2027届高三生物人教版一轮复习课件基因工程热点

基因工程热点一1遍过 一、限制酶的选择（基本原则、双标记（影印法）、特殊法） 二、引物的设计1：外部修饰 （酶切位点） 二、引物的设计 2：定点突变（1、基因融合、2、重叠延伸、3、大引物） 三、引物的选择（鉴别正向连接、反向PCR） 四、基因编辑技术（CRISPR/Cas9） 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 六、PCR技术获取目的基因至少3次 七、不对称PCR技术（获得大量单链DNA） 一、限制酶的选择 （3）、无破坏原则： 启动子、终止子、复制原点、目的基因、标记基因完好无损 （2）、双酶切（同尾酶）优先原则：（确保正向连接，无自身环化） （4）、插入位置正确原则：启动子和终止子之间、（便于基因的表达） 或T－DNA片段中 （因为质粒T－DNA片段最易转移至受体细胞而且整合到受体细胞染色体DNA上） （1）、碱基配对原则：（单酶切、同尾酶） 载体和目的基因产生的黏性末端，能够碱基互补配对 1、基本原则： 沙场点兵：（基本原则） 1.(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。（破坏目的基因、自生环化） 通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S"序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是                       ；此外，不宜同时选用酶Spe I和Xba I，原因是 。 EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接 2．马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。（ 破坏目的基因、双切酶、同尾酶） (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ 沙场点兵：（基本原则） （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcoR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 3、面肩肱型肌营养不良是一种罕见的神经肌肉疾病，该病是由DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白引起的。研究发现利用反义疗法可治疗该病，即将DUX4的反义基因导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。构建DUX4反义基因表达载体的过程如下图所示。（确保正向连接） 已知DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，利用图中质粒和DUX4基因构建反义基因表达载体时,应选择的限制酶为 和 。 BamH HindⅢ 沙场点兵：（基本原则） 解析：DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同,但转录的模板链不同,因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链,子链的延伸方向是5'→3',因此DUX4基因的右侧连接启动子、左侧连接终止子构建DUX4反义基因表达载体,选用的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ 沙场点兵：（基本原则） （2025黑吉辽、内蒙古，25节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入                和              限制酶识别序列。 XbaⅠ Xho Ⅰ 沙场点兵：（基本原则） （2025黑吉辽、内蒙古，25节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (2)利用                 连接DNA片段和质粒，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有                的污染。初步判断实验组              （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是                                    。 DNA 连接酶 外源DNA  1 重组质粒 大小约为9.5Kb，质粒pYL大小约为7.2Kb，因此目的基因N大小为2.3kb 沙场点兵：（基本原则） 紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素（紫色），紫色花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素合成酶基因（S）的cDNA（由某种生物发育某个时期的mRNA 经逆转录产生的互补DNA）和Ti质粒的结构示意图。请结合基因工程相关知识，回答下列问题。 沙场点兵：（基本原则） (1)构建基因表达载体时，需用限制酶切割花青素合成酶基因的cDNA和Ti质粒。若要保证目的基因完整插入Ti质粒的T-DNA区域，且后续能正常表达，应选择的限制酶组合是_______________，选择依据是______________________________。 