第41讲 基因工程（1图4核心6易错+三层精练）（专项训练）（江苏专用）2027年高考生物一轮复习

第41 讲 基因工程 两年模拟·基础题（全国视野，单选+多选） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B C D A D C D B D C 题号 11 12 13 答案 ACD AC ACD （一年重难·情境题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 答案 B D C C B D A C A C B 题号 12 13 14 答案 ABD AD AB 15． 【答案】(1)复制原点 (2)B (3)2 (4) 农杆菌转化法 潮霉素 能在添加潮霉素的培养基上存活并发出绿色荧光 植物组织培养 16． 【答案】(1) 启动子 复制原点 (2)Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ (3) DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 17． 【答案】(1) 不受 促进R蛋白形成二聚体，并启动GFP基因的表达（或解除R蛋白对启动子B的抑制） 绿色荧光强度 (2) 1、4 BglⅡ、HindⅢ (3) 碱基互补配对 磷酸二酯 给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水 粪便 稀释涂布平板 三年真题·压轴题（侧重江苏，辐射全国，单选题） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B D A A B C B A B B 11 BCD 12． 【答案】(1)细胞免疫 (2) 活化的细胞毒性T细胞 细胞因子 VHH (3) Trop2蛋白 总RNA 5′端 DNA连接 (4) 检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强 Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第41 讲 基因工程 第一部分 五年考情·精准定向 ……………………………………………………………… 1 江苏考情概览 高频考点情境 高效备考策略 第二部分 三大核心·主干速记………………………………………………………………… 3 一图串联·核心梳理·速记口诀 核心 01基因工程的基本工具 核心 02基因工程的操作程序 核心 03 DNA相关的两个实验　 核心 04转基因产品的安全性引发社会的广泛关注 第三部分 六大易错·逐点击破…………………………………………………………………9 易错 01双酶切≠一定用两种限制酶 易错 02载体≠质粒 易错 03载体本质是 DNA，不是酶。 易错 04 分子杂交三层鉴定别混淆 易错 05 PCR 三步与酶的易错点 易错 06蛋白质工程≠改造蛋白质 第四部分 分层专练·靶向攻关 …………………………………………………………………10 两年模拟·基础题（全国视野，单选+多选） 一年重难·情境题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 三年真题·压轴题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 江苏考情概览 新课标要求 考题统计 1. 阐明 DNA重组技术的概念，说出基因工程的操作工具 的基本功能，说明载体应具备的基本条件。 2. 阐述基因工程的基本操作程序，举例说明基因工程在农牧业、 医药卫生、环境保护等领域的应用。 3. 说明 PCR 技术的原理和基本过程；简述蛋白质工程的 原理和基本途径。 2025 江苏 基因表达载体的构建与检测鉴定 2024 江苏 目的基因导人方法与 PCR 技术 2022 江苏 基因工程的应用与转基因安全 2021 江苏 蛋白质工程与基因编辑 2023 江苏 限制酶与 DNA连接酶的作用 高频考点情境 1.考查频次：基因工程是江苏高考 “生物技术与工程” 模块的核心考点，单选、多选、非选择题均会考查，近五年江苏卷几乎年年涉考， 常结合基因表达载体构建、PCR 扩增、转基因动植物的培育、基因编辑 (CRISPR/Cas9)、基因检测与基因治疗等科研与生产真实情境命题。 2.考查要点：操作工具的选择与作用部位辨析；基因工程操作程序;PCR 原理与过程；基因工程的应用及转基因生物的安全性；蛋白质工程。 3.命题情境：基因表达载体示意图、质粒图谱、PCR 扩增流程、农杆菌转化、基因编辑、转基因抗虫棉培育流程图：側重工程思维与设计方案评价。常与遗传规律、分子生物学、细胞工程綜合命题 备考策略 1.抓牢核心概念：必背： 目的基因、限制酶、DNA 连接酶、载体、质粒、基因表达载体、启动子、终止子、标记基因、转化、PCR、引 物、DNA 分子杂交、抗原一抗体杂交、转基因生物、蛋白质工程。 2. 构建知识网络：操作工具 （限制酶 +DNA 连接酶+载体)+基本程序（目的基因获取+表达载体构建+导入受体细胞+检測与鉴定）+应用 （农牧业、医药卫生、环保）+蛋白质工程。 3.联系实际应用：转基因抗虫棉；胰岛素、生长激素等药物的生产；基因治疗；基因编辑技术；生物反应器 （乳腺生物反应器、膀胱生物反应器）。 4.强化题型方法：载体构建题 （酶切位点、黏性末端、反向连接判断）：程序判断题，（ 顺序、条件辨析）：检测方法辨析题 (DNA 杂交、分子杂交、抗原一抗体杂交、个体鉴定）;PCR 计算题 （循环次数与 DNA 分子数)；流程图题 （步骤判断、方案评价）。 5.紧扣命题趋势：新课标强调生物技术与工程实践，基因工程常与遗传规律、细胞工程、胚胎工程综合命题，注重工程思維与科学探究能力；江苏卷多以科研与生产情境设置选择题与非选择题。 一图串联 速记口诀 限制连接双酶全，质粒载体条件严； 目的基因两途径，表达载体先构建。 导入受体方法辨，三项杂交鉴定全； PCR 三步高温变，蛋白工程改基因。 核心梳理 核心 01基因工程的基本工具 1.基因工程概述 项目 内容 主要技术 转基因技术 操作环境 体外 操作水平 DNA分子水平 理论依据 基因重组 供体 提供目的基因 受体 复制或表达目的基因 基本过程 切割→改造和拼接→导入→表达 优点 克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状 2.基因工程的基本工具 （1）限制性内切核酸酶(限制酶) 限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开产生的是平末端。 （2）DNA连接酶 ①作用：在两个核苷酸之间形成　磷酸二酯键　以连接两个DNA片段。 ②主要类型：①E．coli DNA连接酶：从大肠杆菌中分离；②T4_DNA连接酶：从T4噬菌体中分离。两者都能连接黏性末端和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。 （3）载体 ①作用：将基因送入细胞。 ②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 ③重要的载体之一——质粒 质粒的本质 是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 特点(条件) 有一个至多个限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制：便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在 带有标记基因(常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等：便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功) （4）限制酶的选择 ①根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ②应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒， ④根据质粒的特点选择限制酶 核心 02基因工程的操作程序 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建(核心工作) （1）过程 （2）基因表达载体的组成 指点迷津：复制原点≠启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 a.启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，基本组成单位是脱氧核苷酸，其位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3′端。 b.起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近mRNA的5′端。 c.复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个复制原点。 3.将目的基因导入受体细胞 受体细胞 常用方法 操作过程 植物细胞(常用体细胞或受精卵) 花粉管通道法(我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二：将DNA溶液滴加在受粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T-DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 动物细胞(常用受精卵) 显微注射法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞 Ca2+处理法(感受态细胞法) Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子 4.目的基因的检测与鉴定 ①通过PCR等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 ②)利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 ③进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 核心03 DNA相关的两个实验　 1.DNA的粗提取与鉴定 （1）实验思路、原理 ①提取的基本思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，利用这些差异，对DNA进行提取。 ②相关原理 （2）材料选择 ①依据：选用DNA含量高的组织，成功的可能性更大。 ②常用材料：新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花、鸡血和猪肝等(方法可能稍有不同)。 （3）实验过程 2.利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 （1）实验原理 ①扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 ②电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动。 ③鉴定原理：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。 （2）设备：PCR仪、电泳装置等。 （3）实验过程 ①PCR操作过程 指点迷津 a.预变性可使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合； b.最后一轮延伸给予更长时间的主要目的是使子链充分延伸，得到更多的等长DNA。 （4）电泳鉴定：配制琼脂糖溶液，加入核酸染料混合→制备凝胶→加缓冲液(没过凝胶1 mm为宜)→加样(PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，留一个孔加标准参照物)→进行电泳(待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止)→紫外灯下鉴定。 核心04　转基因产品的安全性引发社会的广泛关注 1.转基因成果 （1）转基因微生物 ①微生物的优点：微生物的生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感，容易进行遗传物质操作。 ②成果举例：转基因酵母菌减少了啤酒酵母双乙酰的生产，缩短了啤酒的发酵期；构建基因工程菌生产氨基酸、药物等。 （2）转基因动物成果 ①培育生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜。 ②培育抗病毒的动物新品种。 ③建立了某些人类疾病的转基因动物模型。 （3）转基因植物 ①科学家已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状作物。 ②我国批准发放了一些转基因作物的生产应用安全证书，及一些转基因作物的进口安全证书。 2.对转基因产品和技术的态度 （1）对转基因产品安全性的争论 争论主要聚焦在转基因食品的安全性等方面。 （2）理性看待转基因技术 ①研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。 ②相应法规的制定既维护了消费者对转基因产品的知情权和选择权，又最大程度地保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的安全性。 3．生殖性克隆人面临的伦理问题 (1)生殖性克隆和治疗性克隆 治疗性克隆 生殖性克隆 目的 治疗人类疾病 用于生育，产生新个体 处理方式 获得早期胚胎主要用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的　细胞、组织或器官 获得的早期胚胎通过胚胎移植到母体子宫内发育成个体 水平 细胞水平 个体水平 联系 都属于无性繁殖，产生新个体、新组织，遗传物质相同 (2)对生殖性克隆人研究的不同见解 ①伦理学家认为生殖性克隆人“有违人类尊严”；人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德。 ②很多生物学家认为克隆技术还不成熟：构建重构胚成功率低，胚胎移植到子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高。即使有个体活过了幼年期，也可能早亡。 ③我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 易错 01双酶切≠一定用两种限制酶 构建载体常用双酶切，防止质粒自连、目的基因反向连接；但单酶切也可使用，只是容易出现自连与反向连接，做题要看题干条件，不要默认一定双酶切。 易错 02载体≠质粒 质粒是最常用载体，载体还包括 λ 噬菌体衍生物、动植物病毒； 载体必备条件：复制原点、标记基因、多个酶切位点， 易错 03载体本质是 DNA，不是酶。 