2027届高三生物一轮复习课件 基因工程的基本操作程序

该高中生物学高考复习课件聚焦“基因工程”核心模块，依据高考评价体系梳理了目的基因获取（PCR技术）、表达载体构建、导入受体细胞及检测鉴定四大操作程序，通过近五年真题分析明确PCR原理、载体组成、检测方法等高频考点，归纳实验设计与原理分析等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题情境+素养导向”的复习策略，如结合2021全国甲卷PCR检测病原菌真题，剖析引物设计原则与电泳鉴定步骤，培养科学思维与探究实践素养。特设易错点分析（如PCR循环次数计算、限制酶选择）及答题模板，助力学生掌握实验题得分技巧，教师可据此系统开展专题复习，提升备考效率。

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 普通棉花 转基因抗虫棉 第四届花生 抗虫棉有什么优势？需要用到哪几种工具？具体步骤是什么？看书勾画P76 培育转基因抗虫棉的一般步骤： 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 棉花细胞 （核心） 苏云金杆菌 抗虫棉 组织培养 Bt蛋白基因 提取 表达 Bt基因 导入 与载体拼接 第四届花生 一、目的基因的筛选与获取：（P76—79） 1.目的基因： 2.筛选方法： 3.获取方法： （1）概念： （2）种类： （3）实例： 普通棉花 第四届花生 载体载着什么呢？目的基因。 载着目的基因去干嘛？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 1.目的基因及其筛选： （1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于________________或________________等的基因。 （2）种类：主要指__________的基因，或__________________。 （3）实例： 改变受体细胞性状 获得预期表达产物 编码蛋白质 具有调控作用的因子 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 抗除草剂 胰岛素的基因 编码蛋白质的基因 果胶酶的基因 抗虫（Bt基因）基因 第四届花生 一、目的基因的筛选与获取：（P76—79） 1.目的基因：主要指能编码蛋白质的基因。 2.筛选方法： 3.获取方法： 普通棉花 （1）较为有效的方法： （2）认识基因结构和功能的技术方法： 第四届花生 2.筛选方法： （1）较为有效的方法： 普通棉花 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 碱基（核苷酸）序列 第四届花生 思考1：总结Bt抗虫蛋白的抗虫原理。 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽→与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合→导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 思考2：抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 不会；Bt抗虫蛋白只在肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性且肠道细胞也没有特异性受体。 第四届花生 （1）较为有效的方法： （2）认识基因结构和功能的技术方法： 2.筛选方法： 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 基因测序仪 美国国家生物信息中心 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 测序技术、序列数据库、序列对比工具等。 碱基（核苷酸）序列 第四届花生 基因结构：基因在DNA分子上的具体组成和排列方式（碱基排列顺序） 一、目的基因的筛选与获取：（P76—79） 1.目的基因：主要指能编码蛋白质的基因。 2.筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 3.获取方法： （1）从生物组织中直接获取 （2）人工合成 （3）从基因文库中获取 （4）利用PCR获取和扩增目的基因 第四届花生 （在遗传学中叫作扩增）（外源 DNA ）这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。 鸟枪法的具体做法： 用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段 将这些片段分别构建表达载体， 然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA 的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞， 再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。 工作量大，具有一定的盲目性。 适用于基因比较___、核苷酸序列____，通过DNA合成仪用________直接合成目的基因。 （2）人工合成： DNA合成仪 目的基因的mRNA 单链DNA (单链cDNA） 双链DNA(即目的基因) 反转录 合成 反转录法： 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 小 已知 化学方法 第四届花生 资料1：在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成目的基因。 根据cDNA(互补DNA)的合成过程回答以下问题： ①逆转录酶以 为模板合成1条与RNA互补的 链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的 链，使之变成单链DNA； ③以单链 为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另1条互补的 链， 形成双链DNA分子，即cDNA。 mRNA DNA RNA DNA DNA 现学现用1——反转录： 第四届花生 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，受体菌群即为基因库。 供体生物 基因组 DNA DNA片段 限制酶 酶切 与载体重组 导入 受体菌 mRNA 逆转录 cDNA 与载体重组 导入 受体菌 基因组 文库 cDNA 文库 基因文库 提取 提取 （3）从基因文库中获取： 包含一种生物的所有基因， 包含一种生物的一部分基因。 且基因含有启动子、终止子。 第四届花生 基因文库中不是直接储存相应基因，【基因库：一个种群全部个体所含有的全部基因】 目的基因核苷酸序列未知 而是保存受体菌，受体菌中含有基因。 