EcoR I和Hind Ⅲ 既能完整切割下花青素合成酶基因的cDNA，又能在Ti质粒的T - DNA区域打开相同末端，且不破坏T - DNA的启动子、终止子等关键结构，保证目的基因正常表达 一、限制酶的选择 2、特殊法： 1、插入失活筛选法、2、β—半乳糖苷酶显色筛选法（蓝白斑法） 3、双标记（影印法）： 两个标记基因在构建重组表达载体时，将目的基因插入其中一个标记基因内，导致该标记基因无法正常表达，失去抗性，而空载体具有两种抗性，由此区分空载体和重组表达载体。 (LacZ)编码β－半乳糖苷酶，β－半乳糖苷酶可以催化无色的X－gal分解产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色。如果目的基因破坏LacZ，则菌落呈白色，从而筛选出转化成功的细胞。 1、为确保目的基因正确插入图2的载体中，需要选择的限制酶组合是 。 LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，以颜色不同为依据直接筛选含重组DNA分子菌体的方法称为“蓝白斑”法。 BamH I和Sal I 沙场点兵：（特殊法） 2、蓝白斑"法是基因工程中常用的筛选方法。将目的基因导入大肠杆菌并筛选工程菌时，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上。应筛选菌落为 （蓝色/白色）的菌落即为目的菌 白色 2、筛选含重组质粒的农杆菌时，应先将处理后的农杆菌接种至含 的培养基中，再利用无菌绒布影印接种转移至含 的培养基中。 氨苄青霉素 四环素 沙场点兵：（双标记（影印法）） 1 2 9 为所需要的 12 沙场点兵：（双标记（影印法）） 幽门螺杆菌(Hp)可能会导致慢性胃炎等疾病，该菌的Ipp20基因编码其特有的蛋白质，研究者欲利用基因工程制备Hp疫苗。3种常见的限制酶识别序列如图1所示，该实验所用的质粒结构如图2所示，基本操作流程如图3所示。回答下列问题： 保证目的基因和载体正确连接(防止目的基因或载体自身环化) (2)该基因工程中，构建基因表达载体时选用的限制酶是___________。选择双酶切的原因是___________。 Xbal、XhoI （2）据图分析，质粒Z上有2个BamHI的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，但XhoI和Xbal限制酶切后的黏性末端不同，可避免质粒自身环化和任意连接，故用XhoI和Xbal限制酶进行切割； 13 沙场点兵：（双标记（影印法）） 幽门螺杆菌(Hp)可能会导致慢性胃炎等疾病，该菌的Ipp20基因编码其特有的蛋白质，研究者欲利用基因工程制备Hp疫苗。3种常见的限制酶识别序列如图1所示，该实验所用的质粒结构如图2所示，基本操作流程如图3所示。回答下列问题： (3)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，实验可以采用影印法：用无菌毡布压在培养基A的菌落上，带出菌种，平移并压在培养基B上，培养一段时间后的结果如图3所示，数字表示不同的菌落。据题意分析，培养基B中添加的抗生素是___________，图3中符合要求的菌落是___________(填数字)。 氯霉素 3、5 （3）为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，因该大肠杆菌含有潮霉素抗性基因，而氯霉素抗性基因丢失，故培养基A、B中应分别添加潮霉素、氯霉素，符合要求的菌落，应该能在含潮霉素的培养基上生长，但不能在含有氯霉素的培养基上生长，故菌落3、5符合。 14 沙场点兵：（双标记（影印法）） 幽门螺杆菌（Hp）是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的Ipp20基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp疫苗。已知lpp20基因表达时，双链DNA的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1；四种限制酶及其识别序列如图2；三种质粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图4。回答下列问题： 15 沙场点兵：（双标记（影印法）） (2)据图1、2、3分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是___________，最适合用作载体的质粒是__________。 Xbal、XhoI 质粒Z （2）质粒X上有BamHI的酶切位点位于启动子的上游，Xhol的酶切位点会破坏终止子，Xbal酶切后的黏性末端和BamHI的酶切黏性末端相同，可能使启动子丢失，因此质粒X不适合做载体；质粒Y上有2个PstI的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，XhoI和Xbal酶切位点会破坏抗性基因，BamHI单一酶切后会导致质粒自身环化和任意连接，因此质粒Y不适合做载体；质粒Z上有2个BamHI的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，但XhoI和Xbal限制酶切后的黏性末端不同，可避免质粒自身环化和任意连接，故质粒Z适合做载体，用XhoI和Xbal限制酶进行切割。 16 沙场点兵：（双标记（影印法）） (3)图4中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的线毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上、结果如图所示）。