获取目的基因两条途径区分 PCR 扩增：已有部分目的基因序列为前提；人工合成（基因文库 / 化学合成）：无模板，序列已知较短基因；PCR 不能创造全新基因，只能扩增。 易错 04 分子杂交三层鉴定别混淆 DNA 分子杂交：检测目的基因是否导入； 核酸分子杂交：检测目的基因是否转录出 mRNA； 抗原 — 抗体杂交：检测是否翻译出蛋白质； 个体水平鉴定不属于分子杂交。 易错 05PCR 三步与酶的易错点 变性依靠高温解旋，不用解旋酶； Taq 热稳定 DNA 聚合酶只负责延伸，不能从头合成 DNA，需要引物； 三步：变性→复性→延伸，循环扩增。 易错 06蛋白质工程≠改造蛋白质 蛋白质工程：直接改造基因，间接改变蛋白质； 不能直接改造蛋白质（蛋白质空间结构复杂，改造后不能遗传）； 基因工程只能生产自然界已有的蛋白质，蛋白工程可制造自然界不存在的蛋白。 两年模拟·基础题（全国视野，单选+多选） 亮点预览：依托乙烯受体反向抑制转基因番茄培育情境，辨析植物激素与转基因干扰效应（T1）；围绕基因工程改良乳酸菌生产发酵饮料情境，辨析基因工程核心步骤、微生物培养基营养条件（T2）；结合原核、真核细胞结构辨析情境，辨析质粒、拟核、细胞壁、细胞核的判定（T3）；基于 cDNA 制备与原核异源表达抗逆基因情境，辨析逆转录产物特点、原核转录调控机制（T5）；依托质粒图谱与重组 DNA 构建情境，辨析载体各组分功能、限制酶作用位点（T6）。 一、单选题 1．【植物激素转基因抑制基因翻译】（2026·四川雅安·二模）为进一步提高番茄的储存时间，科学家将乙烯受体基因Ers1反向插入质粒，构建基因表达载体，然后导入番茄细胞中，使原有的Ers1基因翻译受到抑制，从而延长番茄储存时间。下列说法正确的是（     ） A．乙烯是由色氨酸为原料合成的一种激素 B．乙烯能促进果实成熟，还能促进植物开花 C．对转基因番茄喷洒适量乙烯可缓解反接Ers1基因的作用 D．番茄果实的成熟只受乙烯的调控 【答案】B 【详解】A、生长素以色氨酸为原料合成，乙烯合成原料不是色氨酸，A 错误； B、乙烯可促进果实成熟，也能诱导部分植物开花，B 正确； C、反接Ers1基因抑制乙烯受体的翻译，缺少受体，外源乙烯无法发挥作用，不能缓解该效应，C 错误； D、果实成熟是多种植物激素共同调控的结果，并非只受乙烯调控，D 错误。 2．【发酵工程 + 基因工程综合】（2026·四川雅安·二模）广西沃柑营养丰富，乳酸菌发酵产品有益健康，欲开发沃柑乳酸菌发酵饮料，研究者进行了相关研究。下列说法错误的是（     ） A．通过发酵工程生产沃柑乳酸菌饮品的中心环节是发酵罐内发酵 B．利用基因工程改良乳酸菌菌种的核心工作是基因表达载体的构建 C．培养乳酸菌时，向培养基中添加水、无机盐、碳源和氮源，并提供无氧条件即可 D．在青贮饲料中添加乳酸菌可提高饲料品质，动物食用后能提高免疫力 【答案】C 【详解】A、发酵工程的中心环节就是发酵罐内的发酵过程，该环节直接控制发酵条件、决定最终产品的产量和品质，A正确； B、基因工程的核心操作步骤就是构建基因表达载体，目的是让目的基因在受体细胞中稳定存在、可以遗传并表达，B正确； C、乳酸菌是异养微生物，基础的水、无机盐、碳源、氮源四类营养物质无法满足其生长需求，还需要额外添加维生素等特殊营养物质，同时除了无氧条件，还需要控制适宜的温度、pH等培养条件，仅满足题干描述的条件无法正常培养乳酸菌，C错误； D、青贮饲料中添加乳酸菌可以通过发酵抑制有害微生物繁殖，提升饲料品质，乳酸菌作为益生菌被动物摄入后能够调节肠道菌群，起到提高动物免疫力的作用，D正确。 3．【原核真核细胞结构辨析】（2026·四川雅安·二模）细胞虽然形态多种多样，但是基本结构具有高度的一致性，下列关于细胞结构的归纳，正确的是（     ） A．没有细胞壁的一定是动物细胞 B．没有细胞核的一定是原核细胞 C．含有质粒的一定是原核细胞 D．含有拟核的一定是原核细胞 【答案】D 【详解】A、不含细胞壁的不一定是动物细胞，如支原体不含细胞壁，但属于原核生物，A错误； B、没有细胞核的不一定是原核细胞，如哺乳动物成熟的红细胞是真核细胞，但没有细胞核，B错误； C、含有质粒的不一定是原核细胞，真核生物如酵母菌的细胞内也存在质粒，C错误； D、拟核是原核细胞特有的结构，是原核生物储存遗传物质的区域，真核细胞不存在拟核结构，因此含有拟核的一定是原核细胞，D正确。 4．【蛋白质工程植物脱毒苗胚胎移植无菌消毒】（2025·广东广州·模拟预测）生物技术是应用生命科学的研究成果，对生物或生物的成分、产物等进行改造和利用的技术，与人类健康、生产生活的关系密切。下列叙述正确的是（     ） A．蛋白质工程通过改造或合成基因实现对蛋白质结构的设计改造 B．生产中培育香蕉脱毒苗常用的方法是进行远缘植物体细胞杂交 C．进行胚胎移植前，要对供体和受体进行免疫检查，以防发生免疫排斥反应 D．微生物培养过程中，接种前需用紫外线对接种室、工作台以及人的双手等进行消毒 【答案】A 【详解】A、蛋白质工程的操作层面为基因水平，通过改造或合成基因，即可实现对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，A正确； B、培育脱毒苗的常用方法是取植物茎尖等分生区（病毒极少甚至无病毒）进行植物组织培养，B错误； C、胚胎移植的生理学基础之一是受体子宫对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，因此移植前不需要进行免疫检查，C错误； D、微生物培养中，接种室、工作台可通过紫外线消毒，但人的双手需用酒精擦拭消毒，不可用紫外线照射双手消毒，D错误。 5．【cDNA、原核转录、诱导基因表达】（2026·湖南永州·一模）为研究荒漠植物花花柴的抗逆机制，科研人员提取其总RNA，经逆转录获得cDNA，PCR扩增得到与抗逆相关的KcHTR基因，将其导入大肠杆菌后，加入IPTG（可去除某种阻碍RNA聚合酶移动的阻遏蛋白）成功诱导该基因表达。下列叙述正确的是（     ） A．KcHTR基因转录过程需要DNA聚合酶催化核糖核苷酸聚合 B．逆转录获得的cDNA含有启动子和终止子 C．大肠杆菌中，KcHTR基因的转录在细胞核内完成 D．IPTG通过调控基因的转录过程诱导目的基因表达 【答案】D 【详解】A、转录过程需要RNA聚合酶催化核糖核苷酸聚合，DNA聚合酶参与DNA复制过程，催化脱氧核苷酸聚合，A错误； B、cDNA是以mRNA为模板逆转录获得的，启动子和终止子属于基因的非编码序列，不会转录到mRNA中，因此cDNA不含启动子和终止子，B错误； C、大肠杆菌是原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，其转录过程在拟核区域完成，C错误； D、由题干可知，IPTG可去除阻碍RNA聚合酶移动的阻遏蛋白，RNA聚合酶是转录过程必需的酶，因此IPTG通过调控基因的转录过程诱导目的基因表达，D正确。 6．【基因表达载体结构辨析】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）下图为基因表达载体构建示意图。下列叙述正确的是（     ） A．限制酶在切割质粒和目的基因时均作用于DNA分子的氢键 B．启动子位于目的基因上游，是DNA聚合酶识别和结合的位点 C．标记基因用于筛选含有重组质粒的受体细胞 D．图中质粒上的复制原点与终止子均属于基因表达载体中的表达调控序列 【答案】C 【详解】A、限制酶切割DNA分子时作用于磷酸二酯键，氢键的断裂一般需要解旋酶参与，A错误； B、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，功能是启动转录过程，DNA聚合酶是参与DNA复制的酶，B错误； C、标记基因的作用就是鉴别受体细胞中是否含有重组质粒，从而筛选出含有重组质粒的受体细胞，C正确； D、复制原点是保证质粒在受体细胞中自主复制的序列，不属于基因表达的调控序列，启动子、终止子属于表达调控序列，D错误。 7．【基因编辑体细胞核移植胚胎分割】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）我国科研团队历经13年在全球首次实现对奶牛胚胎干细胞定点基因编辑，并通过体细胞核移植等技术培育出健康克隆犊牛。下列叙述正确的是（     ） A．定点基因编辑技术通过将外源基因随机整合到受体基因组中来实现基因改造 B．经基因编辑及核移植技术得到的奶牛重构胚，需体外培养至原肠胚时进行胚胎移植 C．体细胞核移植过程中需选用减数第一次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞 D．若要获得多头遗传性状相同的良种奶牛，可通过均等分割囊胚时期的内细胞团实现 【答案】D 【详解】A、定点基因编辑技术是定向对基因组特定位点进行改造，并非将外源基因随机整合，A错误； B、奶牛胚胎移植通常选择发育至桑椹胚或囊胚阶段的胚胎，原肠胚分化程度高，不适宜进行胚胎移植，B错误； C、体细胞核移植的受体细胞是减数第二次分裂中期的去核卵母细胞，而非减数第一次分裂中期的卵母细胞，C错误； D、对囊胚阶段的内细胞团进行均等分割，可获得多头遗传物质完全相同的个体，进而得到遗传性状相同的良种奶牛，D正确。 8．【PCR 实验操作、培养基灭菌、平板划线】（2026·广东广州·一模）下列相关实验操作正确的是（     ） A．为得到两条长度完全一致的目的DNA片段，最多只需进行PCR两轮循环 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 【答案】B 【详解】A、PCR扩增时，第一轮循环的产物长度均大于目的DNA片段，第二轮循环仅能得到2条长度符合要求的单链，无法形成两条长度完全一致的双链目的DNA，至少需要三轮循环才能得到目标产物，A错误； B、核酸染料可与DNA结合，在紫外光照射下会发出荧光，因此用添加核酸染料的凝胶电泳分离PCR产物后，可在紫外灯下观察条带结果，B正确； C、仅煮沸无法彻底杀灭培养基中的芽孢等耐热微生物，培养基需要经过高压蒸汽灭菌后，再冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误； D、接种环烧红后温度极高，直接蘸取菌液会杀死酵母菌，需要冷却后再蘸取菌液进行划线操作，D错误。 9．【琼脂糖凝胶电泳 DNA 迁移规律】（2026·浙江·一模）琼脂糖凝胶电泳是基因工程中分离鉴定DNA片段的常用技术。下列叙述正确的是（     ） A．DNA分子越大，其在电泳过程中迁移速率越快 B．低浓度的琼脂糖凝胶适合分离较小的DNA片段 C．电泳时指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在电场作用下，DNA分子会向与它所带电荷相反的电极移动 【答案】D 【详解】A、琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子越大，受到凝胶的阻力越大，迁移速率越慢，A错误； B、低浓度琼脂糖凝胶孔隙更大，适合分离较大的DNA片段，高浓度凝胶孔隙小，才适合分离较小的DNA片段，B错误； C、电泳指示剂的作用是指示电泳的迁移进度，避免样品跑出凝胶，不能指示DNA分子的具体位置，DNA需要经特殊染色后才可观察到位置，C错误； D、DNA分子的磷酸基团带负电，在电场作用下会向带正电的（与自身所带电荷相反的）电极移动，D正确。 10．【PCR 条带亮度扩增条件优化】（2026·内蒙古呼和浩特·一模）研究小组利用PCR技术扩增某植物的抗病基因片段，电泳检测后发现条带亮度较低，下列措施中最不可能使结果得到改进的是（     ） A．增加模板DNA用量 B．提高引物浓度 C．减少PCR循环次数 D．更换高活性DNA聚合酶 【答案】C 【详解】A、增加模板DNA用量，可提升扩增的起始模板数，最终获得更多产物，能改进条带亮度，A不符合题意； B、适宜范围内提高引物浓度，可让更多模板与引物结合启动扩增，提升产物量，能改进条带亮度，B不符合题意； C、PCR产物量理论上随循环次数增加呈指数增长，减少循环次数会导致产物量更少，条带亮度更低，无法改进结果，C符合题意； D、更换高活性DNA聚合酶可提高扩增效率，增加产物量，能改进条带亮度，D不符合题意。 二、多选题 11．【环状 DNA 限制酶酶切电泳 + PCR 原理】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）科学家对某DNA分子用限制酶EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图。为进一步确认酶切产物中的目的片段，可用PCR技术扩增该片段并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（     ） A．该DNA分子为环状DNA分子 B．PCR变性过程中，高温破坏了DNA双链间的磷酸二酯键 C．该DNA分子上限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ各只有1个酶切位点 D．PCR延伸过程中，耐高温的DNA聚合酶从引物3′端延伸子链 【答案】ACD 【详解】A、若该DNA为线性DNA，单酶切仅1个酶切位点时会得到2个片段，与图中EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ单酶切均只得到1条1000bp的带，不符电泳结果；环状DNA上1个酶切位点切割后得到1条线性DNA片段，符合电泳结果，因此该DNA为环状DNA，A正确； B、PCR变性过程中高温破坏的是DNA双链之间的氢键，使双链解旋，磷酸二酯键没有被破坏，B错误； C、环状DNA上有n个某限制酶的酶切位点时，单酶切会得到n个片段，图中两种酶单酶切均只得到1个片段，双酶切得到800bp和200bp共2个片段，说明两种酶各只有1个酶切位点，C正确； D、DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始添加脱氧核苷酸延伸子链，子链的合成方向为，因此PCR延伸过程中耐高温DNA聚合酶从引物3′端延伸子链，D正确。 易错提醒： PCR变性靠高温破坏氢键，不是磷酸二酯键；磷酸二酯键是脱氧核糖和磷酸之间的骨架键，变性不解开此键。 区分环状 DNA 与线性 DNA 酶切产物：环状 DNA，n 个酶切位点得到 n 个片段；线性 DNA，n 个酶切位点得到 n+1 个片段。 Taq（热稳定 DNA 聚合酶）不能从头合成 DNA，必须依靠引物，只能从引物的 3′端延伸 DNA 子链，子链延伸方向固定 5′→3′。 电泳条带数目结合酶切结果，用来反推质粒 / DNA 上酶切位点的数量。 12．【同源重组基因敲除质粒构建】（2026·湖南·一模）具有相同碱基序列的DNA分子可通过片段互换，从而实现同源重组。下图表示科学家利用同源重组技术敲除放线菌R基因（能辅助放线菌吸收铁离子）的操作过程，主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。下列有关叙述错误的是（　　） A．构建重组质粒时，必须用相同的两种酶处理质粒和目的基因 B．能通过电泳技术检测放线菌相关DNA来判断基因是否敲除成功 C．发生交换时会有氢键与磷酸二酯键的断裂和形成，该过程需要的是DNA水解酶 D．可通过比较放线菌在操作前后吸收铁离子的效率来判断基因是否敲除成功 【答案】AC 【详解】A、构建重组质粒时，不一定必须用相同的两种限制酶。