的含量 ①方法： ②成果： 优良性状的基因导入植物 知识点01 基因工程的应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 (4)改善畜产品的品质： ①方法： ②成果： 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组 转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响 (3)提高动物的生长速率： ①方法： ②成果： 将外源生长激素基因导入动物体内， 以提高动物的生长速率。 转基因鲤鱼 知识点01 基因工程的应用 2.基因工程在医药卫生领域的应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 (1)对微生物或动植物的细胞进行基因改造生产药物 我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。 细胞因子、抗体、疫苗和激素等 常见药物类型： 实例： 干扰素基因 质粒 重组质粒 大肠杆菌或酵母菌 可大量生产干扰素的大肠杆菌或酵母菌 构建 导入 培养 知识点01 基因工程的应用 (2)让转基因哺乳动物批量生产药物 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 ①实例： 乳腺生物反应器或乳房生物反应器 ②培育过程： 药用蛋白基因 乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 受精卵 泌乳期 分泌乳汁 转基因动物 药物蛋白 显微注射 发育 获得乳腺生物反应器的步骤与培育普通转基因动物的步骤有什么区别？ 培育乳腺生反应器时要选用乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件与药用蛋白基因重组在一起，目的是让药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达。 知识点01 基因工程的应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 几乎所有细胞。 【思考1】为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 【思考2】药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 【思考3】研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组。 【思考4】膀胱生物反应器的优点: ①可以从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。 ②从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达。 知识点01 基因工程的应用 (2)让转基因哺乳动物批量生产药物 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 比较内容 基因工程菌 乳腺生物反应器 含义 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 基因表达 细菌合成药物蛋白可能没有活性 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 受体细胞 微生物细胞 哺乳动物受精卵 目的基因 导入方式 Ca2＋处理法 显微注射法 药物提取 从微生物细胞或其培养液中提取 从哺乳动物乳汁中提取 知识点01 基因工程的应用 2.医药卫生领域 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 用转基因动物作为器官移植的供体 培育无免疫排斥的转基因克隆猪器官 抑制抗原决定基因表达 或除去抗原决定基因 在器官供体基因组中导入某种调节因子 3.食品工业方面 基因工程菌 概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 基因工程构建基因工程菌 工业发酵批量生产 培育可以降解多种污染物的“超级细菌” 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 任务6：蛋白质工程改造Bt蛋白 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】天然Cry1Ac对条螟毒力不够，或对家蚕存在潜在风险，怎样改造这种前所未有的蛋白质? 知识落点： 蛋白质工程 密码子简并性 改造基因 预期功能→设计预期结构→推测氨基酸序列→改造或合成基因→表达获得蛋白质。 知识点01 基因工程的应用 1.蛋白质工程崛起缘由 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 (1)基因工程的实质： (2)基因工程的不足： 基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。 a.基因工程原则上只能生产自然界中已存在（天然）的蛋白质。 b.天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 ☞第二代基因工程(蛋白质工程) 知识点02 蛋白质工程的原理和应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 2.蛋白质工程的概念 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种_______蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 新的 基础： 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系； 操作对象： 改造或合成基因 结果： 改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质 与基因工程的关系： 目的： 以满足人类生产和生活的需求 在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程 蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 困难： 知识点02 蛋白质工程的原理和应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 3.蛋白质工程的基本思路： 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 预期的蛋白质功能 设计 预期的蛋白质结构 应有的氨基酸序列 推测 改造或合成 转录 翻译 生物功能 行使 DNA mRNA 思考：蛋白质工程为什么不直接改造蛋白质？ 改造基因易于操作且改造后可遗传。 知识点02 蛋白质工程的原理和应用 4.蛋白质工程的技术手段 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 确定蛋白质结构与功能对应关系 基因定点突变 改变某基因中的 某个或某几个碱基 对应蛋白质的氨基酸组成发生改变 具有新功能的蛋白质 计算机技术 晶体学、X射线衍射技术 ①利用蛋白质工程研发 。 ②实例：如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成 ，在一定条件下，可以延长保存时间。 知识点02 蛋白质工程的原理和应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 5.蛋白质工程的应用 ①蛋白质工程被广泛用于改进 或开发新的工业用酶。 ②实例：枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。 药物 丝氨酸 酶的性能 光合作用 (1)在医药方面 (2)在工业方面 (3)在农业方面 科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物_________的效率，增加粮食的产量。 知识点02 蛋白质工程的原理和应用 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 即时演练 高分破译 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 起点 过程 实质 结果 应用及现状 联系 预期蛋白质功能 目的基因 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 通过改造相应的基因达到对蛋白质的改造 基因重组 可以创造出自然界不存在的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 ①主要集中在对现有蛋白质进行改造，②对创造新的蛋白质还有许多技术难题未突破，因为蛋白质高级结构非常复杂，人们对此知之甚少 ①已被广泛应用，如转基因植物、动物、药品生产等已商业化 ①蛋白质工程获得目的基因后，需要通过基因工程获得预期蛋白质 ②蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 任务6：蛋白质工程改造Bt蛋白 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】天然Cry1Ac对条螟毒力不够，或对家蚕存在潜在风险，怎样改造这种前所未有的蛋白质? 知识落点： 答案要点：若要提高对条螟毒力并降低对家蚕影响，可设计更专一结合条螟中肠受体的结构域，推测氨基酸序列，再对Cry1Ac基因进行定点突变或结构域替换，构建表达载体后在受体中表达并筛选。不能直接改造mRNA；最终必须落实到基因改造。 (1)科学家利用转基因技术培育了抗玉米螟的玉米，种植该玉米的农田就不需要进行防虫管理了。（ ✘ ） (2)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。（ ✘ ） (3)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。（ ✔ ） (4)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。（ ✘ ） (5)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。（ ✘ ） (6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构。（ ✘ ） 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 回归教材·易错辨析 知识解构 高分破译 即时演练 ✔️ ✘️ 提示：是因为抗玉米螟而不是抗所有害虫。 ✘️ ✘️ 提示：药用蛋白基因与乳腺中特意表达的基因启动子等调控原件一起导入哺乳动物的受精卵中。 提示：还要经过加工才可以使用。 ✘️ 提示：只需要改变部分氨基酸序列即可。 提示：都是对基因进行改造从而达到改造蛋白质的目的。 ✘️ 考向01 基因工程的应用 1.下图为获得抗除草剂转基因玉米A的技术路线，下列相关叙述错误的是(　　) 注：报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。 A．采用PCR扩增目的基因时，设计的引物间要避免形成氢键 B．为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种不同的限制酶 C．检测是否转化成功，需要依次利用抗生素抗性基因和报告基因 D．利用T-DNA可以将目的基因插入农杆菌的染色体DNA上 D 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 T-DNA可以将目的基因插入受体玉米细胞的染色体DNA上，D错误。 考向01 基因工程的应用 2.某实验小组将人生长激素基因导入大肠杆菌以制备工程菌，下列相关叙述错误的是(　　) A．人生长激素基因可以下丘脑细胞的mRNA为模板通过逆转录获得 B．将人的生长激素基因导入大肠杆菌，需要处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 C．利用基因工程菌制备的生长激素需要与天然产品的功能进行活性比较 D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，基因工程菌无法对生长激素进行进一步加工和修饰 A 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 人生长激素基因在垂体细胞中表达，在下丘脑细胞中不表达，因此下丘脑细胞中没有生长激素基因转录出的mRNA，A错误； 考向02 蛋白质工程的原理和应用 1．下图是蛋白质工程的示意图，下列有关叙述正确的是(　　) A．蛋白质工程的顺序是A、B、C、D、E、F、G B．A、B过程是在细胞核内完成的，C过程是在细胞质内完成的 C．G过程的完成依赖于改造或合成基因 D．C过程可在大肠杆菌中由内质网和高尔基体完成 C 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 由图可知，蛋白质工程的基本流程为E、F、G、A、B、C、D；A错误。 图中A过程表示转录，其主要场所是细胞核，B过程表示翻译，其场所为细胞质中的核糖体；B错误。 由题图可知，要改造蛋白质结构，最终是通过改造或合成基因来实现的；大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体;D错误。 考向02 蛋白质工程的原理和应用 2.T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。下列叙述正确的是(　　) A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴，自然界中酶都可通过蛋白质工程进行改造 C．蛋白质工程与中心法则的流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 D．若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响 D 考点三 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 蛋白质工程与中心法则的流动方向相反，C项错误； T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类及空间结构发生了改变，A项错误； T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴，自然界中的酶大多数是蛋白质，少数是RNA，蛋白质工程只能用于改造蛋白质类酶，B项错误； 任务7：蔗桑交错区安全性与伦理评价 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】转基因甘蔗在蔗桑交错区试验，需重点评估什么？可采取哪些措施？ 知识落点： 转基因成果 伦理 理性看待转基因技术 基因污染 克隆 转基因产品 知识点01 转基因产品的安全性 1.转基因产品的安全性 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 (1)转基因成果 领域 成果 微生物 方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的 ； ②构建高产、优质的基因工程菌生产氨基酸； ③用基因工程菌生产药物 转基因动物方面　 ①培育 、 的转基因家禽、家畜； ②培育抵抗相应病毒的动物新品种； ③建立某些人类疾病的转基因动物模型 转基因植物方面　 培育具有 、 、 和耐储藏等新性状的作物 发酵周期 生长迅速 营养品质优良 抗虫 抗病 抗除草剂 知识点01 转基因产品的安全性 (2)对转基因产品安全性的争论 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 优点 缺点 ①解决粮食短缺问题； ②大大减少农药的使用量，减少环境污染； ③增加食物营养，提高附加值； ④增加食物种类，提升食物品质； ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ①可能出现新的过敏原或重组形成新病原微生物； ②可能产生抗除草剂的超级杂草； ③可能使疾病的传播跨越物种的界限（基因污染）； ④可能会破坏生物多样性； ⑤可能会对人类生活环境造成二次污染。 知识点01 转基因产品的安全性 (3)基因污染 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 ：指人工组合的基因，通过转基因作物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种并成为后者基因的一部分。 a.基因污染的途径： ①转基因植物的相关基因通过花粉传播而进入附近的野生植物或邻近的非转基因农作物。 ②转基因作物在自然条件下存活并发育成为野生的、杂草化的转基因植物。 ③土壤微生物或动物肠道微生物吸收转基因作物后获得外源基因。 知识点01 转基因产品的安全性 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 b.防止基因污染的方法： ①将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中。由于α-淀粉酶可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。 ②将目的基因转入叶绿体基因组或线粒体基因组中。花粉中含有精子，其几乎不含细胞质，而受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组或线粒体基因组中后，就不会通过花粉转移到自然界中的其他植物。 知识点02 关注生殖性克隆人 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 1.关注生殖性克隆人 取出 体细胞 取核 核移植 去核卵母细胞 诱导 发育 移植 胚胎干细胞 诱导 各种细胞组织或器官 移植 代孕母体 分娩 克隆人 治疗性克隆 生殖性克隆 有本质区别 重构胚胎 知识点02 关注生殖性克隆人 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 （1）生殖性克隆和治疗性克隆的比较 类型 生殖性克隆 治疗性克隆 概念 目的 水平 联系 产生独立生存的新个体 治疗疾病 个体水平 细胞水平 都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同 是指通过克隆技术产生独立生存的新个体 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官,用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官从而达到治疗疾病的目的 知识点02 关注生殖性克隆人 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 2.关于生殖性克隆人的争论 观点 理由 赞同 ①科学研究有 ，社会应该允许科学家研究； ②现在的伦理道德观念还不能接受，但是__________是可以改变的 大多数人反对 ①生殖性克隆人“ ”； ②在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了 ，是克隆技术的滥用； ③克隆技术还不成熟，面临着 等问题 自己内在的发展规律 有违人类尊严 人类伦理道德 人的观念 流产、死胎和畸形儿 不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 3.四不原则： 知识点02 关注生殖性克隆人 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 4.试管婴儿和设计试管婴儿 试管婴儿与设计试管婴儿都是有性生殖，都要通过①体外受精，并进行②外早期胚胎 培养和③胚胎 移植，不同的是设计试管婴儿胚胎移植前需进行遗传学诊断 。 体外受精 遗传学诊断 体外早期胚胎培养 胚胎移植 知识点02 关注生殖性克隆人 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 【提醒】试管婴儿和“设计试管婴儿”的异同点 类型 试管婴儿 设计试管婴儿 技术手段 不需进行__________ 胚胎移植前需进行__________ 实践应用 解决 问题 用于 等疾病的治疗 联系 二者都是体外受精，经体外 ，再进行 ，在生殖方式上都为__________ 遗传诊断 遗传诊断 不孕不育 白血病、贫血病 早期胚胎发育 胚胎移植 有性生殖 知识点03 禁止生物武器 1. 生物武器的种类及特点 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 种类 ①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等； ②病毒类：天花病毒，某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等； ③___________类：肉毒杆菌毒素等。 特点 致病能力___；攻击范围___；传播途径多、范围大；成本低等 散布途径 可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 生化毒剂 强 广 任务7：蔗桑交错区安全性与伦理评价 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 【情境背景】转基因甘蔗在蔗桑交错区试验，需重点评估什么？可采取哪些措施？ 知识落点： 答案要点：重点评估花粉飘移到桑园、基因漂移、对家蚕等非靶标昆虫和土壤生物的影响。措施：设隔离带、缓冲区，不在桑园上风向种植，开花前去雄，监测桑叶Bt蛋白和家蚕饲喂安全，严格审批和标识管理。 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 知识解构 即时演练 高分破译 甘蔗“桂糖42号”设计方案 目标：培育抗条螟转基因甘蔗，评价蔗桑交错区对家蚕影响。 路线：Cry1Ac扩增→双酶切建载体→农杆菌转化→筛选再生→检测→安全评价。 基因获取：据两端序列设计引物，PCR扩增，5′端加不同酶切位点，电泳鉴定。 载体构建与导入：双酶切目的基因和质粒，连接酶连接；目的基因置启动子下游、终止子上游；农杆菌侵染甘蔗愈伤组织，T-DNA整合染色体，优化侵染条件。 筛选再生：用T-DNA内标记基因对应抗生素筛选，组织培养成植株。 检测鉴定：PCR检测插入，RT-PCR检测转录，抗原—抗体杂交检测翻译；条螟饲喂鉴定抗虫性。 拓展与优化：可培育抗病、抗除草剂甘蔗；按蛋白质工程思路改造Cry1Ac。 安全评价：评估花粉漂移和对家蚕影响；设隔离带、缓冲区，不在桑园上风向种植，开花前去雄，家蚕饲喂监测，依法审批 (1)高产青霉素菌株属于转基因成果。（ ✘ ） (2)转基因技术是高科技的分子生物学技术，对利用其开发出来的产品产生争论是一种对科学的无知。（ ✘ ） (3)转基因技术及其应用是伴随着质疑、担忧甚至反对的声音而不断发展的。（ ✔ ） (4)我国政府主张对治疗性克隆和生殖性克隆的有效监控并进行严格审查。（ ✘ ） (5)“设计试管婴儿”技术与试管婴儿技术没有什么不同。（ ✘ ） (6)生物武器可通过吸入、误食、接触带菌物品，被带菌昆虫叮咬等侵入人体。（ ✔ ） 考点四 生物技术的安全性与伦理问题 回归教材·易错辨析 知识解构 高分破译 即时演练 ✔️ ✘️ 提示：是诱变育种的结果。 ✘️ ✘️ 提示：是合理的现象，技术往往有利有弊。 ✘️ 提示：生殖性克隆应该是被禁止的。 提示：设计试管婴儿需要进行遗传学诊断。 ✔️ 考向01 转基因产品的安全性 1.随着转基因技术的发展，“基因污染”应运而生，下列关于基因污染的叙述，不正确的是(　　) A．外源基因可通过转基因作物的花粉散落到该作物的近亲作物上，从而污染生物基因库 B．基因污染是一种不可以扩散的污染 C．杂草、害虫从它的近亲处获得抗性基因，可能会破坏生态系统的稳定性 D．转基因生物有可能成为入侵的外来物种，威胁生态系统中其他生物的生存 B 考点四 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 基因可以通过复制而传播，故基因污染是一种可以通过复制传播给其他生物的可扩散污染，B错误； 考向01 转基因产品的安全性 2.转基因技术就是把某一物种具有的特定基因进行分离，并把它转移到另一物种中去，从而使这一物种具有组合基因。然而，转基因技术也可能会带来负面影响。下列选项中不是由转基因生物带来的弊端的是(　　) A．在转基因生物的食品加工中带来食品污染 B．转基因生物的大规模繁殖导致生态入侵 C．使近亲野生物种具有抗性基因，可能会变成“超级杂草” D．对生物多样性产生的影响，如抗除草剂作物的产生会破坏农田生物多样性 A 考点四 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 食品加工带来的食品污染应属于加工不当，而非转基因技术自身带来的负面影响，A错误。 转基因生物的大规模繁殖导致生态入侵，属于转基因生物带来的弊端，B正确。 使近亲野生物种具有抗性基因，可能会变成“超级杂草”，属于转基因生物带来的弊端，C正确。 对生物多样性产生的影响，如抗除草剂作物的产生会破坏农田生物多样性，属于转基因生物带来的弊端，D正确。 考向02 关注生殖性克隆人和禁止生物武器 1．下列关于治疗性克隆和生殖性克隆的说法，错误的是 (　　) A．使用病人自己的细胞产生胰岛细胞以治疗糖尿病属于治疗性克隆 B．将一个克隆的胚胎移植到一个女性子宫中发育成婴儿的过程属于生殖性克隆 C．治疗性克隆属于无性生殖，生殖性克隆属于有性生殖 D．治疗性克隆和生殖性克隆均需要应用动物细胞培养和核移植技术 C 考点四 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的；生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆和生殖性克隆均需要应用到动物细胞培养和核移植技术；无论治疗性克隆还是生殖性克隆，都属于无性生殖。 考向02 关注生殖性克隆人和禁止生物武器 2.中国首例“设计试管婴儿”的父母均为地中海贫血基因的携带者。此前，二人曾育有一女，此女患有重度地中海贫血。为了再生一个健康的孩子，用孩子的脐带血帮助姐姐进行造血干细胞移植，设计了这个婴儿。下列有关说法不合理的是(　　) A．“设计试管婴儿”利用体外受精、胚胎移植、植入前胚胎遗传学诊断技术等 B．“设计试管婴儿”与试管婴儿均为有性生殖 C．“设计试管婴儿”与试管婴儿都要进行胚胎选择，但两者选择的目的不同 D．设计婴儿性别是“设计试管婴儿”的第一步 D 考点四 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 “设计试管婴儿”不一定非要考虑性别，且设计婴儿性别在一定程度上违背了伦理道德，D不合理，D错误。 考向02 关注生殖性克隆人和禁止生物武器 3.下列有关生物武器的叙述，错误的是(　　) A．生物武器的种类包括致病菌类、病毒类、毒品、生化毒剂等 B．鼠疫、炭疽、霍乱等的病原体都可以用来制造生物武器 C．生物武器可以直接散布或通过食物、生活必需品等散布 D．我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器 A 考点四 基因工程和蛋白质工程的应用 知识解构 高分破译 即时演练 生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类，毒品不属于生物武器，A错误； 真题溯源·考向感知 溯源真题逻辑，感知高考考向 04 135 真题溯源·考向感知 题组一 情景设定： 酶切实例 知识溯源：基因工程的工具 1.（2026·湖北·高考真题） 为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（ ） A. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B. F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C. F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D. F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 B 真题溯源·考向感知 题组一 情景设定： 酶切实例 知识溯源：基因工程的工具 【分析】XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误；F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确；F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误；PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 真题溯源·考向感知 题组二 情景设定：转基因生物培育过程 知识溯源：基因工程的操作步骤 2.（2026·江西·高考真题）（多选） 研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A. 需在72℃条件下培养基因工程菌 B. 添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C. 可根据电泳结果初步评价T的纯度 D. 可根据PCR产物的多少计算T的活性 AB 【分析】该基因工程菌为大肠杆菌，培养大肠杆菌的适宜温度为37℃左右；72℃是该DNA聚合酶T催化PCR反应延伸时的适宜温度，不是培养工程菌的温度，72℃条件下大肠杆菌无法存活，A错误；诱导物浓度并非越高越好，高浓度诱导物通常会对工程菌的生长产生毒害，反而会抑制目的蛋白的表达，降低T酶的产量，B错误；蛋白质电泳可根据条带数目初步判断蛋白质的纯度：若仅出现目的条带说明纯度高，出现多条杂带说明杂质多，C正确；T酶的活性是其催化PCR合成DNA的能力，相同反应条件下，T酶活性越高，单位时间内扩增得到的PCR产物量越多，因此可以根据PCR产物的多少计算T酶的活性，D正确。 真题溯源·考向感知 3.（2026·山东·高考真题） 小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 真题溯源·考向感知 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是___________。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为_______________。 启动子 复制原点 KpnⅠ、XhoⅠ     【分析】要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ。 真题溯源·考向感知 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是___________________________________________________________________________________________________。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。 抗原-抗体杂交     【分析】（3）由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。（4）检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 真题溯源·考向感知 5.（2026·陕晋青宁卷·高考真题） 研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 （1）当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的___________性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是___________(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 （2）为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于___________型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的___________酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是___________。 引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育    简并性  ③ 诱导 RNA聚合 真题溯源·考向感知 题组二 情景设定：转基因生物培育过程 知识溯源：基因工程的操作步骤 【分析】（1）由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因（J*），这样能避免转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符，需要对其进行测序并序列比对，所以选③。 （2）因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗虫棉，所以在该载体中，启动子P属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达。之后检测到J*蛋白在细胞外积累，说明S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育。 真题溯源·考向感知 （3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是___________________或___________________两种组合，原因是__________________________________________________________________ ________________________________。 （4）为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是__________________________________________________________________________________。可利用_____________________法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，___________(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 EcoR I和Kpn I EcoR I和SaI I 从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变） 增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触 农杆菌转化法 抑制 真题溯源·考向感知 题组二 情景设定：转基因生物培育过程 知识溯源：基因工程的操作步骤 【分析】（3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是EcoR I和Kpn I或EcoR I和SaI I两种组合，原因是根据图中信号肽序列的核苷酸数量，从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译（即发生移码突变）。 （4）为获得足够的重组质粒，对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触。将融合基因导入棉花茎尖细胞，可利用农杆菌转化法。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，使组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 真题溯源·考向感知 6.（2026·河南·高考真题） 4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： RNA聚合 （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为___________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为__________________________。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 复制原点 终止子 终止目的基因的转录 XhoⅠ NcoⅠ 真题溯源·考向感知 题组二 情景设定：转基因生物培育过程 知识溯源：基因工程的操作步骤 【分析】（1）载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点（DNA复制的起始位点）。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 （2）结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 真题溯源·考向感知 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________（答出一点即可）。 程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 b 重组表达载体总长度为5129bp， 双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 真题溯源·考向感知 题组二 情景设定：转基因生物培育过程 知识溯源：基因工程的操作步骤 【分析】（3）根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 （4）工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 真题溯源·考向感知 题组三 情景设定：蛋白质改造实例 知识溯源：蛋白质工程 7.（2026·河南·高考真题）胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A. 甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B. 胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C. 第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D. 由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 D 真题溯源·考向感知 题组三 情景设定：蛋白质改造实例 知识溯源：蛋白质工程 【分析】蛋白质工程从预期蛋白质功能出发，经结构设计、氨基酸序列推导最终改造对应基因，再通过基因表达获得改造蛋白，整个过程遵循中心法则即遗传信息传递的一般规律，A正确；酶的专一性指酶只能催化一种或一类化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后的甲无其可作用的位点因此不能被水解，体现了酶的专一性，B正确；改造后甲仍保持抗体活性，第96位精氨酸未被替换，推测该位点可能与抗体的功能密切相关，替换后可能导致抗体活性丧失，C正确；密码子简并性是指同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发生改变，D错误。 真题溯源·考向感知 题组三 情景设定：蛋白质改造实例 知识溯源：蛋白质工程 8.（2026·江西·高考真题） 蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A. 第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B. 将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C. 判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D. 甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 D 真题溯源·考向感知 题组三 情景设定：蛋白质改造实例 知识溯源：蛋白质工程 【分析】酶的活性依赖其特定的空间结构，第n位甲硫氨酸氧化会改变蛋白酶E的局部结构，进而改变E的空间结构，导致酶活性下降，A正确；蛋白质的氨基酸序列由编码它的基因的碱基序列决定，替换特定位置的氨基酸可通过蛋白质工程（即第二代基因工程）改造对应基因的碱基序列，再经表达获得改造后的蛋白酶，B正确；本次改造的目的是提高E对S的耐受性，因此判断改造效果的指标是经S处理后酶的活性保留情况，需用S处理一段时间后测定酶活性进行对比，C正确；酶的专一性由酶活性位点的结构决定，替换甲硫氨酸提高了E对S的耐受性，没有信息表明该替换改变了酶的活性位点结构，无法得出E的专一性降低的结论，D错误。 真题溯源·考向感知 题组四 情景设定：转基因生物实例 知识溯源：基因工程的应用 9.（2026·湖南·高考真题） 将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（ ） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 B 真题溯源·考向感知 题组四 情景设定：转基因生物实例 知识溯源：基因工程的应用 【分析】所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确；重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误；外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确；启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 真题溯源·考向感知 10.（2026·浙江1月·高考真题） 农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： （1）表达载体导入农杆菌细胞：用CaCI溶液处理农杆菌，制备_______________________ ____________________________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从 繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经__________________________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ    感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 真题溯源·考向感知 题组四 情景设定：转基因生物实例 知识溯源：基因工程的应用 【分析】（1）用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞（可导入外源DNA分子的农杆菌）。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 真题溯源·考向感知 （2）假丝酵母重组菌株的获得：在________________________________________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用_______________________________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选_________________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有_____________________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 （3）重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________________________________________________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________________，导致甘油合成代谢受阻。 超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落  腐草霉素 提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间  T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 真题溯源·考向感知 题组四 情景设定：转基因生物实例 知识溯源：基因工程的应用 【分析】（2）为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台（或无菌实验室或灭菌的操作台）的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因（Zeoᴿ）。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 （3）从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 情境探究·素养拓展 深挖素材脉络，规范长句作答 05 160 情境探究·长句作答 1.将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T­DNA转移)和不含有Vir基因、含有T­DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1—F3，R1—R3表示引物；T­DNA­LB表示左边界；T­DNA­RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_____________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是_________________________________。 (2)本操作中获取目的基因的方法是__________和________________。 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是_____________________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_________________________。 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用____________________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 水解蛋白质，去除与DNA结合的蛋白质 溶解蛋白质，更好地析出DNA 人工合成 利用PCR扩增 RNA聚合酶识别和结合的部位 提高目的基因转录的效率 潮霉素B抗性(HygBR) 情境探究·长句作答 【分析】(1)蛋白酶能专一性水解蛋白质，不能水解DNA，因此提取DNA时加入蛋白酶可以去除与DNA结合的蛋白质。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，因此提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精能溶解蛋白质，更好地析出DNA。 (2)据图分析可知，图中的目的基因由两个DNA片段拼接而成，其中1—1 362基因序列是人工合成的，1 363—1 848基因序列是利用PCR扩增Bt基因后酶切得到的，所以本操作中获取目的基因的方法是人工合成和利用PCR扩增。 (3)p35s启动子位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动目的基因转录出mRNA；插入两个p35s启动子的目的可能是提高目的基因转录的效率。(4)据图分析可知，穿梭质粒上的潮霉素B抗性基因(HygBR)位于T­DNA上，T­DNA(可转移的DNA)可整合到棉花愈伤组织细胞的染色体DNA上，因此可以用潮霉素B抗性基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 情境探究·长句作答 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。 A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C．将1—1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D．用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 F3 　R2 D 【分析】(5)据图可知，目的基因由两个DNA片段拼接而成，其中1—1 362基因序列的一条链可以与引物F3配对，1 363—1 848基因序列的互补链可以与引物R2配对，因此，要检测棉花植株是否导入目的基因，应选用引物F3和R2进行PCR。 (6)蛋白质工程是改造或合成基因，而不直接改造蛋白质，本研究中用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，这部分生物技术属于蛋白质工程。 情境探究·长句作答 2.接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是__________________________________。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有________________。 (2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取______________________并用__________扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。 (3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是 否出现杂交带 用于筛选含有重组表达载体的细胞 启动子和终止子 染色体DNA(基因组DNA) PCR 2027年高考一轮复习讲练测 生物学 165 $