培养基A、B中应分别添加______________，符合实验要求的菌落是______（填写数字），判断依据是____________________。 潮霉素、氯霉素 3、5 菌落3、5在含潮霉素培养基中能生长，但在含氯霉素培养基中不能生长，说明含有因插入目的基因而丢失氯霉素抗性基因的重组质粒。 （3）为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，因该大肠杆菌含有潮霉素抗性基因，而氯霉素抗性基因丢失，故培养基A、B中应分别添加潮霉素、氯霉素，符合要求的菌落，应该能在含潮霉素的培养基上生长，但不能在含有氯霉素的培养基上生长，故菌落3、5符合。 17 二、引物的设计1：外部修饰 （酶切位点） 1、遵循原则: （1）、与目的基因两端对应序列特异性互补配对 （2）、引物之间及引物内部不能配对形成双链结构 （3）、子链从5’端向3’端方向延伸，即从两侧指向中心(反向PCR除外) （4）长度适宜：18~30 bp（过短特异性差，过长扩增效率低） （5）、酶切位点加在5' 端，因为3' 端是延伸起点，修饰后 Taq 酶无法结合、扩增失败 2、引物的作用： 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 酶切位点应添加在引物的5' 端，因为3' 端：是延伸起点，修饰后 Taq 酶无法结合、扩增失败 二、引物的设计1：外部修饰 （酶切位点） 引物2 引物1 目的基因 确保HSA基因与Ti质粒正向连接，同时便于对导入重组Ti质粒的农杆菌的筛选，应对质粒用______________酶切。PCR扩增HSA基因时，应在引物1的 端添加限制酶识别序列，据图写出引物1的碱基序列为5′-________________-3'（写出前10个碱基）。 HindⅢ、BclⅠ AAGCTTATGC b链为转录模板链 沙场点兵：（酶切位点） 5' Hind、BclI AAGCTTATGC 因为Hind和BclI 的切割末端都是GATC，而四环素必须破坏，所以选Hind、BclI 20 二、引物的设计 2：定点突变（1、基因融合、2、重叠延伸、3、大引物） 1、遵循原则: （1）、与目的基因两端对应序列特异性互补配对 （2）、引物之间及引物内部不能配对形成双链结构 （3）、子链从5’端向3’端方向延伸，即从两侧指向中心(反向PCR除外) （4）长度适宜：18~30 bp（过短特异性差，过长扩增效率低） （5）、酶切位点加在5' 端，因为3' 端是延伸起点，修饰后 Taq 酶无法结合、扩增失败 2、引物的作用： 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 在基因工程技术中常指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-GAAT................GTCT-3’ 3’-CTTA................CAGA-5’ 5’-AATT- CAGA-5’ CCCG AAA-5’ 添加序列 引物① 添加序列 CCCG-5’ 5’-TTT GAAT 5’-GAAT 引物② 引物④ 引物③ 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-GAAT................GTCT-3’ 3’-CTTA................CAGA-5’ 5’-AAT- CCG-5’ 5’-GAA- AGA-5’ CCG AAA-5’ 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-AAT................. GGGC-3’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 添加序列 第1次复制 第2次复制 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 5’-AAT................. GGC TTT-3’ 其他的子代DNA省略 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-GAAT................GTCT-3’ 3’-CTTA................CAGA-5’ 5’-AAT- 5’-GAA- AGA-5’ CCG AAA-5’ 5’-AATT................GGGC TTT-3’ 3’-TTAA................CCCG AAA-5’ 5’-TTT GAA- 添加序列 5’-TTT GAA......................GTCT-3’ 3’-AAACTT .......................AGA-5’ 引物① 引物② 引物③ 引物④ 需要引物①和② 需要引物③和④ 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 甲5’-AATT................GGGCTTT-3’ 乙3’-TTAA................CCCGAAA-5’ 丙5’-TTT GAA.................GTCT-3’ 丁3’-AAACTT ........ ........AGA-5’ 甲5’-AATT................GGGC TTT -3’ 丁3’- AAACTT ........ ........AGA-5’ 情况①： 情况②： 乙3’-TTAA................CCCG AAA-5’ 丙5’- TTTGAA.................GTCT-3’ DNA聚合酶无法 从5’开始延伸 ① ② 该步骤，需要额外添加引物吗？ 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 情况②： 3’-TTAA................CCCG AAA TTTGAA.................GTCT-3’ 5’-AATT................GGGC CTT .................AGA-5’ 若要得到大量的融合基因片段，需要哪几种引物？ 引物②和引物③ 二、引物的设计 2：定点突变（基因融合） 对比： 沙场点兵：（基因融合） 木糖醇被摄入后不会引起血糖升高，尤适于糖尿病患者。为构建高产木糖醇工程菌，科研人员将毕赤酵母中的木糖醇脱氢酶（XDH）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，并利用pET-28a质粒构建基因表达载体，转入大肠杆菌中表达，相关示意图如下： (2)融合XDH-GFP基因片段时，PCR1和PCR2不能在同一个PCR体系中进行的原因是________________________；引物R1的序列应包含__________（填序号）。①XDH基因部分序列②GFP基因部分序列③限制酶的识别序列 引物R1与F2碱基序列互补 ①② 融合XDH - GFP基因片段时，由于PCR1和PCR2需要的引物不同，若在同一个PCR体系中进行，会因引物R1与F2碱基序列互补结合而失效，所以不能在同一个PCR体系中进行。引物R1是用于扩增XDH基因并融合部分GFP基因序列，为实现XDH与GFP基因的无缝融合，引物 R1（XDH基因的反向引物）的 3'端需与XDH 基因的3'端序列互补（①），5'端需添加GFP 基因的 5'端部分序列（②）。这样经 T5 核酸外切酶处理后，两个基因的末端会产生互补的单链黏性末端，可通过同源重组连接。该过程不使用限制酶，因此无需包含限制酶识别序列（③）。 沙场点兵：（基因融合） (3)为使XDH-GFP融合基因正确插入pET-28a质粒，对融合基因进行扩增时用到的两种引物的碱基序列分别是_______（填序号）。 ①5′-GGATCCACTGCTAAC-3′ ②5′-GGATCCTGACGATTG-3′ ③5′-GAATTCTCGTACCTA-3′ ④5′-GAATTCAGCATGGAT-3′ ①④ 为使融合基因正确插入 pET-28a 质粒并实现表达，需采用定向克隆策略，选择两个不同的限制酶进行双酶切。从质粒图谱可知，启动子下游依次为 BamH I、EcoR I、Xho I 位点，终止子位于 Xho I 下游。因此应在融合基因的 5'端引入 BamH I 位点，3'端引入 EcoR I 位点。正向引物 F1：5'端添加 BamH I 识别序列（GGATCC），3'端与 XDH 基因首段编码链序列（ACTGCTAAC）匹配，对应序列①5'-GGATCCACTGCTAAC-3'。反向引物（R2）：5'端添加 EcoR I 识别序列（GAATTC），3'端与 GFP 基因尾端编码链序列（ATCCATGCT）反向互补（AGCATGGAT），对应序列④5'-GAATTCAGCATGGAT-3'。因此，扩增融合基因的引物是 F1 和 R2，碱基序列分别为①和④。 沙场点兵：（基因融合） 红曲是红曲霉发酵大米制成的传统食品添加剂，因含有红曲素而呈红色，常用于调味和着色。红曲发酵过程中可能会产生有毒的桔霉素，科研人员将高效合成红曲素的基因RubA和抑制桔霉素合成的基因CitS采用融合PCR技术连接为RubA—CitS融合基因，再将融合基因导入红曲霉中，用于生产颜色更红的安全红曲，相关过程如下图。回答下列问题： 沙场点兵：（基因融合） (1)PCR1至少需经过________次循环才可得到①②DNA片段。为实现PCR1和PCR2产物融合，在设计引物2和引物3时需考虑_______________________________________________。为保证基因融合的正常进行，①②③④片段中可用于上述融合过程的DNA片段为___________(填序号)。 ②③ 引物2的5’端与引物3的5’端部分碱基序列互补 2 （1）PCR1至少需要经过2次循环才能获得①②DNA片段。这是因为第一轮循环只能得到双链长度不一的产物，第二轮循环开始产生双链等长的产物。为实现PCR1和PCR2产物的融合，在设计引物2和引物3时，需要让它们的5'端带有与对方5'端互补的序列。这样，①②③④片段中，②的3'端和③的3'端可形成部分互补的重叠区，可以互为模板，便于DNA聚合酶按5'→3'的方向延伸子链，从而形成RubA—CitS融合基因，故可用于上述融合过程的DNA片段是②和③。 沙场点兵：（基因融合） (2)为保证构建的RubA—CitS融合基因能正确插入载体中，还应该在引物1和引物4的___________(填“3′”或“5′”)端分别添加限制酶___________的识别序列。融合基因在表达时，___________会与启动子结合，催化转录。 5’ RNA聚合酶 NdeI、XhoI （2）根据在质粒上的插入位点以及融合基因的转录方向，需要还应该在引物1和引物4的5'端分别添加限制酶NdeI、XhoI的识别序列。融合基因在表达时，RNA聚合酶会与启动子结合，催化转录过程。 (3)结合图中信息，为便于后续筛选，将重组质粒导入受体细胞时，应选择的红曲霉类型为：_______________________(填“普通红曲霉”或“亮氨酸缺陷型”或“尿嘧啶缺陷型”或“亮氨酸和尿嘧啶缺陷型”)。为排除空受体细胞(未导入质粒)、导入了空质粒受体细胞的干扰，目的基因导入后，需进行筛选。制备甲、乙两种培养基，甲培养基缺乏亮氨酸，乙培养基缺乏尿嘧啶，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上___________(填“能”或“不能”)生存，在乙培养基上___________(填“能”或“不能”)生存。 沙场点兵：（基因融合） 不能 亮氨酸和尿嘧啶缺陷型 能 （3）以质粒上的LEU2和URA3作为标记基因对受体细胞进行筛选，故应选择亮氨酸和尿嘧啶缺陷型红曲霉作为受体细胞。已知亮氨酸和尿嘧啶缺陷型红曲霉自身无法合成这亮氨酸和尿嘧啶。重组质粒上只含有亮氨酸合成基因，尿嘧啶合成基因被破坏，含重组质粒的受体细胞在缺乏亮氨酸的甲培养基上能生存，在缺乏尿嘧啶的乙培养基上不能生存。 沙场点兵：（基因融合） 微生物数量、产物浓度 发酵罐内发酵 (4)利用发酵工程产生红曲素时，_________________是发酵工程的中心环节。在发酵过程中要随时检测培养液中__________________________(答出两点)等以了解发酵进程；还要及时添加必需的营养组分，要严格控制_______________________________(答出两点)等发酵条件。 温度、pH、溶解氧 （4）利用发酵工程生产红曲素时，发酵罐内的发酵过程是发酵工程的中心环节。这是实现菌体生长和产物积累的关键阶段。在发酵过程中，要随时检测培养液中菌体浓度(反映菌体生长状况)、产物含量(反映目标产物红曲素的积累情况)、以及营养成分消耗(如碳源、氮源的剩余量)等指标，以了解发酵进程并判断是否达到最佳收获时机。同时，还要及时添加必需的营养组分以维持菌体正常代谢，并严格控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等发酵条件。这些条件直接影响菌体代谢途径和产物的合成效率，对于提高红曲素产量、抑制桔霉素生成至关重要。 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 PCR1 使用引物1和引物2 拟突变位点 引物4 引物3 PCR2 使用引物3和引物4 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 拟突变位点 引物1 引物2 拟突变位点 引物4 引物3 拟突变位点 引物1 引物2 第一次 第一次 拟突变位点 引物4 引物3 第二次 引物2 引物1 第二次 引物3 ? 引物4 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 引物2 引物1 引物3 ? 引物2 引物3 方案一： 引物1 引物4 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 引物1 引物4 方案二： Taq酶 Taq酶 Taq酶 Taq酶 引物4 引物1 拟突变位点 引物4 引物3 引物1 引物2 对比： 二、引物的设计 2：定点突变（重叠延伸） 若要得到大量的融合基因片段，需要哪几种引物？ 引物①和引物④ 沙场点兵：（重叠延伸） 科学家通过 PCR 技术可诱导干扰素基因的中间位点发生突变，即定点突变PCR 技术（重叠延伸 PCR），是通过带突变位点的引物扩增出两段含突变重叠区的片段，再通过片段杂交、延伸获得完整突变基因，过程如图。根据信息回答下列问题： 沙场点兵：（重叠延伸） (1)利用此方法获得突变基因，设计引物2和引物3的序列的要求是__________________________________________________________________________________。（答两点） (2)PCR1和PCR2__________（填“能”或“不能”）在同一个反应体系里面进行，主要原因是________________________________________________________ _________________________________。 都带有突变位点的突变序列；二者碱基序列可以互补配对 不能 引物2和引物3可以互补配对，会相互结合，无法和模板DNA结合发挥引物作用 （1）该方法需要两段扩增片段都含突变位点，因此两个引物都需要引入突变；同时引物2和3需要互补，才能让两段片段在后续杂交时形成重叠配对。 （2）若将两个PCR放在同一体系，互补的引物2和3会优先结合失活，无法和模板DNA结合发挥引物作用，无法完成正常的PCR扩增。 沙场点兵：（重叠延伸） (3)④混合、变性后，杂交会产生_____种新的产物，画出不可以扩增出目标突变基因的杂交产物_______。 (4)过程⑤是否_______________需要加入引物和模板，原因是_________________________________________________________________。 2 不需要 杂交后的重叠单链可以互为引物和模板，直接完成延伸 （3）PCR1和PCR2共得到4条单链，除去原来的自身配对产物，新杂交产物共2种；不可以扩增出目标突变基因，因为没有给DNA聚合酶提供可用于延伸的3'端 。 （4）杂交后，单链的3'端已经和互补链的重叠区配对，杂交后的重叠单链可以互为引物和模板，直接完成延伸，因此不需要额外加入引物和模板。 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 常规下游引物 突变上游引物 第一次复制 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 常规下游引物 突变上游引物 第二次复制 突变上游引物 常规下游引物 作为下一轮PCR的大引物 其中一个 PCR1 使用常规下游引物 和突变上游引物 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 突变上游引物 常规下游引物 作为下一轮PCR的大引物 PCR2 使用常规上游引物和大引物 第一次复制 常规下游引物 大引物 常规下游引物 产物 二、引物的设计 2：定点突变（大引物） 常规下游引物 常规下游引物 常规上游引物 第二次复制 常规下游引物 常规上游引物 拟突变位点 常规下游引物 突变上游引物 常规上游引物 对比： 模板 使用常规上游引物和大引物 模板 子链 PCR2 沙场点兵：（大引物） 塑料的主要成分为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等，塑料制品方便人们生活的同时，也造成了短时期难以降解的“白色污染”。研究人员发现了一种胞外酶基因A，有降解PVC塑料的功能。对A基因测序可知，如果在其调节功能区增加一个碱基对A/T，可大大增强其表达能力。通过经典的大引物PCR定点诱变技术在体外改造A基因(如图1)，然后构建表达载体(如图2)，导入受体菌进而培育“超级菌”。 沙场点兵：（大引物） ①图1所示，通过PCR1获得的大引物②是指以______________(选填图中引物)延伸得到的DNA链为模板，__________(选填图中引物)与之结合延伸得到的DNA子链。要获得图1中的改良A基因至少需要_______个PCR循环。 诱变引物 引物1 4 ①观察图1PCR1大引物是指：以诱变引物延伸得到的DNA链为模板，引物1与之结合延伸得到的DNA子链；经过PCR1得到大引物再利用大引物和引物2至少3个PCR循环才能获得完整的改良A基因，所以至少需要4个PCR循环才能获得完整的改良A基因； 沙场点兵：（大引物） ②图2中为实现质粒和改良A基因的正确连接，应选用的限制酶是______________。将构建的表达载体导入受体菌后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的白色菌落是成功导入了重组质粒的菌株，判断依据是_____________________________________________________________。 含有改良基因A的重组质粒上LacZ基因被破坏，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷，不能产生蓝色物质。 XmaI和BgIⅡ ②构建改良基因表达载体时，为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ，酶切位点在目的基因两侧，且在质粒中这两个酶切位点在启动子和终止子之间，不破坏氨苄青霉素抗性基因，复制原点等重要原件，两种限制酶，形成的黏性末端不同，所以不会出现目的基因和质粒的自我环化以及目的基因的反向连接；在含氨苄青霉素和β半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因，受体菌不能分泌分解β-半乳糖苷而使培养基变蓝的酶。 正 反 若选F1和R1 三、引物的选择（鉴别正向连接） R1 F1 正 反 若选F2和R2 三、引物的选择（鉴别正向连接） F1 R1 正 反 若选F1和R2 就只能扩增出正向插入的序列 三、引物的选择（鉴别正向连接） F1 R1 所以、为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2(或F2和R1)　 正 反 若选F2和R1 同理，也只能扩增出正向插入的序列 三、引物的选择（鉴别正向连接） R1 F1 1、选用引物a、b ，用引物a、c ，则为正向连接。 2、选用引物a、b ，用引物a、c ，则为反向连接。 1100 bp长度的产物 无法扩增出产物 无法扩增出产物 1000 bp长度的产物 沙场点兵：（鉴别正向连接） 选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 58 据图分析，用一种限制酶与DNA连接酶构建重组质粒时，应选择的限制酶是           。完成构建后，取样、鉴定质粒时，选用限制酶               （填“E”或“B”或“H”或“X”）进行完全酶切并电泳。图2中出现Ⅰ结果的原因是             ，出现结果Ⅱ、Ⅲ的原因是                    。最后，根据电泳结果，筛选出正确的重组质粒。 B     E        有质粒未接入目的基因     目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况 沙场点兵：（鉴别正向连接） B     E        有质粒未接入目的基因     目的基因接入质粒时，有正接与反接两种情况 59 香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题： （1）图1过程①需要在 酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含 （答出2点） 逆转录 内含子、启动子和终止子等 沙场点兵：（鉴别正向连接） （2）为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的______（3'或5'）端添加限制酶的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶 、 的识别序列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是 个。 5' XhoⅠ BamHⅠ 2n-2 沙场点兵：（鉴别正向连接） 三、引物的选择（反向PCR） 1、概念：根据DNA片段中间的已知序列设计引物，扩增已知序列两侧的未知序列。 2、思路：先从未知序列的两侧把DNA 切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物。 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 三、引物的选择（反向PCR） 引物1 引物2 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 引物1 引物2 引物3 引物4 引物1 引物2 引物3 引物4 三、引物的选择（反向PCR） 引物1 引物2 引物3 引物4 复制完后 展开成链状 复制完后 展开成链状 引物1 引物2 引物3 引物4 引物1和引物2 继续扩增 大量 引物3和引物4 继续扩增 大量 三、引物的选择（反向PCR） 沙场点兵：（反向PCR） 题目 对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。 四、基因编辑技术（CRISPR/Cas9） 1、CRISPR/Cas9组分及功能 （1）短链RNA(sgRNA、向导RNA)：作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合 （2）细菌的核酸酶Cas9：与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂 2、RISPR/Cas9基因编辑技术的明显优点： 定点编辑基因，实验操作更加精准、高效 CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如图1所示。 (1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说它的意义是   。 防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状（遗传信息）的稳定（或抵御病毒、外源DNA的入侵 (2)Cas9蛋白相当于   酶、可催化    键断裂。 限制 磷酸二酯 沙场点兵：（CRISPR/Cas9） CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如图1所示。 沙场点兵：（CRISPR/Cas9） (3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现脱靶几率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越  （填“长”或“短”），基因编辑的脱靶率越高，原因是  。 长 gRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 荧光定量PCR（qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过荧光信号实时监测产物量，从而对起始模板进行定量分析的技术。其核心原理主要包括“荧光信号与扩增产物关联”和“Ct值定量”两个方面。 1.荧光染料法（SYBRGreenI法）原理：SYBRGreenI是一种非特异性荧光染料，游离状态下荧光微弱，但能非特异性地结合到双链DNA（dsDNA）的小沟区域，结合后荧光信号会呈数百倍增强。关联：随着PCR循环的进行，双链DNA产物不断增多，结合的染料越多，荧光信号越强。因此，荧光信号的强度与双链DNA的产量成正比。 2.荧光探针法（TaqMan探针法）原理：探针为一段与目的DNA序列特异性杂交的寡核苷酸，其5'端标记荧光报告基团（R），3'端标记荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，由于荧光报告基团与淬灭基团距离极近，发生荧光共振能量转移（FRET），荧光被淬灭，不产生荧光信号。关联：在PCR延伸阶段，DNA聚合酶（具有5'→3'外切酶活性）在延伸过程中遇到与模板结合的探针，会将探针水解切断，使荧光报告基团与淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 二、定量分析原理（Ct值法）Ct值（循环阈值）定义：在PCR扩增的指数期，荧光信号达到仪器设定的荧光阈值时所经历的循环数。定量关系：Ct值与模板的起始拷贝数呈负相关。模板起始量越多，荧光信号达到阈值所需的循环数越少（Ct值越小）；反之，模板起始量越少，Ct值越大。 定量方法：通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，将未知样本的Ct值代入标准曲线，即可计算出未知样本的绝对拷贝数（绝对定量）或相对表达量（相对定量）。 阈值 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；不发荧光 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 3 4 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；不发荧光 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 4 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；不发荧光 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 4 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。 3 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 五、荧光定量PCR（检测DNA复制情况） 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ R 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 Q DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。 3 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ 每扩增一次，就有一个荧光分子产生。 沙场点兵：（检测DNA复制情况） 逆转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是检测RNA病毒的重要技术手段。该技术常用TaqMan探针，探针的5'末端连接荧光基团（R），3'末端连接淬灭基团（Q），如图甲所示。当探针完整时，R发出的荧光信号会被Q吸收而不显荧光。在图乙所示的过程中，TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号就会被相应仪器检测到。图中a、b表示引物。请回答下列问题： 沙场点兵：（检测DNA复制情况） (1)与普通PCR类似，qRT-PCR的反应过程包括______、______、延伸。qRT-PCR反应体系中，除了TaqDNA聚合酶还需要添加______酶。 (2)qRT-PCR中所用TaqMan探针序列设计最基本的要求是________________________________________________。 (3)据图写出引物a的序列是：5'-________-3'。反应结果测定的荧光强度与PCR产物浓度的关系是_____________________________________________________________。 变性 复性 逆转录 与待扩增DNA的一段碱基序列互补配对 AGGCAT （在一定范围内）荧光强度越高，PCR产物越多 1）qRT-PCR是指逆转录实时荧光定量PCR，与普通PCR类似，qRT-PCR的反应过程包括变性、复性、延伸。qRT-PCR反应体系中，除了TaqDNA聚合酶还需要添加逆转录酶。 （2）qRT-PCR中所用TaqMan探针序列设计最基本的要求是与待扩增DNA的一段碱基序列互补配对。 （3）据图分析，根据碱基互补配对原则，引物a的序列是：5'-AGGCAT-3'。TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号就会被相应仪器检测到，反应结果测定的荧光强度与PCR产物浓度的关系是（在一定范围内）荧光强度越高，PCR产物越多。 六、PCR技术获取目的基因至少3次 80 80 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物。PCR反应的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。 七、不对称PCR技术（获得大量单链DNA） 最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 5’-ATTTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 3’-CGG-5’ 5’-ATT-3’ 5’-ATTTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 5’-ATT TTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 5’-ATTTTAGCC-3’ 5’-ATT TTAGCC-3’ 无限制性引物的 第一次扩增 无限制性引物的 第二次扩增 七、不对称PCR技术（获得大量单链DNA） 三、启动子作用：RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动转录 (1) 组成型启动子 特点:持续、高效、无组织特异性，几乎在所有细胞 / 组织中恒定表达。 功能:驱动管家基因(维持细胞基本生命活动)，如呼吸酶、核糖体蛋白基因。 (2) 组织特异性启动子 特点：仅在特定组织 / 细胞中激活，具时空特异性。 功能：精准调控基因在目标部位表达，避免资源浪费。 例子：乳腺特异性启动子/乳腺蛋白基因的启动子（乳腺生物反应器） (3) 诱导型启动子 特点：平时低表达 / 不表达，需特定外界信号（诱导剂）才激活转录，像 “可控开关”。 功能：时空可控表达，减少持续表达的代谢负担。 例子：乳糖操纵子 lac 启动子、热休克启动子、光诱导启动子。 解题流程图示 目的基因分析→ 质粒结构分析 → 同尾酶替换判断 → Ti质粒特殊要求     ↓           ↓           ↓               ↓ 保护基因完整   保护关键元件   末端兼容性       T-DNA内插入 双酶切优选     正确插入位置   解决位点冲突     农杆菌转化兼容 $