也可以用两种不同限制酶，只要切割后产生的黏性末端可以互补；还可以用同尾酶，切割产生相同黏性末端，A错误； B、基因敲除成功后，放线菌相关DNA片段的长度会变短，不同长度的DNA在电泳时迁移速率不同，因此可通过电泳技术检测判断基因是否敲除成功，B正确； C、DNA 水解酶作用是水解 DNA，把 DNA 彻底切断降解；DNA 断裂重连需要限制酶（切割）+DNA 连接酶（形成磷酸二酯键），不需要 DNA 水解酶，C错误； D、R基因的功能是辅助放线菌吸收铁离子，若R基因敲除成功，放线菌吸收铁离子的效率会下降，因此可通过比较操作前后吸收铁离子的效率判断敲除是否成功，D正确。 13．【农杆菌转化、RNA 沉默、转录后调控】（2026·江苏徐州·模拟预测）植物细胞靠RNA沉默抵御外源基因，植物病毒可产生抑制子抵消该防御。CYP76AD、DODA1是甜菜苷合成必需基因，将多基因表达盒（如图）转入烟草后，仅侵染部位出现红色。叙述错误的是（     ） A．一个DNA分子上有多个基因串联时，均以同一条链作为转录的模板 B．甜菜苷只在农杆菌侵染的部位合成，在植物体内不会转运 C．基因P19的存在有利于加强植物对外源基因的防御反应 D．植物通过阻碍RNA聚合酶与启动子识别与结合来实现RNA转录后水平调控沉默 【答案】ACD 【详解】A、一个DNA分子上串联的多个基因，转录时并不一定以同一条链作为模板，不同基因的模板链可能不同，A错误； B、题干信息：多基因表达盒（含有甜菜苷合成必需基因）转入烟草后，仅侵染部位出现红色，表明甜菜苷只在农杆菌侵染的部位合成，在植物体内不会转运，B正确； C、P19蛋白是RNA沉默抑制子，它的作用是抵抗宿主的RNA沉默防御反应，也就是削弱植物对外源基因的防御反应，C错误； D、阻碍 RNA 聚合酶与启动子结合，属于转录水平的调控；而 RNA 沉默属于转录后水平调控，作用于 mRNA 翻译阶段，并不影响 RNA 聚合酶和启动子的识别结合，D错误。 一年重难·情境题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 设题创新：依托 Ti 质粒载体农杆菌转化培育高光效甜菜情境，辨析 TDNA 功能、酶切位点选择、电泳迁移影响因素（T3）；围绕质粒不同构象琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物情境，辨析质粒构象对电泳迁移率的影响（T4）；基于 AI 设计全新蛋白质序列的蛋白质工程新情境，辨析蛋白质工程的基本流程（T5）；结合先天性耳聋基因治疗载体构建情境，辨析标记基因作用、双酶切防自环、PCR 引物酶切位点添加位置（T8）。 一、单选题一、单选题 1．【教材基础实验综合】（2026·江苏南通·一模）科学的实验方法和规范的操作流程是实验成功的关键，相关叙述正确的是（     ） A．鉴定脂肪时，先用体积分数为50%的酒精浸泡花生子叶临时切片，然后染色 B．调查土壤中小动物类群的丰富度时，观察、统计样方内小动物种类、数量 C．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用时，可选用碘液对其因变量进行检测 D．提取香蕉DNA时，将香蕉研磨液倒入离心管中离心，弃上清液取沉淀 【答案】B 【详解】A、鉴定脂肪时，正确操作是先对花生子叶临时切片染色，再用体积分数为50%的酒精洗去浮色，A错误； B、调查土壤中小动物类群丰富度采用取样器取样法，实验中需要观察、统计样方内小动物的种类、数量，以此分析类群丰富度，B正确； C、碘液仅能检测淀粉是否剩余，蔗糖及其水解产物均不与碘液发生显色反应，无法判断蔗糖是否被水解，C错误； D、提取香蕉DNA时，研磨液离心后DNA溶解在上清液中，应取上清液进行后续操作，D错误。 2．【纸层析、有丝分裂观察、丰富度调查、PCR 污染对照】（2026·江苏南通·模拟预测）下列有关实验操作或实验方法的叙述，正确的是（　　） A．纸层析法提取和分离绿叶中的色素，可初步判断叶绿体中色素的种类 B．观察根尖分生组织细胞有丝分裂时，可观察到纺锤丝牵引染色体运动的过程 C．用样方法调查某群落中植物的丰富度时，应取各样方中数据的平均值 D．PCR扩增DNA时可增设不加模板的对照组，检验PCR体系是否有外源DNA污染 【答案】D 【详解】A、提取绿叶中的色素利用的是色素可溶于无水乙醇等有机溶剂的原理，纸层析法是分离色素的方法，不能用于提取色素，A错误； B、观察根尖分生组织细胞有丝分裂的实验中，解离步骤会杀死细胞，细胞停留在分裂的某一时期，无法观察到纺锤丝牵引染色体运动的动态过程，B错误； C、丰富度是指群落中物种数目的多少，用样方法调查植物丰富度时，需统计各样方出现的物种总数，而非取数据平均值，调查种群密度时才需取平均值，C错误； D、PCR扩增时增设不加模板的对照组，若对照组出现扩增产物，说明PCR体系存在外源DNA污染，若无扩增产物则说明体系无污染，可达到检验污染的目的，D正确。 3．【Ti 质粒 TDNA、多克隆位点、电泳迁移速率】（2026·江苏徐州·三模）科研人员利用农杆菌转化法将拟南芥SBPase基因转入甜菜，以提高其光合效率和产量。相关载体如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．构建重组质粒时，需在SBPase基因上下游分别添加AarI和HindⅢ序列 B．筛选转基因甜菜细胞时，可使用含卡那霉素的培养基 C．对PCR扩增产物进行凝胶电泳时，DNA片段的迁移速率与片段大小和构象相关 D．该过程改善了甜菜原有的性状，属于蛋白质工程 【答案】C 【详解】A、构建重组质粒时，为了让外源基因正确插入并表达，需要让基因的上游靠近启动子，下游靠近终止子。 启动子（Mav35S）→ 多克隆位点 → 终止子，是转录的正确方向。 质粒上的酶切位点：HindⅢ 更靠近启动子（上游），AarI 更靠近终止子（下游）。 因此，应该在 SBPase 基因上游添加 HindⅢ 序列，下游添加 AarI序列，才能保证插入方向正确，A错误； B、农杆菌转化法中，只有质粒上的T-DNA 区域会被整合到植物细胞的染色体 DNA 中。 潮霉素抗性基因（HygR）位于 T-DNA 内部，会随目的基因一起进入植物细胞。 卡那霉素抗性基因（KanR）位于 T-DNA 外部，不会被整合到甜菜细胞中。 因此，筛选转基因甜菜细胞时，应使用含潮霉素的培养基，B错误； C、凝胶电泳中，DNA 片段的迁移速率主要受以下因素影响： 片段大小：片段越小，迁移速度越快；片段越大，迁移越慢。 构象：超螺旋 DNA、线性 DNA、开环 DNA 的迁移速率不同（如相同大小的 DNA，超螺旋迁移最快，开环最慢）。 因此，DNA 片段的迁移速率确实与片段大小和构象相关，C正确； D、该过程是将拟南芥的SBPase基因转入甜菜，属于基因工程，并没有对蛋白质的结构进行设计改造，不属于蛋白质工程，D错误。 4．【质粒不同构象电泳、PCR 产物鉴定】（2026·江苏盐城·模拟预测）下图为同一质粒（不同形态）和不同长度的PCR产物（目的基因大小为0.65kb）的琼脂糖凝胶电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．依据电泳迁移方向判断DNA分子在缓冲液中带正电 B．同一质粒的开环形态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关 C．样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内 D．依据电泳结果确定最右侧泳道为目的基因 【答案】C 【详解】A、依据图中显示的电泳迁移方向可判断DNA分子在缓冲液中带负电，A错误； B、结合图示可知，同一质粒的线性状态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关，B错误； C、样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内，此后根据待检的DNA大小设计好相应的参数进行电泳，C正确； D、目的基因大小为0.65kb，通过比对电泳结果确定最右侧泳道中应该含有目的基因，D错误。 5．【AI 蛋白质生成大模型蛋白质工程】（2026·江苏·二模）我国科学家研发的蛋白质生成大模型NewOrigin能通过AI高精度生成蛋白质的氨基酸序列，推动了蛋白质工程的发展。下列相关叙述正确的是（　　） A．设计新的蛋白质时首先应从其基因的碱基序列出发 B．AI可通过改变氨基酸序列设计符合预期功能的蛋白质 C．模型NewOrigin可生产出满足人类特定需求的蛋白质 D．该模型能分析基因组数据进而精准找到遗传病的病因 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程设计新蛋白质时，首先要从预期的蛋白质功能出发，而非直接从基因的碱基序列出发，A错误； B、蛋白质的功能由结构决定，氨基酸序列是蛋白质结构的基础，AI可通过调整、生成氨基酸序列，设计出符合预期功能的蛋白质，B正确； C、模型NewOrigin仅能生成蛋白质的氨基酸序列，蛋白质的生产还需要借助基因工程的表达系统（如构建表达载体、导入受体细胞表达等）完成，该模型本身无法直接生产蛋白质，C错误； D、该模型的功能是生成蛋白质的氨基酸序列，不具备分析基因组数据、查找遗传病病因的作用，D错误。 6．【低温诱导染色体、抗生素选择、遗传病调查、DNA 粗提取】（2026·江苏镇江·模拟预测）下列关于高中生物学“探究·实践”的叙述，错误的是（    ） A．“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，低温影响细胞有丝分裂中染色体的运动 B．“探究抗生素对细菌的选择作用”实验中，应从抑菌圈边缘的菌落挑取细菌并接种 C．“调查人群中的遗传病”实验中，选取群体中发病率较高的单基因遗传病更易推断其遗传方式 D．"DNA粗提取“实验中，采用冷酒精作为DNA溶剂可初步分离DNA与蛋白质 【答案】D 【详解】A、“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，低温的作用是抑制有丝分裂前期纺锤体的形成，而纺锤体的功能是牵引后期姐妹染色单体分离后的染色体向细胞两极移动，因此低温会影响染色体的运动，A正确； B、“探究抗生素对细菌的选择作用”实验中，抑菌圈内部抗生素浓度高，细菌已被杀死，边缘抗生素浓度低，能生长的菌落是抗药性较强的细菌，从边缘挑取细菌接种可进一步筛选抗药性菌株，符合实验操作要求，B正确； C、单基因遗传病由一对等位基因控制，遗传规律遵循孟德尔遗传定律，相比多基因遗传病（受多对基因和环境共同影响，遗传规律复杂）更易推断遗传方式；选取群体中发病率较高的单基因遗传病，更容易获得足量的患者家系样本，提升遗传方式推断的准确性，C正确； D、“DNA粗提取”实验中，DNA不溶于冷酒精，而蛋白质等杂质可溶于冷酒精，加入冷酒精后DNA会析出，从而实现DNA与蛋白质的初步分离，冷酒精不是DNA的溶剂，D错误。 7．【有丝分裂实验漂洗、丰富度统计、酵母菌呼吸、DNA 粗提取替代操作】（2026·江苏·模拟预测）下列关于实验操作或观测的叙述错误的是（　　） A．观察根尖分生区细胞有丝分裂时，解离后的根尖用酒精漂洗后再用甲紫溶液染色 B．用样方法调查某群落中植物的丰富度时，需汇总统计各样方内出现的所有物种种类 C．探究酵母菌细胞呼吸方式的实验中，应将酵母菌培养时间适当延长再检测酒精的产生 D．DNA的粗提取与鉴定实验中，可将研磨液离心的操作替换为在4℃冰箱静置一段时间 【答案】A 【详解】A、观察根尖分生区细胞有丝分裂的实验中，解离后的根尖需用清水漂洗，目的是洗去残留的解离液（盐酸和酒精混合液），防止解离过度，同时避免解离液中的盐酸与碱性染料甲紫反应影响染色效果，用酒精漂洗的操作错误，A错误； B、物种丰富度是指群落中物种数目的多少，用样方法调查植物丰富度时，需统计各样方内所有的物种种类再汇总，以准确统计群落的植物物种数量，B正确； C、探究酵母菌细胞呼吸方式的实验中，无氧组需要先消耗掉装置内的氧气后才会进行无氧呼吸产生酒精，葡萄糖也会与酸性重铬酸钾反应干扰实验现象，所以适当延长培养时间消耗葡萄糖，防止产生干扰，C正确； D、DNA的粗提取与鉴定实验中，研磨液离心的目的是分离出含DNA的上清液，4℃冰箱静置一段时间可使杂质沉淀，DNA仍保留在上清液中，可替代离心操作，D正确。 8．【基因治疗载体、标记基因功能、双酶切、PCR 引物酶切位点位置】（2026·湖北恩施·二模）某先天性耳聋是单基因遗传病，科研人员拟通过载体向细胞内导入正常基因治疗先天性耳聋患者，所用载体含启动子、标记基因、HindⅢ（5´-AAGCTT-3´）和BamHⅠ（5´-GGATCC-3´）酶切位点。下列分析正确的是（    ） A．该种先天性耳聋为显性遗传病 B．借助标记基因的表达情况可筛选出正常基因成功表达的细胞 C．用HindⅢ和BamHⅠ切割上述载体，可以防止载体的自身环化 D．为便于将正常基因与载体连接，扩增正常基因时，需在引物3´端添加限制酶识别序列 【答案】C 【详解】A、该病可通过导入正常基因实现治疗，说明该病为隐性遗传病，A错误； B、标记基因的作用是筛选出成功导入载体的受体细胞，无法判断正常基因是否成功表达，正常基因的表达情况需通过抗原-抗体杂交等技术检测，B错误； C、HindⅢ和BamHⅠ是识别序列不同的两种限制酶，切割载体后会产生不同的黏性末端，载体两端的黏性末端无法互补配对，可防止载体自身环化，C正确； D、PCR扩增时，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链，因此限制酶识别序列需添加在引物的5'端，若添加在3'端会导致无法正常扩增目的基因，D错误。 易错提醒：标记基因只能筛选是否导入载体，不能判断目的基因是否转录、翻译（是否成功表达）；检测表达要用抗原抗体杂交。 限制酶识别序列要加在引物 5′端，不能加在 3′端；DNA 聚合酶从引物 3′端延伸子链，若 3′端添加酶切位点，会直接导致 PCR 扩增失败。 双酶切选用两种识别序列不同的限制酶，产生两种不同黏性末端，避免质粒自连、目的基因反向连接。 基因治疗导入正常显性基因来弥补缺陷，患病一般为隐性遗传病。 9．【PCR 无菌操作、培养基灭菌、接种室消毒、梯度稀释】（2026·江苏镇江·模拟预测）下列相关实验操作正确的是（    ） A．在PCR实验中，用无菌水配制相关反应液置于微量离心管中 B．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 C．接种室使用前，应在对其进行紫外线照射同时适量喷洒苯酚 D．在微生物分离与计数实验中，常用蒸馏水对菌液进行梯度稀释 【答案】A 【详解】A、PCR实验要求严格无菌，因此配制反应液应使用无菌水，A正确； B、酵母培养基煮沸可初步灭菌，为防止凝固，应在未完全冷却的情况下，在酒精灯火焰旁（无菌区）倒平板符合无菌操作规范，B错误； C、接种室消毒时，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果，C错误； D、微生物稀释需用无菌水进行梯度稀释，蒸馏水不是无菌水，可能含有细菌，会干扰计数，D错误。 故选A。 10．