是成熟的RNA 什么是文库？百度文库——储存信息，储存基因的信息 cDNA（互补mRNA） 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。 为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将酵母菌中的植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程，下列说法错误的是（　　） A.图中cDNA文库包含基因组文库 B.cDNA含有某种生物的部分基因 C.基因组文库含有某种生物的全部基因 D.①、③过程中可以使用同种探针筛选含目的基因的菌株 A 现学现用——基因文库： 第四届花生 【详解】A、基因组文库包含某种生物所有的基因，而cDNA文库是由mRNA经逆转录形成的基因组成的，由于基因的选择性表达，cDNA文库只包含某种生物部分基因，所以基因组文库包含cDNA文库，A错误； B、cDNA文库是由mRNA经逆转录形成的基因组成的，由于基因的选择性表达，cDNA文库只包含某种生物部分基因，B正确； C、基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA 片段克隆到某种载体上而形成的集合，含有某种生物的全部基因，C正确； D、由于①、③过程都是筛选获得含有同种目的基因的菌株，所以可以使用同一种DNA探针进行筛选，D正确。 （4）利用PCR获取和扩增目的基因： 苏云金杆菌 Bt蛋白基因 提取 大量Bt蛋白基因 PCR 穆里斯 （Polymerase Chain Reaction） PCR扩增仪 微量离心管 第四届花生 获取到一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 一、目的基因的筛选与获取：（P76—79） 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （1）特点： （2）全称： （3）概念： （4）实质： （5）条件： （6）过程： （7）结果与鉴定： 常用的、特异性地快速扩增目的基因。 聚合酶 链式 反应 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （3）概念： （4）实质： （5）条件： （6）过程： （7）结果与鉴定： 根据_____________的原理，通过在____提供参与DNA复制的________与________，对__________________进行______ __的技术。 PCR扩增仪 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因核苷酸序列 制 大量复 模拟细胞内DNA的复制过程， 在体外快速扩增特定的DNA片段。 第四届花生 温故知新——体内DNA复制 新合成的子链 DNA聚合酶 解旋酶 DNA聚合酶 游离的脱氧核苷酸 模板链 复制起点 第四届花生 温故知新——体内DNA复制： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ①边解旋边复制 碱基互补配对原则 ATP ②半保留复制 DNA聚合酶（形成磷酸二酯键） 解旋酶（解螺旋，打开氢键） 模板： 原料： 能量： 酶： ③复制特点: ①条件 ②复制原则: ④子链的延伸方向： 5'端→3'端 DNA聚合酶的特点1：只能从5'端向3'端延伸子链。 第四届花生 边解旋边复制、半保留复制 、多起点双向复制 子链延伸 子链延伸 引物 5′- -3′ -5 ′ 3′- 5′- -3′ 引物 3′- -5′ 新知——引物： DNA聚合酶的特点2：无法从头合成DNA链， 一小段能与DNA母链的一段碱基序列 碱基互补配对的短单链核酸。 ②本质： 需要引物结合在模板链的___端。 3’ ①原因： DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸从5'→3'接在已有的核酸片段上。 ③种类： 2种、分别位于目的基因两侧。 ④PCR进行前提： 目的基因两侧的核苷酸序列已知。 第四届花生 1.细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除）。细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除）。 利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P，其部分序列如下图。请写出扩增P基因的2种引物________________________ 5'-GAAGTCCTCT--------------ACGACGAACC-3' 3'-CTTCAGGAGA--------------TGCTGCTTGG-5' PCR技术扩增R(抗旱)或r基因过程中，利用____可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。 PCR技术可在DNA分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是? 细胞内：RNA单链 现学现用2——引物： 细胞外（PCR）：人工设计的DNA单链 引物自身及引物间不能存在互补序列 引物 第四届花生 引物是根据目的基因两侧已知的核苷酸序列来设计合成的 （或引物能与目的基因通过碱基互补配对结合） 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （5）条件： 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（2种短的单链DNA） 打开DNA双链，断氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 其它条件：如_______（添加______：_________________）和_________（_____________） 缓冲液 Mg2+ 激活DNA聚合酶 控制温度 反应反复进行 体外模拟细胞内DNA的复制过程。 第四届花生 dNTP：脱氧核苷三磷酸；功能：①提供原料；②提供能量 ATP结构中的五碳糖为核糖，dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 dATP脱掉两个磷酸基团后就是腺嘌呤脱氧核苷酸，同时供能。 腺苷三磷酸 脱氧核苷三磷酸（dNTP) 思考：细胞内DNA复制需要什么物质供能？体外复制呢？ 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （5）条件： PCR扩增仪（PCR仪） 微量离心管 Mg2+的加缓冲溶液 控制温度 反应场所 模板 原料 引物 DNA聚合酶 第四届花生 PCR扩增的不是完整的模板DNA分子，是两种引物之间所对应的特定DNA片段 实战——（2021·全国甲卷）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作： ①分析PCR扩增结果； ②从病人组织样本中提取DNA； ③利用PCR扩增DNA片段； ④采集病人组织样本。 （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________。 （2）操作③中使用的酶是_________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是__________________________________。 （3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指____________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 ④②③① Taq酶(耐高温的DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 跟着花花学生物 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 变性 复性 延伸 变性 复性 延伸 （在_________中自动完成） PCR扩增仪 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 变性 复性 延伸 当温度超过____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 ①变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不要解旋酶、DNA全部解开 思考2：变性的温度为何是90℃以上，而不是一个具体值？ 变性的温度与氢键的数量有关。 （呈正相关） 高温 思考1：与体内DNA复制解旋的比较？ 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 变性 复性 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 思考2：50℃，引物的原因、位置、种类？ 当温度下降到 到左右时，__种引物通过 与两条单链DNA结合。 ②复性： 碱基互补配对 50℃ 两 便于引物与互补DNA链结合 思考3：一定是引物与DNA模板链结合吗？ ①引物与DNA模板结合 ②解开的两条模板链重新结合 ③引物与引物结合 加入过量的引物。 设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补。 第四届花生 加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 引物之间可能结合形成二聚体，避免互补序列：④引物可能与非目标序列结合a. 模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。只要引物是过量的，模板与引物配对结合的概率就特别高，就能保证复性时是引物和模板链配对结合。 要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。 2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。 5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’ 3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’ ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 现学现用3——根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 PCR扩增时至少需要____种引物，原因是__________________________________________。 2 设计引物的要求： ①2种引物之间不能发生碱基互补配对→_______________________。 ②同种引物之间不能发生碱基互补配对→_______________________。 防止引物自身配对折叠 引物不能与模板链结合 DNA的两条链是反向平行的（序列不同） ③不能过短、过长。 第四届花生 通过PCR技术可在DNA分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是? 引物是根据目的基因两侧已知的核苷酸序列来设计合成的 （或引物能与目的基因通过碱基互补配对结合） 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 变性 复性 延伸 当温度上升到____左右时，溶液中的4种__________在耐高温的_________的作用下，根据____________原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ ③延伸： 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考4：72℃？Taq酶结合在引物的哪一端？ 碱基互补配对 Taq酶的最适温度 思考6：扩增DNA片段的长度由什么决定？母、子链一样长吗？ 引物的位置；不一样 思考5：子链延伸与体内复制的区别？ 第四届花生 PCR：原料是脱氧核苷三磷酸、2条子链均是连续合成、只合成引物之间的DNA片段、72℃还可以防DNA变性 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 变性 复性 延伸 DNA解链为单链 高温(95℃)变性 低温(50℃)复性 中温(72℃)延伸 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行子链的合成 PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。 循环 →自动控温的仪器。 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （6）过程： 循环 变性 复性 延伸 ④循环： 第一轮循环的产物作为第二轮反应的____，经过_________________三步产生第二轮循环的产物。 模板 变性、复性、延伸 思考7：扩增过程中需要添加哪些物质？ 思考8：循环次数与DNA量的关系？一般要经过几次循环才能分离出等长的DNA片段（目的基因）？ 源源不断加入引物、原料 第四届花生 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ PCR扩增示意图： 以目的基因在DNA内部为例 第四届花生 （1）循环n次 单链间的关系与DNA分子数： 长链 中链 短链 复制 复制 复制 短链 ①第3次循环可分离出等长的DNA片段（目的基因）。 ②单链总数_______=长链_____+中链_____+短链_______________。 2n*2 2 2n 2n*2－2－2n ③DNA分子总数_____ =长—中_______+ 中—短_______+ 短—短_________。 2n 2 2n-2 2n-2n 第四届花生 长链只能来自最初模板链2条，复制过程中不能新增；中链只能来自2条长链复制产生，每轮新增2条，2、4、6、8、、、→2n；短链直接用总的减掉长、中。长—中、中—短两种DNA中每个DNA各含1条中链，所以中—短=中链数—长—中（长链数）。不等长的DNA均含有1条中链，所以等长的DNA=2n-2n （2）循环n次 引物关系： 长（无)—中（1/2) 、中（1/2)—短（2/1)、短（1/2)—短（2/1)。 ①共含___________个引物，两种引物数量______。 2n*2－2 相等 ②含引物1（2）的DNA分子数________； 含引物1和2的DNA分子数__________。 2n－1 2n－2 ③第n轮消耗的引物数____。 2n 第四届花生 除了长链，复制过程中产生的新子链（中、短）均含引物；根据半保留复制原则，消耗引物1时必然消耗引物2→1的数量=2；除了长－中两个DNA只含1或2，其余均同时含1、2；每新增1个DNA，即新增1条子链，必然消耗1个引物→消耗引物数=新产生DNA数。 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 目的片段 第一轮 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 3' 5' 5' 3' 5' 3' 引物A 5' 3' 引物B 目的片段 第一轮 第二轮 目的片段 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 目的片段 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 1.若两条引物均从DNA分子端部结合， 则第 轮出现目的片段。 一 2.若一端部结合、一中间部位结合，则第 轮出现目的片段。 二 第四届花生 现学现用4——PCR： 如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。 下列有关叙述错误的是(　　) A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的 脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条 脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对， 则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 跟着花花学生物 第三轮循环共产生8个DNA，其中含有引物A的DNA是7个，即占7/8，×； 思考9：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 一般不是；扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 PCR是常用的、特异性地快速扩增目的基因。 第四届花生 已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是根据目的基因两端（3 ′端）的核苷酸序列设计引物 思考10：用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 不能！ 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 思考11：如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ 第四届花生 4.利用PCR获取和扩增目的基因： （7）结果及鉴定： 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 ①结果：成_________扩增（约为___，其中n为扩增循环的次数）。 ②PCR产物鉴定：_______________。 指数形式 2n 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶 琼脂糖的微结构 第四届花生 【资料】琼脂糖是从琼脂中提取处理，在电泳缓冲液中加热溶解，冷却后凝固成均匀的胶体，具有滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度。（本实验中，琼脂糖浓度不变） 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 场所 解旋 酶 温度 过程 结果 联系 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 不同温度下进行 解旋酶、DNA聚合酶等 解旋酶、部分DNA双链解开 高温、DNA双链全部解开 耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶） 细胞内温和条件 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 ①都需要提供DNA模板、4种脱氧核苷酸和引物； ②都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则。 第四届花生 五、实验——DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84—85） 1.NDA片段的扩增： （1）实验原理： （2）材料用具： （3）方法步骤： 2.DNA片段的电泳鉴定： 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 中温 低温 复性 延伸 1次循环 第四届花生 1.NDA片段的扩增： （1）实验原理： ①PCR利用了DNA的___________原理，通过________来控制DNA双链的解聚与结合。 ②PCR仪实质上就是一台能够____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环。 （2）材料用具： DNA的热变性 调节温度 DNA半保留复制 30 自动调控温度 PCR扩增仪 第四届花生 1.NDA片段的扩增： （2）材料用具： ②微量离心管： PCR反应的场所。 ③微量移液器 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 一次性枪头 加入组分时的注意事项？ ④戴好一次性手套。 ①各组分依次加入，换试剂时更换移液器上的枪头； ②-20℃储存缓冲液和酶，使用前，放在冰块上缓慢融化； ③微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理； ①PCR仪：自动控温，实现DNA的扩增。 第四届花生 酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。（视频为PCR全过程）依次加入、更换枪头、高压灭菌（防止外援DNA污染）、佩戴手套。 1.NDA片段的扩增： （3）方法步骤： ①移液 ②离心 ①离心：使反应液集中在离心管的底部，提高反应速率。 ③反应 ②预变性：使DNA充分变性，利于引物更好地和模板结合。 ③Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降，每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了→最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，保证所有片段完成延伸。 第四届花生 PCR仪循环程序：预变性？→循环20次→最后一次？ 注：可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 五、实验——DNA片段的扩增及电泳鉴定（P84—85） 1.NDA片段的扩增： 2.DNA片段的电泳鉴定： （1）实验原理： （2）材料用具： （3）方法步骤： 琼脂糖 凝胶 电泳 第四届花生 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （1）实验原理： ①____：DNA分子具有____________，在一定的__下，这些基团可以带上__________，在____的作用下，________会向着_________ ______的电极移动的过程。 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电 正或负电荷 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 荷相反 第四届花生 磷酸电离形成的磷酸基团带负电，样品点样孔应靠近负极。；电泳缓冲液（TAE或TBE）：增加导电性；维持电泳过程中合适的pH;分离DNA的方法及其利用的特性？ ②PCR的产物一般通过______________来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与__________、_____________和____等有关。 琼脂糖凝胶电泳 资料1：琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 资料2：琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越___，能够通过的核酸分子越_____。 小 小 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （1）实验原理： 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 介质：琼脂糖凝胶 低浓度、小分子：移速快。 第四届花生 本实验中琼脂糖的浓度应该相同；DNA的迁移速率与其构象密切相关，超螺旋结构迁移最快，开环结构最慢。在实验中，可通过优化凝胶条件（如浓度、电压）和DNA构象（如酶切处理）来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （1）实验原理： ③凝胶中的DNA分子通过____，可以在波长为_____的______下被检测出来。 染色 300nm 紫外灯 资料3：常用的核酸染料有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 第四届花生 Q4.DNA本身无色，有什么方法可以让DNA被观测？（鉴定原理②） →使核酸染色，便于观察； 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （1）实验原理： 资料4：标准参照物（Marker）：___________________的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计______________。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 第四届花生 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （2）材料用具： 琼脂糖凝胶电泳装置 电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）、无菌水、 电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 第四届花生 凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝和蔗糖）→溴酚蓝作为前沿指示剂可以预测电泳进程；蔗糖：可以增加样品密度； 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （3）方法步骤： 观察鉴定 进行电泳 根据待分离DNA片段的大小，用__________配制（质量分数__________）的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，加入适量的________混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成______。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入______内。 ①熔化： ②倒模： ③凝固： 制备凝胶 电泳缓冲液：①提供导电介质；②维持电泳体系pH稳定。 核酸染料：使DNA条带显色，便于观察。 电泳缓冲液 0.8%～1.2% 核酸染料 加样孔 电泳槽 第四届花生 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为_____V/cm。______________________________，停止电泳。 将扩增得到的PCR产物与______________（内含指示剂） 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的______内。 留一个加样孔加入 ________________________。 观察鉴定 进行电泳 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （3）方法步骤： 制备凝胶 将__________加入电泳槽中，没过凝胶____为宜。 ①加液： ②加样： ③电泳： 凝胶载样缓冲液：①指示剂使样品呈现颜色，便于加样。②含蔗糖等高密度物质，使样品沉入加样孔底部，保证加样的准确性。 电泳缓冲液 1mm 凝胶载样缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物 1～5 待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时 ③指示剂相对分子质量较小，迁移速率较快→可显示电泳进程→防止NDA样品完全穿过凝胶。 第四届花生 观察鉴定 进行电泳 2.DNA片段的电泳鉴定：琼脂糖 凝胶 电泳 （3）方法步骤： 制备凝胶 取出凝胶置于______下观察和照相。 紫外灯 第四届花生 3.注意事项： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行________处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在______储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上_________。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须_____。 4.在进行操作时，一定要戴好___________。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 缓慢融化 更换 一次性手套 第四届花生 4.结果分析与评价： 1.成功扩增出DNA片段的判断依据是： 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 紫外灯下观察到DNA条带的 及 。 分布 粗细程度 扩增产物的类型 扩增产物量的多少 如图：电泳鉴定的结果为 条条带，该片段大小约为 bp(碱基对)。 能否通过电泳条带确定扩增产物是所需的DNA片段？为什么？ 1 750 电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能精准显示的DNA碱基数量及序列。 DNA测序技术 第四届花生 ① 失活； ②Mg2＋浓度过 ； ③ 出现质量问题； ④变性时的温度 、时间 。 4.结果分析与评价： 2.扩增失败没有条带(即未出现扩增条带)，可能原因： Marker TaqDNA聚合酶 低 引物 低 短 第四届花生 注：双链DNA没有解聚为单链，导致模板DNA失效。 4.结果分析与评价： 3.如果不止一条条带(即出现非特异性扩增)，其可能原因： Marker ①模板DNA出现____； ②____特异性不强或形成____二聚体； ③Mg2＋浓度过__，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④复性时的温度_____，引物随机连接到非目的基因片段。 污染 引物 引物 高 过低 第四届花生 DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 二、基因表达载体的构建：（P80） 1.构建目的： 2.表达载体的组成： 3.构建过程： 游离的DNA片段被分解或无法复制 使目的基因在受体细胞中________，且可以____给下一代；能够____和发挥作用。 稳定存在 遗传 表达 ——基因工程的核心 第四届花生 获得了足量的Bt基因后，能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？（1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；（2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 标记基因 复制原点 终止子 启动子 插入目的基因 （4）复制原点： （5）标记基因：作用为鉴别受体细胞中__________________，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （2）启动子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA （3）终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段。 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 （1）目的基因：能控制表达所需要的特殊性状，主要指_______________________。 位置：必须插到 和 之间。 启动子 终止子 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 2.表达载体的组成： 编码特定蛋白质的基因 DNA复制的起始位点。 是否含有目的基因 第四届花生 思考1：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较？ 启动子 终止子 转 录 mRNA 翻 译 多肽链 起始密码子 终止密码子 启动子、终止子：特殊的DNA片段，调控转录； 起始密码子、终止密码子：mRNA相邻的3个碱基，调控翻译。 第四届花生 2.表达载体的构建过程： DNA片段 （含目的基因） 带有相同黏性末端或平末端的载体、目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） （基因表达载体） 同种限制酶 载体 （质粒） 同尾酶切割 外源DNA 质粒 切割位点 标记基因 黏性末端 重组质粒 第四届花生 试一试1：枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。 EcoRⅠ 重点1——限制酶的选择： （1）根据图1和图2，最好使用限制酶______________切割图2中含W基因的DNA片段，导入质粒以获得能正确表达W基因的重组质粒。 EcoRⅠ 和HindⅢ （1）_________________：确保质粒与目的基因出现相同黏性末端； （2）______：避免目的基因和质粒反向连接、自身环化； 同种限制酶/同尾酶 双酶切 （3）保留标记基因(至少1个）、启动子、终止子、复制原点、目的基因； （4）正向连接在启动子和终止子之间。 第四届花生 重点1——限制酶的选择： 试一试1：枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。 EcoRⅠ (2)很多启动子具有物种、组织特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 （填写字母）。 A.枯草芽孢杆菌启动子  B.乳酸杆菌启动子  C.农杆菌启动子 D.家禽启动子 B 根据受体细胞匹配启动子、终止子以确保转录的效率与成功率。 如：人的生长激素基因在其他动物乳腺细胞中表达，则选择__________。 乳腺中特异表达的基因的启动子 第四届花生 重点2——引物设计的原则： 试一试2：分析“影响复性温度的因素”： 1.引物的长度适宜： 过短：特异性差，造成非特异性结合； 2.GC的含量适宜、碱基随机分布： 氢键越多，复性温度越高。 过长：引物内部可能成环、PCR效率低（引物与模板结合时间更长）。 第四届花生 重点2——引物设计的原则： 试一试3：下面设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，是否合理？ 3.避免引物之间或引物内部碱基互补配对： 第四届花生 重点2——引物设计的原则： 试一试4：含Bt基因的DNA片段与质粒上相关限制酶的酶切位点分别如下图所示。 为使Bt基因定向插入质粒中，应选择_____________________________限制酶处理含Bt基因的DNA片段、质粒。 SpeⅠ、Sau3AⅠ； SpeⅠ、BamHⅠ 同尾酶替补：使切割位点的选择范围扩大（P74）。 第四届花生 重点2——引物设计的原则： 试一试5：设计PCR引物，使Bt基因的两端添加限制酶识别序列及切割位点如下： 目的基因： 5＇CATGTCCA-----------------------CCACAACC 3＇ 3＇GTACAGGT-----------------------GGTGTTGG 5＇ CATGTCCA 3＇ 引物A 引物B 3＇GGTGTTGG 5＇EcoR I BamH I 5＇ （2）写出改造后的两种引物序列。 引物A：_____________________；引物B：_____________________ （1）在两种引物的___端分别添加上_________________。 限制酶的识别序列 5＇ 5＇-GGATCCGGTTGTGG-3＇ 5＇-GAATTCCATGTCCA-3＇ 目的基因： （3）PCR扩增的第___轮能获得被修饰的Bt基因→ 3 定向插入目的基因。 第四届花生 思考3：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？ 小结——引物设计的原则： 1.引物的长度适宜： 2.GC的含量适宜、碱基随机分布： 3.避免引物之间或引物内部碱基互补配对： 4.引物5＇端可修饰，3＇端不可修饰； (酶切位点/荧光/定点突变/启动子序列等) 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 第四届花生 重点2——引物设计的原则： （1）如图所示，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择____________识别切割质粒。已知目的基因上无相关酶切位点，应在目的基因上游设计的酶切序列+引物序列为5’- -3’。 EcoRI和BamHI GAATTCATGACAGTTAGT 试一试6：右图为目的基因部分序列： 第四届花生 重点2——引物设计的原则： 试一试6：右图为目的基因部分序列： （2）已知DUR1,2基因的转录模板链为A链，若DUR1,2基因反向连接，构建出反义DUR1,2基因，则其转录模板链为 链。造成的结果是转反义DUR1,2基因酵母工程菌中内源的DUR1,2基因表达受阻，原因可能是__________________ ________________________________________________________________。 B 以B链为模板转录出的RNA与以A链为模板转录出的RNA配对形成双链，抑制了DUR1，2基因的表达 第四届花生 任务：看教材81页第1段和82页倒数第2段，学习受体细胞的类型？ 基因表达载体导入不同的受体细胞所用的方法？ 导入 受体细胞 植物 动物 微生物 （如大肠杆菌） 农杆菌转化法（常用） 花粉管通道法（我国独创） 显微注射法 Ca2+处理法 三、将目的基因导入受体细胞：（P81） 第四届花生 1.将目的基因导入植物细胞：（1）花粉管道通道法： 含目的基因的DNA 溶液 ①方法一：子房注射法 ②方法二： 柱头处理法 （我国独创） 微量注射器 子房 含目的基因的DNA溶液 一定时间内 植物受粉后 剪去柱头 DNA溶液 切面 花粉管通道 囊胚 第四届花生 资料分析:我国科学家独创的花粉管通道法，是利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 受体细胞： 受精卵 优点： 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。 1.将目的基因导入植物细胞：（1）花粉管道通道法： （我国独创） 第四届花生 但要求花朵较大 1.将目的基因导入植物细胞： （2）农杆菌转化法： ①转化： ②转化实质： ③农杆菌特点： ④转化过程： ⑤转化方法： 目的基因进入受体细胞内，且能 和 的过程。 基因重组（控制不同性状的基因的重新组合） （常用的） 维持稳定 表达 第四届花生 任务2：看81页资料卡，找出相关知识点并概括农杆菌转化法的基本思路？ （2）农杆菌转化法：③农杆菌特点： a.侵染对象： 伤口处施加适量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。 自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物。 冠瘿瘤 b.结构特点： 思考1：如何使用农杆菌转化玉米、水稻等单子叶植物？ 第四届花生 伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。并诱导产生冠瘿瘤， b.结构特点： 农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的______(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的_________上。 （2）农杆菌转化法：③农杆菌特点： Ti质粒 T-DNA 染色体DNA 思考2：为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？ 插入Ti质粒的T-DNA中 第四届花生 请根据农杆菌的特点，写出利用农杆菌进行转化的思路。 请根据农杆菌的特点，写出利用农杆菌进行转化的思路。 请根据农杆菌的特点，写出利用农杆菌进行转化的思路。 当双子叶植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成。 Ti质粒 目的基因 ①构建 表达载体 ②转入农杆菌 含重组Ti质粒 的农杆菌 ③导入 植物细胞 ⑤表现出新性状的植物 ④T-DNA转移，将目的基因插入染色体DNA中 植物细胞 重组Ti质粒 DNA重组① DNA重组②（随机） 导入① 导入②（自然转化） 筛选2 筛选1 植物组织培养 （2）农杆菌转化法： ④转化过程： 思考3：几次DNA重组(拼接)?几次导入？几次筛选? 第四届花生 （2）农杆菌转化法： ⑤转化方法： 根据受体植物选择具体的方法 方法1： 新鲜圆形小叶片 含重组Ti质粒的含农杆菌 共培养 筛选 转化细胞 组培 新植株 方法2： 花序 浸没 农杆菌溶液 取出培养 收获种子 筛选、鉴定 受体细胞：体细胞 受体细胞：生殖细胞 思考4：2种转化方法有什么不同？ 第四届花生 对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 1.将目的基因导入植物细胞： （1）花粉管道通道法： （2）显微注射法： 植物细胞 动物细胞 受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 有新性状的动物 全能性高， 体积大易操作 思考5：选择的受精卵原因？ 具体过程？ 第四届花生 对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。如何让目的基因只在某个细胞中表达？ 1.将目的基因导入植物细胞： （1）花粉管道通道法： （2）显微注射法： （3）Ca2+处理法： 动物细胞 受精卵 植物细胞 受精卵、体细胞 微生物 Ca2+处理 可吸收周围环境中DNA分子的生理状态 吸收 大肠 杆菌 Ca2+ 表达 载体 Ca2+ 处理法示意图 常用原核细胞（大肠杆菌应用最广泛） 单细胞：繁殖快、易于培养、遗传物质相对较少。 增加细胞膜的通透性 第四届花生 Ca2+的作用：增加细菌细胞壁的通透性。增强细菌捕获外源 DNA 的能力，成为感受态细胞．如将大肠杆菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，细胞膜通透性改变，成为感受态细胞． 回到农杆菌那儿补充Ca2+处理！ 现学现用——利用转基因大肠杆菌生产胰岛素： 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素 cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。 第四届花生 酵母菌，因为酵母菌是真核细胞，具有多种细胞器，内质网和高尔基体可以对翻译形成的多肽链进一步加工。 重点3——农杆菌转化的筛选： 试一试5：为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。回答下列问题： (1)用 农处理杆菌后，可促进其吸收周围环境的DNA，再将其与基因表达载体混合,完成 后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含目的基因表达载体的农杆菌。 (3)为获得具有抗除草剂性状的转基因水稻，还需要在个体水平进行抗性测试。请你设计一个实验方案，筛选出对草甘膦具有抗性的转基因水稻,实验思路: 潮霉素 转化 选取长势相同的野生型和转基因水稻，用等量相同浓度的草甘膦农药喷洒，相同环境条件下培养一段时间后，观测水稻的生长情况。 Ca2+ (2)当农杆菌成功侵染愈伤组织后,是否标志着转基因水稻培育成功? 第四届花生 此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达。 四、目的基因的检测与鉴定：（P82） 1.操作目的： 2.检测内容及方法： 判断目的基因进入受体细胞后，是否________和____ ___________。 稳定维持 表达 其遗传特性 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 Bt基因 分子水平 个体生物学水平 抗原-抗体杂交技术 PCR技术、核酸分子杂交技术等技术 抗虫接种实验 第四届花生 你可以从哪些角度检测目的基因? （1）分子水平检测——PCR扩增+电泳： 逆转录 提取待测DNA PCR、琼脂糖凝胶电泳 提取待测mRNA cDNA 检测目的基因是否成功导入 检测目的基因是否转录 第四届花生 利用目的基因的核苷酸序列设计引物。 （2）分子水平检测——核酸分子杂交技术： 资料——基因探针：一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。 第四届花生 核酸分子杂交是指两个不同来源核酸单链的核苷酸之间碱基互补配对的过程 基本思路： 步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 （2）分子水平检测——核酸分子杂交技术： 检测目的基因： 检测mRNA： 受体细胞的mRNA RNA分子杂交 标记的DNA/RNA探针 原理：碱基互补配对原则 第四届花生 ①方法： ②原理： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） （3）分子水平检测——目的基因是否翻译（蛋白质） 第四届花生 如何得到被标记的抗体？该方法以目的基因表达出的蛋白质为抗原，制备能与其特异性结合的并能被放射性或荧光标记的抗体。如果能探测到目的蛋白，则说明目的基因在受体细胞内成功表达 拓展：基因工程中，检测是否翻译出相应的蛋白质的抗原—抗体杂交法中，为什么要使用二抗？ ①信号放大 原理：一抗直接与目标蛋白结合，但一抗的分子量较小，携带的标记物（如荧光素、酶）有限。 二抗优势：二抗是针对一抗的抗体，可同时结合多个一抗分子，形成“抗体-一抗-目标蛋白”的复合物，显著增加标记物的数量，从而放大检测信号。 ②通用性与灵活性 一抗的特异性：一抗需针对目标蛋白的特定抗原表位设计，不同目标蛋白需不同的一抗。 二抗的通用性：二抗仅需识别一抗的物种来源（如鼠源、兔源），无需针对具体目标蛋白。 优势：同一批二抗可与多种一抗配合使用，简化实验设计，降低成本。 第四届花生 （4）个体生物学水平的鉴定： 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物（如胰岛素） 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 功能、活性正常 ——检测相应性状或产物的功能活性 第四届花生 第四届花生 小结——基因工程的基本操作程序： 1.目的基因的筛选和获取-前提 利用PCR获取和扩增 人工合成 DNA文库 2.构建基因表达载体-核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因等 3.将目的基因导入受体细胞-关键 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞（如加Ca2+）转化法(微生物); 4.目的基因的检测与鉴定-保证 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 第四届花生 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Lavf57.83.100 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 EV录屏5.1.3软件录制 Lavf58.33.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制, www.ieway.cn Lavf59.34.101 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf59.34.101 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.37 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $