第26讲 基因工程和蛋白质工程（5大考点）（知识清单）（上海专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

第26讲 基因工程和蛋白质工程 目录导航 01知识脑图·核心脉络巧搭建——梳理专题框架，搭建知识体系 02考点梳理·必背知识全突破——深挖高频考点，总结速记易错 考点1 基因工程赋予生物新的遗传特性 考点2 基因工程的三种基本工具 考点3 目的基因的获取与PCR技术 考点4 表达载体的构建、导入与筛选鉴定 考点5 蛋白质工程 知识脑图·核心脉络巧搭建 考点1 基因工程赋予生物新的遗传特性 必背知识梳理 1．基因工程的概念与科学意义 ①概念：将一种或多种生物（供体）的基因与运载工具在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。 ②别称：由于重组拼接的基因和运载工具都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术。 ③操作对象：基因（DNA分子）；操作水平：分子水平；操作场所：主要在生物体外进行。 ④科学意义：对有性生殖的生物而言，不同物种之间存在生殖隔离，难以进行基因交流；重组DNA技术打破了这种天然屏障，使跨物种间基因的定向转移成为可能。 ⑤技术地位：发酵工程所用菌种、细胞工程所涉及的细胞株，很多都是由基因工程改造过的，因此基因工程是现代生物工程的核心技术。 【深度理解】基因工程实现的是“基因重组”，属于可遗传变异中的基因重组范畴，而不是染色体变异；其变异方向由人设计决定，因而具有“定向性”——这与自然状态下基因重组的不定向、随机发生有本质区别。教材强调“打破生殖隔离”，落点正是进化与适应观：自然界的隔离是进化的结果，重组DNA技术则人为跨越了这道屏障。 2．基因工程诞生的理论基础与技术支撑 类别 关键事件 时间 为基因工程提供的基础 理论基础 肺炎双球菌转化实验 1944年 揭示DNA是遗传物质，且DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体——基因转移操作的先驱性工作 理论基础 DNA双螺旋模型与中心法则 1953年起 阐明了DNA复制、转录和翻译过程，明确了遗传信息传递方向，为提升目的基因的复制和表达水平奠定基础 理论基础 遗传密码的破译 1963—1966年 认识到自然界几乎所有生物共用一套遗传密码，为基因的鉴别和合成提供理论依据 技术支撑 发现质粒 1953年 质粒具有独立复制能力、可在细菌细胞间转移——为基因转移找到了运载工具 技术支撑 开发工具酶 1970年 鉴定了第一种能切割DNA的限制性内切核酸酶，随后分离纯化了多种能连接DNA的酶 技术支撑 实现DNA体外重组 1972年 首次在体外完成DNA的切割和拼接，构建出第一个体外重组DNA分子 ⑥诞生的标志：1973年，美国科学家考恩和博耶等人在体外构建出含有四环素和青霉素两个抗性基因的重组DNA分子，导入大肠杆菌后能稳定复制并使大肠杆菌表达出相应的抗生素抗性，由此宣告基因工程的诞生。 【科学史话】从“能不能转”到“确实能转”，科学家用了三组递进实验：①把鼠伤寒沙门氏菌的RSF1010与大肠杆菌的pSC101两种不同来源的DNA片段在试管中拼接，导入大肠杆菌后发现重组分子不仅能准确复制，还能表达两种DNA的遗传信息；②把亲缘关系较远的金黄色葡萄球菌基因导入大肠杆菌，同样表达出原有性状；③把非洲爪蟾的基因植入大肠杆菌并获得表达，从而把结论由原核生物外推到真核生物。微生物之所以成为基因工程的首批“主角”，是因为其无性繁殖、生长迅速、易于基因操作——每个改造过的细胞都如同一台微型生物反应器。 基因工程的理论基础和技术支撑——理论三条、技术三条，共同托举重组DNA技术 【核心知识】“三理论、三技术”配套记忆：理论——肺炎双球菌转化实验（DNA是遗传物质）、DNA双螺旋与中心法则（信息传递方向）、遗传密码的破译（共用一套密码）；技术——发现质粒（运载工具）、开发工具酶（切与接）、实现DNA体外重组（拼装成功）。理论解决“能不能转”，技术解决“用什么转、怎么转”。 3．基因工程改善人类的生活品质 领域 典型案例 技术要点 医学 重组乙肝疫苗 获得乙肝病毒表面蛋白（抗原）基因→转入酵母→酵母高效合成表面抗原蛋白；酵母易大规模发酵，彻底摆脱血液需求与病毒培养。1981年美国批准人血培养病毒制得的乙肝疫苗；1997年我国批准酵母“工程菌”生产重组乙肝疫苗 医学 重组人胰岛素 1982年第一例基因工程产品——重组人胰岛素正式上市；1998年我国重组人胰岛素研制成功，大大推动了国内基因工程的产业化进程 医学 转基因小鼠与大鼠生长激素基因 1982年将大鼠生长激素基因转入小鼠，培育出具有大鼠雄健体魄的转基因小鼠 医学 首例人体基因治疗 1990年美国批准，对一名因腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷患重度联合免疫缺陷病的儿童进行基因治疗并获成功 农牧业 转基因抗虫棉 将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改造后引入棉花；该基因表达无毒的伴孢晶体蛋白，棉铃虫其碱性消化液（pH 7.5~8.0）将其水解为毒性肽，导致消化道麻痹死亡。我国是世界上第二个独立成功研制抗虫棉的国家 农牧业 抗除草剂大豆 20世纪80年代获得草甘膦抗性基因并导入大豆，1994年在美国批准种植 食品工业 氨基酸生产 用谷氨酸棒状杆菌大规模发酵生产谷氨酸；天然菌株产量低，基因工程可改良菌株遗传性状，大幅度提高产量 普通棉花（左，对照）与转基因抗虫棉（右，抗虫）——叶片完整度与棉铃受害程度形成直观对比 【素养链接】抗虫棉的“抗虫”不是靠毒杀，而是“两步激活”：伴孢晶体蛋白本身无毒，被敏感害虫碱性消化液水解成毒性肽后才起作用。这解释了为什么抗虫棉对人畜相对安全——人的胃液为强酸性，不能完成这一步水解。答题时务必写全“伴孢晶体蛋白→碱性消化液水解→毒性肽→消化道麻痹”这条因果链。 【前沿拓展】基因治疗四例：①Luxturna（2017，AAV载体置换修复RPE65功能，治疗遗传性视网膜病变）；②Zolgensma（2019，AAV载体，治疗脊髓性肌萎缩症SMA）；③Casgevy（2023，全球首个CRISPR基因编辑疗法，治疗镰状细胞贫血和β-地中海贫血）；④CAR-T细胞治疗（基因改造患者自身T细胞，精准识别并消灭癌细胞）。四者的共同点是“向细胞内引入或修改基因”，不同点在“修复、补充还是改造免疫细胞”。 速记口诀突破 1． 基因工程的定义与地位 口诀：体外拼接运载体，转入受体显新性；打破隔离定向转，现代生物工程核心。 解释：“体外拼接”点明操作在细胞外进行；“运载体”即载体；“转入受体显新性”是目的；科学意义是打破生殖隔离、实现基因的定向转移；技术地位是现代生物工程的核心技术。 2． 诞生的理论基础与技术支撑 口诀：四分（肺炎）双螺（1953）密码破，质粒载体酶切割；七二拼装七三成，考恩博耶写春秋。 解释：理论三条：1944年肺炎双球菌转化实验、1953年DNA双螺旋与中心法则、1963—1966年遗传密码破译；技术三条：发现质粒、开发工具酶、1972年实现DNA体外重组；1973年考恩与博耶宣布基因工程诞生。 3． 基因工程三大应用领域 口诀：医疫苗加基因治，农抗虫兼抗除草，食品谷氨酸靠工程菌。 解释：医学——乙肝疫苗、基因治疗；农牧业——抗虫棉、抗除草剂大豆；食品工业——用基因工程菌株发酵生产谷氨酸等氨基酸。 4． 抗虫棉的抗虫机理 口诀：晶体蛋白先无毒，碱液水解毒性肽；麻痹肠道虫自死，人胃强酸反无碍。 解释：苏云金芽孢杆菌基因表达的伴孢晶体蛋白本身无毒，被棉铃虫碱性消化液（pH 7.5~8.0）水解成毒性肽，使害虫消化道麻痹死亡；人的胃液呈强酸性，无法完成这一水解，故相对安全。 易错易混辨析 易错点 正确辨析 基因工程能定向改变生物的遗传性状，属于定向的染色体变异 错。基因工程的原理是基因重组，不是染色体变异；其变异方向由人的设计决定，具定向性。 基因工程只能在同种生物之间转移基因 错。基因工程正是要打破生殖隔离这一天然屏障，实现不同物种之间基因的定向转移。 基因工程之所以能跨物种，是因为不同生物共用一套遗传密码 不全面。共用一套遗传密码是“目的基因能在受体细胞中翻译出相同蛋白质”的原因；而跨物种转移之所以可行，还依赖于DNA结构相同、都能自我复制。 基因工程的诞生只依赖分子生物学的发展 错。基因工程是多学科综合发展的成果，其理论基础来自遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等多个分支学科。 基因工程是现代生物工程的核心技术，说明它比其他工程更重要 不准确。“核心”是指发酵工程的菌种、细胞工程的细胞株多经基因工程改造，基因工程技术贯穿于其他工程之中，而非单纯的重要性排序。 乙肝疫苗重组生产中，酵母只是提供营养的培养基 错。酵母是受体细胞（工程菌），目的基因（乙肝病毒表面抗原基因）在酵母中表达，酵母起“微型生物反应器”的作用。 转基因抗虫棉对人有毒，不能食用 错。伴孢晶体蛋白本身无毒，需经昆虫碱性消化液水解成毒性肽才起作用；人胃液为强酸性，不能完成该水解。 基因治疗就是把有缺陷的基因直接切除 错。基因治疗是将正常基因导入受体细胞以补偿或替换缺陷基因的功能（如ADA基因），并非简单“切除”缺陷基因。 抗虫棉导入抗虫基因时，只能以受精卵为受体细胞 错。可用受精卵，也可用体细胞作受体，再经植物组织培养获得完整植株。 转基因作物的基因一定来自同种生物 错。转基因作物的外源基因可来自亲缘关系很远的物种，如抗虫棉的Bt基因来自苏云金芽孢杆菌。 考点2 基因工程的三种基本工具 必背知识梳理 1．限制性内切核酸酶——分子手术刀 ①发现：20世纪60—70年代，限制性内切核酸酶的发现使人们能够对双链DNA分子进行精确切割；目前已在细菌中发现上千种。 ②识别序列：每一种限制酶识别双链DNA特定的序列，长度通常为4~8个碱基对（bp），称为识别序列。如EcoRⅠ的识别序列为5'-GAATTC-3'，PstⅠ为5'-CTGCAG-3'。 ③切割位点：限制酶与识别序列结合后，在识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间切开DNA分子的两条链，断开的化学键是磷酸二酯键。 ④结果：切割后形成的双链DNA片段末端会呈单链突出，EcoRⅠ与PstⅠ切出的单链突出方向不同；若线形DNA分子两端点的单链突出部分呈序列互补且方向相同，则能在较低温度下重新“粘”在一起（互补碱基之间形成氢键），这样的单链末端称为黏性末端。 限制性内切核酸酶识别特定DNA序列并在切割位点切开DNA——识别序列方向相反，切出的黏性末端方向也相反 【结构与功能观】限制酶只有在识别并结合DNA特定序列结构之后，才能发挥切割功能——结构（识别序列）决定功能（切割位点），生命大分子的作用不是“随机切”，而是“认准了才切”，这正是基因工程能够“定向”的分子基础。 2．限制酶的选择原则 ①不破坏目的基因：切割位点不能落在目的基因内部。如目的基因两侧有PstⅠ位点而中间有SmaⅠ位点，应选PstⅠ而不选SmaⅠ。 ②保留载体关键结构：质粒的标记基因、启动子、终止子、复制原点不能被切破。如某限制酶位点落在标记基因内，则不宜选用。 ③确保出现相同黏性末端：通常目的基因与载体选用同一种限制酶；为避免目的基因和载体自身环化、随意连接，也可用两种不同的限制酶进行双酶切。 ④不切割细菌自身DNA：含某种限制酶的细菌，其DNA分子不具备该酶的识别序列，或甲基化酶已把甲基转移至该识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。 常见限制酶 识别序列（5'→3'） 切割结果 末端类型 EcoRⅠ GAATTC／CTTAAG 在G与A之间切开，切出5'-突出口AATT 黏性末端 PstⅠ CTGCAG／GACGTG 在A与G之间切开，切出3'-突出口TGCA 黏性末端 BamHⅠ GGATCC／CCTAGG 在G与G之间切开，切出5'-突出口GATC 黏性末端 MboⅠ GATC／CTAG 识别4个碱基对，切出5'-突出口GATC 黏性末端 SmaⅠ CCCGGG／GGGCCC 在两个碱基之间平切 平末端 常见限制酶举例——EcoRⅠ切出黏性末端，SmaⅠ切出平末端 【实验提醒】BamHⅠ与MboⅠ识别序列不同（GGATCC与GATC），但切出的黏性末端都是5'-GATC，彼此可以连接；连接后原有的两种识别序列都不再存在，因此不能用这两种酶把目的基因重新“卸下”。这正是“同尾酶”设题的落点：①能连——黏性末端相同；②不能再切——识别序列已消失。 3．DNA连接酶——分子缝合针 ①作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 ②本质：恢复的是被限制酶切开的磷酸二酯键，而不是黏性末端之间已经形成的氢键。 ③来源与功能差异：E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端；T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。 DNA连接酶作用示意图——黏性末端靠氢键“粘”住后，连接酶封闭两条链上的缺口 比较项 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只能缝合黏性末端 黏性末端和平末端都能缝合 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 4．载体——分子运输车 ①作用原理：大部分DNA片段（尤其目的基因）不具备可遗传的自我复制能力，缺少复制所必需的特定DNA序列；即便能在原供体细胞中复制，这种能力也难以在受体细胞中正常发挥。载体正是为外源DNA提供在受体细胞中复制能力的运载工具。 ②本质：任何具备在受体细胞中独立复制性能的DNA分子，理论上均可用作载体。 ③两大类：质粒DNA（广泛存在于微生物细胞中，大多数为双链环状DNA分子，能独立于拟核DNA自主复制；并非宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素抗性基因）与病毒DNA（不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将DNA高效导入宿主细胞）。 ④其他：生物体内还存在其他能独立于染色体DNA而自主复制的小型DNA，其结构与功能均有别于质粒DNA和病毒DNA。 细菌破裂后拟核DNA与质粒的透射电子显微镜照片（2700×，左上角为单个质粒的放大图） 载体的条件 原因 能在受体细胞中稳定自主复制（含复制原点） 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因，便于目的基因插入 具有特殊的标记基因（如抗生素抗性基因） 便于重组DNA分子的筛选；也能帮助宿主抵御环境不利因素的影响 对受体细胞无毒害、易分离 避免受体细胞受到损伤，便于后续获得纯净的重组DNA分子 5．三种基本工具的分工与比较 比较项 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体 别称 分子手术刀 分子缝合针 分子运输车 化学本质 蛋白质（酶） 蛋白质（酶） DNA分子（质粒或病毒DNA） 作用部位 磷酸二酯键（切开） 磷酸二酯键（缝合） 无催化作用，提供复制能力 作用结果 把DNA切成带黏性末端（或平末端）的片段 把两个DNA片段连接成完整的DNA分子 携带目的基因进入受体细胞并复制 是否属工具酶 是 是 否——是载体，不是酶 【核心知识】“两酶一载体”，只有两酶是酶。易错点在于把质粒也算作“工具酶”——质粒的本质是DNA，它不催化任何反应。此外，限制酶与DNA连接酶的“作用对象都是磷酸二酯键”，只是方向相反：一个切开、一个缝合，而解旋酶作用于氢键、DNA聚合酶则把单个脱氧核苷酸连接成链。四种酶放在一起考时，先问“断的是哪个键”。 6．相同黏性末端连接后能否再被原酶识别 ①若两个相同的黏性末端由同一种限制酶（如EcoRⅠ）切割所得，连接后形成的序列与原识别序列相同，能再被该酶识别、切开。 ②若两个相同的黏性末端由两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制酶（如BamHⅠ与MboⅠ）分别切割所得，连接后原来的识别序列消失，不能再被这两种酶识别。 【易错拓展】判断能否“重新卸下”目的基因，只需看连接后的序列是否还原了某个酶的完整识别序列：同一种酶切出的两个末端拼接后原位复原（能切）；不同种酶切出的两个末端拼接后形成的是“杂合序列”（不能切）。这也是双酶切构建表达载体后，无法再用同一种酶回收目的基因的原因。 速记口诀突破 1． 限制酶 口诀：认序列、切酯键，四个到八个碱基宽；切出口、成黏端，互补方向才粘连。 解释：限制酶识别4~8个碱基对的特定序列，切断的是磷酸二酯键；切出的单链突出若互补且方向相同，可经氢键黏合，形成黏性末端。 2． DNA连接酶 口诀：连的是酯键不是氢键；大肠只连黏，T4黏平全能接。 解释：DNA连接酶封闭的是磷酸二酯键（共价键），黏性末端之间的氢键是自行形成的；E.coli连接酶只能连黏性末端，T4连接酶黏性、平末端都能连。 3． 载体 口诀：能复制、有切口、带标记、无毒害。 解释：载体须具备四个条件：能在受体细胞中自主复制、有一个至多个限制酶切割位点、有特殊的标记基因、对受体细胞无毒害且易分离。 4． 限制酶的选择原则 口诀：不伤目的不破标，同尾才能接得牢；自身DNA切不到，双酶防环连得妙。 解释：①不破坏目的基因；②不破坏标记基因、启动子、终止子、复制原点；③目的基因与载体要切出相同黏性末端；④限制酶不切割细菌自身DNA；用两种不同限制酶切割可防止自身环化和反向连接。 5． 四种酶的作用对象 口诀：限制切开磷酸酯，连接缝合同一个；解旋只断氢键处，聚合连核苷酸成串。 解释：限制酶切开磷酸二酯键；DNA连接酶缝合磷酸二酯键；DNA解旋酶断裂碱基对之间的氢键；DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸依次连接起来（形成磷酸二酯键）。 6． 同尾酶能否被重新切开 口诀：同酶切、同酶连，原位复原还能切；异酶切、异酶连，序列已改切不成。 解释：同一种限制酶切出的两个黏性末端连接后恢复了原识别序列，可再被该酶识别；两种不同限制酶切出的相同黏性末端连接后识别序列消失，不能再被识别。 ◆ 易错易混辨析 易错点 正确辨析 限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 错。限制酶和DNA连接酶是工具酶，质粒是载体，其化学本质是DNA，不是酶。 限制性内切核酸酶可以切割DNA分子中的任意序列 错。每种限制酶只识别并切割特定的核苷酸序列（通常4~8 bp），具有专一性。 DNA连接酶可以连接目的基因与载体之间的氢键 错。氢键是黏性末端之间自行形成的；DNA连接酶恢复的是被限制酶切开的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用完全相同 错。E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端；T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。 限制酶切割DNA分子后，一定会产生黏性末端 错。若切割位点在两条链的对应位置平齐，则产生平末端，如SmaⅠ切CCCGGG得到平末端。 质粒是细菌生存所必需的DNA分子 错。质粒并非宿主正常生长所必需，但它大都携带抗生素抗性等基因，能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 质粒上的抗生素合成基因常作为标记基因 错。作为标记基因的是抗生素抗性基因（如Amp^r、Tet^r），其表达产物使转化细胞能在含相应抗生素的培养基上存活，从而被筛选出来。 载体只限于质粒，病毒不能作为载体 错。载体包括质粒DNA和病毒DNA两大类；病毒能在宿主细胞中自主复制并通过感染高效导入DNA，是常用的载体。 两种不同的限制酶切出的相同黏性末端连接后，仍能用原来的酶切开 错。连接后原来的识别序列已不存在，序列变为杂合序列，不能再被这两种酶识别。 基因工程中必须用同一种限制酶切割目的基因和载体 错。只要黏性末端相同就能连接，两种DNA并不必须用同一种酶切开；实际中常用双酶切以防止自身环化和反向连接。 考点3 目的基因的获取与PCR技术 必背知识梳理 1．目的基因的概念与获取途径 ①概念：目的基因是人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。例如在规模化生产人胰岛素的基因工程中，人胰岛素基因就是目的基因。 ②意义：从供体生物的DNA中有效分离和克隆目的基因，是基因工程各项产业化应用的前提，也是基因工程项目实施的首要阶段。 ③选取依据：采用何种方法分离获得特定目的基因，取决于对目的基因背景知识的了解程度。 对目的基因序列的了解程度 常用获取方法 关键说明 部分序列已知 聚合酶链式反应（PCR） 需已知目的基因两侧序列，以便设计一对引物 完整序列已知 化学合成法 按设计好的序列直接合成；基因较短时首选，如人胰岛素B链基因 序列未知 基于大规模筛选的方法 构建基因文库（基因组文库或cDNA文库），再从文库中筛选目的基因 2．PCR的原理与体系 ①概念：PCR是一项模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术，由美国科学家穆勒斯于20世纪80年代中期首创，可特异、高效、准确地将微量DNA样品中特定区域的序列扩增到可检测量。 ②体系五要素：DNA模板、引物、DNA聚合酶（耐热Taq酶）、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、缓冲液（含Mg²⁺的10×PCR buffer）。 ③前提条件：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成引物；因为几乎所有生物来源的DNA聚合酶都只能从引物的3'端延伸DNA链，不能从头合成。 ④三步循环：变性—退火—聚合，重复n次，理论上可从1分子双链DNA模板扩增至2ⁿ个分子。 步骤 温度 发生的变化 变性 95 ℃ 待扩增的双链DNA样品变性解链，形成单链模板 退火 55~68 ℃ 两条不同的引物分别与两条单链DNA模板的互补序列结合（形成氢键） 聚合 75 ℃左右 耐热DNA聚合酶催化，从两条引物的3'端以相反方向合成新的DNA子链 【思维训练】PCR为什么要用引物和耐热DNA聚合酶？①迄今为止发现的DNA聚合酶都不能以单个脱氧核苷酸为起点从头合成，只能把脱氧核苷酸加到一段已存在的核苷酸链（引物）上；②引物按碱基互补配对“搭”在模板的特定区域，温度偏低时会与不完全配对的区域结合，造成非特异性扩增，所以连续多轮循环必须在高温下进行；③高温下普通DNA聚合酶会变性失活，只有来自嗜热细菌的耐热DNA聚合酶才能坚持工作——这正是PCR技术得以实用的核心。三步温度也由此确定：95 ℃为了彻底解链，55~68 ℃为了引物“贴得牢又不乱贴”，75 ℃左右是耐热酶最活跃的区间。 PCR的基本程序——变性、退火、聚合三步一循环，多轮循环使目的DNA迅速扩增 3．PCR的操作要点与质量指标 ①引物设计：引物1和引物2之间不能发生碱基互补配对，引物分子内部也不能发生互补配对，否则会形成引物二聚体或发夹结构。 ②加酶切位点：若要保证目的基因能与载体连接，可在引物的5'端加入限制酶识别序列——因为新链是从引物3'端延伸的，5'端会被保留在产物末端。 ③退火温度：与引物的长度和碱基组成有关；引物长度一定时，G-C含量高则退火温度也应升高，否则容易出现非特异性结合。 ④不用解旋酶：PCR过程中DNA双链在高温下即可解旋；由于反应温度高，所用DNA聚合酶必须耐高温（来自嗜热细菌）。 ⑤反应体系配制应在冰浴中进行，避免引物在室温下非特异性结合和酶提前活化。 质量指标 含义 关键影响因素 特异性 扩增产物纯净单一，无杂带 引物长度和退火温度 准确性 扩增产物的序列忠实于模板DNA序列 所用高温DNA聚合酶的保真性 有效性 扩增产物高产量 酶量和镁离子浓度 4．PCR与体内DNA复制的比较 比较项 PCR技术 DNA复制 原理 半保留复制 半保留复制 场所 体外（PCR扩增仪中） 细胞内（主要是细胞核中） 模板 一段目的DNA片段 整个DNA分子 原料 4种脱氧核苷三磷酸 4种脱氧核苷三磷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶等 能量 热能（PCR仪控制温度） ATP 引物 单链DNA片段（上游、下游引物各一条） 短链RNA片段 解旋方式 高温变性解旋 DNA解旋酶催化 温度条件 在较高温度下进行，需控温、缓冲液、Mg²⁺、无菌技术 细胞内温和条件 结果 快速扩增特定目的DNA片段 复制整个DNA分子，速度相对较慢 5．PCR扩增的定量规律 ①经过n轮循环，得到2ⁿ个DNA分子；含引物的DNA分子为2ⁿ个。 ②含其中一种引物的DNA分子数为（2ⁿ－1）个；同时含两种引物的DNA分子为（2ⁿ－2）个。 ③共需要消耗引物（2ⁿ⁺¹－2）个。 ④含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子为2ⁿ个；含等长脱氧核苷酸链的DNA分子为（2ⁿ－2n）个。 【计算提醒】“原模板两条链”是理解全部公式的钥匙：第n轮产物中，只有2个DNA分子各带一条原模板链（即“不等长链”），其余（2ⁿ－2）个都是“等长链”，而“等长链”的数目随循环增加正是由引物延伸而来。求引物消耗量时，用“每轮新增的链数”求和：第1轮2条、第2轮4条……第n轮2ⁿ条，总和为2ⁿ⁺¹－2。 6．DNA的提取、分离与鉴定 ①提取原理（分离DNA与蛋白质）：DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精；在一定浓度的乙醇或异丙醇溶液中，DNA溶解度下降，可沉淀形成纤维状絮团飘浮其中。 ②操作流程：肝脏样品切块→加生理盐水碾压磨碎→纱布过滤收集肝细胞悬浮液→加SDS破碎细胞释放DNA→缓缓加入预冷乙醇→析出DNA→用玻璃棒搅动缠绕（白色絮状物）。 ③鉴定原理：DNA大分子的脱氧核糖在酸性条件下加热，能与二苯胺（1%的冰醋酸溶液）反应，生成蓝色化合物。 ④鉴定步骤：DNA样品加3 mL蒸馏水加热15 min溶解→取1 mL加2 mL二苯胺试剂混匀→60 ℃加热15 min→观察颜色。 常见设问 原因分析 乙醇为什么要预冷？ 降低DNA溶解度，使DNA更易析出；同时减少DNA降解、减少杂质共沉淀 SDS的作用是什么？ 十二烷基硫酸钠使细胞膜破裂、蛋白质变性并与DNA分离，便于释放和纯化DNA 为什么不用哺乳动物成熟红细胞提取DNA？ 哺乳动物成熟红细胞无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，无法用于提取 提取的DNA不是白色絮状物说明什么？ 说明样品中混有较多杂质（如蛋白质、多糖） DNA样品中混有RNA和蛋白质会影响二苯胺鉴定吗？ 不会。二苯胺只与脱氧核糖反应生成蓝色化合物，RNA和蛋白质分子中不含脱氧核糖 【深度理解】“颜色深浅”反映DNA含量多少，“絮状物纯白程度”反映纯度高低——两者不可混为一谈。若溶液不呈蓝色，可能是提取的DNA含量太低、操作失误导致DNA损失，或二苯胺试剂变质。二苯胺法可用于样品中DNA含量的测定，其应用延伸至亲子鉴定、法医鉴定与考古依据等领域。 速记口诀突破 1． 目的基因获取三策 口诀：部分已知用PCR，全长已知化学合，序列未知建库筛。 解释：目的基因部分序列已知时用PCR扩增；完整序列已知时可直接化学合成；序列完全未知时只能构建基因文库后大规模筛选。 2． PCR三步循环 口诀：九五变性、五五至六八退火、七五聚合，一去一来扩两倍。 解释：变性95 ℃使双链解开，退火55~68 ℃让引物与模板互补结合，聚合75 ℃左右由耐热DNA聚合酶延伸子链；每完成一轮，DNA分子数加倍。 3． PCR五要素 口诀：模板、引物、热聚合酶，四种dNTP加缓冲液。 解释：PCR体系由DNA模板、一对引物、耐热DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸和含Mg²⁺的缓冲液构成。 4． PCR与体内复制 口诀：都是半保留，一个体内一个体外；体内靠解旋酶和ATP，体外靠高温加热能。 解释：两者原理都是半保留复制；体内复制用解旋酶解链、消耗ATP、以RNA为引物；PCR在体外靠高温解链、以单链DNA为引物、靠热能驱动。 5． PCR扩增规律 口诀：n轮得2的n次方，含一种引物少一个，含两种引物少两个，耗引物多一倍再减二。 解释：n轮得2ⁿ个DNA分子；含一种引物的DNA为2ⁿ－1个；同时含两种引物的为2ⁿ－2个；共消耗引物2ⁿ⁺¹－2个。 6． DNA提取与鉴定 口诀：酒精沉DNA，SDS碎细胞；二苯胺遇脱氧核糖，酸性加热显蓝色。 解释：DNA不溶于酒精而在乙醇中溶解度下降析出；SDS破碎细胞、使蛋白质变性；二苯胺在酸性条件下与脱氧核糖反应生成蓝色化合物。 7． 猪血不能提取DNA的原因 口诀：猪红成熟无核，鸡红有核带DNA。 解释：哺乳动物成熟红细胞没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA；鸟类（如鸡）成熟红细胞有细胞核，可用于提取DNA。 易错易混辨析 易错点 正确辨析 目的基因一定就是编码蛋白质的基因 错。目的基因主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 PCR扩增需要解旋酶使DNA双链分开 错。PCR中DNA双链通过高温（95 ℃）变性解开，不需要解旋酶。 PCR所用的DNA聚合酶与细胞内的DNA聚合酶完全相同 错。PCR须用耐热的DNA聚合酶（如Taq酶），来自嗜热细菌；普通DNA聚合酶在高温下会变性失活。 PCR过程中引物1和引物2的序列可以相同 错。两条引物分别与两条模板链互补，序列不同；且引物1与引物2之间不能互补配对。 PCR扩增n次后得到2n个DNA分子 错。应得到2ⁿ个DNA分子；n轮是循环次数，不是简单的倍数。 PCR扩增时新链从引物的5'端开始延伸 错。DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸新链，因此5'端序列会被保留在扩增产物末端——这正是可在5'端加限制酶位点的原因。 目的基因序列完全未知时，也可直接设计引物进行PCR 错。PCR的前提是目的基因两侧序列已知；序列未知时只能构建基因文库后筛选。 提高退火温度一定能提高扩增产量 错。退火温度过低易产生非特异性扩增，过高则引物难以结合、扩增效率下降；需根据引物长度和G-C含量选择适宜温度。 二苯胺试剂可与DNA、RNA和蛋白质反应生成蓝色 错。二苯胺只与DNA中的脱氧核糖反应显蓝色，RNA和蛋白质不含脱氧核糖，不会反应。 用哺乳动物血液提取DNA比用肝脏更方便 错。哺乳动物成熟红细胞无细胞核和线粒体，几乎不含DNA；鸡血的红细胞有细胞核，可用于提取DNA。 考点4 表达载体的构建、导入与筛选鉴定 必背知识梳理 1．基因工程的基本操作流程 ①以重组人胰岛素生产为例：获取人胰岛素基因（目的基因）→安装在合适的载体上→把重组好的DNA分子（表达载体）导入合适的受体细胞→对目的基因及其表达产物进行鉴定→借助含重组DNA的受体细胞大量生产重组人胰岛素。 ②四步概括：获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→筛选和鉴定含目的基因的受体细胞。 ③六字口诀式表达：“取（获取）—切（切割）—接（连接）—转（转化）—增（扩增）—检（筛选与鉴定）”。 2．表达载体的构建——切与接 ①过程：将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制酶切割出黏性末端（切），然后加入DNA连接酶将两者连接为一体（接），形成含目的基因且能表达的表达载体。 ②目的：不仅使目的基因在受体细胞中稳定存在，而且要能表达。 ③组成五元件：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。 基因表达载体的组成——启动子、终止子、标记基因、复制原点各司其职 组成 位置 功能 目的基因 插入在载体上 控制目标性状，是基因工程的核心 启动子 目的基因上游的一段DNA序列 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子 目的基因下游的一段DNA序列 使转录在所需要的地方停下来 标记基因 载体上预先存在 供筛选使用，便于挑出含重组DNA分子的细胞 复制原点 载体上预先存在 使表达载体能在受体细胞中自我复制 ④四项注意：a.目的基因两侧黏性末端相同，能以正反两种方式等概率插入载体，但多数应用中只有一种方式可用；b.载体片段两侧黏性末端相同，连接时载体可自我环化，形成“空载”的非重组DNA分子；c.根据DNA连接酶的工作原理，目的基因与载体只需黏性末端相同便能连接，两种DNA并不必须用同一种酶切开；d.若用两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶分别切割，连接后原来的识别序列会消失，不能再用相应酶从重组DNA中“卸下”目的基因。 【核心知识】启动子、终止子与起始密码子、终止密码子必须分清：启动子和终止子都是DNA序列，分别控制转录的开始与结束；起始密码子和终止密码子都位于mRNA上，分别控制翻译的开始与结束。把“启动子决定翻译的开始”写进答案是最常见的失分点。 比较项 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 目的基因上游（DNA） 目的基因下游（DNA） mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别并结合，驱动转录 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 层面 转录水平 转录水平 翻译水平 翻译水平 3．将DNA分子导入受体细胞——转 ①原因：经连接操作后的DNA分子只有导入受体细胞，才能借助细胞内的基因表达系统使目的基因所蕴含的遗传信息得以表达。 ②受体细胞：可以是微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。如改良农作物性状，受体细胞显然来自相应的植物。 ③转化：自然条件下DNA很难进入细胞；为大幅度提高效率，需对受体细胞进行特殊处理，这一操作称为转化（“转”）。 ④方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法）。 ⑤扩增（“增”）：转化成功的效率只有10⁻⁴~10⁻²，转化后的细胞需经过一段时间培养，使用于筛选的性状得以表达，这一过程称为扩增。 生物种类 常用方法 受体细胞 转化过程 植物 农杆菌转化法、花粉管通道法 体细胞或受精卵 目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 动物 显微注射法 受精卵 提纯含目的基因的表达载体→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物 氯化钙法 原核细胞 Ca²⁺处理细胞→使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→导入基因表达载体 4．借助标记基因筛选与鉴定——检 ①必要性：转化操作中只有少数细胞能接纳DNA分子，而且进入受体细胞的DNA分子还有可能是空载质粒，因此需要快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞。 ②标记基因：可供筛选使用的功能性基因，如抗生素抗性基因。 ③抗药性筛选（第一轮）：大肠杆菌pBR322质粒含氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）和四环素抗性基因（Tet^r）。外源DNA插入BamHⅠ位点后，Tet^r基因被插入灭活；转化扩增的细菌涂布在含Amp的平板上，理论上长出的菌落即转化成功的克隆。 ④抗药性筛选（第二轮）：第一轮得到含重组质粒的克隆和含空载质粒的克隆两类。重组质粒为Amp^rTet^s表型，空载质粒为Amp^rTet^r表型；因此含重组质粒的克隆只能在Amp平板上生长，含空载质粒的克隆可出现在同时含Amp和Tet的平板上。 图10 抗药性筛选法的工作原理——第一轮Amp平板初筛，第二轮Amp与Tet平板对照区分为重组与空载 ⑤显色筛选（鉴别）：质粒pUC18/19同时携带Amp^r和lacZ'两个标记基因；lacZ'表达的酶蛋白可将无色化合物X-gal水解成蓝色产物。将外源DNA插入lacZ'内部，该基因失活，转化菌在同时含Amp和X-gal的平板上呈白色——白色克隆即含重组质粒的克隆。 显色筛选法的工作原理及结果——lacZ'被插入失活，白斑为含重组质粒的克隆 【核心知识】两类筛选的“表型—颜色—结论”必须一一对应：抗药性筛选——能长在Amp上、不能长在Tet上的是重组；显色筛选——白斑是重组，蓝斑是空载。判断口诀：插入即灭活，灭活即失去该基因的功能，所以“抗性消失的那个”和“不显蓝色的那个”才是我们要的。 5．目的基因的检测与鉴定 检测层次 检测对象 常用方法 分子水平——导入 受体细胞染色体上是否插入目的基因 PCR技术（DNA分子杂交） 分子水平——转录 目的基因是否转录出mRNA 分子杂交（核酸探针） 分子水平——翻译 目的基因是否翻译出相应蛋白质 抗原—抗体杂交 个体水平 是否表现出目标性状 抗虫接种、抗病接种、个体性状观察等 ⑥经抗药性或显色筛选获得的受体细胞，还需进一步鉴定目的基因在载体上的位置是否正确以及是否能高效表达，这需要使用PCR技术和基因表达产物（蛋白质）的结构和功能分析技术。 6．转基因动植物的构建 ①动物受体细胞：生殖细胞（精细胞和卵细胞）、受精卵（或早期胚胎细胞）、诱导性多能干细胞等；方法为显微注射或病毒感染。 ②DNA显微注射：是动物细胞基因转移普遍采用的物理转化方法。基本程序为：激素疗法使雌鼠超数排卵→与雄鼠交配→从输卵管取出受精卵→用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上→玻璃注射针注入DNA溶液→将受精卵移植到母鼠子宫发育→繁殖转基因小鼠子代。 ③病毒感染：采用动物病毒（如腺相关病毒、慢病毒）DNA作表达载体时，可通过病毒感染高效导入动物细胞。 ④植物受体细胞：愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等；方法为农杆菌转化法或用含表达载体的植物病毒。 ⑤植物更简便：愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建要比转基因动物简便。 ⑥后续验证：转基因动植物培育出来后，仍需使用PCR等技术确认转基因是否成功，以及目的基因是否正确表达。 7．PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定 ①原理：核苷酸的磷酸基团使DNA片段带负电荷，因此电泳前应将负电极插在靠近DNA样品的一端，正电极插在另一端；通电后DNA片段向正极“泳动”，按大小和结构被分离。 ②关键步骤：配50×TAE并稀释成1×TAE→配制0.7%（W/V）琼脂糖悬浮液并微波加热溶解→冷却至50 ℃左右倒入胶模板（厚3~5 mm）→凝固后放入电泳槽、缓冲液没过凝胶约1 mm→拔去电泳梳→样品与5×上样缓冲液按4∶1混匀后加样→80~100 V电泳→蓝色染料泳至凝胶全长约2/3处时断电→紫外灯下观察条带。 图12 凝胶电泳示意（A）与装置（B）——点样端接负极，DNA向正极泳动 观察指标 含义 分析要点 条带的有无 是否成功扩增出待测样品的DNA 无条带常见原因：无DNA模板、引物设计不合适 条带的亮度 扩增得到的DNA数量 越亮代表DNA数量越多 条带的位置 扩增产物的大小 距离点样孔越远说明跑得越快，DNA分子质量越小 速记口诀突破 1． 基因工程四步流程 口诀：取目的、切载体，连接成环再导入；扩增筛选加鉴定，转基因后代才可靠。 解释：获取目的基因→构建表达载体（切与接）→导入受体细胞（转化与扩增）→筛选和鉴定含目的基因的受体细胞。 2． 表达载体五元件 口诀：目的基因加三件套：启动子、终止子、标记基因，再加复制原点好。 解释：表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点组成；“三件套”是原有载体上必备的调控与筛选结构。 3． 启动子与起始密码子 口诀：启动子管转录，位于DNA上；起始密码管翻译，坐在mRNA上。 解释：启动子是DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录；起始密码子位于mRNA上，是翻译的起始信号。 4． 两种筛选 口诀：抗药筛“只能在Amp长”，显色筛“白斑才是重组”。 解释：抗药性筛选：含重组质粒的克隆只能在含Amp的平板上生长，不能长在含Tet的平板上；显色筛选：lacZ'被插入失活，白色克隆才是含重组质粒的克隆。 5． 转化方法按对象 口诀：植物农杆菌，动物显微注，微生物氯化钙。 解释：植物常用农杆菌转化法（或花粉管通道法、植物病毒），动物常用显微注射法（或病毒感染），微生物常用氯化钙法（Ca²⁺处理）。 6． 凝胶电泳 口诀：DNA带负电，负极进正极跑；大块跑得慢，小块跑得早。 解释：DNA因磷酸基团带负电荷，点样端接负极、另一端接正极；分子质量越小泳动越快、位置越靠前。 7． 检测四层次 口诀：导入查PCR，转录做杂交，翻译抗原抗体，个体看性状。 解释：检测是否导入用PCR（DNA分子杂交）；检测是否转录用分子杂交；检测是否翻译用抗原—抗体杂交；个体水平观察目标性状是否表现。 易错易混辨析 易错点 正确辨析 基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束 错。启动子和终止子都是DNA序列，分别决定转录的开始与结束；决定翻译开始和结束的是起始密码子和终止密码子。 检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术 错。检测目的基因是否导入常用PCR等技术；抗原—抗体杂交用于检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。 目的基因与载体必须用同一种限制酶切割才能连接 错。只要黏性末端相同就能连接，也可用两种识别序列不同但黏性末端相同的限制酶分别切割。 用两种不同限制酶切割，可以避免目的基因与载体的自身环化和反向连接 对。双酶切使两端黏性末端不同，片段只能按固定方向连接，可有效减少自身环化与反向插入。 表达载体中只要有目的基因就能保证其表达 错。表达载体还需启动子（驱动转录）、终止子（终止转录）、标记基因（筛选）和复制原点（自主复制）。 抗药性筛选中，能在含Amp和Tet的平板上生长的是含重组质粒的克隆 错。外源DNA插入使Tet^r失活，含重组质粒的克隆只能在含Amp的平板上生长；能同时长在Amp和Tet平板上的是含空载质粒的克隆。 显色筛选中蓝色的菌落是含重组质粒的克隆 错。外源DNA插入lacZ'使其失活，不能水解X-gal，故白色菌落才是含重组质粒的克隆。 转化成功后，目的基因一定能高效表达 错。转化只说明DNA进入了细胞；目的基因可能插入位置不当、不能正确表达，需用PCR和蛋白质结构与功能分析技术进一步鉴定。 农杆菌转化法中，目的基因整合到农杆菌的染色体DNA上 错。目的基因先插入Ti质粒的T-DNA中，由农杆菌导入植物细胞后，才整合到植物受体细胞的染色体DNA上。 构建转基因植物比转基因动物困难，因为植物细胞有细胞壁 错。植物愈伤组织能再生出整株植物，因此转基因植物的构建比转基因动物更简便。 考点5 蛋白质工程 必背知识梳理 1．蛋白质工程的由来与概念 ①基因工程的局限：重组DNA技术使分离、克隆任何天然存在的基因并令其在特定受体细胞中表达成为可能，但其所使用的目的基因均是天然存在的，因而表达出的产物仍为天然蛋白质。 ②天然蛋白质的不足：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，其结构和功能符合特定物种适应特殊环境而生存的需求，但不一定完全符合人类生产和生活的需要。如：水稻和玉米中赖氨酸含量偏低；工业用酶在高温和有机溶剂中易失活；药物蛋白多肽在体内半衰期较短。 ③概念：以蛋白质结构与功能相统一的生命观念为指导，采用重组DNA技术在DNA分子水平上改变基因的序列和结构，对天然蛋白进行理性改造，甚至设计并制造出全新的非天然蛋白，以满足人类生产与生活的需求。这种由人为突变或设计基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程，称为蛋白质工程，又称第二代基因工程。 ④两个方面：修饰改造天然蛋白（定点突变、定向进化）与设计制造全新蛋白。 【深度理解】蛋白质工程的名字里带“蛋白质”，但操作对象仍是基因（DNA）。因为蛋白质的氨基酸序列由基因决定，直接操作蛋白质分子既难精确又无法遗传，只有在DNA水平上改造，才能稳定获得改造后的蛋白。这也正是“第二代基因工程”的含义——它建立在基因工程的技术平台之上。 2．修饰改造天然蛋白的两大策略 策略 操作定义 特点 典型手段 基因的定点突变 在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列 目的性强、只改少数氨基酸，结果可预期 化学合成突变基因、PCR定点突变 基因的定向进化 在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列 模拟自然进化但极大加速，需高通量筛选 低保真DNA聚合酶随机突变、循环突变、噬菌体展示 ⑤改造的意义：一方面可实现氨基酸序列改造、优化其功能；另一方面可确定多肽链中某个氨基酸在蛋白质结构和功能上的作用，收集氨基酸线性序列与其空间构象、生物功能之间的对应关系，为设计新型突变蛋白提供理论依据。 ⑥本质：修饰改造天然蛋白实质上是一个模拟自然界进化与适应的循环渐进过程，可将数千万年的自然进化历程缩短为数月、数周甚至数天的实验室过程。 蛋白质工程修饰改造天然蛋白策略的基本流程——定点突变与随机突变两条路径，均经DNA重组、转化克隆与性能筛选 3．定点突变的三个经典案例 案例 改造位点 改造效果 获得突变基因的方法 人胰岛素→赖脯胰岛素 B链第28位脯氨酸（CCC）与第29位赖氨酸（AAG）互换为AAGCCC 不再聚合成多分子形式，降血糖速率大为提高，称“单体速效胰岛素” 基因较短，首选化学合成；较长序列可用PCR方案（突变引物＋正常引物） 细菌L-天冬酰胺酶 将某位赖氨酸更换为丙氨酸 免疫原性比天然酶蛋白下降2.5倍，且活性保持不变 定点突变技术 人组织型纤溶酶原激活剂t-PA 定点突变 体内半衰期长、血栓溶解效率高、颅内出血倾向大幅度降低（如TNK型t-PA） 定点突变策略 PCR合成人胰岛素突变基因的引物设计——突变引物含突变碱基，与正常引物配对扩增出突变基因 【案例剖析】人胰岛素之所以会聚合成多分子，关键在B链第28、29位两个氨基酸的顺序。把“CCC AAG”改成“AAG CCC”，氨基酸随之互换，聚合界面被破坏，胰岛素便可迅速以单体形式吸收。这个案例说明蛋白质工程的逻辑是“先定功能目标（不聚合），再改结构（换氨基酸），最后回到基因（改碱基）”。 4．定向进化的原理与流程 ①基本操作：在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序，准确、迅速地获得所需要的突变基因。 ②典型流程：对特定基因用PCR扩增→改变反应条件（如使用低保真度的DNA聚合酶）故意让DNA复制发生随机错误→创建一系列随机突变的基因序列→导入合适受体细胞表达出一系列随机突变蛋白→按需求筛选出具有特定优良功能或结构的目的蛋白。 图16 随机突变以获得高效能酶分子——突变—表达—筛选—再突变的循环，加速分子进化 ③与定点突变的分工：定点突变“改已知位置”，定向进化“广撒网再筛选”；前者依赖对结构与功能关系的已有认识，后者依赖高效的筛选体系。 ④2018年诺贝尔化学奖：授予在实验室模拟和加速蛋白质／酶分子自然定向进化方面作出杰出贡献的阿诺德、史密斯和温特。阿诺德发展了随机突变和杂交基因片段以获得高效能酶分子的定向进化技术；史密斯和温特创建了多肽和抗体的噬菌体展示技术，用于一次性筛选大量随机突变或全新设计的蛋白质／多肽分子。 图17 多肽和抗体的噬菌体展示技术——目的蛋白展示在噬菌体表面，用特定抗体高效筛选 5．设计制造全新蛋白 ①思路：根据已掌握的蛋白质结构与功能关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，再借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 ②数据对比：假设蛋白质平均由200个氨基酸构成，按常见氨基酸种类估计，氨基酸序列的可能性高达20²⁰⁰种；但自然界中天然蛋白质的氨基酸序列大约只有10¹²种。 ③意义：数十年来人们采用定点突变和定向进化修饰改造的天然蛋白种类只是沧海一粟；设计制造全新蛋白的理念，就是在更广泛的氨基酸序列海洋中开发自然界并不存在、但理论上可行的蛋白质资源。 6．蛋白质工程与基因工程的比较 比较项 蛋白质工程（第二代基因工程） 基因工程 起点 预期的蛋白质功能 目的基因 过程 预期功能→设计预期结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因）→获得所需蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→导入受体细胞→检测与鉴定 目标 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，获得新的生物类型和生物产品 结果 生产非天然的蛋白质 生产自然界已存在的蛋白质 联系 ①都在生物体外对基因进行操作；②蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的第二代基因工程 ①都在生物体外对基因进行操作；②蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的第二代基因工程 【判断技巧】两步定性：①看有没有“实质性改造基因序列”——仅切割、拼接天然基因属基因工程；对编码区做了碱基替换、增添或缺失属蛋白质工程。②看产物是不是天然蛋白——产物为天然蛋白质属基因工程；产物与天然蛋白有差异甚至自然界没有，属蛋白质工程。CAR-T细胞疗法改造的是受体蛋白结构，因此归入蛋白质工程；而补充或更换ADA基因属基因工程。 速记口诀突破 1． 蛋白质工程的定义 口诀：基因水平动手脚，蛋白功能来重塑；只改几个氨基酸，不碰整条肽链数。 解释：蛋白质工程是在DNA分子水平上改变基因序列和结构，从而改造或创造蛋白质；通常只改变少数氨基酸，而非全部氨基酸序列。 2． 两大方面两策略 口诀：改造天然、设计全新；改造分两手，定点加定向。 解释：蛋白质工程包括修饰改造天然蛋白和设计制造全新蛋白；修饰改造天然蛋白又有定点突变和定向进化两大策略。 3． 定点突变与定向进化 口诀：定点改特定，结果可预期；定向随机变，筛选出惊喜。 解释：定点突变在DNA水平改变特定位点的氨基酸序列，目的性强、结果可预期；定向进化随机改变任一位点，再通过筛选获得优良突变体。 4． 三个定点突变案例 口诀：胰岛素换两位，天冬酰胺降免疫，t-PA改出TNK。 解释：人胰岛素B链第28、29位氨基酸互换得赖脯胰岛素（单体速效）；L-天冬酰胺酶某赖氨酸换丙氨酸，免疫原性下降2.5倍；t-PA定点突变得TNK型t-PA。 5． 蛋白质工程的流程倒推 口诀：先从功能想结构，再由结构推序列，最后回到基因上。 解释：蛋白质工程的起点是预期的蛋白质功能，依次推演：预期功能→设计结构→推测氨基酸序列→找到或合成相应基因→表达并获得蛋白质。 6． 基因工程与蛋白质工程 口诀：基因工程造“天然”，蛋白质工程造“新异”；一个改性状，一个改蛋白。 解释：基因工程的目的基因来自天然，产物是天然蛋白质，目标是改造生物性状；蛋白质工程通过改造基因来改造或创造蛋白质，产物可以是非天然蛋白。 易错易混辨析 易错点 正确辨析 蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 错。蛋白质工程通常只改变蛋白质分子的少数氨基酸，改变的是特定位点。 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 错。蛋白质工程是在DNA分子水平上改造基因，进而改变蛋白质，操作对象是基因而不是蛋白质。 蛋白质工程与基因工程没有本质区别 错。基因工程生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程则改造或创造蛋白质，产物可以是非天然蛋白，故称第二代基因工程。 定点突变与定向进化含义相同 错。定点突变改变特定位置的氨基酸序列，定向进化随机改变任一位点的氨基酸序列并通过筛选获得目标突变体。 人胰岛素改成赖脯胰岛素，属于基因工程 错。该过程对编码区碱基序列做了实质性改造（CCC AAG→AAG CCC），产物为非天然蛋白，属蛋白质工程。 蛋白质工程能直接根据氨基酸序列合成具有活性的蛋白质 错。蛋白质工程最终仍要通过基因（DNA）表达的途径获得蛋白质，不能直接由氨基酸序列合成有活性的蛋白。 定向进化只能在自然界中缓慢发生，无法在实验室加速 错。定向进化正是要在实验室模拟并加速自然进化过程，通过随机突变和高通量筛选在数周或数月内获得目标突变体。 蛋白质工程的起点是目的基因 错。蛋白质工程的起点是预期的蛋白质功能，通过设计结构、推测氨基酸序列来反推基因，与基因工程“以目的基因为起点”正好相反。 基因工程和蛋白质工程都在体外对蛋白质进行操作 错。两者都在生物体外对基因进行操作；蛋白质工程虽以蛋白质功能为设计起点，操作对象仍是基因。 CAR-T细胞疗法属于基因工程，因为要把基因导入T细胞 错。CAR-T改造的是T细胞受体的蛋白结构（用scFv取代TCR的αβ链并改造复合物），属第二代基因工程即蛋白质工程。 / 学科网（北京）股份有限公司 $