【PCR 参数、引物、循环次数、引物计算】（2025·江苏南通·一模）下列关于PCR技术的叙述，错误的是（　　） A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差 B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异 C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量 D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个 【答案】C 【详解】A、引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确； B、不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确； C、PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误； D、DNA为半保留复制，第n次循环是以a×2n-1个DNA分子为模板合成a×2n个DNA分子，故需a·2ⁿ个引物，D正确。 故选C。 11．【极端抗性原核生物结构与应用】（2026·黑龙江大庆·一模）奇球菌可耐受强电离辐射、紫外线、干旱等极端环境，是吉尼斯认证的抗辐射最强生物。下列关于其叙述错误的是（     ） A．拟核区的遗传物质为环状DNA分子 B．细胞壁的主要组成成分与酵母菌相同 C．可应用于基因工程，培育抗逆生物 D．辐射剂量过高也可能导致细胞坏死 【答案】B 【详解】A、奇球菌属于细菌，是原核生物，拟核区的遗传物质为大型环状DNA分子，A正确； B、奇球菌（细菌）细胞壁的主要组成成分为肽聚糖，酵母菌是真菌，细胞壁主要成分为几丁质，二者细胞壁成分不同，B错误； C、奇球菌耐极端环境的抗逆性极强，其相关抗逆基因可应用于基因工程，用于培育抗逆生物，C正确； D、奇球菌的抗辐射能力存在上限，辐射剂量过高时仍会破坏细胞结构、中断正常代谢，导致细胞坏死，D正确。 二、多选题 12．【农杆菌转化、PCR、单克隆抗体、胚胎分割】（2026·湖南长沙·三模）现代生物技术广泛应用于湖南现代农业、医药生产，下列生物技术操作与原理分析正确的是（     ） A．农杆菌转化法转化水稻时，Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞并整合到染色体DNA上 B．PCR技术中，高温变性破坏DNA双链氢键，不需要解旋酶参与解旋 C．单克隆抗体制备过程中，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生多种特异性抗体 D．胚胎分割移植属于无性生殖，分割囊胚时需将内细胞团均等分割 【答案】ABD 【详解】A、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA具有可转移至受体细胞、并整合到受体细胞染色体DNA上的特性，目前农杆菌转化法经过改造已可用于水稻等单子叶植物的转化，A正确； B、PCR技术中，高温（90~95℃）变性步骤可直接破坏DNA双链间的氢键实现解旋，不需要解旋酶参与，B正确； C、单克隆抗体制备中，杂交瘤细胞由单个经特定抗原免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而来，一个B淋巴细胞只能产生一种特异性抗体，因此一种杂交瘤细胞只能产生一种特异性抗体，C错误； D、胚胎分割移植获得的后代来自同一受精卵的有丝分裂，遗传物质完全相同，属于无性生殖；分割囊胚时必须将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，D正确。 13．【插入突变花粉不育PCR 电泳遗传计算】（2026·辽宁营口·三模）某植物基因D位于6号染色体上，基因d由基因D突变产生，仅含基因d时会造成花粉不育。现将一个基因D插入基因型为Dd的植株9号染色体上，让该植株自交得子一代，对子一代的基因D和d进行PCR扩增及电泳鉴定，所用引物和扩增产物的电泳结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．基因D插入植株9号染色体属于基因重组 B．应选择引物S1和R2、T1和W2对子一代进行PCR扩增 C．若只看基因D和d，该植株产生的可育花粉中不含基因d的占比为1/2 D．子一代中电泳结果为类型II的植株占比为1/3 【答案】AD 【详解】A、将外源基因D插入到9号染色体上，属于广义的基因重组（基因工程的原理就是基因重组），A正确； B、PCR扩增需要一对引物分别结合目的片段两条链的两端，且扩增方向为5'到3'，引物延伸方向需相向才能扩增出目的片段：扩增基因D（850bp）需要左引物S1+右引物R2，扩增基因d（790bp）需要左引物W1+右引物T2，符合要求，B错误； C、亲本染色体：6 号D、d，9 号D'。 减数分裂产生花粉（雄配子）4 种：D、d、DD'、dD'，已知只含 d 的花粉不育，可育花粉：D、DD'、dD'（3 种，全带 D）。 可育花粉共3份：不含 d：D、DD'（2 份） ，含 d：dD'（1 份）， 不含d 占比2/3，C错误； D、雄配子（可育）： D：DD′ ：dD′=1：1：1 （3 种可育） ，雌配子（全可育，4 种： D：d：DD′ ：dD′ =1：1：1：1 ）。 只有雄配子不带 d（D、DD'）+ 雌配子不带 d（D、DD'）→子代无 d（类型 Ⅱ，电泳只有850bpD条带）： 雄不含d：2/3(D、DD′ ) ；雌不含d：1/2 (D、DD′) ，类型 Ⅱ 比例 = 2/3​ × 1/2 ​=1/3​ ，D正确。 故选AD。 14．【交错 PCR同源基因重组】（2026·山东聊城·二模）交错PCR能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因产物。相关叙述正确的是（    ） A．交错PCR原理是DNA半保留复制 B．交错PCR延伸温度设定为55℃可增加交错次数 C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增 D．若交错循环20轮，一共产生220个DNA分子 【答案】AB 【详解】A、交错PCR是PCR技术的延伸，利用了DNA半保留复制，A正确； B、在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交错产物③④，故延伸温度设定为55℃可增加交错次数，B正确； CD、交错延伸PCR与普通PCR技术的区别是每轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物—模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因片段混合产物，故上一轮交错产物不需与模板链完全配对即可继续下一轮扩增，交错循环20轮，也只产生1个DNA分子，CD错误。 三、非选择题 15．【耐盐碱水稻融合基因Ti 质粒酶切选择农杆菌转化】（2026·黑龙江大庆·一模）盐胁迫是影响水稻产量的一个重要因素。为培育耐盐碱水稻新品种，科研人员利用耐盐碱基因OsJRL40、绿色荧光蛋白（GFP）基因和Ti质粒构建成OsJRL40-GFP融合基因表达载体，部分操作流程及可能用到的限制酶如图1、2。请回答下列问题： (1)图2中Ori能保证Ti质粒正常复制，推测Ori为____________。 (2)已知OsJRL40基因转录的非模板链序列为：5′-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3′，为构建融合基因，引物2、3需引入同一种限制酶的识别序列，操作流程及可能用到的限制酶如图1、2所示，ATG对应起始密码子AUG，TAG对应终止密码子UAG。引物2的5′端10个碱基序列为____________。 A．5′-GGATCCCTAG-3′ B．5′-GGATCCGTCA-3′ C．5′-GATCCTAGTC-3′ D．5′-GATCGTCAGC-3′ (3)为使构建的OsJRL40-GFP融合基因能正确插入图2所示的Ti质粒并表达融合蛋白，需使用两种限制酶切割Ti质粒和融合基因，可供选择的限制酶组合有____________种。 (4)将融合基因导入水稻细胞常用的方法为____________。在培养水稻细胞的基本培养液中添加____________（选填“四环素”或“潮霉素”），选择出________________________的细胞，转化成功的水稻细胞可通过____________技术培育成转基因水稻植株。 【答案】(1)复制原点 (2)B (3)2 (4) 农杆菌转化法 潮霉素 能在添加潮霉素的培养基上存活并发出绿色荧光 植物组织培养 【详解】（1）质粒上Ori 是复制原点，是 DNA 复制起始的位点，保证质粒在宿主细胞中正常复制。 （2）OsJRL40 非模板链 3' 端序列为 GCTGACTAG，模板链与之互补；引物 2 和模板链 3' 端互补配对，同时引物 5' 端要加上 BamHⅠ 识别序列 GGATCC，并且要避开 TAG 终止密码子，不能提前终止翻译，因此引物 2 的 5' 端 10 个碱基序列为 5'-GGATCCGTCA-3'，故选B。 （3）构建融合基因时，使用了限制酶BamHⅠ，则为使构建的OsJRL40-GFP融合基因能正确插入图2所示的Ti质粒并表达融合蛋白，不能再使用BamHⅠ，Sau3AⅠ的识别序列为GATC，BamHⅠ的识别序列包含Sau3AⅠ的识别序列，因此Sau3AⅠ可切割BamHⅠ的酶切位点，因此能使用的限制酶是SmaⅠ、EcoRV、EcoRⅠ，为了定向插入，需要使用两种限制酶，且需要露出黏性末端的限制酶，则可供选择的限制酶组合有SmaⅠ+EcoRⅠ、EcoRV+EcoRⅠ共两种。 （4）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；潮霉素抗性基因（Hyg）在 T-DNA 片段上，会随 T-DNA 整合到水稻细胞染色体 DNA 上，四环素抗性基因不在 T-DNA 内，因此培养基添加潮霉素；筛选能在添加潮霉素的培养基上存活并发出绿色荧光的细胞；水稻单个细胞培育成完整植株依靠植物组织培养技术，利用植物细胞的全能性。 16．【同聚物加尾连接载体，TdT 末端转移酶】（2026·四川遂宁·一模）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是______，载体上与其能自我复制相关的结构是______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT对基因W和切开的载体两个体系分别进行同聚物加尾（即每个体系中只提供一种脱氧核苷酸），然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是________________________，该过程中___________ （填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是____________________________________________________________________________。 【答案】(1) 启动子 复制原点 (2)Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ (3) DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 （2）要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Pst Ⅰ 、 Xho Ⅰ 。 （3）由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，因为同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 17．【工程益生菌传感器、CRISPRCas 自毁开关】（2026·江苏南通·一模）炎症性肠病（IBD）患者肠道内会产生硫代硫酸盐，生成量与疾病的严重程度呈正相关。图1是科研人员利用大肠杆菌（EcN）建立的响应硫代硫酸盐的益生菌传感器的部分结构，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。请回答下列问题。 (1)图1中，R基因的表达______（“受”或“不受”）硫代硫酸盐的诱导。由于硫代硫酸盐能_____，科研人员可通过检测粪便中_____来判定肠道内硫代硫酸盐的浓度，诊断IBD的发病程度。 (2)为构建图1传感器，科研人员利用PCR技术扩增图2中的R基因时，在引物_____的5＇端分别添加限制酶_____的识别序列。 (3)为了防止EcN工程菌治疗后存在基因转移和抗性基因污染环境的风险，科研人员构建一种如图3的自毁开关系统，该系统能够在诱导条件下激活自毁机制，从而导致细菌无法生长，可用于治疗后EcN的清除。 ①经过人工改造的自毁开关系统由Cascade蛋白、gRNA和Cas3核酸酶组成，Cascade蛋白与：gRNA结合成复合体，gRNA通过与目标DNA部分序列进行_____来识别目标DNA，随后复合体招募Cas3核酸酶切割目标DNA的_____键，诱发细菌死亡。 ②为测试上述自毁开关系统在动物肠道环境中的效果，科研人员制备一些肠道无菌小鼠并将小鼠分为两组：对照组给予重组EcN且正常饮水：实验组_____。一段时间后，收集两组小鼠的_____样本，将其处理后采用_____法接种并统计两组平板上的菌落数。 【答案】(1) 不受 促进R蛋白形成二聚体，并启动GFP基因的表达（或解除R蛋白对启动子B的抑制） 绿色荧光强度 (2) 1、4 BglⅡ、HindⅢ (3) 碱基互补配对 磷酸二酯 给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水 粪便 稀释涂布平板 【详解】（1）从图1可知，R基因自身由启动子A持续驱动表达，不受硫代硫酸盐调控；硫代硫酸盐的作用是和R蛋白结合形成二聚体，解除原本R蛋白对启动子B的抑制，启动GFP基因的转录翻译，合成绿色荧光蛋白。由于硫代硫酸盐生成量和IBD严重程度正相关，最终GFP的表达量和硫代硫酸盐浓度正相关，因此可通过检测粪便中的绿色荧光强度判定硫代硫酸盐浓度，诊断IBD发病程度。 （2）PCR 扩增目的基因，引物分别结合模板两条链的 3' 端；引物1在 R 基因启动子A上游，引物 4 在R基因终止子下游，用引物 1、4 才能完整扩增R基因（既包括启动子也包括终止子）片段。BglⅡ、HindⅢ 两个酶切位点，切割后产生不同黏性末端，防止目的基因自身环化、反向连接，它们又在启动子和终止子附近便于转录，Xam Ⅰ比较远，没有BglⅡ、HindⅢ更合适。Pst Ⅰ和Sau3A在质粒启动子和终止子内部，会破坏转录。BamHⅠ 会破坏R基因，Sam Ⅰ会切掉终止子。所以限制酶用BglⅡ、HindⅢ。 （3）①gRNA识别目标DNA依靠核酸序列的碱基互补配对原则；核酸酶的作用是切割DNA骨架的磷酸二酯键，破坏细菌基因组/关键基因，诱发细菌死亡。 ② 实验遵循单一变量原则，对照组给予重组EcN且正常饮水，实验组需要给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水，激活自毁机制。由于肠道益生菌会随粪便排出，因此收集粪便样本，采用稀释涂布平板法接种，通过统计菌落数反映肠道内存活的工程菌数量，验证自毁开关的清除效果 三年真题·压轴题（侧重江苏，辐射全国，单选题） 设题创新：依托教材 DNA 粗提取、PCR 电泳鉴定综合实验情境，辨析 DNA 提取、电泳上样操作要点（T1）；围绕人源抗体基因克隆制备单克隆抗体情境，辨析 cDNA 获取、异源系统表达抗体（T2）；结合基因工程工具酶综合判断情境，辨析逆转录酶、Taq 酶功能与酶专一性（T3）；基于单酶切构建重组质粒，目的基因正向、反向插入的质粒电泳片段分析情境，辨析载体自连、重组质粒酶切片段计算（T8）。 一、单选题 1．【教材实验判断：抗生素选择、组培移栽、DNA 粗提取、PCR 电泳上样】（2026·福建·高考真题）下列高中生物学教材实验的相应操作，错误的是（     ） 选项 实验名称 实验操作 A 探究抗生素对细菌的选择作用 评价抑菌效果时，要测量抑菌圈的直径 B 菊花的组织培养 移栽时，将含培养基的试管苗移植到室外的土壤中 C DNA的粗提取与鉴定 提取DNA时，将洋葱研磨液离心获得含DNA的上清液 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合后再进行加样 A．A B．B C．C D．D 【答案】B 【详解】A、探究抗生素对细菌的选择作用实验中，抗生素会抑制滤纸片周围细菌的生长，形成透明抑菌圈，抑菌圈直径越大代表抑菌效果越强，通过测量抑菌圈直径可评价抑菌效果，A正确； B、菊花组织培养的试管苗移栽前，需要先打开培养瓶封口膜让试管苗在培养间生长几日炼苗，之后还要用流水清洗掉根部的培养基，再移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等过渡环境中壮苗，待幼苗适应外界环境后再移栽到室外土壤中，不能直接将带培养基的试管苗直接移植到室外土壤，否则残留培养基易引发杂菌污染、幼苗难以适应外界环境导致死亡，B错误； C、以洋葱为材料提取DNA时，研磨后通过离心，细胞碎片等大颗粒物质会沉淀，DNA等可溶性成分存在于上清液中，可收集该上清液进行后续DNA提取操作，C正确； D、进行DNA电泳鉴定时，需要先将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液混合，缓冲液中的染料可以指示电泳进程、高密度成分能让样品沉入点样孔，之后再完成加样操作，D正确。 2．【人源单克隆抗体制备】（2026·福建·高考真题）流感病毒威胁人类健康。科研人员抽取经流感疫苗免疫后的人体血液，分离获得相应的浆细胞，利用相关技术快速制备抗流感病毒的人源单克隆抗体，该抗体可用于流感重症患者的应急治疗。部分实验流程如下： 下列叙述正确的是（     ） A．该技术是利用蛋白质工程原理制备人源单克隆抗体 B．步骤②中分离的血液淋巴细胞都可以用于抗体基因序列的获取 C．将步骤③中的单细胞注射到小鼠腹腔中也可获得大量的单克隆抗体 D．步骤⑤中单克隆抗体的表达和生产都不依赖于B细胞 【答案】D 【详解】A、该技术是从已免疫的浆细胞中获取天然的抗流感抗体的基因序列，通过基因工程构建重组载体实现抗体表达，并未对抗体的基因/蛋白质结构进行定向改造，不属于蛋白质工程的原理，A错误； B、步骤②分离的血液淋巴细胞包含T细胞、未免疫的B细胞等多种类型，只有能产生抗流感抗体的浆细胞才含有对应的抗体基因序列转录出的mRNA，并非所有淋巴细胞都可用于获取目标抗体基因，B错误； C、步骤③的单细胞是人体的浆细胞，浆细胞是高度分化的细胞，不能无限增殖，注射到小鼠腹腔无法大量增殖，也就不能获得大量单克隆抗体；只有能无限增殖的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔才能制备腹水型单克隆抗体，C错误； D、步骤⑤是将抗体基因构建到重组载体中，导入工程细胞完成抗体的表达与生产，整个过程不需要依赖B细胞的参与，D正确。 3．【基因工程的酶：逆转录酶、TaqDNA 聚合酶、限制酶专一性】（2026·江苏·高考真题）基因工程中需要使用多种酶，下列叙述正确的是（     ） A．逆转录酶催化形成磷酸二酯键 B．Taq酶催化形成氢键和肽键 C．限制酶有专一性而Taq酶没有专一性 D．Taq酶催化新链合成时以双链DNA为模板 【答案】A 【详解】A、逆转录酶以RNA为模板，利用脱氧核苷酸合成DNA，脱氧核苷酸之间依靠磷酸二酯键相连，逆转录酶催化磷酸二酯键的生成，A正确； B、Taq酶是热稳定DNA聚合酶，仅催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键；氢键在DNA复性时自发形成，不需要酶催化；肽键是翻译过程形成，与Taq酶无关，B错误； C、专一性是酶的基本特性。限制酶专一识别特定DNA序列；Taq酶只能催化DNA子链合成，同样具有专一性，C错误； D、PCR反应中，高温变性使双链DNA解旋为单链，延伸阶段Taq酶以单链DNA作为模板合成DNA新链，D错误。 4．【生物学实验操作正误辨析】（2026·江苏·高考真题）下列关于中学实验操作的叙述正确的是（     ） A．消毒过的菊花幼茎切成小段后可作为外植体 B．观察花生子叶中的脂肪用斐林试剂染色 C．加入预冷的无水乙醇研磨菠菜叶提取DNA D．用双缩脲试剂检测小麦籽粒中的淀粉 【答案】A 【详解】A、植物组织培养的外植体需要经过消毒处理，消毒后的菊花幼茎切成适宜小段可以作为外植体使用，A正确； B、观察花生子叶中的脂肪使用的是苏丹Ⅲ染液，B错误； C、提取菠菜叶中的DNA时，预冷的无水乙醇的作用是在研磨后对DNA进行析出纯化，不能在研磨阶段加入，研磨时需要先加研磨液破坏细胞结构释放核物质，C错误； D、双缩脲试剂是用来检测蛋白质的，检测淀粉应该使用碘液，D错误； 5．【菌株蛋白替换改造电泳条带分析】（2026·广西·高考真题）菌株甲能分泌多种蛋白，主要包括蛋白酶G、脂肪酶D和淀粉酶T。科研人员将菌株甲编码酶G的基因替换为编码酶T的基因，构建出菌株乙；然后将菌株乙编码酶D的基因替换为编码酶T的基因，构建出菌株丙。各菌株发酵液中多种外泌蛋白电泳结果如图所示。下列说法错误的是（     ） A．脂肪酶D、蛋白酶G分别是蛋白4、5 B．菌株丙水解煮熟大豆的能力比菌株甲强 C．测定发酵液外泌蛋白含量前，应先去除菌体 D．通过检测还原糖产生速率可比较各菌株外泌淀粉酶T的含量 【答案】B 【详解】A、首先根据菌株构建逻辑和电泳结果推导各蛋白对应种类：菌株甲含蛋白酶G、脂肪酶D、淀粉酶T；菌株乙替换G基因为T基因，对比甲、乙条带，乙缺少蛋白5且蛋白2含量升高，说明蛋白5为蛋白酶G、蛋白2为淀粉酶T；菌株丙替换乙的D基因为T基因，对比乙、丙条带，丙缺少蛋白4且蛋白2含量进一步升高，说明蛋白4为脂肪酶D，A正确； B、煮熟大豆的主要可水解成分包括蛋白质、脂肪和淀粉，菌株甲含有蛋白酶G、脂肪酶D、淀粉酶T，菌株丙无蛋白酶G和脂肪酶D，仅淀粉酶T含量高于甲，因此丙水解煮熟大豆的整体能力弱于甲，B错误； C、外泌蛋白是菌株分泌到发酵液中的蛋白，菌体自身含有大量胞内蛋白，若不去除菌体会干扰外泌蛋白含量的测定，C正确； D、淀粉酶T催化淀粉水解产生还原糖，在相同且适宜的反应条件下，还原糖产生速率与淀粉酶T的含量正相关，因此可通过该指标比较不同菌株外泌淀粉酶T的含量，D正确。 6．【细菌限制修饰系统表观遗传】（2026·浙江·高考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 【答案】C 【详解】A、由图可知，细菌的甲基化酶仅对自身DNA进行甲基化，避免自身DNA被限制酶切割，不会对噬菌体DNA进行甲基化，A错误； B、酶的专一性指一种酶只能催化一种或一类化学反应，限制酶和甲基化酶是两种不同的酶，二者作用于相同底物不能体现酶的专一性，B错误； C、由图可知，噬菌体DNA未被甲基化，可被细菌的限制酶特异性切割，C正确； D、DNA甲基化属于表观遗传的修饰方式，该修饰是可以遗传给子代的，D错误。 7．【蛋白质工程转基因荧光斑马鱼】（2026·甘肃·高考真题）科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish。为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是（     ） A．步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B．处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C．步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D．新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 【答案】B 【详解】A、该流程属于蛋白质工程范畴，设计荧光蛋白结构后，步骤①应是推测氨基酸序列以及对应的脱氧核苷酸序列（基因序列），不需要推测转运RNA类型，A错误； B、将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，可通过显微操作将改造后的荧光蛋白基因导入斑马鱼受精卵，B正确； C、斑马鱼是卵生生物，受精卵可在体外适宜环境中发育，不需要移植到斑马鱼体内发育，C错误； D、转基因生物存在潜在的安全风险，新型荧光斑马鱼上市前必须进行安全性评价，D错误。 8．【重组质粒构建，单酶切自连，目的基因正反插入】（2026·全国卷·高考真题）为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B．若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C．重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D．重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 【答案】A 【详解】A、用限制酶X切割质粒时，存在部分质粒未被切割，或切割后自身环化的情况，这类质粒仍为2.4kb的环状结构，抗性基因完整，可在抗性平板上生长，因此能挑选到含2.4kb质粒的大肠杆菌菌落，A错误； B、原质粒长度为2.4kb，目的基因长度为1.5kb，二者连接后得到的重组质粒总长度为2.4+1.5=3.9kb，因此提取到3.9kb的质粒提示其中可能含有目的基因，B正确； C．目的基因两端均为X酶的黏性末端，插入时存在两种方向：若目的基因上0.4kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+0.4=0.7kb，2.1+1.1=3.2kb，C正确； D．若目的基因反向插入，即1.1kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+1.1=1.4kb，2.1+0.4=2.5kb，D正确。 9．【蛋白质工程改造酶热稳定性】（2026·北京·高考真题）MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（     ） A．温度和pH会影响MT的催化活性 B．第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C．为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D．对MT结构的改造属于蛋白质工程 【答案】B 【详解】A、酶的活性受温度、pH等因素的影响，MT本质是酶，因此温度和pH会影响其催化活性，A正确； B、根据题干信息，将第216位的丙氨酸变为苏氨酸后，MT的热稳定性提高，并未改变其催化功能（仍可催化海藻糖合成），说明该位点的丙氨酸与MT的热稳定性有关，未体现对其专一性的作用，B错误； C、热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高活性，因此筛选热稳定性高的MT时，应在较高温度下测定酶活性，C正确； D、通过改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，以获得功能符合需求的蛋白质，该技术属于蛋白质工程，D正确。 10．【PCR 引物酶切位点设计，质粒图谱酶切位点破坏判断】（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 【答案】B 【详解】A、XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误； B、F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确； C、F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误； D、PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 二、多选题 11．【酵母表达质粒复制原点、MCS 多克隆位点、营养缺陷型筛选】（2026·江苏·高考真题）利用酵母表达外源蛋白时，构建的质粒通常需在大肠杆菌中扩增，鉴定后再转入酵母细胞中表达。图示色氨酸营养缺陷型酵母筛选系统的表达质粒结构。下列叙述正确的有（     ） A．Ori在完成质粒构建和表达过程中不起作用 B．该质粒在酵母细胞中复制时需识别2μ Ori C．MCS含有多个酶切位点，便于设计目的基因插入位点 D．用不添加色氨酸的培养基筛选成功导入质粒的酵母 【答案】BCD 【详解】A、Ori是细菌复制原点，题干提到质粒需要先在大肠杆菌中扩增，质粒在大肠杆菌内复制扩增必须依赖Ori，因此Ori发挥重要作用，A错误； B、题图注释标明2μ Ori是酵母质粒复制原点，复制原点是DNA复制起始位点，质粒在酵母细胞中进行复制，需要识别2μ Ori，B正确； C、MCS即多克隆位点，集中了多种限制酶的识别切割位点，便于选择合适限制酶，将目的基因插入质粒，C正确； D、酵母是色氨酸营养缺陷型，自身无法合成色氨酸；质粒携带TRP1色氨酸合成相关基因。成功导入质粒的酵母可以合成色氨酸，能在无色氨酸培养基存活；未导入质粒的酵母不能合成色氨酸，无法存活，以此完成筛选，D正确。 三、非选择题 12．【CART 细胞、VHH 驼源抗体、抗体基因文库构建、小鼠肿瘤模型实验】（2026·江苏·高考真题）驼源抗体（VHH）具有分子量小、与人源抗体同源性高等优点，科研人员将其作为抗原受体改造T细胞，开发出新型CAR-T细胞（V-CAR-T细胞）用于肿瘤治疗。请回答下列问题： (1)CAR-T细胞通过抗原受体直接识别肿瘤细胞表面上的靶点进而裂解肿瘤细胞，在免疫方式上属于______。 (2)早期CAR-T细胞受靶细胞刺激后，难以分裂、分化为______细胞杀伤肿瘤细胞。V-CAR-T细胞中增加了两个协同刺激结构域（图1），以促进T细胞分泌______加速其增殖和分化。V-CAR-T细胞表面的______可作为其标记，用于验证输注V-CAR-T细胞治疗后，机体内是否存在V-CAR-T细胞。 (3)非小细胞肺癌细胞高表达Trop2，科研人员研发新型识别Trop2的V-CAR-T细胞。为筛选获得抗Trop2的VHH，构建VHH基因文库，流程如下： 步骤 实验目的 实验操作 ⅰ 制备cDNA模板 用①______免疫羊驼，分离获得外周血淋巴细胞，提取②______，反转录成cDNA； ⅱ 扩增VHH基因 用③______端加入SfiⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增； ⅲ 构建文库 质粒载体与VHH基因片段经SfiⅠ酶切后，用④______酶连接，转化感受态细胞。 (4)筛选出高亲和力的抗Trop2的VHH，构建获得特异识别Trop2的V-CAR-T细胞（Trop2 CAR-T细胞）。为验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，建立肺癌小鼠模型，随机分为3组开展实验，实验结果见图2、图3。 ①设置未改造T细胞组作对照的目的是______。 ②根据图2、图3结果，可得出结论______。 【答案】(1)细胞免疫 (2) 活化的细胞毒性T细胞 细胞因子 VHH (3) Trop2蛋白 总RNA 5′端 DNA连接 (4) 检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强 Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期 【详解】（1）CAR-T细胞属于改造后的T细胞，直接裂解肿瘤靶细胞，符合细胞免疫的特征，因此属于细胞免疫。 （2）通过图1分析及题干背景提示，V-CAR-T细胞表达协同刺激结构域，分泌细胞因子，加速V-CAR-T细胞增殖和分化成激活的细胞毒性T细胞，杀伤肿瘤细胞。驼源抗体（VHH）作为改造后T细胞上的抗原受体，赋予T细胞直接识别肿瘤细胞表面靶点的能力进而裂解肿瘤细胞。VHH位于V-CAR-T细胞表面，因而也可用作检测标记来验证机体 内是否存在V-CAR-T细胞。 （3）VHH的分子大小仅为传统抗体的1/10（15kD），具有穿透力 强、特异性高、稳定性好等优势，因而被用于替代传统单链抗体构建新一代CAR-T细胞。识别 Trop2的VHH基因序列主要通过抗体基因文库构建、噬菌体展示技术筛选和DNA测序等环节获得，其中抗体基因文库构建的流程是：Trop2蛋白免疫羊驼，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，反 转录获得cDNA；设计合成特异性引物（5′端加入SfiI酶切位点），经PCR扩增获得VHH基因；SfiI 限制酶分别酶切VHH基因片段和噬菌粒载体，DNA连接酶进行连接，电转化入感受态细胞，构建驼 源抗体基因文库。 （4）①实验目的是验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，所以设置未改造T细胞组是为了检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强； ②对比三组实验结果：缓冲液组和未改造T细胞组的肿瘤体积大、小鼠生存期短，Trop2CAR-T组肿瘤体积显著降低、小鼠生存率和生存时间明显提升，可证明Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期。 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第41 讲 基因工程 第一部分 五年考情·精准定向 ……………………………………………………………… 1 江苏考情概览 高频考点情境 高效备考策略 第二部分 三大核心·主干速记………………………………………………………………… 3 一图串联·核心梳理·速记口诀 核心 01基因工程的基本工具 核心 02基因工程的操作程序 核心 03 DNA相关的两个实验　 核心 04转基因产品的安全性引发社会的广泛关注 第三部分 六大易错·逐点击破…………………………………………………………………9 易错 01双酶切≠一定用两种限制酶 易错 02载体≠质粒 易错 03载体本质是 DNA，不是酶。 易错 04 分子杂交三层鉴定别混淆 易错 05 PCR 三步与酶的易错点 易错 06蛋白质工程≠改造蛋白质 第四部分 分层专练·靶向攻关 …………………………………………………………………10 两年模拟·基础题（全国视野，单选+多选） 一年重难·情境题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 三年真题·压轴题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 江苏考情概览 新课标要求 考题统计 1. 阐明 DNA重组技术的概念，说出基因工程的操作工具 的基本功能，说明载体应具备的基本条件。 2. 阐述基因工程的基本操作程序，举例说明基因工程在农牧业、 医药卫生、环境保护等领域的应用。 3. 说明 PCR 技术的原理和基本过程；简述蛋白质工程的 原理和基本途径。 2025 江苏 基因表达载体的构建与检测鉴定 2024 江苏 目的基因导人方法与 PCR 技术 2022 江苏 基因工程的应用与转基因安全 2021 江苏 蛋白质工程与基因编辑 2023 江苏 限制酶与 DNA连接酶的作用 高频考点情境 1.考查频次：基因工程是江苏高考 “生物技术与工程” 模块的核心考点，单选、多选、非选择题均会考查，近五年江苏卷几乎年年涉考， 常结合基因表达载体构建、PCR 扩增、转基因动植物的培育、基因编辑 (CRISPR/Cas9)、基因检测与基因治疗等科研与生产真实情境命题。 2.考查要点：操作工具的选择与作用部位辨析；基因工程操作程序;PCR 原理与过程；基因工程的应用及转基因生物的安全性；蛋白质工程。 3.命题情境：基因表达载体示意图、质粒图谱、PCR 扩增流程、农杆菌转化、基因编辑、转基因抗虫棉培育流程图：側重工程思维与设计方案评价。常与遗传规律、分子生物学、细胞工程綜合命题 备考策略 1.抓牢核心概念：必背： 目的基因、限制酶、DNA 连接酶、载体、质粒、基因表达载体、启动子、终止子、标记基因、转化、PCR、引 物、DNA 分子杂交、抗原一抗体杂交、转基因生物、蛋白质工程。 2. 构建知识网络：操作工具 （限制酶 +DNA 连接酶+载体)+基本程序（目的基因获取+表达载体构建+导入受体细胞+检測与鉴定）+应用 （农牧业、医药卫生、环保）+蛋白质工程。 3.联系实际应用：转基因抗虫棉；胰岛素、生长激素等药物的生产；基因治疗；基因编辑技术；生物反应器 （乳腺生物反应器、膀胱生物反应器）。 4.强化题型方法：载体构建题 （酶切位点、黏性末端、反向连接判断）：程序判断题，（ 顺序、条件辨析）：检测方法辨析题 (DNA 杂交、分子杂交、抗原一抗体杂交、个体鉴定）;PCR 计算题 （循环次数与 DNA 分子数)；流程图题 （步骤判断、方案评价）。 5.紧扣命题趋势：新课标强调生物技术与工程实践，基因工程常与遗传规律、细胞工程、胚胎工程综合命题，注重工程思維与科学探究能力；江苏卷多以科研与生产情境设置选择题与非选择题。 一图串联 速记口诀 限制连接双酶全，质粒载体条件严； 目的基因两途径，表达载体先构建。 导入受体方法辨，三项杂交鉴定全； PCR 三步高温变，蛋白工程改基因。 核心梳理 核心 01基因工程的基本工具 1.基因工程概述 项目 内容 主要技术 转基因技术 操作环境 体外 操作水平 DNA分子水平 理论依据 基因重组 供体 提供目的基因 受体 复制或表达目的基因 基本过程 切割→改造和拼接→导入→表达 优点 克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状 2.基因工程的基本工具 （1）限制性内切核酸酶(限制酶) 限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开产生的是平末端。 （2）DNA连接酶 ①作用：在两个核苷酸之间形成　磷酸二酯键　以连接两个DNA片段。 ②主要类型：①E．coli DNA连接酶：从大肠杆菌中分离；②T4_DNA连接酶：从T4噬菌体中分离。两者都能连接黏性末端和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。 （3）载体 ①作用：将基因送入细胞。 ②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 ③重要的载体之一——质粒 质粒的本质 是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 特点(条件) 有一个至多个限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制：便于目的 DNA 在受体细胞中稳定存在 带有标记基因(常是人工改造后具有)，一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等：便于重组DNA分子的筛选(鉴定目的基因是否导入成功) （4）限制酶的选择 ①根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ②应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒， ④根据质粒的特点选择限制酶 核心 02基因工程的操作程序 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建(核心工作) （1）过程 （2）基因表达载体的组成 指点迷津：复制原点≠启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 a.启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，基本组成单位是脱氧核苷酸，其位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3′端。 b.起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近mRNA的5′端。 c.复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T，是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个复制原点。 3.将目的基因导入受体细胞 受体细胞 常用方法 操作过程 植物细胞(常用体细胞或受精卵) 花粉管通道法(我国独创) 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二：将DNA溶液滴加在受粉后一定时间内的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→感染植物细胞→T-DNA整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 动物细胞(常用受精卵) 显微注射法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞 Ca2+处理法(感受态细胞法) Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收周围环境中的DNA分子 4.目的基因的检测与鉴定 ①通过PCR等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 ②)利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 ③进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 核心03 DNA相关的两个实验　 1.DNA的粗提取与鉴定 （1）实验思路、原理 ①提取的基本思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，利用这些差异，对DNA进行提取。 ②相关原理 （2）材料选择 ①依据：选用DNA含量高的组织，成功的可能性更大。 ②常用材料：新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花、鸡血和猪肝等(方法可能稍有不同)。 （3）实验过程 2.利用PCR技术扩增DNA片段并电泳鉴定 （1）实验原理 ①扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 ②电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动。 ③鉴定原理：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。 （2）设备：PCR仪、电泳装置等。 （3）实验过程 ①PCR操作过程 指点迷津 a.预变性可使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合； b.最后一轮延伸给予更长时间的主要目的是使子链充分延伸，得到更多的等长DNA。 （4）电泳鉴定：配制琼脂糖溶液，加入核酸染料混合→制备凝胶→加缓冲液(没过凝胶1 mm为宜)→加样(PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，留一个孔加标准参照物)→进行电泳(待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止)→紫外灯下鉴定。 核心04　转基因产品的安全性引发社会的广泛关注 1.转基因成果 （1）转基因微生物 ①微生物的优点：微生物的生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感，容易进行遗传物质操作。 ②成果举例：转基因酵母菌减少了啤酒酵母双乙酰的生产，缩短了啤酒的发酵期；构建基因工程菌生产氨基酸、药物等。 （2）转基因动物成果 ①培育生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜。 ②培育抗病毒的动物新品种。 ③建立了某些人类疾病的转基因动物模型。 （3）转基因植物 ①科学家已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状作物。 ②我国批准发放了一些转基因作物的生产应用安全证书，及一些转基因作物的进口安全证书。 2.对转基因产品和技术的态度 （1）对转基因产品安全性的争论 争论主要聚焦在转基因食品的安全性等方面。 （2）理性看待转基因技术 ①研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。 ②相应法规的制定既维护了消费者对转基因产品的知情权和选择权，又最大程度地保证了转基因技术和已经上市的转基因产品的安全性。 3．生殖性克隆人面临的伦理问题 (1)生殖性克隆和治疗性克隆 治疗性克隆 生殖性克隆 目的 治疗人类疾病 用于生育，产生新个体 处理方式 获得早期胚胎主要用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的　细胞、组织或器官 获得的早期胚胎通过胚胎移植到母体子宫内发育成个体 水平 细胞水平 个体水平 联系 都属于无性繁殖，产生新个体、新组织，遗传物质相同 (2)对生殖性克隆人研究的不同见解 ①伦理学家认为生殖性克隆人“有违人类尊严”；人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，严重地违反了人类伦理道德。 ②很多生物学家认为克隆技术还不成熟：构建重构胚成功率低，胚胎移植到子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高。即使有个体活过了幼年期，也可能早亡。 ③我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。 易错 01双酶切≠一定用两种限制酶 构建载体常用双酶切，防止质粒自连、目的基因反向连接；但单酶切也可使用，只是容易出现自连与反向连接，做题要看题干条件，不要默认一定双酶切。 易错 02载体≠质粒 质粒是最常用载体，载体还包括 λ 噬菌体衍生物、动植物病毒； 载体必备条件：复制原点、标记基因、多个酶切位点， 易错 03载体本质是 DNA，不是酶。 获取目的基因两条途径区分 PCR 扩增：已有部分目的基因序列为前提；人工合成（基因文库 / 化学合成）：无模板，序列已知较短基因；PCR 不能创造全新基因，只能扩增。 易错 04 分子杂交三层鉴定别混淆 DNA 分子杂交：检测目的基因是否导入； 核酸分子杂交：检测目的基因是否转录出 mRNA； 抗原 — 抗体杂交：检测是否翻译出蛋白质； 个体水平鉴定不属于分子杂交。 易错 05PCR 三步与酶的易错点 变性依靠高温解旋，不用解旋酶； Taq 热稳定 DNA 聚合酶只负责延伸，不能从头合成 DNA，需要引物； 三步：变性→复性→延伸，循环扩增。 易错 06蛋白质工程≠改造蛋白质 蛋白质工程：直接改造基因，间接改变蛋白质； 不能直接改造蛋白质（蛋白质空间结构复杂，改造后不能遗传）； 基因工程只能生产自然界已有的蛋白质，蛋白工程可制造自然界不存在的蛋白。 两年模拟·基础题（全国视野，单选+多选） 亮点预览：依托乙烯受体反向抑制转基因番茄培育情境，辨析植物激素与转基因干扰效应（T1）；围绕基因工程改良乳酸菌生产发酵饮料情境，辨析基因工程核心步骤、微生物培养基营养条件（T2）；结合原核、真核细胞结构辨析情境，辨析质粒、拟核、细胞壁、细胞核的判定（T3）；基于 cDNA 制备与原核异源表达抗逆基因情境，辨析逆转录产物特点、原核转录调控机制（T5）；依托质粒图谱与重组 DNA 构建情境，辨析载体各组分功能、限制酶作用位点（T6）。 一、单选题 1．【植物激素转基因抑制基因翻译】（2026·四川雅安·二模）为进一步提高番茄的储存时间，科学家将乙烯受体基因Ers1反向插入质粒，构建基因表达载体，然后导入番茄细胞中，使原有的Ers1基因翻译受到抑制，从而延长番茄储存时间。下列说法正确的是（     ） A．乙烯是由色氨酸为原料合成的一种激素 B．乙烯能促进果实成熟，还能促进植物开花 C．对转基因番茄喷洒适量乙烯可缓解反接Ers1基因的作用 D．番茄果实的成熟只受乙烯的调控 2．【发酵工程 + 基因工程综合】（2026·四川雅安·二模）广西沃柑营养丰富，乳酸菌发酵产品有益健康，欲开发沃柑乳酸菌发酵饮料，研究者进行了相关研究。下列说法错误的是（     ） A．通过发酵工程生产沃柑乳酸菌饮品的中心环节是发酵罐内发酵 B．利用基因工程改良乳酸菌菌种的核心工作是基因表达载体的构建 C．培养乳酸菌时，向培养基中添加水、无机盐、碳源和氮源，并提供无氧条件即可 D．在青贮饲料中添加乳酸菌可提高饲料品质，动物食用后能提高免疫力 3．【原核真核细胞结构辨析】（2026·四川雅安·二模）细胞虽然形态多种多样，但是基本结构具有高度的一致性，下列关于细胞结构的归纳，正确的是（     ） A．没有细胞壁的一定是动物细胞 B．没有细胞核的一定是原核细胞 C．含有质粒的一定是原核细胞 D．含有拟核的一定是原核细胞 4．【蛋白质工程植物脱毒苗胚胎移植无菌消毒】（2025·广东广州·模拟预测）生物技术是应用生命科学的研究成果，对生物或生物的成分、产物等进行改造和利用的技术，与人类健康、生产生活的关系密切。下列叙述正确的是（     ） A．蛋白质工程通过改造或合成基因实现对蛋白质结构的设计改造 B．生产中培育香蕉脱毒苗常用的方法是进行远缘植物体细胞杂交 C．进行胚胎移植前，要对供体和受体进行免疫检查，以防发生免疫排斥反应 D．微生物培养过程中，接种前需用紫外线对接种室、工作台以及人的双手等进行消毒 5．【cDNA、原核转录、诱导基因表达】（2026·湖南永州·一模）为研究荒漠植物花花柴的抗逆机制，科研人员提取其总RNA，经逆转录获得cDNA，PCR扩增得到与抗逆相关的KcHTR基因，将其导入大肠杆菌后，加入IPTG（可去除某种阻碍RNA聚合酶移动的阻遏蛋白）成功诱导该基因表达。下列叙述正确的是（     ） A．KcHTR基因转录过程需要DNA聚合酶催化核糖核苷酸聚合 B．逆转录获得的cDNA含有启动子和终止子 C．大肠杆菌中，KcHTR基因的转录在细胞核内完成 D．IPTG通过调控基因的转录过程诱导目的基因表达 6．【基因表达载体结构辨析】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）下图为基因表达载体构建示意图。下列叙述正确的是（     ） A．限制酶在切割质粒和目的基因时均作用于DNA分子的氢键 B．启动子位于目的基因上游，是DNA聚合酶识别和结合的位点 C．标记基因用于筛选含有重组质粒的受体细胞 D．图中质粒上的复制原点与终止子均属于基因表达载体中的表达调控序列 7．【基因编辑体细胞核移植胚胎分割】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）我国科研团队历经13年在全球首次实现对奶牛胚胎干细胞定点基因编辑，并通过体细胞核移植等技术培育出健康克隆犊牛。下列叙述正确的是（     ） A．定点基因编辑技术通过将外源基因随机整合到受体基因组中来实现基因改造 B．经基因编辑及核移植技术得到的奶牛重构胚，需体外培养至原肠胚时进行胚胎移植 C．体细胞核移植过程中需选用减数第一次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞 D．若要获得多头遗传性状相同的良种奶牛，可通过均等分割囊胚时期的内细胞团实现 8．【PCR 实验操作、培养基灭菌、平板划线】（2026·广东广州·一模）下列相关实验操作正确的是（     ） A．为得到两条长度完全一致的目的DNA片段，最多只需进行PCR两轮循环 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 9．【琼脂糖凝胶电泳 DNA 迁移规律】（2026·浙江·一模）琼脂糖凝胶电泳是基因工程中分离鉴定DNA片段的常用技术。下列叙述正确的是（     ） A．DNA分子越大，其在电泳过程中迁移速率越快 B．低浓度的琼脂糖凝胶适合分离较小的DNA片段 C．电泳时指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在电场作用下，DNA分子会向与它所带电荷相反的电极移动 10．【PCR 条带亮度扩增条件优化】（2026·内蒙古呼和浩特·一模）研究小组利用PCR技术扩增某植物的抗病基因片段，电泳检测后发现条带亮度较低，下列措施中最不可能使结果得到改进的是（     ） A．增加模板DNA用量 B．提高引物浓度 C．减少PCR循环次数 D．更换高活性DNA聚合酶 二、多选题 11．【环状 DNA 限制酶酶切电泳 + PCR 原理】（2026·内蒙古锡林郭勒·一模）科学家对某DNA分子用限制酶EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图。为进一步确认酶切产物中的目的片段，可用PCR技术扩增该片段并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是（     ） A．该DNA分子为环状DNA分子 B．PCR变性过程中，高温破坏了DNA双链间的磷酸二酯键 C．该DNA分子上限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ各只有1个酶切位点 D．PCR延伸过程中，耐高温的DNA聚合酶从引物3′端延伸子链 12．【同源重组基因敲除质粒构建】（2026·湖南·一模）具有相同碱基序列的DNA分子可通过片段互换，从而实现同源重组。下图表示科学家利用同源重组技术敲除放线菌R基因（能辅助放线菌吸收铁离子）的操作过程，主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。下列有关叙述错误的是（　　） A．构建重组质粒时，必须用相同的两种酶处理质粒和目的基因 B．能通过电泳技术检测放线菌相关DNA来判断基因是否敲除成功 C．发生交换时会有氢键与磷酸二酯键的断裂和形成，该过程需要的是DNA水解酶 D．可通过比较放线菌在操作前后吸收铁离子的效率来判断基因是否敲除成功 13．【农杆菌转化、RNA 沉默、转录后调控】（2026·江苏徐州·模拟预测）植物细胞靠RNA沉默抵御外源基因，植物病毒可产生抑制子抵消该防御。CYP76AD、DODA1是甜菜苷合成必需基因，将多基因表达盒（如图）转入烟草后，仅侵染部位出现红色。叙述错误的是（     ） A．一个DNA分子上有多个基因串联时，均以同一条链作为转录的模板 B．甜菜苷只在农杆菌侵染的部位合成，在植物体内不会转运 C．基因P19的存在有利于加强植物对外源基因的防御反应 D．植物通过阻碍RNA聚合酶与启动子识别与结合来实现RNA转录后水平调控沉默 一年重难·情境题（侧重江苏，辐射全国，单选+多选+非选择题） 设题创新：依托 Ti 质粒载体农杆菌转化培育高光效甜菜情境，辨析 TDNA 功能、酶切位点选择、电泳迁移影响因素（T3）；围绕质粒不同构象琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物情境，辨析质粒构象对电泳迁移率的影响（T4）；基于 AI 设计全新蛋白质序列的蛋白质工程新情境，辨析蛋白质工程的基本流程（T5）；结合先天性耳聋基因治疗载体构建情境，辨析标记基因作用、双酶切防自环、PCR 引物酶切位点添加位置（T8）。 一、单选题一、单选题 1．【教材基础实验综合】（2026·江苏南通·一模）科学的实验方法和规范的操作流程是实验成功的关键，相关叙述正确的是（     ） A．鉴定脂肪时，先用体积分数为50%的酒精浸泡花生子叶临时切片，然后染色 B．调查土壤中小动物类群的丰富度时，观察、统计样方内小动物种类、数量 C．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用时，可选用碘液对其因变量进行检测 D．提取香蕉DNA时，将香蕉研磨液倒入离心管中离心，弃上清液取沉淀 2．【纸层析、有丝分裂观察、丰富度调查、PCR 污染对照】（2026·江苏南通·模拟预测）下列有关实验操作或实验方法的叙述，正确的是（　　） A．纸层析法提取和分离绿叶中的色素，可初步判断叶绿体中色素的种类 B．观察根尖分生组织细胞有丝分裂时，可观察到纺锤丝牵引染色体运动的过程 C．用样方法调查某群落中植物的丰富度时，应取各样方中数据的平均值 D．PCR扩增DNA时可增设不加模板的对照组，检验PCR体系是否有外源DNA污染 3．【Ti 质粒 TDNA、多克隆位点、电泳迁移速率】（2026·江苏徐州·三模）科研人员利用农杆菌转化法将拟南芥SBPase基因转入甜菜，以提高其光合效率和产量。相关载体如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．构建重组质粒时，需在SBPase基因上下游分别添加AarI和HindⅢ序列 B．筛选转基因甜菜细胞时，可使用含卡那霉素的培养基 C．对PCR扩增产物进行凝胶电泳时，DNA片段的迁移速率与片段大小和构象相关 D．该过程改善了甜菜原有的性状，属于蛋白质工程 4．【质粒不同构象电泳、PCR 产物鉴定】（2026·江苏盐城·模拟预测）下图为同一质粒（不同形态）和不同长度的PCR产物（目的基因大小为0.65kb）的琼脂糖凝胶电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．依据电泳迁移方向判断DNA分子在缓冲液中带正电 B．同一质粒的开环形态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关 C．样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内 D．依据电泳结果确定最右侧泳道为目的基因 5．【AI 蛋白质生成大模型蛋白质工程】（2026·江苏·二模）我国科学家研发的蛋白质生成大模型NewOrigin能通过AI高精度生成蛋白质的氨基酸序列，推动了蛋白质工程的发展。下列相关叙述正确的是（　　） A．设计新的蛋白质时首先应从其基因的碱基序列出发 B．AI可通过改变氨基酸序列设计符合预期功能的蛋白质 C．模型NewOrigin可生产出满足人类特定需求的蛋白质 D．该模型能分析基因组数据进而精准找到遗传病的病因 6．【低温诱导染色体、抗生素选择、遗传病调查、DNA 粗提取】（2026·江苏镇江·模拟预测）下列关于高中生物学“探究·实践”的叙述，错误的是（    ） A．“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，低温影响细胞有丝分裂中染色体的运动 B．“探究抗生素对细菌的选择作用”实验中，应从抑菌圈边缘的菌落挑取细菌并接种 C．“调查人群中的遗传病”实验中，选取群体中发病率较高的单基因遗传病更易推断其遗传方式 D．"DNA粗提取“实验中，采用冷酒精作为DNA溶剂可初步分离DNA与蛋白质 7．【有丝分裂实验漂洗、丰富度统计、酵母菌呼吸、DNA 粗提取替代操作】（2026·江苏·模拟预测）下列关于实验操作或观测的叙述错误的是（　　） A．观察根尖分生区细胞有丝分裂时，解离后的根尖用酒精漂洗后再用甲紫溶液染色 B．用样方法调查某群落中植物的丰富度时，需汇总统计各样方内出现的所有物种种类 C．探究酵母菌细胞呼吸方式的实验中，应将酵母菌培养时间适当延长再检测酒精的产生 D．DNA的粗提取与鉴定实验中，可将研磨液离心的操作替换为在4℃冰箱静置一段时间 8．【基因治疗载体、标记基因功能、双酶切、PCR 引物酶切位点位置】（2026·湖北恩施·二模）某先天性耳聋是单基因遗传病，科研人员拟通过载体向细胞内导入正常基因治疗先天性耳聋患者，所用载体含启动子、标记基因、HindⅢ（5´-AAGCTT-3´）和BamHⅠ（5´-GGATCC-3´）酶切位点。下列分析正确的是（    ） A．该种先天性耳聋为显性遗传病 B．借助标记基因的表达情况可筛选出正常基因成功表达的细胞 C．用HindⅢ和BamHⅠ切割上述载体，可以防止载体的自身环化 D．为便于将正常基因与载体连接，扩增正常基因时，需在引物3´端添加限制酶识别序列 9．【PCR 无菌操作、培养基灭菌、接种室消毒、梯度稀释】（2026·江苏镇江·模拟预测）下列相关实验操作正确的是（    ） A．在PCR实验中，用无菌水配制相关反应液置于微量离心管中 B．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 C．接种室使用前，应在对其进行紫外线照射同时适量喷洒苯酚 D．在微生物分离与计数实验中，常用蒸馏水对菌液进行梯度稀释 10．【PCR 参数、引物、循环次数、引物计算】（2025·江苏南通·一模）下列关于PCR技术的叙述，错误的是（　　） A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差 B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异 C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量 D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个 11．【极端抗性原核生物结构与应用】（2026·黑龙江大庆·一模）奇球菌可耐受强电离辐射、紫外线、干旱等极端环境，是吉尼斯认证的抗辐射最强生物。下列关于其叙述错误的是（     ） A．拟核区的遗传物质为环状DNA分子 B．细胞壁的主要组成成分与酵母菌相同 C．可应用于基因工程，培育抗逆生物 D．辐射剂量过高也可能导致细胞坏死 二、多选题 12．【农杆菌转化、PCR、单克隆抗体、胚胎分割】（2026·湖南长沙·三模）现代生物技术广泛应用于湖南现代农业、医药生产，下列生物技术操作与原理分析正确的是（     ） A．农杆菌转化法转化水稻时，Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞并整合到染色体DNA上 B．PCR技术中，高温变性破坏DNA双链氢键，不需要解旋酶参与解旋 C．单克隆抗体制备过程中，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生多种特异性抗体 D．胚胎分割移植属于无性生殖，分割囊胚时需将内细胞团均等分割 13．【插入突变花粉不育PCR 电泳遗传计算】（2026·辽宁营口·三模）某植物基因D位于6号染色体上，基因d由基因D突变产生，仅含基因d时会造成花粉不育。现将一个基因D插入基因型为Dd的植株9号染色体上，让该植株自交得子一代，对子一代的基因D和d进行PCR扩增及电泳鉴定，所用引物和扩增产物的电泳结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．基因D插入植株9号染色体属于基因重组 B．应选择引物S1和R2、T1和W2对子一代进行PCR扩增 C．若只看基因D和d，该植株产生的可育花粉中不含基因d的占比为1/2 D．子一代中电泳结果为类型II的植株占比为1/3 14．【交错 PCR同源基因重组】（2026·山东聊城·二模）交错PCR能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因产物。相关叙述正确的是（    ） A．交错PCR原理是DNA半保留复制 B．交错PCR延伸温度设定为55℃可增加交错次数 C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增 D．若交错循环20轮，一共产生220个DNA分子 三、非选择题 15．【耐盐碱水稻融合基因Ti 质粒酶切选择农杆菌转化】（2026·黑龙江大庆·一模）盐胁迫是影响水稻产量的一个重要因素。为培育耐盐碱水稻新品种，科研人员利用耐盐碱基因OsJRL40、绿色荧光蛋白（GFP）基因和Ti质粒构建成OsJRL40-GFP融合基因表达载体，部分操作流程及可能用到的限制酶如图1、2。请回答下列问题： (1)图2中Ori能保证Ti质粒正常复制，推测Ori为____________。 (2)已知OsJRL40基因转录的非模板链序列为：5′-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3′，为构建融合基因，引物2、3需引入同一种限制酶的识别序列，操作流程及可能用到的限制酶如图1、2所示，ATG对应起始密码子AUG，TAG对应终止密码子UAG。引物2的5′端10个碱基序列为____________。 A．5′-GGATCCCTAG-3′ B．5′-GGATCCGTCA-3′ C．5′-GATCCTAGTC-3′ D．5′-GATCGTCAGC-3′ (3)为使构建的OsJRL40-GFP融合基因能正确插入图2所示的Ti质粒并表达融合蛋白，需使用两种限制酶切割Ti质粒和融合基因，可供选择的限制酶组合有____________种。 (4)将融合基因导入水稻细胞常用的方法为____________。在培养水稻细胞的基本培养液中添加____________（选填“四环素”或“潮霉素”），选择出________________________的细胞，转化成功的水稻细胞可通过____________技术培育成转基因水稻植株。 16．【同聚物加尾连接载体，TdT 末端转移酶】（2026·四川遂宁·一模）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是______，载体上与其能自我复制相关的结构是______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT对基因W和切开的载体两个体系分别进行同聚物加尾（即每个体系中只提供一种脱氧核苷酸），然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是________________________，该过程中___________ （填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是____________________________________________________________________________。 17．【工程益生菌传感器、CRISPRCas 自毁开关】（2026·江苏南通·一模）炎症性肠病（IBD）患者肠道内会产生硫代硫酸盐，生成量与疾病的严重程度呈正相关。图1是科研人员利用大肠杆菌（EcN）建立的响应硫代硫酸盐的益生菌传感器的部分结构，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。请回答下列问题。 (1)图1中，R基因的表达______（“受”或“不受”）硫代硫酸盐的诱导。由于硫代硫酸盐能_____，科研人员可通过检测粪便中_____来判定肠道内硫代硫酸盐的浓度，诊断IBD的发病程度。 (2)为构建图1传感器，科研人员利用PCR技术扩增图2中的R基因时，在引物_____的5＇端分别添加限制酶_____的识别序列。 (3)为了防止EcN工程菌治疗后存在基因转移和抗性基因污染环境的风险，科研人员构建一种如图3的自毁开关系统，该系统能够在诱导条件下激活自毁机制，从而导致细菌无法生长，可用于治疗后EcN的清除。 ①经过人工改造的自毁开关系统由Cascade蛋白、gRNA和Cas3核酸酶组成，Cascade蛋白与：gRNA结合成复合体，gRNA通过与目标DNA部分序列进行_____来识别目标DNA，随后复合体招募Cas3核酸酶切割目标DNA的_____键，诱发细菌死亡。 ②为测试上述自毁开关系统在动物肠道环境中的效果，科研人员制备一些肠道无菌小鼠并将小鼠分为两组：对照组给予重组EcN且正常饮水：实验组_____。一段时间后，收集两组小鼠的_____样本，将其处理后采用_____法接种并统计两组平板上的菌落数。 三年真题·压轴题（侧重江苏，辐射全国，单选题） 设题创新：依托教材 DNA 粗提取、PCR 电泳鉴定综合实验情境，辨析 DNA 提取、电泳上样操作要点（T1）；围绕人源抗体基因克隆制备单克隆抗体情境，辨析 cDNA 获取、异源系统表达抗体（T2）；结合基因工程工具酶综合判断情境，辨析逆转录酶、Taq 酶功能与酶专一性（T3）；基于单酶切构建重组质粒，目的基因正向、反向插入的质粒电泳片段分析情境，辨析载体自连、重组质粒酶切片段计算（T8）。 一、单选题 1．【教材实验判断：抗生素选择、组培移栽、DNA 粗提取、PCR 电泳上样】（2026·福建·高考真题）下列高中生物学教材实验的相应操作，错误的是（     ） 选项 实验名称 实验操作 A 探究抗生素对细菌的选择作用 评价抑菌效果时，要测量抑菌圈的直径 B 菊花的组织培养 移栽时，将含培养基的试管苗移植到室外的土壤中 C DNA的粗提取与鉴定 提取DNA时，将洋葱研磨液离心获得含DNA的上清液 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合后再进行加样 A．A B．B C．C D．D 2．【人源单克隆抗体制备】（2026·福建·高考真题）流感病毒威胁人类健康。科研人员抽取经流感疫苗免疫后的人体血液，分离获得相应的浆细胞，利用相关技术快速制备抗流感病毒的人源单克隆抗体，该抗体可用于流感重症患者的应急治疗。部分实验流程如下： 下列叙述正确的是（     ） A．该技术是利用蛋白质工程原理制备人源单克隆抗体 B．步骤②中分离的血液淋巴细胞都可以用于抗体基因序列的获取 C．将步骤③中的单细胞注射到小鼠腹腔中也可获得大量的单克隆抗体 D．步骤⑤中单克隆抗体的表达和生产都不依赖于B细胞 3．【基因工程的酶：逆转录酶、TaqDNA 聚合酶、限制酶专一性】（2026·江苏·高考真题）基因工程中需要使用多种酶，下列叙述正确的是（     ） A．逆转录酶催化形成磷酸二酯键 B．Taq酶催化形成氢键和肽键 C．限制酶有专一性而Taq酶没有专一性 D．Taq酶催化新链合成时以双链DNA为模板 4．【生物学实验操作正误辨析】（2026·江苏·高考真题）下列关于中学实验操作的叙述正确的是（     ） A．消毒过的菊花幼茎切成小段后可作为外植体 B．观察花生子叶中的脂肪用斐林试剂染色 C．加入预冷的无水乙醇研磨菠菜叶提取DNA D．用双缩脲试剂检测小麦籽粒中的淀粉 5．【菌株蛋白替换改造电泳条带分析】（2026·广西·高考真题）菌株甲能分泌多种蛋白，主要包括蛋白酶G、脂肪酶D和淀粉酶T。科研人员将菌株甲编码酶G的基因替换为编码酶T的基因，构建出菌株乙；然后将菌株乙编码酶D的基因替换为编码酶T的基因，构建出菌株丙。各菌株发酵液中多种外泌蛋白电泳结果如图所示。下列说法错误的是（     ） A．脂肪酶D、蛋白酶G分别是蛋白4、5 B．菌株丙水解煮熟大豆的能力比菌株甲强 C．测定发酵液外泌蛋白含量前，应先去除菌体 D．通过检测还原糖产生速率可比较各菌株外泌淀粉酶T的含量 6．【细菌限制修饰系统表观遗传】（2026·浙江·高考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 7．【蛋白质工程转基因荧光斑马鱼】（2026·甘肃·高考真题）科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish。为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是（     ） A．步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B．处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C．步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D．新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 8．【重组质粒构建，单酶切自连，目的基因正反插入】（2026·全国卷·高考真题）为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B．若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C．重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D．重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 9．【蛋白质工程改造酶热稳定性】（2026·北京·高考真题）MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（     ） A．温度和pH会影响MT的催化活性 B．第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C．为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D．对MT结构的改造属于蛋白质工程 10．【PCR 引物酶切位点设计，质粒图谱酶切位点破坏判断】（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 二、多选题 11．【酵母表达质粒复制原点、MCS 多克隆位点、营养缺陷型筛选】（2026·江苏·高考真题）利用酵母表达外源蛋白时，构建的质粒通常需在大肠杆菌中扩增，鉴定后再转入酵母细胞中表达。图示色氨酸营养缺陷型酵母筛选系统的表达质粒结构。下列叙述正确的有（     ） A．Ori在完成质粒构建和表达过程中不起作用 B．该质粒在酵母细胞中复制时需识别2μ Ori C．MCS含有多个酶切位点，便于设计目的基因插入位点 D．用不添加色氨酸的培养基筛选成功导入质粒的酵母 三、非选择题 12．【CART 细胞、VHH 驼源抗体、抗体基因文库构建、小鼠肿瘤模型实验】（2026·江苏·高考真题）驼源抗体（VHH）具有分子量小、与人源抗体同源性高等优点，科研人员将其作为抗原受体改造T细胞，开发出新型CAR-T细胞（V-CAR-T细胞）用于肿瘤治疗。请回答下列问题： (1)CAR-T细胞通过抗原受体直接识别肿瘤细胞表面上的靶点进而裂解肿瘤细胞，在免疫方式上属于______。 (2)早期CAR-T细胞受靶细胞刺激后，难以分裂、分化为______细胞杀伤肿瘤细胞。V-CAR-T细胞中增加了两个协同刺激结构域（图1），以促进T细胞分泌______加速其增殖和分化。V-CAR-T细胞表面的______可作为其标记，用于验证输注V-CAR-T细胞治疗后，机体内是否存在V-CAR-T细胞。 (3)非小细胞肺癌细胞高表达Trop2，科研人员研发新型识别Trop2的V-CAR-T细胞。为筛选获得抗Trop2的VHH，构建VHH基因文库，流程如下： 步骤 实验目的 实验操作 ⅰ 制备cDNA模板 用①______免疫羊驼，分离获得外周血淋巴细胞，提取②______，反转录成cDNA； ⅱ 扩增VHH基因 用③______端加入SfiⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增； ⅲ 构建文库 质粒载体与VHH基因片段经SfiⅠ酶切后，用④______酶连接，转化感受态细胞。 (4)筛选出高亲和力的抗Trop2的VHH，构建获得特异识别Trop2的V-CAR-T细胞（Trop2 CAR-T细胞）。为验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，建立肺癌小鼠模型，随机分为3组开展实验，实验结果见图2、图3。 ①设置未改造T细胞组作对照的目的是______。 ②根据图2、图3结果，可得出结论______。 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $