专题15 基因工程（6年汇编）（福建专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 福建考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025福建（1题） · 情境设置：以质粒和多种限制酶切位点为载体，创设核酸操作情境。 · 考查重点：限制酶识别位点、切割结果、DNA片段数及载体构建。 · 命题趋势：由单纯识记转向结合图示和限制酶切图谱进行推理。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026福建（1题）、2025福建（1题） · 情境设置：联系植物病害诊断、药用植物代谢产物合成等实际问题。 · 考查重点：PCR检测原理、引物与模板作用及基因导入、表达等程序。 · 命题趋势：突出技术应用，强调实验流程分析与结果判定的综合能力。 考点3 基因工程综合 2025福建（1题）、2024福建（1题）、2023福建（1题）、2021福建（1题） · 情境设置：覆盖基因敲除、植物性状改良、抗病毒和重金属处理。 · 考查重点：载体构建、目的基因表达、基因编辑原理及实验验证。 · 命题趋势：强化多技术融合，突出从基因功能到性状表现的因果分析。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（    ） A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 2．（2026·福建·高考真题）非洲芋常遭受致病菌P感染，导致植株根系腐烂，造成大幅减产。致病菌的早期鉴定有利于植物病害的防治。回答下列问题： （1）使用_______法分离非洲芋根系的微生物，根据菌落的形态和致病性挑取P菌进行纯培养。在纯培养过程中发现，培养基平板上存在形态不同的菌落，可能的原因有_______（填序号）。 A．放置了一段时间的培养基灭菌后再使用 B．倒平板时，拔出锥形瓶棉塞后，没有将瓶口通过火焰 C．为避免烫伤，在远离酒精灯火焰的地方倒平板 D．使用酒精灯短暂灼烧接种环 E．接种环蘸取菌液时不小心碰到了试管的内壁 （2）致病菌P是非致病菌P′的突变菌，两者形态高度相似。对两种菌进行测序，序列比对后发现，致病菌P在图1所示的DNA片段中有一个碱基对发生了替换，产生了Aar Ⅰ限制酶的识别序列。可用PCR联合限制酶酶切快速鉴定致病菌P，方法如下： ①采集非洲芋根系表面的菌，利用PCR扩增待鉴定片段。若仅用一对引物，应选用图1的引物_______。将上述PCR产物直接进行电泳，无法鉴定非洲芋是否受到致病菌P感染，理由是_________________。 ②用Aar Ⅰ限制酶对上述PCR产物完全酶切后进行电泳，其中5个样本电泳结果如图2。推测被致病菌P感染的非洲芋是_______号样本。分析3号样本呈现3条带的原因是_________________。 考点3 基因工程综合 1．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： （1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素_____的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是_____色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 （2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子_____对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子_____用于该系统。 （3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌_____（填选项）。 A．含质粒1和质粒2   B．只含质粒1   C．只含质粒2    D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：_____。 2．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （2）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是______。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是______。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用______限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其______。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是______。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是______。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是______。 3．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY基因的转基因菊花。重组Ti质粒的部分信息及实验流程如图1所示。启动子均为真核细胞启动子。 一、将重组Ti质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY转基因菊花。 （1）根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选____，步骤①培养过程一般____（填“需要”或“不需要”）光照，流程图中的Ⅰ是____。 （2）通过调整过程②和③中____的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY转基因菊花。 （3）以____为模板、选用与LFY基因特异性结合的引物，利用PCR技术鉴定菊花细胞是否存在LFY基因。再选用____技术检测转基因菊花的LFY蛋白的表达水平，进一步筛选LFY转基因菊花。 二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA的Ti质粒（如图2）培养转基因植物。 （4）已知Ti质粒携带双T-DNA时，每个T-DNA都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA上。请设计培育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY转基因菊花____。（写出实验思路即可） 4．（2021·福建·高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： （1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。 （2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 （3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。 1．（2026·福建厦门双十中学·模拟预测）2024年大卫·贝克等三位科学家因利用AI精准预测蛋白质的结构，推动蛋白质结构研究取得革命性进展，共同获得了诺贝尔化学奖。AI蛋白质的合成是蛋白质工程在人工智能时代的技术延伸。下列叙述错误的是（　　） A．AI蛋白在设计前需要先明确其功能需求 B．利用AI能设计出自然界不存在的蛋白质 C．AI蛋白的最终获得不需要经过基因工程 D．AI蛋白的功能需进行实验验证才能确定 2．（2026·福建泉州·二模）数字PCR技术称为第三代PCR，可对样本中的目标DNA进行精确计数。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含0-1个拷贝的目标DNA，在每个单元中分别对目标DNA进行PCR扩增，扩增结束后对每个单元的荧光信号进行分析，计算出稀释前初始样本中目标DNA的拷贝数。下列说法错误的是（　　） A．数字PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制 B．数字PCR技术更适用于样本中目标DNA含量高的材料 C．每个反应单元中目标DNA两条子链均从5′向3′延伸 D．每个反应单元中加入的酶是耐高温的DNA聚合酶 3．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）人工智能（AI）正在深刻改变疾病诊断与治疗的方式。下列关于AI应用的叙述，错误的是（    ） A．分析氨基酸序列，预测蛋白质空间结构，推断其功能 B．识别细胞的形态特征，区分正常细胞与癌细胞 C．分析家族与人群数据库，评估子代患遗传病的概率 D．分析细菌基因组序列，精确预测其产生耐药突变的时间和位点 4．（2027·福建漳州·一模）正常条件下，高粱抗旱基因启动子区域发生甲基化修饰，抑制该基因表达；干旱胁迫时，去甲基化酶特异性去除该区域甲基化修饰，使该基因得以表达，增强抗旱能力。下列叙述正确的是（     ） A．甲基化不改变基因的碱基序列，且不遗传给子代细胞 B．甲基化可能改变启动子结构，阻碍RNA 聚合酶与起始密码子结合 C．去甲基化酶特异性识别甲基化位点，体现了酶的高效性 D．高粱抗旱性状的差异，是基因与环境共同作用的结果 5．（2026·福建闽侯一中·模拟预测）“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 6．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）生产中常用植酸酶来分解植酸。现需对植酸酶进行改造使其能够耐受食品生产时的高温环境。研究者利用计算机技术辅助蛋白质改造，筛选有潜力的突变位点，并最终生产出一种单一氨基酸改变的植酸酶MU，与原植酸酶WT相比，有如下变化。下列叙述错误的是（　　） 品种 半衰期（min） 与植酸分子的作用力 60℃ 80℃ 氢键数 离子键数 WT 15.35 0.98 2 7 MU 25.72 1.89 4 8 A．植酸酶特定氨基酸基团能够与植酸分子专一地结合，形成氢键或离子键 B．MU热稳定性比WT高，是因为氨基酸的改变引起了酶空间结构的改变 C．MU与植酸分子作用力增加，可以为植酸分子提供更多活化能 D．在将MU应用于生产前，还需要比较其与WT的酶活性 7．（2026·福建福州·二模）我国科学家研发了利用微球进行多重核酸检测的技术，每种微球只固定同一种引物对，形成独立的扩增空间，实现同一个PCR体系中多种微球对多种基因片段的同时扩增，进而检测多种病毒。下列叙述错误的是（　　） A．每个微球上的引物只与一种病毒的核酸结合 B．该反应体系需要根据引物的碱基序列调整延伸的温度 C．该技术可以降低不同种引物之间碱基互补配对 D．该技术还可应用于多基因遗传病检测 8．（2026·福建漳州·模拟预测）“黄金大米”是一种转基因水稻，通过转入外源基因（如crt Ⅰ）使大米胚乳富含β-胡萝卜素，该物质可在人体内转化为维生素A，对预防和改善维生素A缺乏病具有潜在价值。下列叙述正确的是（    ） A．用PCR扩增crt Ⅰ基因时需在反应体系中添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶 B．构建重组质粒时应选择Hind Ⅲ和Sal Ⅰ同时切割质粒和含crt Ⅰ的DNA片段 C．用抗原-抗体杂交技术检测相关蛋白质可确定crt Ⅰ基因在大米细胞中的表达 D．大米细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，可合成β-胡萝卜素 9．（2026·福建泉州·二模）由vbp2基因编码的VBP蛋白参与T-DNA转运。为表征vbp2c启动子的转录活性，科研人员将vbp2启动子控制的vbp2基因替换为红色荧光蛋白基因（rfp基因），并转入根癌农杆菌中。为探究根癌农杆菌其他成分是否干扰荧光检测，将野生型菌与重组菌（含红色荧光蛋白RFP）的粗提液按不同比例混合，测定荧光强度，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A．用rfp基因替换vbp2基因时，需保证其插入方向与启动子正确匹配 B．每组实验混合前应保证两种粗提液的来源不变 C．实验结果说明粗提液中的其他成分对RFP荧光强度测定有显著干扰 D．实验结果表明重组菌RFP荧光强度能够表征vbp2启动子的转录活性 10．（2026·厦门双十中学·模拟预测）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 11．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A．Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B．选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C．根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D．筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 12．（2026·福建厦门一中·一模）将目的基因导入空载体（载体中含启动子和终止子），构建重组表达载体并导入受体细胞，载体中的插入序列随机整合至植物基因组。利用PCR技术进行检测时，可以采用不同的引物设计策略，如下图。下列叙述错误的是（    ） A．引物对中的两个引物分别与不同的模板链结合 B．引物对a可区分目的基因插入位置不同的转基因植株 C．引物对b可用于检测插入序列是否成功导入植物细胞 D．引物对c可用于检测植物细胞中是否含有空载体 13．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）在蛋白质特定位置的氨基酸侧链基团上安装一个分子接头，诱导蛋白质主链发生局部环化的技术，可改变蛋白质局部的折叠方式从而调控其功能。下列有关此技术的叙述正确的是（　　） A．适用于改造任意氨基酸序列的蛋白质 B．改造此蛋白质需要通过基因工程来实现 C．可能导致蛋白质分子内氢键数量发生变化 D．改变了氨基酸的种类和数量从而改变蛋白质的功能 14．（2026·福州第四中学·一模）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示，其中F1、F2、R1、R2表示引物。回答下列问题： （1）图1中启动子的作用是______。作为基因表达载体，除图1中标出的结构外，其还需具备的结构有______（答出1点）。 （2）利用PCR技术进行体外扩增时，已知引物F1与图1中P基因的a链相应序列互补配对，则a链从左到右的方向是______（填“5'→3'”或“3'→5'”），P基因转录的模板链是______（填“a”或“b”）链。 （3）随机挑取5个品系细胞通过PCR和______技术验证基因型，结果如图2所示。 ①在进行PCR扩增时，所选择的是图1中的______作为引物。 ②加样孔在______（填“上”或“下”）端，属于GFP基因纯合子的品系是______。 15．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）科研人员开发了一种基于近红外光的光开关系统——NIR系统（如图），实现目的基因表达的精准控制和治疗的定制化。 （1）通过基因工程构建NIR系统需要的工具酶有________。 （2）P酶在近红外光下被激活后具有较高活性，在黑暗条件下具有较低活性。M基因编码的M蛋白是一种转录激活因子，c-di-GMP水平升高可促进M蛋白与特定的启动子结合。为实现近红外光对目的基因表达的精准控制，构建NIR系统时，科研人员选用组成型启动子（不需要诱导物、可持续驱动基因表达）驱动P基因表达，①②应选用的启动子为：①________②________。 （3）沙门氏菌能够选择性定植于肿瘤微环境中，但具有感染性，对动物体存在毒力风险。以PD-L1抗体基因为目的基因构建NIR系统，以沙门氏菌为受体菌，构建用于癌症治疗的工程菌。对此工程菌的叙述正确的有________。 A．敲除沙门氏菌内源c-di-GMP合成酶基因，可降低目的基因的基础表达水平 B．敲除沙门氏菌毒力相关基因，以减弱工程菌的毒性 C．NIR系统中Y基因的作用，是为了降低无光条件下胞内c-di-GMP水平 D．可通过改变近红外光的强度和照射时间，来实现目的基因表达的精准控制 （4）将上述工程菌接种到小鼠的肿瘤内，通过检测________，来评价该工程菌是否构建成功以及治疗效果。 （5）NIR系统在癌症治疗之外也具有广阔的应用前景。在肠道炎症中活性氧起重要作用，通过抗氧化酶（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）清除炎症部位的活性氧，可抑制炎症性肠病。拟利用NIR系统构建工程菌以治疗炎症性肠病，请写出设计思路________。 16．（2026·福建·模拟预测）草甘膦是一种广谱除草剂，在一般情况下，草甘膦既能杀死杂草，也能杀死庄稼，只要是没有抗性的绿色植物，接触到足够剂量的草甘膦都会被杀死。科学家探究如何让草甘膦只除掉田里的杂草，而不伤害庄稼。图1表示构建苘麻抗草甘膦基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。回答下列问题： （1）构建含草甘膦抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶和______与载体进行重组。若目的基因两端缺少所需的限制酶识别序列，可通过PCR技术在引物的______（填“3’端”或“5’端”）添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。PCR扩增A时可在引物中加入______的酶切位点，用PCR技术扩增获得抗草甘膦基因A，引物的作用是______。 （2）导入重组质粒的愈伤组织______（填“会”或“不会”）出现蓝色组织。采用Ti质粒转运抗草甘膦基因A的原因是______。 （3）启动子若为草甘膦诱导启动子将减少细胞物质和能量的浪费，原因是______。 （4）图2表示利用体细胞诱变获得抗除草剂白三叶草新品种的实验过程。 ①该培育过程的原理是______。 ②用γ射线处理愈伤组织的原因是______。过程Ⅲ常采用的方法是______。 17．（2026·漳州立人学校·模拟预测）培育转VEGF基因的山羊，有利于提高羊绒产量。但转基因动物含有标记基因可能造成安全性问题。研究者利用Cre/LoxP系统删除标记基因。回答下列问题。 （1）要获得转VEGF基因的山羊，需用____________技术把基因表达载体导入山羊受精卵，获得的早期胚胎移植到代孕母体子宫前，需对代孕母羊进行_______________处理。 （2）如图1所示， Cre酶能切割特定位点形成黏性末端。结合图1和图2分析，Cre酶能将______（填“①”或“②”）中的目标片段删除，并且其余片段末端可以连接形成一个DNA分子。 （3）图3利用P0构建的P1表达载体可实现转化后可删除标记基因，图中引物 a添加的LoxP序列为5´­GCATACAT­3´则引物b应添加的LoxP序列为：5′—_________________—3′（填“5´­GCATACAT­3´”或“5´­ATGTATGC­3´”），同时，需在LoxP序列的________端添加限制酶BglⅡ和HindⅢ的识别序列。用BglⅡ和HindⅢ处理P1并对产物进行电泳鉴定，结果长度为________________说明P1构建成功。 （4）将P1导入山羊皮肤成纤维细胞，经检测VEGF已成功表达。此时还需要Cre/LoxP系统中________的作用将标记基因删除。利用荧光显微镜观察，结果为_______（填“有”或“无”）红色荧光，说明已成功删除标记基因。 18．（2027·福建福州·一模）烟草叶绿体转化技术已广泛应用于外源基因的高效表达。若要将外源基因导入烟草叶绿体基因组，需要合适的载体。下图是质粒P1的改造过程，回答相关问题。 （1）将MCS序列插入质粒P1，目的是________________。将MCS序列与质粒P1连接时，选用_______酶效率更高。在P3的MCS序列两侧还需加入________等调控元件，以确保外源基因能够正确表达。 （2）为了在P2上保留ScaⅠ酶切位点，PCR扩增MCS序列时应该在引物F1的5′端插入的序列是5′-______-3′。引物F2不能插入该序列，否则难以构建质粒P3，原因是_______。 （3）为了鉴定MCS序列与质粒P1是否正确连接，PCR扩增P2片段，用ScaⅠ酶切PCR产物，如果正确连接，则得到的电泳条带长度为_______。 （4）P2载体引入aadA基因作为_____（填“目的基因”“标记基因”）。与细胞核转基因烟草相比，从生物安全角度说明叶绿体转化烟草的优点是________。 19．（2026·福建百校·模拟预测）苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因发生单个碱基突变引起的常染色体隐性遗传病。患者因肝脏中PAH酶活性缺陷，导致苯丙氨酸代谢障碍，血液中苯丙酮酸浓度升高，造成神经系统损伤。2025年，苏黎世大学研究团队开发了一种基于Prime编辑的基因治疗策略，成功纠正了PKU模型小鼠的致病突变。Prime编辑系统（PE）由三部分组成：①Cas9n结构域；②RT结构域；③Prime编辑引导RNA（pegRNA），pegRNA包含引导序列、引物结合位点（PBS）和RT模板序列，其作用机制如图1所示。回答下列问题： （1）Prime编辑系统中，Cas9n结构域、RT结构域分别发挥了______酶和______酶的功能。RT模板序列需与突变位点附近的______（填“正常”或“突变”）序列相同，以实现对致病突变的精确修复。 （2）研究团队开发了LNP—mRNA递送策略（用脂质体包裹PE mRNA），给PKU模型小鼠注射2mg/kg的LNP—mRNA后，检测相关mRNA和蛋白质的水平如图2所示。结果表明，PEmRNA在细胞内的表达具有______（填“稳定性”或“瞬时性”），依据是______。 （3）给药7周后，提取小鼠肝细胞基因组DNA，通过_______技术扩增目的基因，______（填“能”或“不能”）通过琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效果，理由是______。 （4）为进一步验证PEmRNA是否成功表达并发挥功能，除了检测PAH的量和活性，还可以检测______（答出1点），评估基因治疗的效果。 20．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）牛乳铁蛋白肽（LF）是由25个氨基酸组成的小分子抗菌肽，具有广谱抗菌活性，但其分子量小（约4kDa），常规电泳难以检测。为提高表达效率和便于纯化，科研人员将增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）与LF基因融合构建重组表达载体（两个基因之间设计了甲酸裂解位点，可使融合蛋白在酸性条件下特异性断裂），然后将其导入到毕赤酵母中，最终实现LF的高效生产与提纯。请回答下列问题： 注：PA为甲醇诱导型启动子 （1）为获取荧光强度更强、灵敏度更高的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），需将野生型绿色荧光蛋白（GFP）氨基酸序列的第64位苯丙氨酸定点改造为亮氨酸，实现这一过程需要运用___________技术。科学家将EGFP与LF连接构建融合基因的目的是___________。 （2）为将EGFP基因定向的插入图3所示载体中，据图分析不能选择限制酶组合___________（填编号）（①BamHⅠ、EcoRⅠ  ②BgtⅡ、BamHⅠ  ③BgtⅡ、EcoRⅠ）切割质粒，理由是___________。形成EGFP—LF融合基因时，要注意将EGFP基因编码区中___________的序列删除以确保LF基因表达，获得EGFP—LF融合蛋白。 （3）重组酵母在甲醇诱导下表达融合蛋白。甲醇在此实验中的作用是___________。 （4）纯化后的LF对5株致病菌的最小抑菌浓度（MIC）测定结果如下表所示。根据表中数据，LF的抗菌活性有何特点？___________。 菌株 MIC（μg/mL） 金黄色葡萄球菌CMCC26003 64 金黄色葡萄球菌ATCC29213 64 大肠杆菌ATCC25922 16 大肠杆菌C600 16 大肠杆菌CMCC44103 64 21．（2026·福建福州·二模）H蛋白在各类细胞中广泛存在，对免疫功能具有促进作用，但正常情况下表达水平较低。研究人员将乙肝病毒B抗原基因与质粒D结合为重组质粒DB，研发了乙肝DNA疫苗；进一步利用H基因对乙肝DNA疫苗进行改造，开展了一系列实验。 回答下列问题： （1）研究人员设计了特异性引物，用PCR技术从结核杆菌中获取H基因。在______的催化下，子链从引物的______（填“3’端”或“5’端”）延伸。 （2）PCR合成的子链末端会多出一个腺嘌呤核苷酸（A）。根据这个特点，研究人员设计一种3’端各多出一个胸腺嘧啶核苷酸（T）的线性载体P，将其与PCR扩增的H基因混合构建重组质粒PH，并导入大肠杆菌进行扩增。与常规操作相比，该方法能快速构建表达载体的原因是无需用______酶处理载体和目的基因。通过该方法得到的重组质粒至少有两种，原因是______。 （3）质粒D能在真核细胞中表达，用______（填限制酶）对重组质粒PH中的H基因和质粒D进行处理，构建重组质粒DH。为检测H基因表达情况，将小鼠细胞分三组进行实验，培养一段时间后提取蛋白质进行电泳，结果如图。从结果判断导入小鼠细胞后重组质粒PH中的H基因______（填“能”或“不能”）正常表达，判断依据是______。 注：①组导入重组质粒DH，②组导入质粒D，③组不处理；β-actin蛋白在真核细胞中表达相对恒定，蛋白质电泳实验中常以它为参照 （4）为探究H蛋白在细胞中同步表达时对乙肝DNA疫苗激发特异性免疫的影响，研究人员选择三种不同质粒分别注射入三组小鼠体内，定期检测抗体水平进行验证。其中空白对照组注射质粒D，另两组应选择质粒______。 22．（2026·福建宁德·二模）LL-37是人体内一种重要抗菌肽，但易被蛋白酶分解。为解决上述问题，科研人员利用生物技术将LL-37包裹在类弹性蛋白多肽（ELP）纳米纤维内部，制备自组装纳米胶束。ELP具有显著热响应性，当温度低于T时ELP呈溶解状态，反之则沉淀。图1为构建融合蛋白（ELP-LL-37）表达载体的部分流程，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。 回答下列问题： （1）与质粒中的启动子结合的酶是______。为使LL-37基因正确连接到PUC19质粒中，并将ELP表达至LL-37抗菌肽的羧基端，利用PCR技术扩增LL-37基因时需在X链、Y链引物的5′端分别添加限制酶______的识别序列，引物的作用是______。 （2）将基因表达载体导入大肠杆菌，再用含______的培养基进行初步筛选，得到导入质粒的大肠杆菌。已知LL-37基因长度为1500bp，ELP基因长度为900bp，质粒上相关酶切位点的距离如图2。请在图3中画出构建成功的重组质粒经SacI、SmaI酶切后的电泳条带______。 （3）为分离纯化ELP-LL-37融合蛋白，将大肠杆菌培养24h后，将培养液离心→取细菌→破坏细胞→离心→取上清液→调节温度→分离。要分离出融合蛋白，调节后的温度应_____（填“大于”或“小于”）T。该过程中需反复升降温循环几次，依据的原理是_____。 23．（2026·福建·模拟预测）植物的光合效率易受CO2浓度、光照等环境因素影响，同时也与叶绿体的发育（形态结构建成）密切相关。科研人员通过一系列实验探究某植物的光合作用机制及环境适应性，回答下列问题： （1）植物叶片气孔开放时，CO2进入叶肉细胞的过程_______（填“需要”或“不需要”）载体蛋白协助，_______（填“需要”或“不需要”）消耗ATP。 （2）为追踪该植物光合作用中碳元素的转移路径，科研人员向密闭培养的该植物植株提供14C标记的CO2，在适宜光照下培养不同时间后，检测叶片中含14C的化合物。请写出该实验中14C的转移途径：_______。若突然停止光照，短时间内叶片中14C标记的C3含量会_______（填“增加”“减少”或“不变”），理由是_______。 （3）叶绿体的发育受基因的精细调控，以适应环境。科研人员对光响应基因BG在此过程中的作用进行了研究。 ①实验中发现一株叶绿素含量升高的该植物突变体。经鉴定，其BG基因功能缺失，被命名为bg。已知GK蛋白促进叶绿体发育相关基因的转录，BG蛋白可以与GK蛋白结合。科研人员构建了GK基因功能缺失突变体gk（叶绿素含量降低）及双突变体bggk。对三种突变体进行观察，发现双突变体bggk的表型与突变体_______相同，由此推测BG蛋白通过抑制GK蛋白的功能来影响叶绿体的发育。 ②为进一步证明BG蛋白对GK蛋白的抑制作用并探索其作用机制，将一定浓度的GK蛋白与一系列浓度BG蛋白混合后，再加入GK蛋白靶基因CAO的启动子DNA片段，反应一段时间后，电泳检测DNA所在位置，结果如图。分析实验结果，可得出BG蛋白抑制GK蛋白功能的机制是_______。 ③基于突变体bg的表型，从进化与适应的角度推测光响应基因BG存在的意义：_______。 24．（2026·闽侯县第一中学·模拟预测）为研究生长激素（GH）基因（603bp，起始密码子AUG，终止密码子UAG）在斑马鱼早期胚胎发育阶段的表达，研究人员以GH基因为外源基因，以增强型荧光蛋白（EGFP）基因（720bp，起始密码子AUG，终止密码子UAA）为报告基因，构建了含两个基因（GH-EGFP）的融合表达载体。操作基本流程、融合表达载体、相关基因、引物和限制酶，如下图所示。回答以下问题： （1）载体中复制原点的作用是保证表达载体具有______________的能力。 （2）在构建含有EGFP基因重组质粒时使用的限制酶是__________________。 （3）补充引物序列：引物3为5′______________ATGGCT3′；引物4为5′CCATGGCAACCAC______________3′（均写6个碱基序列）。 （4）注射后3h，在荧光显微镜下观察到受精卵开始发光。随着胚胎发育的进行，发光卵逐渐增多，荧光亮度也增强，荧光集中在头部和背部。24h后荧光亮度开始减弱，仔鱼孵出3-4d后，荧光全部消失。 ①挑取发光卵提取DNA，使用不同的引物分别扩增外源目的基因GH和融合基因GH-EGFP进行检测，结果如下图所示。据此推测泳道2、3上的条带所示基因为__________________，理由是________________________________________________________________________________________。 ②尝试提出假说解释荧光消失的原因：________________________________________________________________________________，验证该假说需检测仔鱼细胞中的物质为___________________________________________________________________________________。 25．（2026·福建厦门·二模）研究人员构建了一种由近红外光激活的大肠杆菌工程菌，该菌能表达并分泌Noxa蛋白（一种促凋亡蛋白）诱导肿瘤细胞凋亡。图1为PCR扩增ClyA-Noxa融合基因的流程，图2为温度敏感型载体的工作原理，Tcl基因编码的cI857蛋白形成的二聚体，与pR-pL基因启动子结合，42℃时cI857蛋白变性失活。 请回答： （1）大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，推测其目的是___________。扩增融合基因时，引物R1和P2实现了两种基因片段的拼接，则R1和P2分别是___________（从下列引物中选填）。 引物a：5'-GCCTTAAGCCATGGC……-3' 引物b：5'-GGTGATGGCATGCGC……-3' 引物c：5'-GCGCATGCCATCACC……-3' 引物d：5'-CGGAATTCGGTACCG……-3' （2）将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用___________处理大肠杆菌细胞，以提高转化效率。为鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录和翻译，在分子水平进行检测的方法是___________。 （3）将构建好的工程菌与肿瘤细胞在37℃下共培养，与对照组相比，肿瘤细胞存活率无明显差异；若温度升高至42℃，肿瘤细胞存活率显著下降。结合图2分析，42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是___________。 （4）工程菌植入肿瘤部位会破坏肿瘤组织的血管，肿瘤组织颜色变暗对近红外光的吸收值增大，肿瘤组织部位温度升高。通过近红外光照射肿瘤部位，可达到杀死肿瘤的目的。肿瘤细胞死亡的因素包括___________（多选）。 ①营养和氧气供应障碍    ②高温导致细胞热损伤和坏死 ③肿瘤细胞快速表达Noxa蛋白    ④Noxa蛋白诱导肿瘤细胞凋亡 26．（2026·福建南平·二模）解钾菌能将土壤中难溶性的含钾矿物质转化为植物可利用的有效钾。研究表明gcd基因与pqqABCDE基因（图1）的协同表达可使解钾菌的解钾效率提高。研究人员从土壤中分离出野生型解钾菌，在gcd基因载体（图2）上构建gcd-pqqABCDE融合基因表达载体。利用基因工程技术培育出解钾效率更高的转基因解钾菌。 回答下列问题。 （1）通过PCR技术获取pqqABCDE基因时，应选择引物________。已知pqqABCDE基因两端不含限制酶的酶切位点，为了能与gcd基因载体定向连接，扩增pqqABCDE基因时，需在目的基因两端加上________限制酶的识别序列。依据图1、图2信息，写出上游引物的部分碱基序列5′-_________-3′（包括添加的限制酶识别序列，写出12个碱基）。 （2）将构建好的gcd-pqqABCDE融合基因表达载体转入野生型解钾菌，常采用________处理以完成转化。转化后获得的解钾菌扩大培养后，先在含________的培养基（甲）上培养，再利用灭菌的绒布将菌落复制到含________的培养基（乙）上培养，在甲、乙培养基中生长情况为________的菌落，即为所需转基因解钾菌。 （3）若该转基因解钾菌释放到自然土壤中，可能引发的生态风险有________。 27．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）插入突变是基于农杆菌Ti质粒的遗传学技术，通过将农杆菌Ti质粒上的T-DNA片段随机插入受体生物，破坏基因结构或影响其表达，是研究植物基因功能的重要手段。土壤镉（Cd）污染严重危害植物的生长发育。研究人员通过构建Cd敏感的T-DNA插入突变体拟南芥（S）进行植物耐Cd分子机制的研究。回答下列问题： （1）构建拟南芥突变体S过程中，Ti质粒的T-DNA可随机整合至拟南芥的______________中，筛选后的细胞需经植物组织培养成为突变体植株。 （2）提取突变体S的DNA，测序可确定发生突变的基因为SCL14基因。研究人员欲构建突变体S的回补株系进一步验证： ①利用Ti质粒和SCL14基因（如图）构建基因表达载体时，需用PCR技术对SCL14基因进行扩增，为保证该基因能以正确方向连入T-DNA，根据图中信息写出SCL14基因上游引物的碱基序列______________（从5′端到3′端，只写出前8个碱基即可）。 ②将重组质粒成功导入农杆菌后配成细菌悬液，突变体S的花序直接浸入细菌悬液一段时间，继续培养植株获得T0种子。将T0种子平铺至含______________（填抗生素）固体培养基上培养，筛选后移栽至营养土生长，自交得T1种子。 ③将若干单株收获的T1种子平铺至含相同抗生素的培养基中，选择分离比为3（有抗性）:1（无抗性）的植株继续种植、自交以最后获得纯合株系。优先选择分离比为3:1而非15:1或其他比例的植株的目的是______________。 （3）实验证明，SCL14基因的缺失是突变体S对Cd胁迫敏感的原因。另有研究表明TGA3基因缺失导致突变体T对Cd胁迫敏感。若正常和Cd胁迫条件下，突变体S中TGA3表达量无明显差异，且______________，则表明SCL14蛋白与TGA3蛋白可能独立调控拟南芥对Cd的耐受性。 （4）为进一步探究SCL14调控拟南芥耐Cd的分子机制，研究人员对Cd胁迫下WT和突变体S特定细胞的总mRNA进行提取和测序分析，目的是______________。 28．（2026·三明一中·模拟预测）韧皮部杆菌（CLas）可引起柑橘黄龙病并导致柑橘植株死亡。西南大学柑橘研究所的科研人员发现，CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。为培育抗黄龙病柑橘，研究人员进行了相关实验。 （1）据图1分析，应选限制酶________切割质粒，为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因A端引物的________（填“5′”或“3′”）端添加________（填“SphI”“Sau3AI”或“MunI”）的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）将Ti质粒转入农杆菌，在含氨苄青霉素的培养基上培养得到多个单菌落。欲鉴定某单菌落是否为重组农杆菌从而用于柑橘外植体的感染，有两种鉴定方案。方案①：挑取该单菌落提取质粒，对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。方案②：挑取该单菌落转入3mL培养液，振荡培养12小时后取1mL提取质粒，再对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。你建议选择方案________（填“①”或“②”），理由是________。 （3）为鉴定获得的转基因柑橘植株是否抗病，研究人员对甲、乙、丙三组植株进行CLas菌接种实验，一段时间后检测剩余细菌相对数量。结果如图2所示。丙组抗病效果最好，结合题干信息分析机理为________。 29．（2026·福建·模拟预测）研究发现，某种深海嗜热菌产生的TaqDNA聚合酶（T酶）具有极高的热稳定性，远优于常规来源的同类酶。有人设想通过基因工程技术将该嗜热菌的T基因转入大肠杆菌，以实现T酶大规模生产，其主要技术流程如图1所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 NdeI EcoRI HindIII SalI （1）从嗜热菌中提取总DNA，采用PCR技术对T基因进行扩增。PCR反应体系中需添加的物质有缓冲液、_______（答出两点）、dNTP和引物等。PCR反应中引物的设计非常关键，据图表分析，扩增T基因时可供选择的两对引物是_______和_______（填选项）。 A.引物Ⅰ：……GGGAATTC……引物Ⅱ：……CTCATATG…… B.引物Ⅰ：……GAATTCCC……引物Ⅱ：……CATATGAG…… C.引物Ⅰ：……GGAAGCTT……引物Ⅱ：……AAGCTTCC…… D.引物Ⅰ：……CTCATATG……引物Ⅱ：……AAGCTTAAGCTT…… （2）图1质粒中的结构①是_______，其主要作用是_______。用质粒和T基因构建重组质粒，应选用_______两种限制酶进行切割。为了筛选出转入了质粒的受体菌，应在筛选培养基中添加_______。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌时，常先用Ca2⁺处理细胞，其目的是_______。T基因导入大肠杆菌后，若要检测该基因在大肠杆菌细胞中是否成功表达，常用的分子检测方法是_______。 （4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为进一步提高T酶的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第_______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_______。 30．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）副猪格拉瑟菌（GPS）是定植于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶（OppA）具有良好的免疫原性。为增加OppA 基因表达量，研究人员利用质粒和外源片段、强启动子构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA 基因如图所示。请回答下列问题： （1）构建OppA基因过表达载体时，应该选择___________这两种限制酶切割质粒。 （2）已知OppA基因的甲链为编码链（与模板链互补的DNA链），图中OppA基因的转录方向是___________（填“从左往右”或“从右往左”）。据图分析，利用PCR 扩增OppA基因时所需的引物组合是___________，PCR连续循环5次时，共需要引物___________个。 （3）为便于与质粒连接，需对引物进行特殊处理，在其中一种引物的5'端需添加___________识别序列和强启动子，另一种引物的5'端需添加___________识别序列。已知OppA基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3'，请写出OppA基因上游引物的15个碱基序列：5'-_________-3'。 （4）为了筛选出正确串联了强启动子、OppA基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型b和d加入的抗生素分别是___________、___________，得到 M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示（+ 表示生长，一表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是___________（填“M”“N”或“O”）类。 平板类型 菌落类型 M N O a．无抗生素 + + + b． 一 + + c．氨苄青霉素 一 + 一 d． 一 + 一 31．（2026·福建闽侯一中·模拟预测）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 32．（2026·厦门外国语学校·模拟预测）利用RNAi技术（RNA干扰）可以抑制细胞内特定基因表达。研究者选择MS26基因中的一段序列（rMS26），以PMI作为筛选标记，最终构建玉米植物重组表达载体MS26RNAi，转入到玉米幼胚中，通过植物组织培养后获得目的植株。 （注：PMI是酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因，该酶能将6—磷酸甘露糖转化为6—磷酸果糖，从而使生物体能够利用甘露糖作为碳源） 请分析回答以下问题： （1）提取玉米MS26基因形成的RNA，使用_________法合成cDNA，选择其中的一段序列rMS26用于构建RNAi载体。 （2）常用的标记基因主要是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，已经引起了社会的广泛争议。用PMI做标记基因的目的是为了_________，可转入含_________的选择培养基中实现，其优点是_________。 （3）RNAi载体结构中有一段正向和反向的rMS26，其直接目的是：_________，请据图1分析MS26基因沉默的原理：_________。 （4）T—DNA插入玉米的位置是随机的，当其插入基因内部时导致_________，这是获得植物突变体的一种重要方法。若进一步确定T—DNA是否插入MS26基因中，某同学尝试采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T—DNA的特异引物，如图2所示。（说明：两端的引物本身长度小于0．1kb，而T—DNA本身的长度约为17kb，插入基因后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。）请根据下表中三种样品的预期电泳结果判断哪个是纯合突变体_________，理由是_______________。 引物种类样品序号 LP+RP BP+RP 样品1 有大片段 无 样品2 有大片段 有小片段 样品3 无 有小片段 33．（2026·福建福州·二模）四硫酸盐（TTR）是肠道炎症的特异性标志物，将大肠杆菌P1改造为P3菌株，以感知并报告TTR信号，可实现对肠道疾病的无损检测。回答下列问题。 （1）构建融合基因 ①在改造载体2的过程中，研究人员通过PCR技术分别扩增pBCA启动子和cro基因，PCR反应体系中，除模板、引物，还需加入__________________（写出2点）。 ②利用PCR将pBCA启动子与cro基因进行拼接，需要对下图引物______进行设计，使其______端的序列能够互补。 （2）筛选重组菌株P3 将转化后的P3菌液涂布在培养基上进行筛选，该培养基的成分除碳源、氮源、无机盐、水、琼脂等外，还需添加______。依据菌落颜色可筛选出目标菌株的生理机制是______________________。 （3）验证P3对肠道炎症特异性检测的功能 研究人员构建肠道炎症模型小鼠并设计实验如下： ①实验分组： 甲组：__________________。 乙组：肠道炎症模型小鼠+接种P2菌株 丙组：__________________________。 ②在相同且适宜条件下饲养，定期收集粪便样本，检测粪便菌落中蓝白比例的高低。 ③预期实验结果__________________。 34．（2026·福建福州·模拟预测）拟南芥开花受光照和FT基因调控，FT基因在叶中表达，在茎尖不表达。有假说认为，光照刺激拟南芥叶片中表达FTmRNA，FTmRNA运输到茎尖，促进茎尖的花芽分化。为检验该假说，科研人员运用pGreen质粒构建反义FT基因的表达载体，导入拟南芥开展实验。反义FT基因表达得到的小分子RNA会特异性结合FTmRNA并使其降解。回答下列问题： 注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。 （1）pGreen质粒结构及两种限制酶的识别序列如图所示。 ①PCR扩增反义FT基因时，需在引物的____（填“5’端”或“3’端”）添加限制酶识别序列。 ②反义FT基因需插入两个酶切位点之间，下列选项中，符合反义基因序列（阴影部分）及两端限制酶切位点的是：____（单选）。 A 5’-GAATTCTTGG………GGCCGGATCC-3’ 3’-CTTAAGAACC………CCGGCCTAGG-5’ B 5’-GGATCCTTGG………GGCCGAATTC-3’ 3’-CCTAGGAACC………CCGGCTTAAG-5’ C 5’-CTCGAGGGCC………CCAAGGATCC-3’ 3’-GAGCTCCCGG………GGTTCCTAGG-5’ D 5’-CTCGAGGGCC………CCAAGAATTC-3’ 3’-GAGCTCCCGG………GGTTCTTAAG-5’ A.A    B.B    C.C   D.D ③为获得含重组表达载体的拟南芥细胞，在添加了X–gal等成分的培养基上培养，应挑选____的颜色植物细胞进行后续研究。 （2）已知启动子有组成型启动子（可驱动基因在全身组织表达）和组织特异性启动子（仅驱动基因在不同组织中定向表达）。科研人员利用不同类型启动子进行载体改造，设置以下组别： A组：野生型拟南芥； B组：FT基因完全失活的突变体； C组：含组成型启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥； D组：________________； E组：________________。 ①完善实验分组。 ②已知A组正常开花，B、C组延迟开花。预期D、E组结果为____________，则否定该假说。 35．（2026·福建泉州·二模）自然杀伤细胞（NK）是免疫细胞，能非特异性识别肿瘤细胞。为探究NK细胞表面CD226分子在小鼠溃疡性结肠炎中的作用，研究人员利用Cre-loxP系统敲除NK细胞上的CD226分子，获得NK特异性CD226基因敲除鼠。 （1）Cre-loxP系统由loxP序列和Cre酶两部分组成。loxP是一段具有方向性的特殊碱基序列，而Cre酶可识别DNA分子中loxP序列，当DNA上存在两个同向loxP序列时，Cre酶可将两个loxP序列之间的DNA序列剪除，并促使切口重新连接，其中重组形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的（图1）。Cre酶起到类似____（填“限制酶”“DNA连接酶”或“限制酶和DNA连接酶”）的作用，对DNA序列中的____键发挥作用。 （2）利用Cre-loxP系统在小鼠体内实现对CD226基因的敲除，首先需要建立Cre和Flox两种小鼠（图2）。 注：1.NCR1是一种主要在NK细胞表达的细胞膜上的免疫受体。 38.NCR1+Cre是指将Cre基因插入NCR1中。 39.Cre/+是指两条同源染色体中的一条具有Cre基因，另一条+为野生型。 40.f/f是指两条同源染色体都带有Loxp序列。 ①NK细胞由____细胞分化而来，属于机体抵御病原体攻击的第____道防线。 ②将Cre基因插入NCR1中的目的是____。 ③上述两只小鼠杂交，获得的F1（Cre/+，f/+）与Flox小鼠（+/+，f/f）杂交，子代通过基因型鉴定，筛选出基因型为____（填选项）的小鼠即为NK特异性CD226基因敲除鼠。 ACre/+，f/+    B.Cre/+，f/f    C.+/+，f/+    D.+/+，f/f （3）Cre-loxP系统还能实现基因在特定的组织细胞中表达。利用下列元件构建一个在NK细胞中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cre-loxP系统，完善下图___。 36．（2026·厦门双十中学·模拟预测）人肺特异性X蛋白（LUNX）基因是某种肺癌诊断的标志物，增强子是基因转录的调控序列，对启动子具有促进作用。为了研究LUNX基因的增强子发挥作用的最佳位置是位于启动子的上游还是下游，科研人员从人类全基因组序列数据库中筛选并扩增了3个LUNX基因增强子片段（En，表示E1~E3），分别将每个En片段定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因（luc+）启动子（SV40启动子）的上游或SV40终止序列的下游，通过检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断。luc+的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。相关信息见下图，回答下列问题。 （1）PCR每次循环一般可以分为_______三步。在上述实验的PCR反应体系中共需要设计_______种引物；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5'端需要引入的限制性酶切位点有_______种。 （2）将以上获得的En经酶切后分别定向连接到用对应限制酶处理的pGL3载体中，构建重组载体，利用相关实验技术对荧光素酶活性进行检测，结果如图所示。 ①根据结果得出的结论是_______。 ②据图判断，对luc+表达促进作用最大的增强子的引物5'端需添加_______限制酶的识别序列。 （3）半夏蛋白具有抗肿瘤等作用，科研人员提取半夏块根细胞中总RNA，纯化获得mRNA，后在逆转录酶的作用下获得不同大小片段的半夏蛋白cDNA。构建高效表达半夏蛋白的重组质粒是利用基因工程实现大规模生产半夏蛋白的核心工作，人员甲设想如下：根据实验室现有质粒A的限制酶识别位点，在E1增强子引物的5'端添加相应的限制酶识别序列，以此为引物，进行PCR扩增，得到足够数量的半夏蛋白cDNA，再与质粒A拼接，从而获得高效表达半夏蛋白的重组质粒，再进行后续实验。按此设想，甲进行了PCR、电泳操作，结果无相应条带出现，判断是扩增失败了。经检查，PCR所用的缓冲液、dNTP、Taq酶均正常，PCR操作程序正确，请分析扩增失败原因并提出改进措施： ①失败原因：_______。 ②改进措施：_______。 37．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）生物制造是推动我国高质量发展的重要新质生产力。2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）是一种具有改善肠道健康等功能的婴儿配方食品成分。我国科学家通过基因工程技术动态调节枯草芽孢杆菌的代谢过程，提高2′-FL的产量。 回答下列问题： （1）已知futC和pfkA分别是2′-FL合成和菌体生长的关键基因（下图）。研究人员构建了持续高表达futC基因的枯草芽孢杆菌并进行发酵实验，结果显示2′-FL产量较低，推测原因很可能是___________。因此，理想的合成过程为：前期两种基因的表达状态是___________，待菌体数量达到一定值后两种基因的表达正好相反，从而实现2′-FL的高产。 注：枯草芽孢杆菌本身不含futC基因，需外源导入。 （2）为了实现2′-FL的高产，研究人员利用温度作为“开关”来动态调控相关代谢基因的表达，并由此构建了质粒1和质粒2（下图），利用荧光蛋白基因进行功能测试。 ①构建质粒1的目的是实现基因的温控激活。在30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，使RNA聚合酶无法结合到该区域；37℃时，C蛋白失活下游基因启动表达。若在测试过程中观察到___________，说明质粒1构建成功。 ②质粒2的CRISPRi系统中，人工设计的crRNA（一种RNA分子）可通过碱基互补配对识别靶基因，引导dCpfl蛋白结合并抑制靶基因转录。利用由启动子P2驱动的红色荧光蛋白基因测试质粒2的功能。上图中P1和P2应分别为___________型启动子。若在测试过程中观察到___________，说明质粒2构建成功。 （3）在实际2′-FL的生产中，需要将测试完成的质粒1和质粒2中的基因进行替换，质粒1中将绿色荧光蛋白基因替换为___________，质粒2中将___________。 38．（2026·漳浦第一中学·一模）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 （1）大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子是_________的部位，驱动基因转录出mRNA。细胞中氨基酸在_________中以该mRNA为模板合成苏氨酸合成酶。 （2）当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。分别利用三种具有持续表达活性的启动子和A基因、红色荧光蛋白（RFP）基因构建表达载体并导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图。 ①该实验的目的是_________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是_________。 （3）W-01菌株具有更高的苏氨酸产量，但其生长明显弱于菌株W和其他工程菌，从物质与能量的角度，推测原因是_________。 （4）大肠杆菌拟核中有一个环状DNA分子，其上的F基因是调控细胞分裂的主要基因，当其表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，这种菌株细胞体积和细胞内基因表达产物增加。综合利用上述信息，设计一个插入W-01菌株F基因启动子与编码区之间的表达元件（如图），制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，且该工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长①_________②_________③_________。 39．（2026·福建莆田·二模）多种霉菌能产生T-2毒素污染饲料，引起家猪中毒。我国科学家将C3A酶基因导入家猪受精卵内，获得肝脏细胞具有降解T-2毒素能力的转基因家猪。C3A酶含有R和Q两个功能区，质粒、C3A酶基因及两个功能区对应序列的相关结构如图1所示。 （1）科研人员在对C3A基因扩增时选用的A、B两端引物分别是_______。为保证目的基因与载体正确连接，应在A、B两端分别添加限制酶_______的识别序列。 （2）要实现目的基因仅在家猪的肝脏细胞中表达，应将其与_______等调控元件重组在一起。将基因表达载体导入受精卵后在含_______的培养液中培养，能存活的细胞即为含有基因表达载体的受精卵。 （3）成功培育的转基因家猪对T-2毒素的降解效果不佳。研究发现，家猪体内PM蛋白能抑制C3A酶活性，影响解毒效果。为了探究PM蛋白作用机理，科研人员扩增了3种不同长度的C3A基因片段（图2），并将其分别插入带有FLAG标签序列的质粒中，构建了3种含融合基因的质粒：F-C（Full）、F-C（RΔ）、F-C（QΔ），分别转染受体细胞并表达。收集3种融合蛋白并将其与PM蛋白按照图3的组合方式分成4组实验，分组流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质再用PM抗体检测，结果如图3所示。 ①分析：对照组Ⅰ的作用是说明PM蛋白不与_______结合。 ②结论：PM是通过与C3A酶的_______（填“R”或“Q”或“R和Q”）功能区的结合来抑制C3A酶的活性。 ③除了开发能降解PM蛋白的药物外，请基于上述实验结论，为提高家猪解毒能力提出一条新的药物研发思路：_______。 40．（2026·福建漳州·模拟预测）科研人员研发出一套基于近红外光的光控开关系统-NIR系统，该系统由近红外光响应调控元件和目的基因调控元件组成，可实现对目的基因表达的精准调控。回答下列问题： （1）已知转座子质粒上的转座片段能被转座酶切割并整合到受体菌的基因组中。利用转座酶和图1所示的转座子质粒，将近红外光响应调控元件整合到沙门氏菌拟核中。 ①据图1分析，构建基因表达载体时，利用PCR技术扩增近红外光响应调控元件时，应在引物两端添加_______限制酶识别序列。延伸温度下发生的扩增过程是_______。 ②将转化后的沙门氏菌液稀释涂布在无抗生素平板上培养。在此基础上，进一步筛选目的沙门氏菌的实验思路是_______。 （2）M基因编码的M蛋白是一种转录激活因子，与c-di-GMP结合能激活特定的启动子。为实现近红外光对目的基因表达的精准控制，构建图2所示的NIR系统时，P基因和B基因选用可持续驱动基因表达启动子，目的基因应选用的启动子为：_______。 （3）NIR系统的目的基因为荧光素酶基因时，用710nm近红外光进行处理，检测结果如图3和图4所示。 ①结合图推测，黑暗时发光强度近为零的原因是______________。 ②结果表明，NIR系统要发挥好的效果应选用______________处理。 41．（2026·福建漳州·模拟预测）H蛋白在各类细胞中广泛存在，对免疫功能具有促进作用，但正常情况下表达水平较低。研究人员将乙肝病毒B抗原基因与质粒D结合为重组质粒DB，研发了乙肝DNA疫苗；进一步利用H基因对乙肝DNA疫苗进行改造，开展了一系列实验。回答下列问题： 限制酶 识别序列 Sph I 5′-GCATG↓C-3′ BamH I 5′-G↓GATCC-3′ Pst I 5′-CTGCA↓G-3′ EcoR I 5′-G↓AATTC-3′ Xho I 5′-C↓TCGAG-3′ Nde I 5′-CA↓TATG-3′ 注：①引物横线处为限制酶识别序列②识别序列箭头处为切割位点 （1）研究人员设计了特异性引物，用PCR技术从结核杆菌中获取H基因。在__________的催化下，子链从引物的________（填“3'端”或“5'端”）延伸。 （2）PCR合成的子链末端会多出一个腺嘌呤核苷酸（A）。根据这个特点，研究人员设计一种3'端各多出一个胸腺嘧啶核苷酸（T）的线性载体P，将其与PCR扩增的H基因混合构建重组质粒PH，并导入大肠杆菌进行扩增。与常规操作相比，该方法能快速构建表达载体的原因是无需用___________酶处理载体和目的基因。通过该方法得到的重组质粒至少有两种，原因是_________。 （3）质粒D能在真核细胞中表达，用________（填限制酶）对重组质粒PH中的H基因和质粒D进行处理，构建重组质粒DH。为检测H基因表达情况，将小鼠细胞分三组进行实验，培养一段时间后提取蛋白质进行电泳，结果如下图。 注：①组导入重组质粒DH，②组导入质粒D，③组不处理；β-actin蛋白在真核细胞中表达相对恒定，蛋白质电泳实验中常以它为参照 从结果判断导入小鼠细胞后重组质粒PH中的H基因_____________（填“能”或“不能”）正常表达，判断依据是___________。 （4）为探究H蛋白在细胞中同步表达时对乙肝DNA疫苗激发特异性免疫的影响，研究人员选择三种不同质粒分别注射入三组小鼠体内，定期检测抗体水平进行验证。其中空白对照组注射质粒D，另两组应选择质粒____________。 42．（2026·福建三明·二模）隐花色素（CRY2）是植物中普遍存在的蓝光受体，广泛参与植物的生长和发育过程。研究团队利用某种植物的野生型植株（WT）和CRY2缺陷型植株，探究CRY2对根长的影响，结果如图1所示。 （1）光作为一种________，影响、调控植物生长发育的全过程。据图分析，在黑暗条件下，CRY2可以抑制根的生长，而蓝光可以________（填“增强”或“解除”）这一抑制作用。 （2）研究发现，黑暗中无活性的CRY2通过与FLs蛋白结合，降低FLs蛋白与染色质的结合，从而降低与细胞分裂相关基因的表达，抑制根系发育。 为验证这一机制研究团队利用质粒1、2构建重组质粒导入某营养缺陷型酵母菌等进行以下实验： ①利用图2中质粒1和________构建重组质粒1，使其能指导合成FLs-AD重组蛋白。 ②构建含BD和CRY2蛋白融合基因的重组质粒2：为使CRY2基因能够正确地插入质粒2，如图2所示，利用PCR技术扩增CRY2基因时两端应该引入________酶切位点（4种限制酶产生的末端不同）。 ③将上述步骤构建的重组质粒侵染图3的营养缺陷型酵母菌（不能合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤）后接种在不同类型的平板上，并观察菌落出现情况，结果如表所示。 组别 平板类型 酵母菌菌落 甲组 不含色氨酸 有 乙组 不含亮氨酸 有 丙组 不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤 有 该实验结果验证了上述机制，请结合图表分析原因：________。 ④在上述实验的基础上，用蓝光照射甲、乙、丙组的平板，观察菌落的生长情况，若________，则证明蓝光条件下CRY2与FLs的结合可被解除。 43．（2026·福建龙岩·二模）TOC1是起源最古老的生物钟核心基因之一，为研究TOC1基因的调控转录机制，研究人员开展了以下实验，回答下列问题： （1）利用PCR技术获取与扩增TOC1基因，构建基因文库： ①PCR反应体系中除加入模板、四种脱氧核苷酸、扩增缓冲液外，还需加入______，若复性温度过高，会引起______的现象，从而降低扩增效率。 ②将PCR获得的基因片段与______连接起来导入大肠杆菌中保存备用。 （2）研究两种蛋白质（如X和Y）能否相互作用常用酵母双杂交技术。酵母菌的某种转录激活因子是一种复合蛋白，由DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）两个独立结构域构成，X和Y能相互作用时，BD和AD在空间上才能靠近，形成完整的转录激活因子，激活酵母菌报告基因的转录（图1）。已知53蛋白与T蛋白能够相互作用，从而启动酵母体系中某报告基因表达，合成组氨酸并导致菌落显蓝色。一种观点认为：TOC1蛋白也需要与某种蛋白结合后再激活基因表达。针对该观点，科研人员进行相关研究，请回答： ①为构建重组质粒，据图2分析，PCR获取TOC1基因时需在上游引物和下游引物的5'端分别添加限制酶______和______的识别序列。 ②构建人工质粒：pBD-TOC1、pBD-53、pAD-T、pBD-Lam、pAD，5种质粒均能正常表达相应蛋白产物，其中Lam蛋白不能与T蛋白结合，酵母细胞中其它蛋白与报告基因激活过程无关。科研人员进行相关实验，利用筛选平板（缺少组氨酸）进行培养观察，实验处理及结果如下表所示。 实验分组 质粒组合 菌落生长情况及显色情况 实验结论 阳性对照组 pBD-53、pAD-T 正常生长，菌落呈蓝色 报告基因激活 阴性对照组 pBD-Lam、pAD-T 无菌落生长 报告基因未激活 待测组 pBD-TOC1、pAD 正常生长，菌落呈蓝色 ？ 分析表中内容，推测待测组中报告基因_______（填“激活”或“未激活”），结合结论说明你赞同或反对观点“TOC1蛋白也需要与某种蛋白结合后再激活基因表达”的理由：_______。 44．（2026·福建厦门双十中学·模拟预测）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 （1）图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5′-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3′，为构建融合基因，需去除OsJRL40基因上________，引物2的前10个碱基序列为________。（用字母） A．5′-AGATCTCTAG-3′ B．5′-AGATCTGTCA-3′ C．5′-GATCCTAGTC-3′ D．5′-GATCGTCAGC-3′ （2）在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5′端”或“3′端”）添加loxP序列。 （3）为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 45．（2026·福建厦门一中·一模）溶细胞素A（ClyA）与细胞膜接触时可形成跨膜孔道，直接导致靶细胞裂解。研究者拟利用该原理使结肠癌细胞裂解死亡，为结肠癌的治疗提供新策略。回答下列问题： （1）大肠杆菌（EcN）能适应肿瘤组织低氧、酸性微环境，并在肿瘤组织内定植。研究者尝试利用大肠杆菌实现ClyA的靶向递送。 ①从能表达ClyA的细胞中提取_______，再经RT-PCR（逆转录PCR）获得ClyA基因序列，此序列不包含_______。（写出两点） ②设计如图1所示的乳酸感应模块（gfp为绿色荧光蛋白基因），导入大肠杆菌，获得可合成ClyA的工程菌E1。当乳酸存在时，_______，E1发出绿色荧光。 ③将E1置于含不同浓度乳酸的培养液中（10 mM为模拟肿瘤环境），一段时间后测定其荧光强度，结果如图2。该实验的目的是______。 ④对E1进行升级改造，通过导入信号转导模块使其可吸收近红外光并转化为热能，快速升高局部温度。在此基础上，研究者又构建一个基因表达载体，与图1所示载体共同导入，以实现ClyA蛋白仅在近红外光照射的肿瘤部位释放。请根据示例，选择合适的启动子和基因构建该基因表达载体________。 备选启动子：启动子J、启动子R、启动子P 备选基因：TcI基因、Mel裂解肽基因、LldR基因 （注：温度升高可使TcI蛋白失去抑制启动子P的能力；Mel裂解肽可使细菌裂解） 示例： （2）采用升级改造后的工程菌治疗结肠癌的优势为：可精准调控ClyA在结肠癌细胞处释放，_______。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 福建考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025福建（1题） · 情境设置：以质粒和多种限制酶切位点为载体，创设核酸操作情境。 · 考查重点：限制酶识别位点、切割结果、DNA片段数及载体构建。 · 命题趋势：由单纯识记转向结合图示和限制酶切图谱进行推理。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026福建（1题）、2025福建（1题） · 情境设置：联系植物病害诊断、药用植物代谢产物合成等实际问题。 · 考查重点：PCR检测原理、引物与模板作用及基因导入、表达等程序。 · 命题趋势：突出技术应用，强调实验流程分析与结果判定的综合能力。 考点3 基因工程综合 2025福建（1题）、2024福建（1题）、2023福建（1题）、2021福建（1题） · 情境设置：覆盖基因敲除、植物性状改良、抗病毒和重金属处理。 · 考查重点：载体构建、目的基因表达、基因编辑原理及实验验证。 · 命题趋势：强化多技术融合，突出从基因功能到性状表现的因果分析。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2025·福建·高考真题）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（    ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 【答案】C 【解析】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（    ） A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 【答案】A 【解析】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化前，需要将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态，A错误； B、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA中，因此紫杉醇合成的相关基因会随T-DNA整合到烟草染色体DNA上，B正确； C、紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌作用，C正确； D、利用转基因技术生产紫杉醇前体，可减少对天然红豆杉的依赖，有利于保护其资源，D正确。 故选A。 2．（2026·福建·高考真题）非洲芋常遭受致病菌P感染，导致植株根系腐烂，造成大幅减产。致病菌的早期鉴定有利于植物病害的防治。回答下列问题： （1）使用_______法分离非洲芋根系的微生物，根据菌落的形态和致病性挑取P菌进行纯培养。在纯培养过程中发现，培养基平板上存在形态不同的菌落，可能的原因有_______（填序号）。 A．放置了一段时间的培养基灭菌后再使用 B．倒平板时，拔出锥形瓶棉塞后，没有将瓶口通过火焰 C．为避免烫伤，在远离酒精灯火焰的地方倒平板 D．使用酒精灯短暂灼烧接种环 E．接种环蘸取菌液时不小心碰到了试管的内壁 （2）致病菌P是非致病菌P′的突变菌，两者形态高度相似。对两种菌进行测序，序列比对后发现，致病菌P在图1所示的DNA片段中有一个碱基对发生了替换，产生了Aar Ⅰ限制酶的识别序列。可用PCR联合限制酶酶切快速鉴定致病菌P，方法如下： ①采集非洲芋根系表面的菌，利用PCR扩增待鉴定片段。若仅用一对引物，应选用图1的引物_______。将上述PCR产物直接进行电泳，无法鉴定非洲芋是否受到致病菌P感染，理由是_________________。 ②用Aar Ⅰ限制酶对上述PCR产物完全酶切后进行电泳，其中5个样本电泳结果如图2。推测被致病菌P感染的非洲芋是_______号样本。分析3号样本呈现3条带的原因是_________________。 【答案】（1）平板划线/稀释涂布平板 BCD （2）3、4 以P菌和P′菌DNA为模板扩增的产物大小相同，电泳无法区分 3、5 样本中同时含有P菌和P′菌 【解析】（1）采用平板划线法或稀释涂布平板法可以将聚集的菌种分离得到单菌落，用于后续挑取目标菌纯培养。 A、放置了一段时间的培养基灭菌后所有微生物都会被杀死，培养基没有杂菌污染，不会长出杂菌菌落，A不符合题意； B、倒平板时，拔出锥形瓶棉塞后，没有将瓶口通过火焰，瓶口的杂菌可能会落入培养基造成污染，产生不同形态菌落，B符合题意； C、为避免烫伤，在远离酒精灯火焰的地方倒平板，周围空气的杂菌易落入培养基引发污染，C符合题意； D、使用酒精灯短暂灼烧接种环，接种环灭菌不彻底，无法彻底杀灭环上的所有微生物，接种环接种时，残留杂菌会在平板上生长出不同菌落，D符合题意； E、接种环蘸取菌液时不小心碰到了试管的内壁，由于试管内壁并没有杂菌，所以接种环没有被杂菌污染，E不符合题意。 （2）①与P′相比，致病菌P的DNA片段中只有一个碱基对发生了替换，采集非洲芋根系表面的菌，选择一对引物利用PCR扩增待鉴定片段，根据引物延伸的方向为5'-3'，且要将待鉴定片段扩增出来，须使扩增产物包含AarⅠ限制酶的识别序列，故应选择位于待鉴定片段两侧、能将含该位点的片段扩增出来的引物3和引物4。琼脂糖凝胶电泳能区分不同大小的PCR产物，但以P菌和P'菌DNA为模板扩增的产物大小相同，电泳无法区分。 ②P菌的DNA为模板扩增的产物含有1个AarⅠ限制酶的识别序列，而P'菌的DNA为模板扩增的产物没有该识别序列，用AarⅠ限制酶对P菌的DNA扩增产物完全酶切后进行电泳，应含有2个条带，而P'菌的DNA扩增产物不被切割，电泳后仅含一个条带，因此推测被致病菌P感染的非洲芋是3、5号样本；3号样本呈现3条带的原因是样本中同时含有P菌和P'菌。 考点3 基因工程综合 1．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： （1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素_____的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是_____色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 （2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子_____对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子_____用于该系统。 （3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌_____（填选项）。 A．含质粒1和质粒2   B．只含质粒1   C．只含质粒2    D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：_____。 【答案】（1）卡那霉素和四环素 白 （2）C A （3）B 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因（LacZ基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 （2）Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。 （3）①质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，ACD错误。 故选B。 ②试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。 2．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （2）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是______。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是______。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用______限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其______。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是______。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是______。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是______。 【答案】（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ （3）超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 （4）排除PCR体系中外源DNA的污染 （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【解析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 （1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 3．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY基因的转基因菊花。重组Ti质粒的部分信息及实验流程如图1所示。启动子均为真核细胞启动子。 一、将重组Ti质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY转基因菊花。 （1）根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选____，步骤①培养过程一般____（填“需要”或“不需要”）光照，流程图中的Ⅰ是____。 （2）通过调整过程②和③中____的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY转基因菊花。 （3）以____为模板、选用与LFY基因特异性结合的引物，利用PCR技术鉴定菊花细胞是否存在LFY基因。再选用____技术检测转基因菊花的LFY蛋白的表达水平，进一步筛选LFY转基因菊花。 二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA的Ti质粒（如图2）培养转基因植物。 （4）已知Ti质粒携带双T-DNA时，每个T-DNA都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA上。请设计培育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY转基因菊花____。（写出实验思路即可） 【答案】（1）转入LFY基因的菊花细胞 不需要 愈伤组织 （2）生长素和细胞分裂素 （3）菊花染色体DNA 抗原-抗体杂交 （4）将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达LFY的转基因菊花 【解析】1、基因工程的基本工具：分子手术刀”是指限制性核酸内切酶（限制酶）、“分子缝合针”是指DNA连接酶、“分子运输车”是指载体。 1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 2、标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 1、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 （1）重组质粒中含有潮霉素抗性基因，能表达出潮霉素抗性物质，故本实验中潮霉素的作用是筛选转入LFY基因的菊花细胞。步骤①为脱分化形成愈伤组织过程，一般不需要光照，图中Ⅰ为愈伤组织。 （2）步骤②和步骤③为再分化形成根和芽的过程，愈伤组织分化的方向与生长素和细胞分裂素的浓度和比例有关，故调整步骤②和步骤③培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例可诱导菊花芽或根的形成。 （3）利用农杆菌转化法转化时，其LFY基因与菊花染色体DNA进行了重组，故以菊花染色体DNA为模板，选用LFY基因特异性引物，用PCR检测LFY基因是否导入菊花细胞中。检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。因此，可用抗原-抗体杂交方法检测转基因菊花中LFY蛋白的表达水平，进一步筛选转基因菊花。 （4）将两个Ti质粒存在双T-DNA独立整合进植物细胞染色体DNA中制备转基因菊花，最后根据是否表达LFY来筛选转基因菊花。具体方案为：将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达LFY的转基因菊花。 4．（2021·福建·高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： （1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。 （2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 （3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。 【答案】（1）引物1和引物4 （2）EcoRV T4DNA 启动子 终止子 XhoI和PstI 钙 （3）尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 【解析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。 1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。 （2）①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xho I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E·coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoI和PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。 （3）由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。 【点睛】本题考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是分析题图，明确基因工程的工具，并根据限制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列，结合题意明确检测基因表达载体的方法。 1．（2026·福建厦门双十中学·模拟预测）2024年大卫·贝克等三位科学家因利用AI精准预测蛋白质的结构，推动蛋白质结构研究取得革命性进展，共同获得了诺贝尔化学奖。AI蛋白质的合成是蛋白质工程在人工智能时代的技术延伸。下列叙述错误的是（　　） A．AI蛋白在设计前需要先明确其功能需求 B．利用AI能设计出自然界不存在的蛋白质 C．AI蛋白的最终获得不需要经过基因工程 D．AI蛋白的功能需进行实验验证才能确定 【答案】C 【解析】A、蛋白质工程的基本流程是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），所以 AI 蛋白在设计前需要先明确其功能需求，A正确； B、利用 AI 进行蛋白质设计属于蛋白质工程范畴，蛋白质工程可以设计出自然界不存在的蛋白质，B正确； C、AI 蛋白的合成需要以基因工程为基础，因为最终要通过基因的表达（转录和翻译 ）来合成蛋白质，需要构建基因表达载体，导入受体细胞等基因工程操作，C错误； D、AI 设计出的蛋白功能需要进行实验验证（如体外活性检测、体内功能验证等 ）才能确定是否符合预期，不能仅依赖理论模型，D正确。 故选C。 2．（2026·福建泉州·二模）数字PCR技术称为第三代PCR，可对样本中的目标DNA进行精确计数。该技术通过将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含0-1个拷贝的目标DNA，在每个单元中分别对目标DNA进行PCR扩增，扩增结束后对每个单元的荧光信号进行分析，计算出稀释前初始样本中目标DNA的拷贝数。下列说法错误的是（　　） A．数字PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制 B．数字PCR技术更适用于样本中目标DNA含量高的材料 C．每个反应单元中目标DNA两条子链均从5′向3′延伸 D．每个反应单元中加入的酶是耐高温的DNA聚合酶 【答案】B 【解析】A、数字PCR技术基于PCR扩增，其原理是DNA的半保留复制，通过变性、复性、延伸循环复制目标DNA，A正确； B、数字PCR通过高度稀释将样本分配到独立单元，适用于低含量目标DNA的精确计数，若目标DNA含量过高，稀释后多数单元仍含多个拷贝，反而降低计数准确性，B错误； C、PCR扩增时，DNA聚合酶催化子链合成方向始终为5′→3′，每个反应单元中目标DNA的延伸符合此规律，C正确； D、PCR需在高温（约95℃）下变性DNA，因此每个反应单元必须加入耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），D正确。 故选B。 3．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）人工智能（AI）正在深刻改变疾病诊断与治疗的方式。下列关于AI应用的叙述，错误的是（    ） A．分析氨基酸序列，预测蛋白质空间结构，推断其功能 B．识别细胞的形态特征，区分正常细胞与癌细胞 C．分析家族与人群数据库，评估子代患遗传病的概率 D．分析细菌基因组序列，精确预测其产生耐药突变的时间和位点 【答案】D 【解析】A、蛋白质的结构由氨基酸序列决定，且结构决定功能，AI可通过分析氨基酸序列预测蛋白质空间结构，进而推断其功能，A正确； B、癌细胞与正常细胞的形态特征存在明显差异（如癌细胞通常形态不规则、失去正常细胞的固定形态），AI可通过图像识别等技术区分二者，B正确； C、通过分析家族遗传病史、人群遗传病相关基因频率等数据库，结合遗传规律可评估子代患遗传病的概率，AI对大数据的处理能力可提升该过程的效率和准确性、C正确； D、基因突变具有随机性、不定向性的特点，无法精确预测突变发生的时间和位点，即使分析细菌基因组序列也不能实现该目的，D错误。 4．（2027·福建漳州·一模）正常条件下，高粱抗旱基因启动子区域发生甲基化修饰，抑制该基因表达；干旱胁迫时，去甲基化酶特异性去除该区域甲基化修饰，使该基因得以表达，增强抗旱能力。下列叙述正确的是（     ） A．甲基化不改变基因的碱基序列，且不遗传给子代细胞 B．甲基化可能改变启动子结构，阻碍RNA 聚合酶与起始密码子结合 C．去甲基化酶特异性识别甲基化位点，体现了酶的高效性 D．高粱抗旱性状的差异，是基因与环境共同作用的结果 【答案】D 【解析】A、甲基化属于表观遗传修饰，不改变基因的碱基序列，但可通过细胞分裂遗传给子代细胞，A错误； B、启动子是DNA上RNA聚合酶识别结合的序列，而起始密码子位于mRNA上，是翻译的起始信号，二者结合的物质和位置不同，B错误； C、去甲基化酶特异性识别甲基化位点，体现的是酶的专一性，酶的高效性是指酶与无机催化剂相比降低活化能的作用更显著，C错误； D、正常条件下抗旱基因因甲基化被抑制表达，干旱胁迫下通过去甲基化使该基因表达以增强抗旱性，说明高粱抗旱性状的差异是基因与环境共同作用的结果，D正确。 5．（2026·福建闽侯一中·模拟预测）“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（　　） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 【答案】D 【解析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，在经过三次筛选：①筛选能够产生单一抗体的B淋巴细胞②筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）③筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。两次抗体检测：专一抗体检验阳性，获得能产生特异性抗体、又能大量增殖杂交瘤细胞。最后从培养液或小鼠腹水中提取单克隆抗体。 A、诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体有可能是白菜原生质体之间相互融合，或者就是白菜叶肉细胞原生质体，没有发生融合，A错误； B、用灭活的仙台病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，促进二者融合，而不是筛选杂交瘤细胞，B错误； C、培育耐盐转基因植株时，用特异性探针进行分子杂交显示出杂交带，表明植株含有目的基因，但不一定表达，所以不一定能筛选耐盐植株，C错误； D、SRY基因是哺乳动物Y染色体上具有决定雄性性别作用的基因片段，所以制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行SRY基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 ，D正确。 故选D。 6．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）生产中常用植酸酶来分解植酸。现需对植酸酶进行改造使其能够耐受食品生产时的高温环境。研究者利用计算机技术辅助蛋白质改造，筛选有潜力的突变位点，并最终生产出一种单一氨基酸改变的植酸酶MU，与原植酸酶WT相比，有如下变化。下列叙述错误的是（　　） 品种 半衰期（min） 与植酸分子的作用力 60℃ 80℃ 氢键数 离子键数 WT 15.35 0.98 2 7 MU 25.72 1.89 4 8 A．植酸酶特定氨基酸基团能够与植酸分子专一地结合，形成氢键或离子键 B．MU热稳定性比WT高，是因为氨基酸的改变引起了酶空间结构的改变 C．MU与植酸分子作用力增加，可以为植酸分子提供更多活化能 D．在将MU应用于生产前，还需要比较其与WT的酶活性 【答案】C 【解析】A、酶具有专一性，植酸酶的特定结合位点能与底物植酸专一性结合，由表格可知二者之间可形成氢键、离子键，A正确； B、MU在60℃、80℃下的半衰期均高于WT，说明MU热稳定性更高，MU是单一氨基酸替换的突变体，氨基酸种类改变会引起蛋白质空间结构改变，进而改变热稳定性，B正确； C、酶的作用机理是降低化学反应的活化能，无法为反应底物提供活化能，C错误； D、改造后的酶除热稳定性外，酶活性是影响生产应用的关键指标，因此应用前需要比较MU与WT的酶活性，D正确。 7．（2026·福建福州·二模）我国科学家研发了利用微球进行多重核酸检测的技术，每种微球只固定同一种引物对，形成独立的扩增空间，实现同一个PCR体系中多种微球对多种基因片段的同时扩增，进而检测多种病毒。下列叙述错误的是（　　） A．每个微球上的引物只与一种病毒的核酸结合 B．该反应体系需要根据引物的碱基序列调整延伸的温度 C．该技术可以降低不同种引物之间碱基互补配对 D．该技术还可应用于多基因遗传病检测 【答案】B 【解析】A、引物具有特异性，每个微球上的引物是针对一种病毒的特定核酸序列设计，仅能与该种病毒的互补核酸序列结合，A正确； B、PCR的延伸温度由所用耐高温DNA聚合酶（Taq酶）的最适温度决定，通常为72℃左右，引物的碱基序列仅影响退火（复性）步骤的温度，与延伸温度无关，B错误； C、不同引物对被固定在不同微球上，形成独立扩增空间，可降低不同种引物之间发生碱基互补配对、形成引物二聚体的概率，C正确； D、该技术可在同一PCR体系中同时扩增多种基因片段，因此可用于同时检测多基因遗传病相关的多个致病基因，D正确。 8．（2026·福建漳州·模拟预测）“黄金大米”是一种转基因水稻，通过转入外源基因（如crt Ⅰ）使大米胚乳富含β-胡萝卜素，该物质可在人体内转化为维生素A，对预防和改善维生素A缺乏病具有潜在价值。下列叙述正确的是（    ） A．用PCR扩增crt Ⅰ基因时需在反应体系中添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶 B．构建重组质粒时应选择Hind Ⅲ和Sal Ⅰ同时切割质粒和含crt Ⅰ的DNA片段 C．用抗原-抗体杂交技术检测相关蛋白质可确定crt Ⅰ基因在大米细胞中的表达 D．大米细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，可合成β-胡萝卜素 【答案】C 【解析】A、PCR 扩增目的基因时，Taq 酶（热稳定 DNA 聚合酶） 负责催化子链合成，但 PCR 过程中 DNA 双链的解开依赖高温变性（90℃以上），A错误； B、构建重组质粒时，需保证目的基因（crtI 基因）完整且质粒与目的基因的黏性末端能互补配对；结合图示，crtI 基因内部无 HindⅢ 切点，但 SalⅠ 和 HindⅢ 切割会导致目的基因与质粒连接时方向错误，所以不能选择Hind Ⅲ和Sal Ⅰ同时切割质粒和含crt Ⅰ的DNA片段，B错误； C、目的基因（crtI 基因）表达的产物是β- 胡萝卜素合成相关蛋白质，抗原 - 抗体杂交技术的核心是利用抗体特异性识别其对应的抗原（蛋白质）。若检测到杂交带，说明目的基因已成功表达出蛋白质，C正确； D、植物细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，细胞失去分化状态，成为高度液泡化的薄壁细胞，此时细胞不具备合成 β- 胡萝卜素的分化功能，D错误。 故选C。 9．（2026·福建泉州·二模）由vbp2基因编码的VBP蛋白参与T-DNA转运。为表征vbp2c启动子的转录活性，科研人员将vbp2启动子控制的vbp2基因替换为红色荧光蛋白基因（rfp基因），并转入根癌农杆菌中。为探究根癌农杆菌其他成分是否干扰荧光检测，将野生型菌与重组菌（含红色荧光蛋白RFP）的粗提液按不同比例混合，测定荧光强度，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A．用rfp基因替换vbp2基因时，需保证其插入方向与启动子正确匹配 B．每组实验混合前应保证两种粗提液的来源不变 C．实验结果说明粗提液中的其他成分对RFP荧光强度测定有显著干扰 D．实验结果表明重组菌RFP荧光强度能够表征vbp2启动子的转录活性 【答案】C 【解析】A、rfp基因替换vbp2基因时，为保证rfp基因的正确表达，需要正确插入启动子下游，A正确； B、实验需控制变量，粗提液来源应一致，B正确； C、随着重组菌粗提液比例增加，荧光强度线性增加，且过原点，说明野生型菌粗提液成分对RFP荧光强度测定无显著干扰，C错误； D、重组菌RFP可以产生红色荧光，且和vbp2启动子结合，所以荧光强度可反映vbp2启动子活性，D正确。 故选C。 10．（2026·厦门双十中学·模拟预测）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 【答案】D 【解析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 故选D。 11．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A．Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B．选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C．根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D．筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 【答案】C 【解析】A、Cas12a蛋白可对DNA位点进行剪切，而限制酶也是通过水解DNA上的磷酸二酯键来切割DNA分子的，所以Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用，A正确； B、由图a可知，导入了含有潮霉素抗性基因的重组质粒的稻瘟病菌能在含有潮霉素的培养基上存活，而BUF1基因功能正常时病菌为深色，功能不正常时为浅色，所以浅色菌落对应BUF1基因被编辑的目标菌株，因此选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株，B正确； C、编辑成功的菌株，PCR产物因插入潮霉素抗性基因而片段更长，电泳条带迁移距离更短（更靠上）。由图b可知，菌株1、3 的条带位置靠上，说明片段长，是插入了抗性基因的编辑成功产物；菌株 2 的条带位置靠下，说明片段更短，是未编辑的原始BUF1基因，C错误； D、目标菌株是致病性减弱的稻瘟病菌突变体，可用于培育抗稻瘟病水稻的研究，D正确。 12．（2026·福建厦门一中·一模）将目的基因导入空载体（载体中含启动子和终止子），构建重组表达载体并导入受体细胞，载体中的插入序列随机整合至植物基因组。利用PCR技术进行检测时，可以采用不同的引物设计策略，如下图。下列叙述错误的是（    ） A．引物对中的两个引物分别与不同的模板链结合 B．引物对a可区分目的基因插入位置不同的转基因植株 C．引物对b可用于检测插入序列是否成功导入植物细胞 D．引物对c可用于检测植物细胞中是否含有空载体 【答案】D 【解析】A、引物对中的两个引物分别与不同的模板链结合，为DNA聚合酶提供3'端起点，从而沿5'→3'方向分别延伸，A正确； B、 引物对a的一条引物位于植物基因组，另一条位于插入序列的启动子区。不同植株中插入序列的位置不同，扩增出的片段长度也会不同，因此可以区分插入位置，B正确； C、引物对b位于插入序列内部（启动子和目的基因之间），只要插入序列成功导入，就能扩增出对应的片段，因此可以检测导入是否成功，C正确； D、引物对c位于目的基因内部，空载体不含目的基因，因此无法用引物对c扩增出片段，不能检测空载体，D错误。 13．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）在蛋白质特定位置的氨基酸侧链基团上安装一个分子接头，诱导蛋白质主链发生局部环化的技术，可改变蛋白质局部的折叠方式从而调控其功能。下列有关此技术的叙述正确的是（　　） A．适用于改造任意氨基酸序列的蛋白质 B．改造此蛋白质需要通过基因工程来实现 C．可能导致蛋白质分子内氢键数量发生变化 D．改变了氨基酸的种类和数量从而改变蛋白质的功能 【答案】C 【解析】A、该技术要求在“特定位置”的氨基酸侧链进行操作，说明对氨基酸类型（如需特定反应基团）和位置有选择性，并非适用于任意序列的蛋白质，A错误； B、该技术是对蛋白质直接进行化学修饰（在侧链基团安装分子接头），并不同于蛋白质工程中通过改造基因来改造蛋白质，无需通过基因工程改变DNA序列来合成新蛋白质，B错误； C、局部环化会改变蛋白质主链构象，影响肽链间或肽链内的氢键（维持二级结构的关键作用力），可能导致氢键数量或分布变化，C正确； D、该技术是通过修饰侧链基团（如巯基、氨基等）而改变蛋白质的空间结构，未替换或增减氨基酸，故氨基酸种类和数量不变，D错误。 故选C。 14．（2026·福州第四中学·一模）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示，其中F1、F2、R1、R2表示引物。回答下列问题： （1）图1中启动子的作用是______。作为基因表达载体，除图1中标出的结构外，其还需具备的结构有______（答出1点）。 （2）利用PCR技术进行体外扩增时，已知引物F1与图1中P基因的a链相应序列互补配对，则a链从左到右的方向是______（填“5'→3'”或“3'→5'”），P基因转录的模板链是______（填“a”或“b”）链。 （3）随机挑取5个品系细胞通过PCR和______技术验证基因型，结果如图2所示。 ①在进行PCR扩增时，所选择的是图1中的______作为引物。 ②加样孔在______（填“上”或“下”）端，属于GFP基因纯合子的品系是______。 【答案】（1）RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动基因的转录 标记基因；复制原点 （2）3'→5' a （3）（琼脂糖凝胶）电泳 F1、R1 下 4 【解析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （1）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，能驱动基因的转录。图1中标出了启动子和终止子，除此之外，作为基因表达载体还需具备的结构有标记基因、复制原点。 （2）已知引物F1与图1中P基因的a链相应序列互补配对，则a链从左到右的方向是3'→5'，P基因转录的模板链是a链。 （3）随机挑取5个品系细胞通过PCR和（琼脂糖凝胶）电泳技术验证基因型。结合图1和图2推测，P-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，GFP基因电泳后的DNA片段较小，引物F1和引物F2延伸方向相同，不能扩增，用引物F2和引物R1进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物，选择引物F1和引物R1进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，整合GFP基因后，核酸片段变长，乙个体只有大片段，应选择图1中的引物组合是F1、R1。PCR产物进行电泳时，相同构型的DNA分子，分子量越大，在凝胶中的阻力就越大，速度越慢，故琼脂糖凝胶的加样孔在下端。其中属于GFP基因纯合子的品系是4。 15．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）科研人员开发了一种基于近红外光的光开关系统——NIR系统（如图），实现目的基因表达的精准控制和治疗的定制化。 （1）通过基因工程构建NIR系统需要的工具酶有________。 （2）P酶在近红外光下被激活后具有较高活性，在黑暗条件下具有较低活性。M基因编码的M蛋白是一种转录激活因子，c-di-GMP水平升高可促进M蛋白与特定的启动子结合。为实现近红外光对目的基因表达的精准控制，构建NIR系统时，科研人员选用组成型启动子（不需要诱导物、可持续驱动基因表达）驱动P基因表达，①②应选用的启动子为：①________②________。 （3）沙门氏菌能够选择性定植于肿瘤微环境中，但具有感染性，对动物体存在毒力风险。以PD-L1抗体基因为目的基因构建NIR系统，以沙门氏菌为受体菌，构建用于癌症治疗的工程菌。对此工程菌的叙述正确的有________。 A．敲除沙门氏菌内源c-di-GMP合成酶基因，可降低目的基因的基础表达水平 B．敲除沙门氏菌毒力相关基因，以减弱工程菌的毒性 C．NIR系统中Y基因的作用，是为了降低无光条件下胞内c-di-GMP水平 D．可通过改变近红外光的强度和照射时间，来实现目的基因表达的精准控制 （4）将上述工程菌接种到小鼠的肿瘤内，通过检测________，来评价该工程菌是否构建成功以及治疗效果。 （5）NIR系统在癌症治疗之外也具有广阔的应用前景。在肠道炎症中活性氧起重要作用，通过抗氧化酶（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）清除炎症部位的活性氧，可抑制炎症性肠病。拟利用NIR系统构建工程菌以治疗炎症性肠病，请写出设计思路________。 【答案】（1）限制酶和DNA连接酶 （2）组成型启动子 以M蛋白为转录激活因子的启动子 （3）ABCD （4）不同强度近红外光或不同照射时长下PD-L1抗体水平；肿瘤体积或小鼠存活率 （5）以过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因为目的基因构建NIR系统，以肠道益生菌为受体菌构建工程菌 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）基因工程中，要获取目的基因（如NIR系统相关基因）并对它们进行切割和连接等操作，需要用到限制酶来切割特定的DNA片段，再用DNA连接酶将切割后的片段连接起来，所以需要的工具酶是‌限制酶和DNA连接酶‌。 （2）据题干及图可知，P酶催化GTP生成c-di-GMP，c-di-GMP水平升高促进M蛋白与特定启动子结合激活目的基因表达。Y基因和M基因共用启动子①，科研人员选用组成型启动子驱动Y和M基因表达，因为组成型启动子不需要诱导物且可持续驱动基因表达，能保证Y基因持续表达产生Y酶（分解c-di-GMP，防止在黑暗条件下其在细胞内积累而促进M蛋白起作用，影响光控效果），M基因持续表达产生M蛋白（保证光控时被c-di-GMP激活），所以①处应选‌组成型启动子‌。P酶在近红外光下被激活后具有较高活性，在黑暗条件下具有较低活性。在近红外光下促进P酶催化GTP生成c-di-GMP，由于c-di-GMP水平升高可促进M蛋白与特定启动子结合，M蛋白是转录激活因子，要实现近红外光对目的基因表达的精准控制，②处应选‌以M蛋白为转录激活因子的启动子‌。 （3）A、沙门氏菌内源c-di-GMP合成酶基因被敲除后，其自身产生c-di-GMP的能力下降，由于c-di-GMP水平升高促进M蛋白与特定启动子结合激活目的基因表达，所以可降低目的基因的基础表达水平，A正确； B、敲除沙门氏菌毒力相关基因，能直接减弱工程菌的毒性，降低对动物体的毒力风险，B正确‌； C、NIR系统中Y基因的作用是在无光条件下使系统处于合适状态，降低胞内c-di-GMP水平，避免目的基因在不合适的时候表达，C正确‌； D、改变近红外光的强度和照射时间，可调控P酶活性，进而影响c-di-GMP水平，实现目的基因表达的精准控制，D正确‌。 故选ABCD。 （4）以PD-L1抗体基因为目的基因构建NIR系统，工程菌接种到小鼠肿瘤内后，不同强度近红外光或不同照射时长会影响PD-L1抗体基因的表达水平，所以可通过检测‌不同强度近红外光或不同照射时长下PD-L1抗体水平‌，来了解工程菌是否按预期工作。治疗的最终效果体现在肿瘤的变化和小鼠的生存情况上，所以还可检测‌肿瘤体积或小鼠存活率‌来评价治疗效果。 （5）在肠道炎症中活性氧起重要作用，抗氧化酶（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）能清除炎症部位的活性氧，抑制炎症性肠病。所以可以‌以过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因为目的基因构建NIR系统，以肠道益生菌为受体菌构建工程菌‌，这样工程菌可以在肠道炎症部位根据近红外光的调控表达抗氧化酶，清除活性氧，达到治疗炎症性肠病的目的。 16．（2026·福建·模拟预测）草甘膦是一种广谱除草剂，在一般情况下，草甘膦既能杀死杂草，也能杀死庄稼，只要是没有抗性的绿色植物，接触到足够剂量的草甘膦都会被杀死。科学家探究如何让草甘膦只除掉田里的杂草，而不伤害庄稼。图1表示构建苘麻抗草甘膦基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。回答下列问题： （1）构建含草甘膦抗性基因的表达载体，传统的方法是目的基因通过限制酶和______与载体进行重组。若目的基因两端缺少所需的限制酶识别序列，可通过PCR技术在引物的______（填“3’端”或“5’端”）添加相应限制酶识别序列，以便构建表达载体。PCR扩增A时可在引物中加入______的酶切位点，用PCR技术扩增获得抗草甘膦基因A，引物的作用是______。 （2）导入重组质粒的愈伤组织______（填“会”或“不会”）出现蓝色组织。采用Ti质粒转运抗草甘膦基因A的原因是______。 （3）启动子若为草甘膦诱导启动子将减少细胞物质和能量的浪费，原因是______。 （4）图2表示利用体细胞诱变获得抗除草剂白三叶草新品种的实验过程。 ①该培育过程的原理是______。 ②用γ射线处理愈伤组织的原因是______。过程Ⅲ常采用的方法是______。 【答案】（1）DNA连接酶 5'端 PstI、XhoI 与解旋后的母链结合，使（耐高温的）DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 （2）不会 Ti质粒上的T-DNA为可转移DNA，并将其整合到被侵染细胞的染色体DNA上 （3）只有在草甘膦存在的情况下抗草甘膦基因A才表达，没有草甘膦时不表达 （4）基因突变（和染色体变异）和植物细胞的全能性 愈伤组织分裂能力强，容易诱导突变 向白三叶草幼苗喷洒一定浓度的除草剂 【解析】基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 （1）在构建基因表达载体时，需用限制酶将载体切开，以便目的基因的插入，需要DNA连接酶将目的基因与载体进行重组。若目的基因两侧缺少相应的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列，由于（耐高温的）DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，故一般在引物的5'端添加相应限制酶识别序列。PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，据图可知，即在引物中加入Pst I和Xho I的酶切位点。PCR一次循环包括高温变性、低温复性、中温延伸三个步骤，其引物的作用是与解旋后的母链结合，使（耐高温的）DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2） 重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织不含有该基因，故不会出现蓝色组织。采用Ti质粒转运草甘膦抗性基因A的原因是Ti质粒上的T-DNA为可转移DNA，并将其整合到被侵染细胞的染色体DNA上，从而完成转化。 （3）若启动子为草甘膦诱导启动子，即只有在草甘膦存在的情况下抗草甘膦基因A才表达，没有草甘膦时不表达，所以减少了细胞物质和能量的浪费。 （4）用射线照射愈伤组织，能诱发基因突变（和染色体变异），白三叶草组织细胞发育成个体运用了植物组织培养技术，原理是植物细胞具有全能性，因此，该培育过程的原理是基因突变（和染色体变异）和植物细胞的全能性。用γ射线处理愈伤组织的原因是愈伤组织分裂能力强，容易诱导突变。过程Ⅲ是个体水平上的检测，常采用的方法是向白三叶草幼苗喷洒一定浓度的除草剂。 17．（2026·漳州立人学校·模拟预测）培育转VEGF基因的山羊，有利于提高羊绒产量。但转基因动物含有标记基因可能造成安全性问题。研究者利用Cre/LoxP系统删除标记基因。回答下列问题。 （1）要获得转VEGF基因的山羊，需用____________技术把基因表达载体导入山羊受精卵，获得的早期胚胎移植到代孕母体子宫前，需对代孕母羊进行_______________处理。 （2）如图1所示， Cre酶能切割特定位点形成黏性末端。结合图1和图2分析，Cre酶能将______（填“①”或“②”）中的目标片段删除，并且其余片段末端可以连接形成一个DNA分子。 （3）图3利用P0构建的P1表达载体可实现转化后可删除标记基因，图中引物 a添加的LoxP序列为5´­GCATACAT­3´则引物b应添加的LoxP序列为：5′—_________________—3′（填“5´­GCATACAT­3´”或“5´­ATGTATGC­3´”），同时，需在LoxP序列的________端添加限制酶BglⅡ和HindⅢ的识别序列。用BglⅡ和HindⅢ处理P1并对产物进行电泳鉴定，结果长度为________________说明P1构建成功。 （4）将P1导入山羊皮肤成纤维细胞，经检测VEGF已成功表达。此时还需要Cre/LoxP系统中________的作用将标记基因删除。利用荧光显微镜观察，结果为_______（填“有”或“无”）红色荧光，说明已成功删除标记基因。 【答案】（1）显微注射 同期发情 （2）② （3）ATGTATGC 5' 3600bp和4100bp （4）Cre酶 无 【解析】（1）将目的基因导入动物受精卵的常用方法是显微注射技术。胚胎移植前，要对代孕母羊做同期发情处理，使供体和受体生理状态保持一致，为移入胚胎提供适宜的生理环境。 （2）结合图 1 和图 2 分析： 图 1 显示：Cre 酶识别 LoxP 序列，在5'-GCATACAT...-3'和3'-CGTATGTA...-5'之间剪切，产生黏性末端； 图 2 中，②的两个 LoxP 序列方向一致，Cre 酶剪切后，两个 LoxP 之间的目标片段被删除，剩余的黏性末端可以互补连接，形成完整的 DNA 分子； ①的 LoxP 序列方向相反，Cre 酶剪切后会导致片段倒位，而非删除。因此 Cre 酶能将②中的目标片段删除。 （3）根据图 1，LoxP 序列的已知 8 个碱基为5'-GCATACAT-3'（正链），其互补链为3'-CGTATGTA-5'（即5'-ATGTATGC-3'）。引物 a 和 b 需要添加 LoxP 序列，因此引物 a 添加5'-GCATACAT-3'，引物 b 添加5'-ATGTATGC-3'。限制酶需要识别并切割 DNA，因此其识别序列必须添加在 LoxP 序列的5' 端，才能保证后续酶切操作正常进行。图 3 中，P₁载体总长度为 7700bp，VEGF 基因长度为 5600bp。 用HindⅢ单酶切：载体被切成 1 个片段，长度为 7700bp； 用BglⅡ 和 HindⅢ双酶切：载体被切成 2 个片段： 含 VEGF 的片段：7700bp - 4100bp = 3600bp, 含 LoxP、DsRed、KanR的片段：4100bp（图中标注）因此电泳结果出现3600bp 和 4100bp两个条带，说明 P₁构建成功。 （4）本题利用Cre/LoxP 系统删除标记基因，因此需要Cre 酶识别 LoxP 序列，剪切并删除两个 LoxP 之间的标记基因（DsRed 红色荧光基因、KanR卡那霉素抗性基因）。标记基因包含DsRed 红色荧光基因，若标记基因被成功删除，细胞将不再表达红色荧光蛋白。因此用荧光显微镜观察，结果为无（红色）荧光，说明标记基因已成功删除。 18．（2027·福建福州·一模）烟草叶绿体转化技术已广泛应用于外源基因的高效表达。若要将外源基因导入烟草叶绿体基因组，需要合适的载体。下图是质粒P1的改造过程，回答相关问题。 （1）将MCS序列插入质粒P1，目的是________________。将MCS序列与质粒P1连接时，选用_______酶效率更高。在P3的MCS序列两侧还需加入________等调控元件，以确保外源基因能够正确表达。 （2）为了在P2上保留ScaⅠ酶切位点，PCR扩增MCS序列时应该在引物F1的5′端插入的序列是5′-______-3′。引物F2不能插入该序列，否则难以构建质粒P3，原因是_______。 （3）为了鉴定MCS序列与质粒P1是否正确连接，PCR扩增P2片段，用ScaⅠ酶切PCR产物，如果正确连接，则得到的电泳条带长度为_______。 （4）P2载体引入aadA基因作为_____（填“目的基因”“标记基因”）。与细胞核转基因烟草相比，从生物安全角度说明叶绿体转化烟草的优点是________。 【答案】（1）提供多个限制酶切割位点，有利于外源基因的插入 T4 DNA连接酶 启动子、终止子 （2）AGTACT 若F1、F2引物上均添加该序列，则用ScaⅠ酶切质粒P2时，会把MCS序列切除 （3）1.8kb、1.3kb （4）标记基因 避免花粉介导的基因污染 【解析】（1）由图可知，质粒P1只有一个限制酶的酶切位点，而MCS序列上有多个限制酶切割位点，将MCS序列插入质粒P1，使得质粒上有多个限制酶切割位点，有利于外源基因的插入。质粒P1用Sca Ⅰ酶切后产生平末端，而E·coli DNA连接酶连接平末端片段的效率远低于T4 DNA连接酶，所以选择T4 DNA连接酶。要使外源基因能够正确表达，必须在外源基因的上游有启动子，启动转录，在外源基因的下游必须有终止子，终止转录，终止子和启动子是基因表达的必需元件，保证外源基因转录和翻译正常进行。 （2）Sca Ⅰ限制酶的识别序列是5′-AGTACT-3′，引物F1的5′端插入该序列，扩增后的DNA末端就带上该酶切位点。若F1、F2两端引物都加上ScaⅠ识别序列，质粒P2酶切时MCS片段两端都会被ScaⅠ切开，MCS片段会被完整切下，无法得到重组质粒P3，若只给F1加位点，扩增产物只有一端带ScaⅠ位点。 （3）正确连接后，DNA的长度是1.8+1.2+0.1=3.1kb，PCR产物上有1个ScaⅠ酶切位点；酶切把一条DNA切成两段，由于MCS片段连接在ScaⅠ酶切位点的右边，所以切割后片段大小分别为1.8 kb和1.3 kb；电泳会出现两条条带。 （4）aadA基因是链霉素抗性基因，一般是作为抗性基因引入质粒中，筛选是否成功导入受体细胞。叶绿体DNA属于细胞质遗传（母系遗传）。 烟草花粉几乎不含叶绿体，叶绿体上的转基因不会随花粉扩散到野生烟草，防止基因漂移，降低基因污染风险，而花粉细胞核携带目的基因，授粉会扩散，造成基因污染。 19．（2026·福建百校·模拟预测）苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因发生单个碱基突变引起的常染色体隐性遗传病。患者因肝脏中PAH酶活性缺陷，导致苯丙氨酸代谢障碍，血液中苯丙酮酸浓度升高，造成神经系统损伤。2025年，苏黎世大学研究团队开发了一种基于Prime编辑的基因治疗策略，成功纠正了PKU模型小鼠的致病突变。Prime编辑系统（PE）由三部分组成：①Cas9n结构域；②RT结构域；③Prime编辑引导RNA（pegRNA），pegRNA包含引导序列、引物结合位点（PBS）和RT模板序列，其作用机制如图1所示。回答下列问题： （1）Prime编辑系统中，Cas9n结构域、RT结构域分别发挥了______酶和______酶的功能。RT模板序列需与突变位点附近的______（填“正常”或“突变”）序列相同，以实现对致病突变的精确修复。 （2）研究团队开发了LNP—mRNA递送策略（用脂质体包裹PE mRNA），给PKU模型小鼠注射2mg/kg的LNP—mRNA后，检测相关mRNA和蛋白质的水平如图2所示。结果表明，PEmRNA在细胞内的表达具有______（填“稳定性”或“瞬时性”），依据是______。 （3）给药7周后，提取小鼠肝细胞基因组DNA，通过_______技术扩增目的基因，______（填“能”或“不能”）通过琼脂糖凝胶电泳检测基因编辑效果，理由是______。 （4）为进一步验证PEmRNA是否成功表达并发挥功能，除了检测PAH的量和活性，还可以检测______（答出1点），评估基因治疗的效果。 【答案】（1）限制（或限制性内切核酸） 逆转录 正常 （2）瞬时性 PEmRNA和蛋白质水平分别在6小时左右和28小时左右达到峰值，且随时间推移，mRNA的含量和蛋白质的含量均降低 （3）PCR 不能 该病是单个碱基突变引起的，基因的长度不变，而琼脂糖凝胶电泳只能检测基因长度，不能检测具体的碱基序列 （4）血液中苯丙酮酸浓度（或神经损伤程度） 【解析】（1）由图1可知，Cas9n结构域切割DNA链，其有限制酶（限制性内切核酸酶）功能，RT结构域以pegRNA序列的RT为模板合成DNA，行使逆转录酶功能。要修复致病突变，RT模板必须携带正常基因序列，才能将突变序列改变为正常序列。 （2）据图2分析，PEmRNA和蛋白质水平分别在6小时左右和28小时左右达到峰值，且随时间推移，mRNA的含量和蛋白质的含量均降低，因此表达呈瞬时性，另外，mRNA会被细胞内核酸酶降解，不能持续存在，翻译出的蛋白质也随之减少。 （3）扩增目的基因常用PCR技术。该病是单个碱基突变引起的，基因片段长度不变，琼脂糖凝胶电泳只能分离不同大小的DNA，不能分辨单碱基差异，因此无法检测编辑效果。 （4）评估治疗效果的核心是检测疾病相关表型：检测PKU的关键指标是血液中苯丙酮酸浓度是否下降，PAH功能恢复则苯丙氨酸代谢正常，血液中的苯丙酮酸浓度下降，同时可观察神经系统的功能是否得到改善。 20．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）牛乳铁蛋白肽（LF）是由25个氨基酸组成的小分子抗菌肽，具有广谱抗菌活性，但其分子量小（约4kDa），常规电泳难以检测。为提高表达效率和便于纯化，科研人员将增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）与LF基因融合构建重组表达载体（两个基因之间设计了甲酸裂解位点，可使融合蛋白在酸性条件下特异性断裂），然后将其导入到毕赤酵母中，最终实现LF的高效生产与提纯。请回答下列问题： 注：PA为甲醇诱导型启动子 （1）为获取荧光强度更强、灵敏度更高的增强型绿色荧光蛋白（EGFP），需将野生型绿色荧光蛋白（GFP）氨基酸序列的第64位苯丙氨酸定点改造为亮氨酸，实现这一过程需要运用___________技术。科学家将EGFP与LF连接构建融合基因的目的是___________。 （2）为将EGFP基因定向的插入图3所示载体中，据图分析不能选择限制酶组合___________（填编号）（①BamHⅠ、EcoRⅠ  ②BgtⅡ、BamHⅠ  ③BgtⅡ、EcoRⅠ）切割质粒，理由是___________。形成EGFP—LF融合基因时，要注意将EGFP基因编码区中___________的序列删除以确保LF基因表达，获得EGFP—LF融合蛋白。 （3）重组酵母在甲醇诱导下表达融合蛋白。甲醇在此实验中的作用是___________。 （4）纯化后的LF对5株致病菌的最小抑菌浓度（MIC）测定结果如下表所示。根据表中数据，LF的抗菌活性有何特点？___________。 菌株 MIC（μg/mL） 金黄色葡萄球菌CMCC26003 64 金黄色葡萄球菌ATCC29213 64 大肠杆菌ATCC25922 16 大肠杆菌C600 16 大肠杆菌CMCC44103 64 【答案】（1）蛋白质工程 便于通过荧光观察检测融合蛋白的表达情况，同时增加分子量以便于电泳检测 （2）② BgtⅡ与BamHⅠ会产生相同的黏性末端而无法防止目的基因反向连接 编码终止密码子 （3）诱导PA启动子，启动融合蛋白基因的表达 （4）LF具有广谱抗菌活性，但对不同菌株的抑制效果存在差异，对大肠杆菌ATCC25922和C600的抑菌效果最好（MIC为16μg/mL），金黄色葡萄球菌和大肠杆菌CMCC44103的抑菌效果相对较弱（MIC为64μg/mL） 【解析】（1）定点改造蛋白质运用的技术是蛋白质工程，通过分析组成蛋白质的氨基酸序列，推测mRNA序列，进而确定基因序列，通过定点改造基因的碱基序列，最终实现改造蛋白质。题干信息表明牛乳铁蛋白肽（LF）分子量小（约4kDa），常规电泳难以检测，因此将EGFP与LF连接构建融合基因的目的是便于通过荧光观察检测融合蛋白的表达情况，同时增加分子量以便于电泳检测。 （2）PCR扩增需要Taq DNA聚合酶，构建基因表达载体的过程需要限制酶和DNA连接酶。设计引物时需在引物1和引物2的5'端添加相应的限制酶识别序列。结合图1分析，Bgt Ⅱ与BamH I会产生相同的黏性末端而无法防止目的基因反向连接，所以不能选择限制酶组合②Bgt Ⅱ、BamH I。形成EGFP—LF融合基因时，要注意将EGFP基因编码区中编码终止密码子的序列删除，终止密码子是让翻译过程停止，若不去除，会影响后续基因LF的表达。 （3）PA为甲醇诱导型启动子，结合图示分析，甲醇在此实验中的作用是诱导PA启动子，启动融合蛋白基因的表达。若在488 nm激发光下观察到酵母细胞发出绿色荧光，说明融合蛋白EGFP-LF在酵母细胞内成功表达。 （4）结合表格数据分析，LF的抗菌活性特点是LF具有广谱抗菌活性，但对不同菌株的抑制效果存在差异，对大肠杆菌ATCC25922和C600的抑菌效果最好（MIC为16μg/mL），对部分金黄色葡萄球菌和大肠杆菌CMCC44103的抑菌效果相对较弱（MIC为64μg/mL）。 21．（2026·福建福州·二模）H蛋白在各类细胞中广泛存在，对免疫功能具有促进作用，但正常情况下表达水平较低。研究人员将乙肝病毒B抗原基因与质粒D结合为重组质粒DB，研发了乙肝DNA疫苗；进一步利用H基因对乙肝DNA疫苗进行改造，开展了一系列实验。 回答下列问题： （1）研究人员设计了特异性引物，用PCR技术从结核杆菌中获取H基因。在______的催化下，子链从引物的______（填“3’端”或“5’端”）延伸。 （2）PCR合成的子链末端会多出一个腺嘌呤核苷酸（A）。根据这个特点，研究人员设计一种3’端各多出一个胸腺嘧啶核苷酸（T）的线性载体P，将其与PCR扩增的H基因混合构建重组质粒PH，并导入大肠杆菌进行扩增。与常规操作相比，该方法能快速构建表达载体的原因是无需用______酶处理载体和目的基因。通过该方法得到的重组质粒至少有两种，原因是______。 （3）质粒D能在真核细胞中表达，用______（填限制酶）对重组质粒PH中的H基因和质粒D进行处理，构建重组质粒DH。为检测H基因表达情况，将小鼠细胞分三组进行实验，培养一段时间后提取蛋白质进行电泳，结果如图。从结果判断导入小鼠细胞后重组质粒PH中的H基因______（填“能”或“不能”）正常表达，判断依据是______。 注：①组导入重组质粒DH，②组导入质粒D，③组不处理；β-actin蛋白在真核细胞中表达相对恒定，蛋白质电泳实验中常以它为参照 （4）为探究H蛋白在细胞中同步表达时对乙肝DNA疫苗激发特异性免疫的影响，研究人员选择三种不同质粒分别注射入三组小鼠体内，定期检测抗体水平进行验证。其中空白对照组注射质粒D，另两组应选择质粒______。 【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶 3’端 （2）限制（酶） H基因和载体两个连接处的黏性末端相同，可能发生正接或反接 （3）BamHⅠ和EcoRⅠ 能 ①组H蛋白表达量显著高于②和③组 （4）乙和丙 【解析】（1）PCR技术中，在耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的催化下，根据碱基互补配对原则，子链从引物的3'端延伸。 （2）常规构建表达载体时，需用限制酶处理载体和目的基因，而该方法中，由于PCR合成的子链末端会多一个腺嘌呤核苷酸（A），设计的线性载体P的3'端各多出一个胸腺嘧啶核苷酸（T），二者可通过碱基互补配对直接连接，无需用限制酶处理。由于H基因和载体两个连接处的黏性末端相同，导致H基因与载体P可能正向连接，也可能反向连接，所以通过该方法得到的重组质粒至少有两种。 （3）要构建重组质粒DH，需对重组质粒PH中的H基因和质粒D进行处理，分析图中限制酶识别序列可知，H基因上下游分别存在BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列，而质粒D相应部位也存在BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列，所以应选用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ用于构建重组质粒DH。为检测H基因表达情况，将小鼠细胞分组培养后提取蛋白质进行电泳，相比于②③组，①组导入重组质粒DH后，检测到更明显的H蛋白条带，说明①组H蛋白表达量显著高于②和③组，则导入小鼠细胞后的H基因能正常表达。 （4）空白对照组注射质粒D，另一组应选择乙组，注射的质粒D中仅含有B基因，表达乙肝病毒B抗原，模拟乙肝DNA疫苗作用，还有一组应选择丙组，注射的质粒D中含有H基因和B基因，实现H蛋白和乙肝病毒B抗原在细胞内同步表达，以检测H蛋白对乙肝DNA疫苗激发特异性免疫的影响。 22．（2026·福建宁德·二模）LL-37是人体内一种重要抗菌肽，但易被蛋白酶分解。为解决上述问题，科研人员利用生物技术将LL-37包裹在类弹性蛋白多肽（ELP）纳米纤维内部，制备自组装纳米胶束。ELP具有显著热响应性，当温度低于T时ELP呈溶解状态，反之则沉淀。图1为构建融合蛋白（ELP-LL-37）表达载体的部分流程，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。 回答下列问题： （1）与质粒中的启动子结合的酶是______。为使LL-37基因正确连接到PUC19质粒中，并将ELP表达至LL-37抗菌肽的羧基端，利用PCR技术扩增LL-37基因时需在X链、Y链引物的5′端分别添加限制酶______的识别序列，引物的作用是______。 （2）将基因表达载体导入大肠杆菌，再用含______的培养基进行初步筛选，得到导入质粒的大肠杆菌。已知LL-37基因长度为1500bp，ELP基因长度为900bp，质粒上相关酶切位点的距离如图2。请在图3中画出构建成功的重组质粒经SacI、SmaI酶切后的电泳条带______。 （3）为分离纯化ELP-LL-37融合蛋白，将大肠杆菌培养24h后，将培养液离心→取细菌→破坏细胞→离心→取上清液→调节温度→分离。要分离出融合蛋白，调节后的温度应_____（填“大于”或“小于”）T。该过程中需反复升降温循环几次，依据的原理是_____。 【答案】（1）RNA聚合酶 SacI、NcoI（顺序不能倒） 能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 （2）氨苄青霉素 说明：正确条带为1800bp、5500bp （3）大于 根据ELP的热响应性，在温度高于T时沉淀，实现分离融合蛋白；低于T时溶解，通过反复的升降温循环实现纯化 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶的识别与结合位点，驱动基因转录。根据转录方向可知，X链为转录的模板链，X链的羟基端要靠近启动子且为引物连接的部位，酶切质粒时因为Ampr抗性基因中有一个EcoRⅠ的酶切位点，故不能选用EcoRⅠ，只能选用SacⅠ、NcoⅠ双酶切；X 链、Y 链引物 5′端需分别添加SacⅠ、NcoⅠ，这样可以保证LL-37基因的羟基端连接到启动子一侧，即保证了目的基因正确的连接到载体上。PCR中引物的作用是与模板链互补配对，为耐高温 DNA 聚合酶提供3′‑OH，使子链从3′端延伸。 （2）质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），因此用含氨苄青霉素的培养基筛选导入质粒的大肠杆菌。 酶切片段长度计算： ELP基因900 bp+LL‑37基因1500 bp → 质粒经SacⅠ+SmaⅠ酶切后，载体骨架为7000-1200-300=5500 bp，目的条带1500+300=1800 bp。 电泳图如图：。 （3）ELP温度高于T时沉淀，因此调节温度大于T，使目标融合蛋白沉淀，便于分离。利用ELP的热响应性，反复升降温可以多次纯化，去除杂蛋白，提高目标蛋白纯度。 23．（2026·福建·模拟预测）植物的光合效率易受CO2浓度、光照等环境因素影响，同时也与叶绿体的发育（形态结构建成）密切相关。科研人员通过一系列实验探究某植物的光合作用机制及环境适应性，回答下列问题： （1）植物叶片气孔开放时，CO2进入叶肉细胞的过程_______（填“需要”或“不需要”）载体蛋白协助，_______（填“需要”或“不需要”）消耗ATP。 （2）为追踪该植物光合作用中碳元素的转移路径，科研人员向密闭培养的该植物植株提供14C标记的CO2，在适宜光照下培养不同时间后，检测叶片中含14C的化合物。请写出该实验中14C的转移途径：_______。若突然停止光照，短时间内叶片中14C标记的C3含量会_______（填“增加”“减少”或“不变”），理由是_______。 （3）叶绿体的发育受基因的精细调控，以适应环境。科研人员对光响应基因BG在此过程中的作用进行了研究。 ①实验中发现一株叶绿素含量升高的该植物突变体。经鉴定，其BG基因功能缺失，被命名为bg。已知GK蛋白促进叶绿体发育相关基因的转录，BG蛋白可以与GK蛋白结合。科研人员构建了GK基因功能缺失突变体gk（叶绿素含量降低）及双突变体bggk。对三种突变体进行观察，发现双突变体bggk的表型与突变体_______相同，由此推测BG蛋白通过抑制GK蛋白的功能来影响叶绿体的发育。 ②为进一步证明BG蛋白对GK蛋白的抑制作用并探索其作用机制，将一定浓度的GK蛋白与一系列浓度BG蛋白混合后，再加入GK蛋白靶基因CAO的启动子DNA片段，反应一段时间后，电泳检测DNA所在位置，结果如图。分析实验结果，可得出BG蛋白抑制GK蛋白功能的机制是_______。 ③基于突变体bg的表型，从进化与适应的角度推测光响应基因BG存在的意义：_______。 【答案】（1）不需要 不需要 （2）14CO2​→14C3​→14（CH2​O）​（或14CO2​→14C3​→含¹⁴C的有机物） 增加 突然停止光照，光反应产生的ATP和NADPH减少，C₃还原速率减慢，而CO₂固定仍在持续生成C₃，因此短时间内标记C₃含量增加 （3）gk BG蛋白可抑制GK蛋白与CAO基因启动子DNA的结合，且BG蛋白浓度越高，抑制作用越强 BG基因可使植物根据环境光照调控叶绿素合成，避免不必要的物质能量消耗，也可防止强光下叶绿素过多引发光损伤，提升植物对光照环境的适应能力，利于植物生存（合理即可） 【解析】（1）CO2跨膜进入叶肉细胞的方式为自由扩散，自由扩散不需要载体蛋白协助，也不消耗ATP。 （2）光合作用暗反应中，碳元素的转移过程为CO2与C5固定生成C3​，C3再被还原为有机物，因此按顺序即可写出转移路径为14CO2→14C3​→14（CH2O）（或14CO2→14C3→含¹⁴C的有机物）；突然停止光照时，光反应停止，ATP和NADPH合成减少，C3还原速率下降，而CO2固定仍在正常进行，不断生成新的C3，因此短时间内标记C3​含量增加。 （3）①根据推论"BG蛋白抑制GK蛋白的功能"可知，BG蛋白发挥功能的前提是存在GK蛋白，BG通过抑制GK的功能发挥作用，GK功能缺失后，无论BG功能是否正常，GK都无法发挥促进叶绿体发育、增加叶绿素含量的作用，因此双突变体bggk的表型与GK功能缺失突变体gk一致（均为叶绿素含量降低）。 ② 电泳结果显示：无BG蛋白时，大部分CAO启动子DNA都与GK结合（条带在上方，结合蛋白后电泳迁移速率减慢）；随着BG浓度升高，游离的DNA条带逐渐变深，说明游离的启动子DNA逐渐增多，结合态DNA逐渐减少，说明说明BG蛋白通过抑制GK与靶基因启动子结合，来抑制GK功能，且浓度越高抑制作用越强。 ③从进化与适应的角度，BG作为光响应基因，可根据光照强度调节叶绿体发育和叶绿素含量，避免资源浪费和强光对叶绿素的损伤，提升植物对多变光环境的适应能力，有利于植物生存。 24．（2026·闽侯县第一中学·模拟预测）为研究生长激素（GH）基因（603bp，起始密码子AUG，终止密码子UAG）在斑马鱼早期胚胎发育阶段的表达，研究人员以GH基因为外源基因，以增强型荧光蛋白（EGFP）基因（720bp，起始密码子AUG，终止密码子UAA）为报告基因，构建了含两个基因（GH-EGFP）的融合表达载体。操作基本流程、融合表达载体、相关基因、引物和限制酶，如下图所示。回答以下问题： （1）载体中复制原点的作用是保证表达载体具有______________的能力。 （2）在构建含有EGFP基因重组质粒时使用的限制酶是__________________。 （3）补充引物序列：引物3为5′______________ATGGCT3′；引物4为5′CCATGGCAACCAC______________3′（均写6个碱基序列）。 （4）注射后3h，在荧光显微镜下观察到受精卵开始发光。随着胚胎发育的进行，发光卵逐渐增多，荧光亮度也增强，荧光集中在头部和背部。24h后荧光亮度开始减弱，仔鱼孵出3-4d后，荧光全部消失。 ①挑取发光卵提取DNA，使用不同的引物分别扩增外源目的基因GH和融合基因GH-EGFP进行检测，结果如下图所示。据此推测泳道2、3上的条带所示基因为__________________，理由是________________________________________________________________________________________。 ②尝试提出假说解释荧光消失的原因：________________________________________________________________________________，验证该假说需检测仔鱼细胞中的物质为___________________________________________________________________________________。 【答案】（1）自我复制 （2）ClaI、XhoI （3）ATCGAT CAGAGT （4）GH-EGFP GH-EGFP融合基因片段为1320bp左右，GH基因仅为600bp，条带3处于1000-2000之间 基因未表达（甲基化）或基因丢失（未整合到染色体、酶降解）或基因突变 检测EGFP基因及其mRNA或检测EGFP基因或检测EGFP基因序列（合理即可，证据能验证假说） 【解析】（1）载体中复制原点的作用是保证表达载体具有自主复制的能力，使载体能在宿主细胞内独立复制。 （2）结合引物1和2可知，题图中扩增后的EGFP基因两端、载体启动子与终止子之间均有ClaⅠ和XhoⅠ酶切位点，且切割不破坏载体功能，同时双酶切可避免载体自连和目的基因反向连接，因此在构建含有EGFP基因重组质粒时使用ClaI、XhoI这两种酶。 （3）引物3需引入ClaⅠ酶切位点（5'-ATCGAT-3'），且与GH基因上游序列互补，前6个碱基为ATCGAT，保证后续酶切连接。引物4需要去除GH基因中决定终止密码子（5＇-UAG-3＇）的碱基（3＇-ATC-5＇），避免翻译提前终止，应为为了让GH接在EGFP基因上游，且融合基因能通过表达形成融合蛋白，引物4的后6个碱基应为CAGAGT，即与GH基因下游去除了TAG的序列互补。 （4）①GH基因长603bp，去除决定终止密码子的3个碱基对后基因长600bp，EGFP基因长720bp，融合基因GH-EGFP总长度 = 600+720=1320bp，泳道2、3上的条带位于1000-2000bp区间，与融合基因长度匹配，因此泳道2、3上的条带所示基因为GH-EGFP融合基因。 ②胚胎后期荧光消失的原因有基因未表达（甲基化）或基因丢失（未整合到染色体、酶降解）或基因突变，使转录或翻译受阻等；验证该假说需检测仔鱼细胞中的物质：可检测EGFP基因（判断基因是否丢失）或检测EGFP基因序列、EGFP的mRNA（判断转录是否正常），基因存在但无mRNA，说明不能转录，基因不存在，说明基因丢失。 25．（2026·福建厦门·二模）研究人员构建了一种由近红外光激活的大肠杆菌工程菌，该菌能表达并分泌Noxa蛋白（一种促凋亡蛋白）诱导肿瘤细胞凋亡。图1为PCR扩增ClyA-Noxa融合基因的流程，图2为温度敏感型载体的工作原理，Tcl基因编码的cI857蛋白形成的二聚体，与pR-pL基因启动子结合，42℃时cI857蛋白变性失活。 请回答： （1）大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，推测其目的是___________。扩增融合基因时，引物R1和P2实现了两种基因片段的拼接，则R1和P2分别是___________（从下列引物中选填）。 引物a：5'-GCCTTAAGCCATGGC……-3' 引物b：5'-GGTGATGGCATGCGC……-3' 引物c：5'-GCGCATGCCATCACC……-3' 引物d：5'-CGGAATTCGGTACCG……-3' （2）将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用___________处理大肠杆菌细胞，以提高转化效率。为鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录和翻译，在分子水平进行检测的方法是___________。 （3）将构建好的工程菌与肿瘤细胞在37℃下共培养，与对照组相比，肿瘤细胞存活率无明显差异；若温度升高至42℃，肿瘤细胞存活率显著下降。结合图2分析，42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是___________。 （4）工程菌植入肿瘤部位会破坏肿瘤组织的血管，肿瘤组织颜色变暗对近红外光的吸收值增大，肿瘤组织部位温度升高。通过近红外光照射肿瘤部位，可达到杀死肿瘤的目的。肿瘤细胞死亡的因素包括___________（多选）。 ①营养和氧气供应障碍    ②高温导致细胞热损伤和坏死 ③肿瘤细胞快速表达Noxa蛋白    ④Noxa蛋白诱导肿瘤细胞凋亡 【答案】（1）使Noxa蛋白分泌到细胞外 b、c（或c、b） （2）Ca2+ PCR等技术、抗原—抗体杂交 （3）42℃时cI857蛋白变性失活，解除对pR-pL启动子的抑制，促进ClyA-Noxa融合基因表达，Noxa蛋白被分泌到细胞外，诱导肿瘤细胞凋亡 （4）①②④ 【解析】（1）大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，据此推测其目的是利用ClyA蛋白天然的分泌功能，将融合表达的Noxa蛋白分泌到细胞外，从而作用于肿瘤细胞，实现靶向诱导凋亡。PCR 拼接融合基因时，需要设计互补的重叠引物，使两个基因片段通过重叠延伸连接。引物 c（5'-GCGCATGCCATCACC……-3'）与引物 b（5'-GGTGATGGCATGCGC……-3'）序列反向互补，可作为重叠引物，实现 ClyA 基因片段与 Noxa 基因片段的拼接；引物 a、d 为酶切位点引物，用于后续载体连接，不用于片段拼接，故选b、c。 （2）将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中，以提高转化效率。鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录可通过PCR等技术检测ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌或检测ClyA-Noxa融合基因是否转录出了mRNA；从大肠杆菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，检测ClyA-Noxa融合基因是否翻译成Noxa蛋白等。 （3）据题干信息和图2信息可知，37℃时 cI857 蛋白形成二聚体，结合 pR-pL 启动子，抑制融合基因表达；42℃时 cI857 蛋白变性，抑制解除，融合基因高效表达，Noxa 蛋白大量分泌，诱导肿瘤细胞死亡。故42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是42℃时cI857蛋白变性失活，解除对pR-pL启动子的抑制，促进ClyA-Noxa融合基因表达，Noxa蛋白被分泌到细胞外，诱导肿瘤细胞凋亡。 （4）①工程菌破坏肿瘤组织血管，导致肿瘤细胞营养、氧气供应不足，①正确； ②近红外光照射使肿瘤部位温度升高，高温导致细胞热损伤和坏死，②正确； ③Noxa 蛋白由工程菌表达，并非肿瘤细胞自身表达，③错误； ④工程菌分泌的 Noxa 蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡，④正确。 26．（2026·福建南平·二模）解钾菌能将土壤中难溶性的含钾矿物质转化为植物可利用的有效钾。研究表明gcd基因与pqqABCDE基因（图1）的协同表达可使解钾菌的解钾效率提高。研究人员从土壤中分离出野生型解钾菌，在gcd基因载体（图2）上构建gcd-pqqABCDE融合基因表达载体。利用基因工程技术培育出解钾效率更高的转基因解钾菌。 回答下列问题。 （1）通过PCR技术获取pqqABCDE基因时，应选择引物________。已知pqqABCDE基因两端不含限制酶的酶切位点，为了能与gcd基因载体定向连接，扩增pqqABCDE基因时，需在目的基因两端加上________限制酶的识别序列。依据图1、图2信息，写出上游引物的部分碱基序列5′-_________-3′（包括添加的限制酶识别序列，写出12个碱基）。 （2）将构建好的gcd-pqqABCDE融合基因表达载体转入野生型解钾菌，常采用________处理以完成转化。转化后获得的解钾菌扩大培养后，先在含________的培养基（甲）上培养，再利用灭菌的绒布将菌落复制到含________的培养基（乙）上培养，在甲、乙培养基中生长情况为________的菌落，即为所需转基因解钾菌。 （3）若该转基因解钾菌释放到自然土壤中，可能引发的生态风险有________。 【答案】（1）引物2和引物3 EcoRI和HindIII GAATTCATGGCA （2）Ca2+（CaCl2） 氯霉素 四环素 在甲中菌落能生长，在乙中菌落不能生长 （3）基因污染（或“破坏生物平衡”、“降低生物多样性”、“改变自然种群基因频率”、“影响生态系统稳定性”） 【解析】（1）PCR扩增目的基因时，引物要与模板链的3'端结合，通过PCR技术获取pqqABCDE基因时，应选择引物2和引物3。 要将目的基因定向插入载体gcd基因下游，且保证插入后不破坏载体其他必需结构，根据图2，需要选择gcd下游、四环素抗性基因内部两个酶切位点Sau3AI和BsrGI，二者酶切后产生不同黏性末端，可实现定向连接，因此需要在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列。依据图1、图2信息，写出上游引物的部分碱基序列5′-GAATTCATGGCA-3′。 （2）将重组质粒转入原核细胞（解钾菌）时，常用Ca2+处理使细胞处于感受态，完成转化。重组载体插入目的基因后，氯霉素抗性基因Cmr完整，四环素抗性基因TetR被插入失活，因此筛选时：先在含氯霉素的培养基甲上培养，能存活的是导入了载体的菌；再影印到含四环素的培养基乙上，重组菌（插入目的基因）的TetR失活，因此表现为甲中能生长，乙中不能生长。 （3）转基因解钾菌释放到自然环境中，可能的生态风险有：目的基因发生扩散造成基因污染，改变土壤原有微生物群落结构，破坏土壤生态系统的生物多样性，打破原有生态平衡（答出合理一点即可） 27．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）插入突变是基于农杆菌Ti质粒的遗传学技术，通过将农杆菌Ti质粒上的T-DNA片段随机插入受体生物，破坏基因结构或影响其表达，是研究植物基因功能的重要手段。土壤镉（Cd）污染严重危害植物的生长发育。研究人员通过构建Cd敏感的T-DNA插入突变体拟南芥（S）进行植物耐Cd分子机制的研究。回答下列问题： （1）构建拟南芥突变体S过程中，Ti质粒的T-DNA可随机整合至拟南芥的______________中，筛选后的细胞需经植物组织培养成为突变体植株。 （2）提取突变体S的DNA，测序可确定发生突变的基因为SCL14基因。研究人员欲构建突变体S的回补株系进一步验证： ①利用Ti质粒和SCL14基因（如图）构建基因表达载体时，需用PCR技术对SCL14基因进行扩增，为保证该基因能以正确方向连入T-DNA，根据图中信息写出SCL14基因上游引物的碱基序列______________（从5′端到3′端，只写出前8个碱基即可）。 ②将重组质粒成功导入农杆菌后配成细菌悬液，突变体S的花序直接浸入细菌悬液一段时间，继续培养植株获得T0种子。将T0种子平铺至含______________（填抗生素）固体培养基上培养，筛选后移栽至营养土生长，自交得T1种子。 ③将若干单株收获的T1种子平铺至含相同抗生素的培养基中，选择分离比为3（有抗性）:1（无抗性）的植株继续种植、自交以最后获得纯合株系。优先选择分离比为3:1而非15:1或其他比例的植株的目的是______________。 （3）实验证明，SCL14基因的缺失是突变体S对Cd胁迫敏感的原因。另有研究表明TGA3基因缺失导致突变体T对Cd胁迫敏感。若正常和Cd胁迫条件下，突变体S中TGA3表达量无明显差异，且______________，则表明SCL14蛋白与TGA3蛋白可能独立调控拟南芥对Cd的耐受性。 （4）为进一步探究SCL14调控拟南芥耐Cd的分子机制，研究人员对Cd胁迫下WT和突变体S特定细胞的总mRNA进行提取和测序分析，目的是______________。 【答案】（1）染色体的DNA （2）5'-AAGCTTTC-3' 潮霉素 确保只有1个SCLI4基因整合至细胞染色体DNA （3）突变体T中SCL14基因表达量无明显差异 （4）比较两种转录组的差异性/寻找Cd胁迫下受到SCL14蛋白特异性调控的基因 【解析】（1）农杆菌转化法中，Ti 质粒的 T-DNA 片段可以随机整合到植物细胞的染色体DNA（核基因） 中，从而稳定遗传给后代。 （2）①为保证基因定向连接，Ti质粒启动子后酶切位点顺序为BamH Ⅰ→Hind Ⅲ，选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切载体，而SCL14的下游（转录终止端）本身自带BamH Ⅰ位点，仅需在上游引物5'端加入Hind Ⅲ的识别序列（5′−AAGCTT−3′，共6个碱基），SCL14基因开头序列为TCGCAACGTG，后续两个碱基为TC，因此上游引物5'端前8个碱基为5'-AAGCTTTC-3'。 ②潮霉素抗性基因位于T-DNA区域，随T-DNA整合到植物基因组中，卡那霉素抗性基因位于T-DNA外，因此用含潮霉素的培养基筛选成功转入重组T-DNA的植株。 ③3:1是一对等位基因的性状分离比，说明目的基因仅插入一个染色体位点，为单拷贝，后续自交筛选纯合株系更简便；若为15:1说明目的基因插入两个非同源染色体，后续筛选纯合难度大，故优先选择分离比为3:1而非15:1或其他比例的植株的目的是确保只有1个SCLI4基因整合至细胞染色体DNA。 （3）若SCL14与 TGA3 蛋白独立调控拟南芥对 Cd 的耐受性，则突变体 S（SCL14 缺失）中 TGA3 表达量无明显差异；同时，突变体 T（TGA3 缺失）中 SCL14的表达量也无明显差异，说明两者的表达互不影响，功能上独立调控。 （4）提取总mRNA测序属于转录组分析，目的是比较两种转录组的差异性，寻找Cd胁迫下受到SCL14蛋白特异性调控的基因，明确其调控耐镉性的机制。 28．（2026·三明一中·模拟预测）韧皮部杆菌（CLas）可引起柑橘黄龙病并导致柑橘植株死亡。西南大学柑橘研究所的科研人员发现，CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。为培育抗黄龙病柑橘，研究人员进行了相关实验。 （1）据图1分析，应选限制酶________切割质粒，为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因A端引物的________（填“5′”或“3′”）端添加________（填“SphI”“Sau3AI”或“MunI”）的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）将Ti质粒转入农杆菌，在含氨苄青霉素的培养基上培养得到多个单菌落。欲鉴定某单菌落是否为重组农杆菌从而用于柑橘外植体的感染，有两种鉴定方案。方案①：挑取该单菌落提取质粒，对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。方案②：挑取该单菌落转入3mL培养液，振荡培养12小时后取1mL提取质粒，再对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。你建议选择方案________（填“①”或“②”），理由是________。 （3）为鉴定获得的转基因柑橘植株是否抗病，研究人员对甲、乙、丙三组植株进行CLas菌接种实验，一段时间后检测剩余细菌相对数量。结果如图2所示。丙组抗病效果最好，结合题干信息分析机理为________。 【答案】（1）EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ 5′ Mun Ⅰ （2）② 方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验 （3）茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果 【解析】（1）据图分析要保证正确插入，应选择双酶切，不能使用BamH I和Sau3A I，二者会破坏复制原点。可使用EcoR I和Sph I双酶切。为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因靠近启动子的A端引物的5端添加EcoR I的同尾酶Mun I识别序列，B端的5端添加Sph I的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）后续转基因植株培育需要大量的重组菌，方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验，故建议选择方案②。 （3）CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反 应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。结合图示结果：茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果。 29．（2026·福建·模拟预测）研究发现，某种深海嗜热菌产生的TaqDNA聚合酶（T酶）具有极高的热稳定性，远优于常规来源的同类酶。有人设想通过基因工程技术将该嗜热菌的T基因转入大肠杆菌，以实现T酶大规模生产，其主要技术流程如图1所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列及切割位点 NdeI EcoRI HindIII SalI （1）从嗜热菌中提取总DNA，采用PCR技术对T基因进行扩增。PCR反应体系中需添加的物质有缓冲液、_______（答出两点）、dNTP和引物等。PCR反应中引物的设计非常关键，据图表分析，扩增T基因时可供选择的两对引物是_______和_______（填选项）。 A.引物Ⅰ：……GGGAATTC……引物Ⅱ：……CTCATATG…… B.引物Ⅰ：……GAATTCCC……引物Ⅱ：……CATATGAG…… C.引物Ⅰ：……GGAAGCTT……引物Ⅱ：……AAGCTTCC…… D.引物Ⅰ：……CTCATATG……引物Ⅱ：……AAGCTTAAGCTT…… （2）图1质粒中的结构①是_______，其主要作用是_______。用质粒和T基因构建重组质粒，应选用_______两种限制酶进行切割。为了筛选出转入了质粒的受体菌，应在筛选培养基中添加_______。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌时，常先用Ca2⁺处理细胞，其目的是_______。T基因导入大肠杆菌后，若要检测该基因在大肠杆菌细胞中是否成功表达，常用的分子检测方法是_______。 （4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为进一步提高T酶的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第_______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_______。 【答案】（1）模板DNA、TaqDNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶） A B （2）启动子 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动T基因（目的基因）转录 EcoRⅠ、NdeⅠ 抗生素A （3）使大肠杆菌成为感受态细胞，让细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 抗原-抗体杂交 （4）44 第44位保守度低，替换后对T酶功能影响小，且与119位半胱氨酸空间距离近，更容易形成二硫键，提升T酶耐热性 【解析】（1）PCR反应体系需要缓冲液、模板DNA、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP、引物，题干已给出缓冲液、dNTP、引物，故还需要模板DNA和Taq酶；扩增后需要目的基因两端带有与质粒匹配的不同酶切位点，分析切割质粒和目的基因的两种限制酶Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ的识别序列和切割位点，发现AB选项的引物Ⅱ中有Nde Ⅰ的识别序列CA↓TATG，而AB选项的引物Ⅰ中都有EcoR Ⅰ的识别序列G↓AATTC，而CD中都不含，所以应选择AB。 （2）质粒上目的基因插入位点上游的①是启动子，作用是作为RNA聚合酶识别结合的位点，驱动目的基因转录；结合四种限制酶的识别序列和酶切位点，构建重组质粒时，选择EcoR Ⅰ和Nde Ⅰ切割，既可以产生不同粘性末端实现定向连接，也不会破坏质粒的标记基因；质粒的标记基因是抗生素A抗性基因，因此筛选转入质粒的受体菌需要在培养基中添加抗生素A。 （3）导入原核细胞时，Ca²⁺处理的目的是使大肠杆菌成为感受态细胞，让细胞处于能够吸收外源DNA的生理状态；检测目的基因是否成功表达出蛋白质，常用的分子检测方法是抗原-抗体杂交，依据的原理是抗原与抗体的特异性结合。 （4）要形成二硫键提升耐热性，需要满足：替换位点保守度低（保守度越高对酶功能越关键，替换后越容易影响酶功能），且与现有119位半胱氨酸空间距离近（越近越容易形成二硫键）。第44位保守度低（0.31），且与119位半胱氨酸空间距离更近，因此是最合适的替换位点。 30．（2026·漳浦第一中学·模拟预测）副猪格拉瑟菌（GPS）是定植于猪上呼吸道的一种病原菌，其细胞膜上的寡肽渗透酶（OppA）具有良好的免疫原性。为增加OppA 基因表达量，研究人员利用质粒和外源片段、强启动子构建了可以高表达OppA的GPS菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA 基因如图所示。请回答下列问题： （1）构建OppA基因过表达载体时，应该选择___________这两种限制酶切割质粒。 （2）已知OppA基因的甲链为编码链（与模板链互补的DNA链），图中OppA基因的转录方向是___________（填“从左往右”或“从右往左”）。据图分析，利用PCR 扩增OppA基因时所需的引物组合是___________，PCR连续循环5次时，共需要引物___________个。 （3）为便于与质粒连接，需对引物进行特殊处理，在其中一种引物的5'端需添加___________识别序列和强启动子，另一种引物的5'端需添加___________识别序列。已知OppA基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3'，请写出OppA基因上游引物的15个碱基序列：5'-_________-3'。 （4）为了筛选出正确串联了强启动子、OppA基因的重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型b和d加入的抗生素分别是___________、___________，得到 M、N、O三类菌落，其生长状况如下表所示（+ 表示生长，一表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是___________（填“M”“N”或“O”）类。 平板类型 菌落类型 M N O a．无抗生素 + + + b． 一 + + c．氨苄青霉素 一 + 一 d． 一 + 一 【答案】（1）BamHⅠ、SalⅠ （2）从左往右 ②③ 62 （3）BamHⅠ XhoⅠ GGATCCCATGCTTAC （4）卡那霉素 卡那霉素和氨苄青霉素 O 【解析】（1）标记基因用于筛选和鉴定成功导入了基因表达载体的受体细胞，图示所用质粒的卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，HindⅢ在这两种标记基因上都有酶切位点，会破坏质粒上的全部标记基因，所以选择HindIII进行酶切不合适。图示质粒上，除了HindIII，还剩下BamHI、SalⅠ的酶切位点，且它们仅破坏氨苄青霉素抗性基因，可以选择BamHI、SalⅠ这两种限制酶切割质粒。 （2）转录方向沿DNA模板链的3'→5'方向进行，新合成的RNA链则沿5'→3'方向延伸，图示OppA基因的甲链方向为编码链（与模板链互补的DNA链），乙链为模板链，乙链的左边为3端，OppA基因的转录方向是沿乙链的3'→5方向进行，即从左往右。PCR扩增时需要一对方向相对的引物，子链DNA的延伸方向是5'→3'，引物的3'端必须指向待扩增的DNA区域内部，以保证DNA聚合酶能向模板中间合成新链。引物与碱基互补配对的链方向相反，图中①②③④的3'端指向依次是向左、向右、向 左、向右，只有②③的3'端指向OppA基因区域内部，为所需的引物组合。，PCR连续循环5次时，共需要引物26-2=62个引物。 （3）在（1）中已经分析出在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI识别序列，且看图示转录方向可知BamHI在前，SalI在后，为了让质粒和OppA基因产生能够互补配对的相同黏性末端，以便在DNA连接酶的作用下将OppA基因定向、准确地插入质粒，需要在扩增OppA基因时，在其中一种引物的5'端添加BamHI识别序列和强启动子。预想在另一种引物的5'端添加SalI识别序列，但是SalI在OppA基因内部有酶切位点，不能使用SalI切割OppA基因，观察、比较限制酶识别序列可知SalI与XhoI切割后能产生相同的黏性末端，因此在另一种引物的5'端应当添加XhoI的识别序列。已知OppA基因甲链的碱基序列为5'-TTACAGCGCTCC-3'，则OppA基因乙链的相应碱基序列为3'-AATGTCGCGAGG-5，上游引I物（即图中的②）5端与OppA基因乙链的相应碱基序列能进行碱基互补配对，且方向相反，为：5'-TTACAGCGCTCC-3'（与甲链的碱基序列相同），再在它5端加上BamHI识别序列（5'-GGATCC-3'）和强启动子的碱基序列（5'-CATGC-3），OppA基因上游引物的15个碱基序列：5'-GGATCCCATGCTTAC-3。 （4）在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI切割质粒，它们破坏了质粒上的氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏卡那霉素抗性基因，则导入重组质粒的微生物不能在含有氨苄青霉素的培养基上生存，能在含有卡那霉素的培养基上生存。表中平板类型b和d加入的抗生素分别是卡那霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。M只能在无抗生素的培养基上生长，证明它是未导入质粒的菌落；N能在添加了卡那霉素和氨苄青霉素的培养基上生长，证明它是导入了空载质粒的菌落；O只能在无抗生素和添加了卡那霉素的培养基上生长，证明它是导入了重组质粒的菌落；根据表中结果判断，应选择的菌落是O。 31．（2026·福建闽侯一中·模拟预测）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 （2）CD （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 （4）ABC （5）P2、P4 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 32．（2026·厦门外国语学校·模拟预测）利用RNAi技术（RNA干扰）可以抑制细胞内特定基因表达。研究者选择MS26基因中的一段序列（rMS26），以PMI作为筛选标记，最终构建玉米植物重组表达载体MS26RNAi，转入到玉米幼胚中，通过植物组织培养后获得目的植株。 （注：PMI是酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因，该酶能将6—磷酸甘露糖转化为6—磷酸果糖，从而使生物体能够利用甘露糖作为碳源） 请分析回答以下问题： （1）提取玉米MS26基因形成的RNA，使用_________法合成cDNA，选择其中的一段序列rMS26用于构建RNAi载体。 （2）常用的标记基因主要是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，已经引起了社会的广泛争议。用PMI做标记基因的目的是为了_________，可转入含_________的选择培养基中实现，其优点是_________。 （3）RNAi载体结构中有一段正向和反向的rMS26，其直接目的是：_________，请据图1分析MS26基因沉默的原理：_________。 （4）T—DNA插入玉米的位置是随机的，当其插入基因内部时导致_________，这是获得植物突变体的一种重要方法。若进一步确定T—DNA是否插入MS26基因中，某同学尝试采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T—DNA的特异引物，如图2所示。（说明：两端的引物本身长度小于0．1kb，而T—DNA本身的长度约为17kb，插入基因后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。）请根据下表中三种样品的预期电泳结果判断哪个是纯合突变体_________，理由是_______________。 引物种类样品序号 LP+RP BP+RP 样品1 有大片段 无 样品2 有大片段 有小片段 样品3 无 有小片段 【答案】（1）逆转录 （2）便于重组DNA分子的筛选 甘露糖 不含抗生素抗性基因或除草剂抗性基因，对人体和环境较为安全 （3）表达出两条互补的RNA链，形成RNA双链 RNA双链被D酶切割后形成SiRNA，形成的小干扰RNA与MS26基因转录形成的mRNA部分配对，从而引起MS26基因转录形成的mRNA发生降解，MS26基因无法表达（翻译） （4）基因突变 样品3 若T-DNA插入植物体MS26基因中，BP与RP扩增会形成小片段 【解析】质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。 （1）利用RNA合成DNA的过程是逆转录。 （2）用PMI做标记基因的目的是便于重组DNA分子的筛选。由题干可知，导入PMI使植物细胞可以利用甘露糖，通过构建以甘露糖为唯一碳源的培养基，可以筛选导入重组表达载体的细胞。这样获得的转基因植物由于不含抗生素抗性基因或除草剂抗性基因，因而对人体和环境较为安全。 （3）体内基因的表达只会有一条链表达，故正向与反向的rMS26基因会表达出两条互补的RNA链。据图可知，正向和反向的rMS26基因表达产物会形成RNA双链，经修饰后，RNA双链被D酶切割后形成SiRNA，形成的小干扰RNA与MS26基因转录形成的mRNA部分配对，从而引起MS26基因转录形成的mRNA发生降解，MS26基因无法表达（翻译）。 （4）T—DNA插入玉米的基因，造成碱基的增添，属于基因突变。据题图信息可知，若T-DNA插入植物体MS26基因中，则会有BP与RP扩增形成小片段，样品3仅有小片段，故样品3为纯合突变体。 33．（2026·福建福州·二模）四硫酸盐（TTR）是肠道炎症的特异性标志物，将大肠杆菌P1改造为P3菌株，以感知并报告TTR信号，可实现对肠道疾病的无损检测。回答下列问题。 （1）构建融合基因 ①在改造载体2的过程中，研究人员通过PCR技术分别扩增pBCA启动子和cro基因，PCR反应体系中，除模板、引物，还需加入__________________（写出2点）。 ②利用PCR将pBCA启动子与cro基因进行拼接，需要对下图引物______进行设计，使其______端的序列能够互补。 （2）筛选重组菌株P3 将转化后的P3菌液涂布在培养基上进行筛选，该培养基的成分除碳源、氮源、无机盐、水、琼脂等外，还需添加______。依据菌落颜色可筛选出目标菌株的生理机制是______________________。 （3）验证P3对肠道炎症特异性检测的功能 研究人员构建肠道炎症模型小鼠并设计实验如下： ①实验分组： 甲组：__________________。 乙组：肠道炎症模型小鼠+接种P2菌株 丙组：__________________________。 ②在相同且适宜条件下饲养，定期收集粪便样本，检测粪便菌落中蓝白比例的高低。 ③预期实验结果__________________。 【答案】（1）四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、 缓冲液、Mg²⁺等 引物2和引物3 5' （2）TTR、X-gal 培养基中的TTR激活P3的pBCA启动子，启动cro基因表达，CRO蛋白抑制M蛋白的合成，解除其对cro、LacZ基因表达的抑制，使菌落呈现蓝色 （3）甲组：正常小鼠+接种P3菌株 丙组：肠道炎症模型小鼠+接种P3菌株（甲、丙可对调，相应实验结果也需调换） 预期结果：丙组小鼠粪便中蓝色菌落比例显著高于甲组和乙组 【解析】（1）PCR反应体系中，除模板和引物外，还需要原料 四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、 缓冲液、Mg²⁺等，写出任意两点即可。 拼接两个DNA片段时，需要对两个片段相邻的引物（pBCA片段的下游引物引物2、cro片段的上游引物引物3）进行设计，在两个引物的5'端添加互补序列，才能实现两个片段的拼接。 （2）根据题干信息，培养基中的TTR激活P3的pBCA启动子，启动cro基因表达，CRO蛋白抑制M蛋白的合成，解除其对cro、LacZ基因表达的抑制，使菌落呈现蓝色，因此培养基中需要添加TTR、X-gal。 （3）实验目的是验证P3可特异性检测肠道炎症（肠道炎症的TTR含量高），遵循对照原则和单一变量原则设计分组：甲组为正常小鼠（无炎症，TTR低）+接种P3，丙组为实验组（炎症模型小鼠，TTR高）+接种P3，乙组为对照组（炎症模型+接种P2）。 结果分析，甲组无 TTR，M 基因和cro基因相互抑制，LacZ几乎不表达，菌落主要呈白色，乙组P2 无载体 2，LacZ 几乎不表达，菌落主要呈白色，只有丙组（炎症+P3）中，TTR诱导cro表达产生CRO，促进LacZ表达，菌落主要呈蓝色，因此丙组小鼠粪便中蓝色菌落比例显著高于甲组和乙组。 34．（2026·福建福州·模拟预测）拟南芥开花受光照和FT基因调控，FT基因在叶中表达，在茎尖不表达。有假说认为，光照刺激拟南芥叶片中表达FTmRNA，FTmRNA运输到茎尖，促进茎尖的花芽分化。为检验该假说，科研人员运用pGreen质粒构建反义FT基因的表达载体，导入拟南芥开展实验。反义FT基因表达得到的小分子RNA会特异性结合FTmRNA并使其降解。回答下列问题： 注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。 （1）pGreen质粒结构及两种限制酶的识别序列如图所示。 ①PCR扩增反义FT基因时，需在引物的____（填“5’端”或“3’端”）添加限制酶识别序列。 ②反义FT基因需插入两个酶切位点之间，下列选项中，符合反义基因序列（阴影部分）及两端限制酶切位点的是：____（单选）。 A 5’-GAATTCTTGG………GGCCGGATCC-3’ 3’-CTTAAGAACC………CCGGCCTAGG-5’ B 5’-GGATCCTTGG………GGCCGAATTC-3’ 3’-CCTAGGAACC………CCGGCTTAAG-5’ C 5’-CTCGAGGGCC………CCAAGGATCC-3’ 3’-GAGCTCCCGG………GGTTCCTAGG-5’ D 5’-CTCGAGGGCC………CCAAGAATTC-3’ 3’-GAGCTCCCGG………GGTTCTTAAG-5’ A.A    B.B    C.C   D.D ③为获得含重组表达载体的拟南芥细胞，在添加了X–gal等成分的培养基上培养，应挑选____的颜色植物细胞进行后续研究。 （2）已知启动子有组成型启动子（可驱动基因在全身组织表达）和组织特异性启动子（仅驱动基因在不同组织中定向表达）。科研人员利用不同类型启动子进行载体改造，设置以下组别： A组：野生型拟南芥； B组：FT基因完全失活的突变体； C组：含组成型启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥； D组：________________； E组：________________。 ①完善实验分组。 ②已知A组正常开花，B、C组延迟开花。预期D、E组结果为____________，则否定该假说。 【答案】（1）5’端 B 蓝色 （2）D组：含叶组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥 E组：含茎尖组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥 D组延迟开花，E组正常开花 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）①DNA聚合酶将脱氧核苷酸原料连接在引物的3’端，及子链的延伸方向是5’端→3’端；PCR扩增反义FT基因时，需在引物的5’端添加限制酶识别序列。 ②FT mRNA上与反义RNA结合的序列为 5’-GGCC------CCAA-3’，即反义RNA的序列为5’-UUGG----GGCC-3’，反义RNA的对应的FT 基因模板链序列为3’-AACC---CCGG-5’，反义RNA的对应的FT基因的编码链为5’-TTGG----GGCC-3’，根据质粒可知，反义RNA的对应的FT 基因序列需要插入启动子后，反义RNA的对应的FT 基因模板链3’端位于启动子的下游，反义FT基因需插入两个酶切位点之间，根据质粒上的酶切序列可知，反义FT基因左侧加BamH I，右侧加EcoR I，由此可知，符合反义基因序列（阴影部分）及两端限制酶切位点的是5’-GGATCCTTGG………GGCCGAATTC-3’，3’-CCTAGGAACC………CCGGCTTAAG-5’，B正确，ACD错误。 故选B。 ③LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色；由于反义FT基因插入质粒时没有破坏LacZ基因，在添加了X–gal等成分的培养基上培养，含重组表达载体受体细胞（拟南芥细胞）应该呈现蓝色，故应挑选蓝色植物细胞进行后续研究。 （2）实验目的是利用不同类型启动子进行载体改造，自变量应该是不同类型的启动子，实验应该遵循对照原则、单一变量原则和无关变量一致原则等，根据题意：A组：野生型拟南芥（对照）；B组：FT基因完全失活的突变体；C组：含组成型启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥；D组：含叶组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥；E组：含茎尖组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥；结合题意，可预期D、E组结果为D组延迟开花，E组正常开花。（D、E组顺序可对调） 35．（2026·福建泉州·二模）自然杀伤细胞（NK）是免疫细胞，能非特异性识别肿瘤细胞。为探究NK细胞表面CD226分子在小鼠溃疡性结肠炎中的作用，研究人员利用Cre-loxP系统敲除NK细胞上的CD226分子，获得NK特异性CD226基因敲除鼠。 （1）Cre-loxP系统由loxP序列和Cre酶两部分组成。loxP是一段具有方向性的特殊碱基序列，而Cre酶可识别DNA分子中loxP序列，当DNA上存在两个同向loxP序列时，Cre酶可将两个loxP序列之间的DNA序列剪除，并促使切口重新连接，其中重组形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的（图1）。Cre酶起到类似____（填“限制酶”“DNA连接酶”或“限制酶和DNA连接酶”）的作用，对DNA序列中的____键发挥作用。 （2）利用Cre-loxP系统在小鼠体内实现对CD226基因的敲除，首先需要建立Cre和Flox两种小鼠（图2）。 注：1.NCR1是一种主要在NK细胞表达的细胞膜上的免疫受体。 38.NCR1+Cre是指将Cre基因插入NCR1中。 39.Cre/+是指两条同源染色体中的一条具有Cre基因，另一条+为野生型。 40.f/f是指两条同源染色体都带有Loxp序列。 ①NK细胞由____细胞分化而来，属于机体抵御病原体攻击的第____道防线。 ②将Cre基因插入NCR1中的目的是____。 ③上述两只小鼠杂交，获得的F1（Cre/+，f/+）与Flox小鼠（+/+，f/f）杂交，子代通过基因型鉴定，筛选出基因型为____（填选项）的小鼠即为NK特异性CD226基因敲除鼠。 ACre/+，f/+    B.Cre/+，f/f    C.+/+，f/+    D.+/+，f/f （3）Cre-loxP系统还能实现基因在特定的组织细胞中表达。利用下列元件构建一个在NK细胞中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cre-loxP系统，完善下图___。 【答案】（1）限制酶和DNA连接酶 磷酸二酯键 （2）造血干细胞 2 利用NCR1的启动子，让Cre基因仅在NK细胞中表达，实现仅在NK细胞中敲除CD226基因的目的 B （3）将Cre基因置于NCR1启动子后，使其仅在NK细胞中表达；将STOP转录终止信号盒置于两个同向loxP序列之间，启动子在loxP上游，GFP在loxP下游。NCR1启动子使Cre基因仅在NK细胞表达产生Cre酶，Cre酶敲除了启动子和GFP基因之间的STOP转录终止信号盒，使GFP基因能正常表达，而在其他组织细胞中，由于缺乏Cre酶，STOP转录终止信号盒阻止GFP基因的正常表达。从而实现仅在NK细胞中特异性表达绿色荧光蛋白的目的 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取 从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 （3）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。 将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）从题干信息来看，Cre酶行使切割和连接DNA的功能，因而起到类似限制酶和DNA连接酶的作用，作用于磷酸二酯键。 （2）①从题干可知，NK细胞是免疫细胞，且能非特异性识别肿瘤细胞，所以，NK细胞由（骨髓）造血干细胞分化而来，其发挥的免疫作用属于非特异性免疫，属于抵御病原体攻击的第2道防线。 ②NCR1是一种主要在NK细胞表达的细胞膜上的免疫受体。将Cre基因插入NCR1中的目的是利用NCR1的启动子，让Cre基因仅在NK细胞中表达，实现仅在NK细胞中敲除CD226基因的目的。 ③F1（Cre/+，f/+）与Flox小鼠（+/+，f/f）杂交，子代有4种类型：Cre/+，f/+、Cre/+，f/f、+/+，f/+、+/+，f/f，其中Cre/+，f/f不仅具有Cre基因，可在NK细胞中特异性表达Cre酶，且CD226基因所在的两条同源染色体的CD226基因两端都具有同向loxP序列，可以将NK细胞中的CD226基因完全敲除。 故选B。 （3）将Cre基因置于NCR1启动子后，使其仅在NK细胞中表达；将STOP转录终止信号盒置于两个同向loxP序列之间，启动子在loxP上游，GFP在loxP下游。NCR1启动子使Cre基因仅在NK细胞表达产生Cre酶，Cre酶敲除了启动子和GFP基因之间的STOP转录终止信号盒，使GFP基因能正常表达，而在其他组织细胞中，由于缺乏Cre酶，STOP转录终止信号盒阻止GFP基因的正常表达。从而实现仅在NK细胞中特异性表达绿色荧光蛋白的目的。 36．（2026·厦门双十中学·模拟预测）人肺特异性X蛋白（LUNX）基因是某种肺癌诊断的标志物，增强子是基因转录的调控序列，对启动子具有促进作用。为了研究LUNX基因的增强子发挥作用的最佳位置是位于启动子的上游还是下游，科研人员从人类全基因组序列数据库中筛选并扩增了3个LUNX基因增强子片段（En，表示E1~E3），分别将每个En片段定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因（luc+）启动子（SV40启动子）的上游或SV40终止序列的下游，通过检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断。luc+的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。相关信息见下图，回答下列问题。 （1）PCR每次循环一般可以分为_______三步。在上述实验的PCR反应体系中共需要设计_______种引物；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5'端需要引入的限制性酶切位点有_______种。 （2）将以上获得的En经酶切后分别定向连接到用对应限制酶处理的pGL3载体中，构建重组载体，利用相关实验技术对荧光素酶活性进行检测，结果如图所示。 ①根据结果得出的结论是_______。 ②据图判断，对luc+表达促进作用最大的增强子的引物5'端需添加_______限制酶的识别序列。 （3）半夏蛋白具有抗肿瘤等作用，科研人员提取半夏块根细胞中总RNA，纯化获得mRNA，后在逆转录酶的作用下获得不同大小片段的半夏蛋白cDNA。构建高效表达半夏蛋白的重组质粒是利用基因工程实现大规模生产半夏蛋白的核心工作，人员甲设想如下：根据实验室现有质粒A的限制酶识别位点，在E1增强子引物的5'端添加相应的限制酶识别序列，以此为引物，进行PCR扩增，得到足够数量的半夏蛋白cDNA，再与质粒A拼接，从而获得高效表达半夏蛋白的重组质粒，再进行后续实验。按此设想，甲进行了PCR、电泳操作，结果无相应条带出现，判断是扩增失败了。经检查，PCR所用的缓冲液、dNTP、Taq酶均正常，PCR操作程序正确，请分析扩增失败原因并提出改进措施： ①失败原因：_______。 ②改进措施：_______。 【答案】（1）变性、复性和延伸 12 4 （2）增强子E1、E2和E3在启动子（或SV40终止序列）的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著；E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达 BamH I、Sal I （3）原扩增E1增强子的引物无法与半夏蛋白cDNA片段的两条模板链充分配对，实现复性 对半夏蛋白cDNA两端进行测序，重新设计引物 【解析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸。图中上游和下游的限制酶识别序列不同，当E1、E2、E3分别插入上游和下游时有6种情况，故共有12种引物用于PCR反应体系；目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3'端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5'端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，即在引物5'端需要引入的限制性酶切位点为4种。 （2）①比较图中荧光素酶活性，与只导入pGL3载体相比，增强子E1、E2和E3在启动子（或SV40终止序列）的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著；E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。②由于E1在SV40终止序列的下游增强作用最大，SV40终止序列下游的酶切位点是BamH I、Sal I，故需添加BamH I、Sal I的酶切序列。 （3）PCR反应的条件是缓冲液、原料（dNTP）、两种引物、Taq酶、温度等，其中最关键的是引物设计，在其他程序均正常的情况下，失败原因是引物设计不合理，原扩增E1增强子的引物无法与半夏蛋白cDNA片段的两条模板链充分配对，实现复性。改进措施是对半夏蛋白cDNA两端进行测序，重新设计引物。 37．（2026·福建漳浦第一中学·模拟预测）生物制造是推动我国高质量发展的重要新质生产力。2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）是一种具有改善肠道健康等功能的婴儿配方食品成分。我国科学家通过基因工程技术动态调节枯草芽孢杆菌的代谢过程，提高2′-FL的产量。 回答下列问题： （1）已知futC和pfkA分别是2′-FL合成和菌体生长的关键基因（下图）。研究人员构建了持续高表达futC基因的枯草芽孢杆菌并进行发酵实验，结果显示2′-FL产量较低，推测原因很可能是___________。因此，理想的合成过程为：前期两种基因的表达状态是___________，待菌体数量达到一定值后两种基因的表达正好相反，从而实现2′-FL的高产。 注：枯草芽孢杆菌本身不含futC基因，需外源导入。 （2）为了实现2′-FL的高产，研究人员利用温度作为“开关”来动态调控相关代谢基因的表达，并由此构建了质粒1和质粒2（下图），利用荧光蛋白基因进行功能测试。 ①构建质粒1的目的是实现基因的温控激活。在30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，使RNA聚合酶无法结合到该区域；37℃时，C蛋白失活下游基因启动表达。若在测试过程中观察到___________，说明质粒1构建成功。 ②质粒2的CRISPRi系统中，人工设计的crRNA（一种RNA分子）可通过碱基互补配对识别靶基因，引导dCpfl蛋白结合并抑制靶基因转录。利用由启动子P2驱动的红色荧光蛋白基因测试质粒2的功能。上图中P1和P2应分别为___________型启动子。若在测试过程中观察到___________，说明质粒2构建成功。 （3）在实际2′-FL的生产中，需要将测试完成的质粒1和质粒2中的基因进行替换，质粒1中将绿色荧光蛋白基因替换为___________，质粒2中将___________。 【答案】（1）持续的2′-FL合成影响了菌体正常生长 pfkA基因高表达，futC基因低表达 （2）37℃时荧光强度高于30℃ 温度诱导型、持续表达型 37℃时荧光强度低于30℃ （3）futC基因 靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向pfkA基因的crRNA基因 【解析】（1）从代谢路径图可以看到，持续高表达futC基因，会与pfkA基因竞争中间体，导致菌体生长所需的中间体不足，菌体生长受抑制，菌体数量不足，即持续的2′-FL合成影响了菌体正常生长，最终2'-FL总产量较低。要实现高产，需要分两个阶段，前期：需要让菌体快速生长、积累足够的生物量，因此需要pfkA基因高表达，futC基因低表达，让中间体优先用于菌体生长，保证菌体数量达到一定水平。后期：菌体数量足够后，需要让中间体优先用于2'-FL合成，因此futC基因高表达，pfkA基因低表达，实现2'-FL的高产。 （2） ①质粒1中，C基因由持续表达型启动子驱动，持续合成C蛋白；绿色荧光蛋白基因由温度诱导型启动子驱动。30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，使RNA聚合酶无法结合到该启动子区域，绿色荧光蛋白基因不表达；37℃时，C蛋白失活，下游温度诱导型启动子激活，RNA聚合酶结合启动子，启动绿色荧光蛋白基因表达。 因此，若测试成功，会观察到：37℃时荧光强度高于30℃。 ②CRⅠSPRi系统的功能是抑制靶基因转录，需要可调控的启动子来控制该系统的表达，从而实现对靶基因的动态抑制。质粒1用了温度诱导型启动子实现温控，因此质粒2中，CRISPRi”系统的启动子P1，应与质粒1的绿色荧光蛋白基因启动子类型一致，为温度诱导型；红色荧光蛋白基因由启动子P2驱动，用于测试质粒2功能，P2应为持续表达型。30℃时，CRISPRi”系统不表达，红色荧光正常发光；37℃时，CRISPRi”系统表达，抑制红色荧光蛋白基因的转录，红色荧光消失或减弱。因此，若构建成功会观察到：37℃时荧光强度低于30℃。 （3）前期需要pfkA高表达、futC低表达，后期需要futC高表达、pfkA低表达。质粒1的功能是温控激活基因表达，因此将绿色荧光蛋白基因替换为futC基因；质粒2的CRISPRi”系统功能是温控抑制基因表达，因此需要将crRNA基因的靶基因改为pfkA基因，即靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向pfkA基因的crRNA基因。 38．（2026·漳浦第一中学·一模）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 （1）大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子是_________的部位，驱动基因转录出mRNA。细胞中氨基酸在_________中以该mRNA为模板合成苏氨酸合成酶。 （2）当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。分别利用三种具有持续表达活性的启动子和A基因、红色荧光蛋白（RFP）基因构建表达载体并导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图。 ①该实验的目的是_________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是_________。 （3）W-01菌株具有更高的苏氨酸产量，但其生长明显弱于菌株W和其他工程菌，从物质与能量的角度，推测原因是_________。 （4）大肠杆菌拟核中有一个环状DNA分子，其上的F基因是调控细胞分裂的主要基因，当其表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，这种菌株细胞体积和细胞内基因表达产物增加。综合利用上述信息，设计一个插入W-01菌株F基因启动子与编码区之间的表达元件（如图），制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，且该工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长①_________②_________③_________。 【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合 核糖体 （2）探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响 A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 （3）外源基因表达及苏氨酸大量合成消耗菌体中的物质和能量 （4）氯霉素抗性基因 终止子 活性低的启动子 【解析】（1）RNA聚合酶可以识别并结合大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子，驱动基因转录出mRNA。翻译的模板是mRNA，原料是氨基酸，在核糖体中以脱水缩合的形式合成苏氨酸合成酶。 （2）①图示的处理是构建了三种不同的A基因表达载体，实验结果显示不同的A基因表达载体会影响大肠杆菌菌株苏氨酸的产量，因此分析可知，该实验的目的是探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响。 ②与菌株W相比，工程菌W-01的不同点是导入了A基因，且已知A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞，因此推测工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱。 （3）各种菌株细胞代谢产生的总能量基本相同，但W-01菌株中更多的能量用于外源基因表达及苏氨酸大量合成，而用于生长的能量较少，因此W-01菌株生长明显弱于菌株W和其他工程菌。 （4）实验目的是通过基因工程的手段制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，只有当F基因表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，因此在F基因编码区前面插入活性低的启动子，减少F基因的表达。本实验要求工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长，因此表达元件中需要插入氯霉素抗性基因，此外基因的转录需要启动子和终止子，综合分析，①②③分别是氯霉素抗性基因、终止子、活性低的启动子。 39．（2026·福建莆田·二模）多种霉菌能产生T-2毒素污染饲料，引起家猪中毒。我国科学家将C3A酶基因导入家猪受精卵内，获得肝脏细胞具有降解T-2毒素能力的转基因家猪。C3A酶含有R和Q两个功能区，质粒、C3A酶基因及两个功能区对应序列的相关结构如图1所示。 （1）科研人员在对C3A基因扩增时选用的A、B两端引物分别是_______。为保证目的基因与载体正确连接，应在A、B两端分别添加限制酶_______的识别序列。 （2）要实现目的基因仅在家猪的肝脏细胞中表达，应将其与_______等调控元件重组在一起。将基因表达载体导入受精卵后在含_______的培养液中培养，能存活的细胞即为含有基因表达载体的受精卵。 （3）成功培育的转基因家猪对T-2毒素的降解效果不佳。研究发现，家猪体内PM蛋白能抑制C3A酶活性，影响解毒效果。为了探究PM蛋白作用机理，科研人员扩增了3种不同长度的C3A基因片段（图2），并将其分别插入带有FLAG标签序列的质粒中，构建了3种含融合基因的质粒：F-C（Full）、F-C（RΔ）、F-C（QΔ），分别转染受体细胞并表达。收集3种融合蛋白并将其与PM蛋白按照图3的组合方式分成4组实验，分组流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质再用PM抗体检测，结果如图3所示。 ①分析：对照组Ⅰ的作用是说明PM蛋白不与_______结合。 ②结论：PM是通过与C3A酶的_______（填“R”或“Q”或“R和Q”）功能区的结合来抑制C3A酶的活性。 ③除了开发能降解PM蛋白的药物外，请基于上述实验结论，为提高家猪解毒能力提出一条新的药物研发思路：_______。 【答案】（1）L39、R1 HindⅢ、EcoRⅠ （2）肝脏细胞特异性表达的启动子 G418和DHPG （3）FLAG抗体 R 研发能抑制PM蛋白与C3A酶R功能区结合的药物 【解析】（1）要扩增C3A酶基因，引物需要和基因两端的序列互补配对。从图1能看到，A端的L2引物和R功能区的左端序列互补，B端的R1引物和Q功能区的右端序列互补，所以选用的A、B两端引物分别是L2、R1。观察质粒和目的基因的酶切位点：质粒上有Hind Ⅲ和EcoR I的酶切位点，目的基因A端对应Hind Ⅲ的识别序列（5'-AGCTT-3'），B端对应EcoR I的识别序列（5'-GAATTC-3'）。为保证目的基因与载体正确连接，防止自身环化和反向连接，应在A、B两端分别添加限制酶HindⅢ、EcoR I的识别序列。 （2）若要实现目的基因在家猪肝脏细胞中表达，应将其与肝脏细胞特异性表达的启动子等调控元件重组在一起，因为启动子是RNA聚合酶结合的部位，能启动基因转录，且具有组织特异性。 已知含有neor基因的细胞具有G418抗性，Hsv基因的产物能把DHPG转化成有毒物质使细胞死亡，所以可在含G418和DHPG的培养基中对细胞进行选择，能存活的细胞含有目的基因且能在肝脏细胞中表达。 （3）①对照组I中只加入了PM蛋白，没有加入融合蛋白，用PM抗体检测没有出现条带，这说明PM蛋白不与FLAG抗体结合，排除了FLAG抗体对实验结果的干扰。 ②F-C（Full）和PM混合后，能被PM抗体检测到条带，说明全长C3A酶能和PM结合； F-C（RΔ）（缺失R功能区）和PM混合后，没有条带，说明缺失R功能区后无法和PM结合； F-C（QΔ）（缺失Q功能区）和PM混合后，有条带，说明缺失Q功能区不影响和PM结合。 由此可以得出结论：PM是通过与C3A酶的R功能区的结合来抑制C3A酶的活性。 ③根据实验结论，研发思路可以是研发能抑制PM蛋白与C3A酶R功能区结合的药物，从而解除PM蛋白对C3A酶活性的抑制。 40．（2026·福建漳州·模拟预测）科研人员研发出一套基于近红外光的光控开关系统-NIR系统，该系统由近红外光响应调控元件和目的基因调控元件组成，可实现对目的基因表达的精准调控。回答下列问题： （1）已知转座子质粒上的转座片段能被转座酶切割并整合到受体菌的基因组中。利用转座酶和图1所示的转座子质粒，将近红外光响应调控元件整合到沙门氏菌拟核中。 ①据图1分析，构建基因表达载体时，利用PCR技术扩增近红外光响应调控元件时，应在引物两端添加_______限制酶识别序列。延伸温度下发生的扩增过程是_______。 ②将转化后的沙门氏菌液稀释涂布在无抗生素平板上培养。在此基础上，进一步筛选目的沙门氏菌的实验思路是_______。 （2）M基因编码的M蛋白是一种转录激活因子，与c-di-GMP结合能激活特定的启动子。为实现近红外光对目的基因表达的精准控制，构建图2所示的NIR系统时，P基因和B基因选用可持续驱动基因表达启动子，目的基因应选用的启动子为：_______。 （3）NIR系统的目的基因为荧光素酶基因时，用710nm近红外光进行处理，检测结果如图3和图4所示。 ①结合图推测，黑暗时发光强度近为零的原因是______________。 ②结果表明，NIR系统要发挥好的效果应选用______________处理。 【答案】（1）EcoRI、HindIII 耐高温的DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA子链 将同一菌落的沙门氏菌分别用含氨苄青霉素和卡那霉素培养基进行培养，在含卡那霉素的培养基生长，在含氨苄青霉素的培养基中不生长的则为筛出的目的沙门氏菌 （2）M蛋白-c-di-GMP复合物依赖型启动子 （3）黑暗时，P酶光响应活性低，催化产生c-di-GMP少，Y酶降解c-di-GMP，使c-di-GMP与M蛋白结合少，启动子难以驱动荧光素酶基因表达 近红外光光照强度为6mWcm-2、光照时间为1小时 【解析】（1）①从图1的转座子质粒可以看到，转座片段的两侧是EcoRI和HindIII的酶切位点，为了让扩增的近红外光响应调控元件能插入到转座子质粒的转座片段中，所以要在引物两端添加EcoRI、HindⅢ限制酶识别序列，这样才能保证酶切后产生的黏性末端匹配，完成重组质粒构建。 PCR的延伸阶段，是耐高温的DNA聚合酶（比如Taq酶）按照碱基互补配对原则，将4种脱氧核苷酸合成DNA子链，实现目的片段的延伸扩增。 ②从图1质粒标注可以看到，转座片段上携带卡那霉素抗性基因，而原质粒的氨苄青霉素抗性基因在转座片段外。当转座子整合到沙门氏菌拟核中，成功导入近红外光响应调控元件的沙门氏菌会获得卡那霉素抗性，但失去氨苄青霉素抗性（因为转座片段脱离了原质粒，原质粒未整合到宿主基因组）。所以筛选思路是将同一菌落的沙门氏菌分别用含氨苄青霉素和卡那霉素培养基进行培养，在含卡那霉素的培养基生长，在含氨苄青霉素的培养基中不生长的就是成功导入的目的沙门氏菌。 （2）M蛋白是一种转录激活因子，与c-di-GMP结合后能激活特定的启动子。P基因和B基因用可持续驱动的启动子，是为了持续表达相关蛋白，而目的基因需要实现近红外光的精准控制：只有在近红外光存在时，才能逐步产生c-di-GMP，进而和M蛋白结合激活目的基因的启动子。所以目的基因应选用M蛋白-c-di-GMP复合物依赖型启动子，这样才能实现只有当近红外光触发相关通路产生c-di-GMP后，目的基因才会被激活表达。 （3）①根据图2的NIR系统流程和图3、图4黑暗时荧光强度近零的结果可以推断：黑暗环境下，P酶的光响应活性低，催化产生的c-di-GMP数量很少，同时Y酶还会降解c-di-GMP，导致细胞内c-di-GMP浓度极低，无法和M蛋白形成足够的复合物，也就无法激活荧光素酶基因的启动子，所以荧光强度接近零。 ②观察图3可以看到，当光照强度达到6mWcm⁻²时，荧光强度达到较高水平且继续提升幅度变小；观察图4可以看到，光照时间到1小时后，荧光强度也达到较高水平且后续提升不明显。所以NIR系统要发挥好的效果应选用近红外光光照强度为6mWcm-2、光照时间为1小时的处理条件。 41．（2026·福建漳州·模拟预测）H蛋白在各类细胞中广泛存在，对免疫功能具有促进作用，但正常情况下表达水平较低。研究人员将乙肝病毒B抗原基因与质粒D结合为重组质粒DB，研发了乙肝DNA疫苗；进一步利用H基因对乙肝DNA疫苗进行改造，开展了一系列实验。回答下列问题： 限制酶 识别序列 Sph I 5′-GCATG↓C-3′ BamH I 5′-G↓GATCC-3′ Pst I 5′-CTGCA↓G-3′ EcoR I 5′-G↓AATTC-3′ Xho I 5′-C↓TCGAG-3′ Nde I 5′-CA↓TATG-3′ 注：①引物横线处为限制酶识别序列②识别序列箭头处为切割位点 （1）研究人员设计了特异性引物，用PCR技术从结核杆菌中获取H基因。在__________的催化下，子链从引物的________（填“3'端”或“5'端”）延伸。 （2）PCR合成的子链末端会多出一个腺嘌呤核苷酸（A）。根据这个特点，研究人员设计一种3'端各多出一个胸腺嘧啶核苷酸（T）的线性载体P，将其与PCR扩增的H基因混合构建重组质粒PH，并导入大肠杆菌进行扩增。与常规操作相比，该方法能快速构建表达载体的原因是无需用___________酶处理载体和目的基因。通过该方法得到的重组质粒至少有两种，原因是_________。 （3）质粒D能在真核细胞中表达，用________（填限制酶）对重组质粒PH中的H基因和质粒D进行处理，构建重组质粒DH。为检测H基因表达情况，将小鼠细胞分三组进行实验，培养一段时间后提取蛋白质进行电泳，结果如下图。 注：①组导入重组质粒DH，②组导入质粒D，③组不处理；β-actin蛋白在真核细胞中表达相对恒定，蛋白质电泳实验中常以它为参照 从结果判断导入小鼠细胞后重组质粒PH中的H基因_____________（填“能”或“不能”）正常表达，判断依据是___________。 （4）为探究H蛋白在细胞中同步表达时对乙肝DNA疫苗激发特异性免疫的影响，研究人员选择三种不同质粒分别注射入三组小鼠体内，定期检测抗体水平进行验证。其中空白对照组注射质粒D，另两组应选择质粒____________。 【答案】（1）Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶） 3′端 （2）限制 载体P和H基因两端都是A-T配对，连接无方向性；H基因可能产生正反两种连接方式 （3）BamH I  和  EcoR I 能 第①组 -actin条带正常，且H蛋白电泳条带比另外2组更粗 （4）乙、丙 【解析】（1）PCR 技术需要热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。 DNA 的合成方向是5'→3'，子链从引物的3' 端开始延伸。 （2）常规构建重组质粒需要限制酶切割产生黏性末端，再用DNA 连接酶连接；本题利用 PCR 产物 3' 端 A 与载体 3' 端 T 的T-A 配对直接连接，无需用限制酶切割载体和目的基因。 H基因插入载体时方向不唯一，可进行正向或反向连接，因此重组质粒至少两种。 （3）需要看题干中的引物设计图，H基因的引物两端分别带有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，用这两种酶切割，可以完整切出H基因，同时与质粒D的相应位点匹配。电泳结果中，β-actin是内参蛋白（表达恒定），用于确认实验操作正常，第①组（导入重组质粒DH）出现更粗的H蛋白条带，第②组（质粒D）和第③组（不处理）几乎没有H蛋白条带，说明H基因在真核细胞中成功表达。 （4）实验目的是探究H蛋白对乙肝DNA疫苗（含B抗原基因）免疫效果的影响，自变量为是否存在H基因；空白对照组为空质粒D，另外两组应为：仅含B抗原基因的原疫苗（质粒乙）、同时含B抗原基因和H基因的改造疫苗（质粒丙），因此选择乙和丙。 42．（2026·福建三明·二模）隐花色素（CRY2）是植物中普遍存在的蓝光受体，广泛参与植物的生长和发育过程。研究团队利用某种植物的野生型植株（WT）和CRY2缺陷型植株，探究CRY2对根长的影响，结果如图1所示。 （1）光作为一种________，影响、调控植物生长发育的全过程。据图分析，在黑暗条件下，CRY2可以抑制根的生长，而蓝光可以________（填“增强”或“解除”）这一抑制作用。 （2）研究发现，黑暗中无活性的CRY2通过与FLs蛋白结合，降低FLs蛋白与染色质的结合，从而降低与细胞分裂相关基因的表达，抑制根系发育。 为验证这一机制研究团队利用质粒1、2构建重组质粒导入某营养缺陷型酵母菌等进行以下实验： ①利用图2中质粒1和________构建重组质粒1，使其能指导合成FLs-AD重组蛋白。 ②构建含BD和CRY2蛋白融合基因的重组质粒2：为使CRY2基因能够正确地插入质粒2，如图2所示，利用PCR技术扩增CRY2基因时两端应该引入________酶切位点（4种限制酶产生的末端不同）。 ③将上述步骤构建的重组质粒侵染图3的营养缺陷型酵母菌（不能合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤）后接种在不同类型的平板上，并观察菌落出现情况，结果如表所示。 组别 平板类型 酵母菌菌落 甲组 不含色氨酸 有 乙组 不含亮氨酸 有 丙组 不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤 有 该实验结果验证了上述机制，请结合图表分析原因：________。 ④在上述实验的基础上，用蓝光照射甲、乙、丙组的平板，观察菌落的生长情况，若________，则证明蓝光条件下CRY2与FLs的结合可被解除。 【答案】（1）信号 解除 （2）FLs基因 Nde Ⅰ和Sma Ⅰ 丙组不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤，但是该酵母菌能正常生存，说明重组质粒1、2成功导入酵母菌，同时表达了FLs蛋白与CRY2能够结合，启动组氨酸和腺嘌呤基因的表达 甲组和乙组均长出菌落，丙组无菌落产生 【解析】（1）光作为一种信号分子，能够影响、调控植物生长发育的全过程。分析图1，在黑暗条件下，野生型植株（含CRY2）根长比CRY2缺陷型植株根长短，说明CRY2可以抑制根的生长，而在蓝光条件下，野生型植株根长比黑暗条件下长，且比CRY2缺陷型植株根长也长，所以蓝光可以解除这一抑制作用。 （2）①要构建能指导合成FLs-AD重组蛋白的重组质粒1，需利用图2中质粒1和FLs基因，这样才能实现相应蛋白的合成。 ②构建含BD和CRY2蛋白融合基因的重组质粒2，为使CRY2基因能够正确地插入质粒2，CRY2基因应拼接在启动子和终止子之间，且需要和BD基因连接在一起，结合图2中质粒2的限制酶切位点情况，利用PCR技术扩增CRY2基因时两端应该引入Nde Ⅰ和Sma Ⅰ酶切位点。 ③在图3营养缺陷型酵母菌中，其不能合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。甲组平板不含色氨酸有菌落，质粒2上有合成色氨酸的基因，说明重组质粒2成功导入酵母菌；乙组平板不含亮氨酸有菌落，质粒1上有合成亮氨酸的基因，说明重组质粒1成功导入酵母菌；丙组平板不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤有菌落，说明重组质粒1、2成功导入酵母菌，重组质粒1能指导合成FLs-AD重组蛋白，重组质粒2能指导合成CRY2-BD重组蛋白，即同时表达了FLs蛋白与CRY2能够结合，启动组氨酸和腺嘌呤基因的表达。 ④在上述实验基础上，用蓝光照射甲、乙、丙组的平板，若蓝光条件下CRY2与FLs的结合可被解除，那么BD和AD无法靠近结合，无法启动组氨酸、腺嘌呤合成基因的转录，酵母菌无法合成组氨酸和腺嘌呤，因此甲组和乙组均长出菌落，丙组无菌落产生。 43．（2026·福建龙岩·二模）TOC1是起源最古老的生物钟核心基因之一，为研究TOC1基因的调控转录机制，研究人员开展了以下实验，回答下列问题： （1）利用PCR技术获取与扩增TOC1基因，构建基因文库： ①PCR反应体系中除加入模板、四种脱氧核苷酸、扩增缓冲液外，还需加入______，若复性温度过高，会引起______的现象，从而降低扩增效率。 ②将PCR获得的基因片段与______连接起来导入大肠杆菌中保存备用。 （2）研究两种蛋白质（如X和Y）能否相互作用常用酵母双杂交技术。酵母菌的某种转录激活因子是一种复合蛋白，由DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）两个独立结构域构成，X和Y能相互作用时，BD和AD在空间上才能靠近，形成完整的转录激活因子，激活酵母菌报告基因的转录（图1）。已知53蛋白与T蛋白能够相互作用，从而启动酵母体系中某报告基因表达，合成组氨酸并导致菌落显蓝色。一种观点认为：TOC1蛋白也需要与某种蛋白结合后再激活基因表达。针对该观点，科研人员进行相关研究，请回答： ①为构建重组质粒，据图2分析，PCR获取TOC1基因时需在上游引物和下游引物的5'端分别添加限制酶______和______的识别序列。 ②构建人工质粒：pBD-TOC1、pBD-53、pAD-T、pBD-Lam、pAD，5种质粒均能正常表达相应蛋白产物，其中Lam蛋白不能与T蛋白结合，酵母细胞中其它蛋白与报告基因激活过程无关。科研人员进行相关实验，利用筛选平板（缺少组氨酸）进行培养观察，实验处理及结果如下表所示。 实验分组 质粒组合 菌落生长情况及显色情况 实验结论 阳性对照组 pBD-53、pAD-T 正常生长，菌落呈蓝色 报告基因激活 阴性对照组 pBD-Lam、pAD-T 无菌落生长 报告基因未激活 待测组 pBD-TOC1、pAD 正常生长，菌落呈蓝色 ？ 分析表中内容，推测待测组中报告基因_______（填“激活”或“未激活”），结合结论说明你赞同或反对观点“TOC1蛋白也需要与某种蛋白结合后再激活基因表达”的理由：_______。 【答案】（1）引物（对）、Taq DNA聚合酶（耐高温DNA聚合酶） 引物与模板结合效率低 质粒（运载体） （2）BamHⅠ EcoRⅠ 激活 反对，因待测组细胞中无与TOC1结合的特定蛋白，说明报告基因的激活，可能是 BD-TOC1蛋白独立作用，并不需要与AD蛋白拉近（或：只需TOC1蛋白就可拉近BD与AD），与上述观点不同 【解析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。 （1）①PCR 反应体系中除加入模板、四种脱氧核苷酸、扩增缓冲液外，还需加入引物和Taq DNA聚合酶（耐高温DNA聚合酶），若复性温度过高，会引起引物与模板结合效率低，从而降低扩增效率。 ②将 PCR 获得的基因片段与质粒（运载体）连接起来导入大肠杆菌中保存备用。 （2）①据图 2 分析，由于质粒上存在EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，因此PCR获取 TOC1基因时需在上游引物和下游引物的 5' 端分别添加限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列。 ②根据表格内容可知，菌落正常生长，呈蓝色，因此待测组中报告基因激活；反对“TOC1蛋白也需要与某种蛋白结合后再激活基因表达”，理由：因待测组细胞中无与TOC1结合的特定蛋白，说明报告基因的激活，可能是 BD-TOC1蛋白独立作用，并不需要与AD蛋白拉近（或：只需TOC1蛋白就可拉近BD与AD），与上述观点不同）。 44．（2026·福建厦门双十中学·模拟预测）为培育耐盐碱大豆新品种，科研人员把耐盐碱基因OsJRL40和荧光素酶基因构建成融合基因，荧光素酶可催化荧光素产生荧光以检测融合基因表达产生融合蛋白的情况，部分操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中DEX启动子在DEX诱导下才可发挥作用；AUG为起始密码子，UAA、UGA、UAG为终止密码子。回答下列问题。 （1）图中构建基因表达载体时，切割载体用到的限制酶有________。与单酶切相比，双酶切的优点是________（答出1点）。已知OsJRL40基因转录的非模板链的序列为：5′-ATGATCCAG……GCTGACTAG-3′，为构建融合基因，需去除OsJRL40基因上________，引物2的前10个碱基序列为________。（用字母） A．5′-AGATCTCTAG-3′ B．5′-AGATCTGTCA-3′ C．5′-GATCCTAGTC-3′ D．5′-GATCGTCAGC-3′ （2）在培养大豆细胞的基本培养液中添加________，若检测结果为________说明转化成功。成功后需要去除荧光素酶基因，已知Cre酶可以将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，因此在设计引物3和引物4时需要在限制酶识别序列的________（填“5′端”或“3′端”）添加loxP序列。 （3）为检测荧光素酶基因是否被成功敲除，可用PCR技术进行鉴定。 实验组：首先提取在有DEX环境下培养的转基因大豆细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入上图中的一对引物________进行PCR扩增后用BglⅡ完全切割，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无OsJRL40基因和荧光素酶基因的条带。对照组：用未经DEX环境下培养的转基因大豆细胞，其余同实验组。若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为________。 【答案】（1）SacI和XhoI 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） 对应终止密码子的序列 B （2）荧光素 有荧光出现 3′端 （3） 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 【解析】（1）构建基因表达载体时，要将目的基因插入启动子和终止子之间，一般选用双酶切，避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接），切割载体用到的限制酶有SacⅠ和XhoⅠ，不能选用BglⅡ，若用该酶切会破坏质粒上的四环素抗性基因，导致后续无法对重组DNA分子进行筛选。已知OsJRL40转录非模板链末端为5'-…GCTGACTAG-3'，构建融合基因需要去除对应终止密码子的序列，引物2为下游引物，其5'端需要添加BglⅡ的识别序列（5'-AGATCT-3'，共6个碱基），剩余4个碱基与OsJRL40末端互补，GTCA，因此前10个碱基为5'-AGATCTGTCA-3'，B正确。 （2）融合基因的表达依赖DEX启动子，而该启动子仅在DEX诱导下才能启动转录，才能诱导融合基因表达出荧光素酶，因此培养液中须添加荧光素，荧光素酶催化荧光素产生荧光，因此检测到细胞有荧光出现即可证明转化成功。loxP等额外序列必须添加在引物的3'端，才能使Cre酶将DNA上两个相同loxP序列位点之间的片段切除，完整保留目的片段两端。 （3）要扩增同时包含OsJRL40和荧光素酶基因的片段，需要选择OsJRL40上游的引物1和荧光素酶基因下游的引物4。Cre酶仅切除两个loxP序列之间的荧光素酶基因，OsJRL40基因不会被切除：实验组：DEX诱导Cre酶表达，荧光素酶基因被敲除，cDNA中仅保留OsJRL40基因，两种基因的条带都无；对照组：无DEX诱导，Cre酶不表达，荧光素酶基因完整保留。 45．（2026·福建厦门一中·一模）溶细胞素A（ClyA）与细胞膜接触时可形成跨膜孔道，直接导致靶细胞裂解。研究者拟利用该原理使结肠癌细胞裂解死亡，为结肠癌的治疗提供新策略。回答下列问题： （1）大肠杆菌（EcN）能适应肿瘤组织低氧、酸性微环境，并在肿瘤组织内定植。研究者尝试利用大肠杆菌实现ClyA的靶向递送。 ①从能表达ClyA的细胞中提取_______，再经RT-PCR（逆转录PCR）获得ClyA基因序列，此序列不包含_______。（写出两点） ②设计如图1所示的乳酸感应模块（gfp为绿色荧光蛋白基因），导入大肠杆菌，获得可合成ClyA的工程菌E1。当乳酸存在时，_______，E1发出绿色荧光。 ③将E1置于含不同浓度乳酸的培养液中（10 mM为模拟肿瘤环境），一段时间后测定其荧光强度，结果如图2。该实验的目的是______。 ④对E1进行升级改造，通过导入信号转导模块使其可吸收近红外光并转化为热能，快速升高局部温度。在此基础上，研究者又构建一个基因表达载体，与图1所示载体共同导入，以实现ClyA蛋白仅在近红外光照射的肿瘤部位释放。请根据示例，选择合适的启动子和基因构建该基因表达载体________。 备选启动子：启动子J、启动子R、启动子P 备选基因：TcI基因、Mel裂解肽基因、LldR基因 （注：温度升高可使TcI蛋白失去抑制启动子P的能力；Mel裂解肽可使细菌裂解） 示例： （2）采用升级改造后的工程菌治疗结肠癌的优势为：可精准调控ClyA在结肠癌细胞处释放，_______。 【答案】（1） ①总mRNA 启动子、终止子 LldR二聚体分解，解除对启动子R的抑制，gfp-ClyA基因表达 探究工程菌中的乳酸感应模块对乳酸浓度的响应情况 （2）减少对正常细胞的损伤 【解析】（1）①逆转录PCR（RT-PCR）需要先从目的细胞中提取ClyA的总mRNA，以mRNA为模板逆转录得到ClyA的cDNA；原基因的启动子和终止子不被转录，真核基因的内含子在mRNA加工阶段被剪切掉，因此得到的cDNA不包含启动子、内含子、终止子等序列。 ②结合图1调控逻辑：LldR形成的二聚体可抑制启动子R；乳酸结合LldR后，抑制LldR形成二聚体，解除对启动子R的抑制，下游gfp基因正常表达，使工程菌发出绿色荧光。 ③ 该实验自变量为乳酸浓度，因变量为荧光强度（反映基因表达水平），且设置10mM模拟肿瘤环境的乳酸浓度，因此实验目的是探究工程菌中的乳酸感应模块对乳酸浓度的响应情况。 ④根据题意，要实现仅在近红外照射（升温）的肿瘤部位释放ClyA：需要常温下持续表达TcI，抑制启动子P，Mel不表达，细菌不裂解；升温后TcI失活，解除对启动子P的抑制，Mel表达使细菌裂解，释放ClyA。因此选择持续表达的启动子J驱动TcI基因，温度响应的启动子P驱动Mel裂解肽基因即可，可用下图： （2）精准靶向释放ClyA，既可以保证对肿瘤细胞的杀伤效果，又能避免ClyA损伤正常组织，降低治疗的副作用。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】C 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】A 2.【答案】（1）平板划线/稀释涂布平板 BCD （2）3、4 以P菌和P′菌DNA为模板扩增的产物大小相同，电泳无法区分 3、5 样本中同时含有P菌和P′菌 考点3 基因工程综合 1.【答案】（1）卡那霉素和四环素 白 （2）C A （3）B 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌 2.【答案】（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ （3）超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 （4）排除PCR体系中外源DNA的污染 （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 3.【答案】（1）转入LFY基因的菊花细胞 不需要 愈伤组织 （2）生长素和细胞分裂素 （3）菊花染色体DNA 抗原-抗体杂交 （4）将LFY基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti质粒的两个T-DNA上，构建重组Ti质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达LFY的转基因菊花 4.【答案】（1）引物1和引物4 （2）EcoRV T4DNA 启动子 终止子 XhoI和PstI 钙 （3）尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 1.【答案】C 2.【答案】B 3.【答案】D 4.【答案】D 5.【答案】D 6.【答案】C 7.【答案】B 8.【答案】C 9.【答案】C 10.【答案】D 11.【答案】C 12.【答案】D 13.【答案】C 14.【答案】（1）RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动基因的转录 标记基因；复制原点 （2）3'→5' a （3）（琼脂糖凝胶）电泳 F1、R1 下 4 15.【答案】（1）限制酶和DNA连接酶 （2）组成型启动子 以M蛋白为转录激活因子的启动子 （3）ABCD （4）不同强度近红外光或不同照射时长下PD-L1抗体水平；肿瘤体积或小鼠存活率 （5）以过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因为目的基因构建NIR系统，以肠道益生菌为受体菌构建工程菌 16.【答案】（1）DNA连接酶 5'端 PstI、XhoI 与解旋后的母链结合，使（耐高温的）DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 （2）不会 Ti质粒上的T-DNA为可转移DNA，并将其整合到被侵染细胞的染色体DNA上 （3）只有在草甘膦存在的情况下抗草甘膦基因A才表达，没有草甘膦时不表达 （4）基因突变（和染色体变异）和植物细胞的全能性 愈伤组织分裂能力强，容易诱导突变 向白三叶草幼苗喷洒一定浓度的除草剂 17.【答案】（1）显微注射 同期发情 （2）② （3）ATGTATGC 5' 3600bp和4100bp （4）Cre酶 无 18.【答案】（1）提供多个限制酶切割位点，有利于外源基因的插入 T4 DNA连接酶 启动子、终止子 （2）AGTACT 若F1、F2引物上均添加该序列，则用ScaⅠ酶切质粒P2时，会把MCS序列切除 （3）1.8kb、1.3kb （4）标记基因 避免花粉介导的基因污染 19.【答案】（1）限制（或限制性内切核酸） 逆转录 正常 （2）瞬时性 PEmRNA和蛋白质水平分别在6小时左右和28小时左右达到峰值，且随时间推移，mRNA的含量和蛋白质的含量均降低 （3）PCR 不能 该病是单个碱基突变引起的，基因的长度不变，而琼脂糖凝胶电泳只能检测基因长度，不能检测具体的碱基序列 （4）血液中苯丙酮酸浓度（或神经损伤程度） 20.【答案】（1）蛋白质工程 便于通过荧光观察检测融合蛋白的表达情况，同时增加分子量以便于电泳检测 （2）② BgtⅡ与BamHⅠ会产生相同的黏性末端而无法防止目的基因反向连接 编码终止密码子 （3）诱导PA启动子，启动融合蛋白基因的表达 （4）LF具有广谱抗菌活性，但对不同菌株的抑制效果存在差异，对大肠杆菌ATCC25922和C600的抑菌效果最好（MIC为16μg/mL），金黄色葡萄球菌和大肠杆菌CMCC44103的抑菌效果相对较弱（MIC为64μg/mL） 21.【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶 3’端 （2）限制（酶） H基因和载体两个连接处的黏性末端相同，可能发生正接或反接 （3）BamHⅠ和EcoRⅠ 能 ①组H蛋白表达量显著高于②和③组 （4）乙和丙 22.【答案】（1）RNA聚合酶 SacI、NcoI（顺序不能倒） 能使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 （2）氨苄青霉素 说明：正确条带为1800bp、5500bp （3）大于 根据ELP的热响应性，在温度高于T时沉淀，实现分离融合蛋白；低于T时溶解，通过反复的升降温循环实现纯化 23.【答案】（1）不需要 不需要 （2）14CO2​→14C3​→14（CH2​O）​（或14CO2​→14C3​→含¹⁴C的有机物） 增加 突然停止光照，光反应产生的ATP和NADPH减少，C₃还原速率减慢，而CO₂固定仍在持续生成C₃，因此短时间内标记C₃含量增加 （3）gk BG蛋白可抑制GK蛋白与CAO基因启动子DNA的结合，且BG蛋白浓度越高，抑制作用越强 BG基因可使植物根据环境光照调控叶绿素合成，避免不必要的物质能量消耗，也可防止强光下叶绿素过多引发光损伤，提升植物对光照环境的适应能力，利于植物生存（合理即可） 24.【答案】（1）自我复制 （2）ClaI、XhoI （3）ATCGAT CAGAGT （4）GH-EGFP GH-EGFP融合基因片段为1320bp左右，GH基因仅为600bp，条带3处于1000-2000之间 基因未表达（甲基化）或基因丢失（未整合到染色体、酶降解）或基因突变 检测EGFP基因及其mRNA或检测EGFP基因或检测EGFP基因序列（合理即可，证据能验证假说） 25.【答案】（1）使Noxa蛋白分泌到细胞外 b、c（或c、b） （2）Ca2+ PCR等技术、抗原—抗体杂交 （3）42℃时cI857蛋白变性失活，解除对pR-pL启动子的抑制，促进ClyA-Noxa融合基因表达，Noxa蛋白被分泌到细胞外，诱导肿瘤细胞凋亡 （4）①②④ 26.【答案】（1）引物2和引物3 EcoRI和HindIII GAATTCATGGCA （2）Ca2+（CaCl2） 氯霉素 四环素 在甲中菌落能生长，在乙中菌落不能生长 （3）基因污染（或“破坏生物平衡”、“降低生物多样性”、“改变自然种群基因频率”、“影响生态系统稳定性”） 27.【答案】（1）染色体的DNA （2）5'-AAGCTTTC-3' 潮霉素 确保只有1个SCLI4基因整合至细胞染色体DNA （3）突变体T中SCL14基因表达量无明显差异 （4）比较两种转录组的差异性/寻找Cd胁迫下受到SCL14蛋白特异性调控的基因 28.【答案】（1）EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ 5′ Mun Ⅰ （2）② 方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验 （3）茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果 29.【答案】（1）模板DNA、TaqDNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶） A B （2）启动子 RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动T基因（目的基因）转录 EcoRⅠ、NdeⅠ 抗生素A （3）使大肠杆菌成为感受态细胞，让细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 抗原-抗体杂交 （4）44 第44位保守度低，替换后对T酶功能影响小，且与119位半胱氨酸空间距离近，更容易形成二硫键，提升T酶耐热性 30.【答案】（1）BamHⅠ、SalⅠ （2）从左往右 ②③ 62 （3）BamHⅠ XhoⅠ GGATCCCATGCTTAC （4）卡那霉素 卡那霉素和氨苄青霉素 O 31.【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 （2）CD （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 （4）ABC （5）P2、P4 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 32.【答案】（1）逆转录 （2）便于重组DNA分子的筛选 甘露糖 不含抗生素抗性基因或除草剂抗性基因，对人体和环境较为安全 （3）表达出两条互补的RNA链，形成RNA双链 RNA双链被D酶切割后形成SiRNA，形成的小干扰RNA与MS26基因转录形成的mRNA部分配对，从而引起MS26基因转录形成的mRNA发生降解，MS26基因无法表达（翻译） （4）基因突变 样品3 若T-DNA插入植物体MS26基因中，BP与RP扩增会形成小片段 33.【答案】（1）四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、 缓冲液、Mg²⁺等 引物2和引物3 5' （2）TTR、X-gal 培养基中的TTR激活P3的pBCA启动子，启动cro基因表达，CRO蛋白抑制M蛋白的合成，解除其对cro、LacZ基因表达的抑制，使菌落呈现蓝色 （3）甲组：正常小鼠+接种P3菌株 丙组：肠道炎症模型小鼠+接种P3菌株（甲、丙可对调，相应实验结果也需调换） 预期结果：丙组小鼠粪便中蓝色菌落比例显著高于甲组和乙组 34.【答案】（1）5’端 B 蓝色 （2）D组：含叶组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥 E组：含茎尖组织特异性启动子的重组质粒，导入野生型拟南芥 D组延迟开花，E组正常开花 35.【答案】（1）限制酶和DNA连接酶 磷酸二酯键 （2）造血干细胞 2 利用NCR1的启动子，让Cre基因仅在NK细胞中表达，实现仅在NK细胞中敲除CD226基因的目的 B （3）将Cre基因置于NCR1启动子后，使其仅在NK细胞中表达；将STOP转录终止信号盒置于两个同向loxP序列之间，启动子在loxP上游，GFP在loxP下游。NCR1启动子使Cre基因仅在NK细胞表达产生Cre酶，Cre酶敲除了启动子和GFP基因之间的STOP转录终止信号盒，使GFP基因能正常表达，而在其他组织细胞中，由于缺乏Cre酶，STOP转录终止信号盒阻止GFP基因的正常表达。从而实现仅在NK细胞中特异性表达绿色荧光蛋白的目的 36.【答案】（1）变性、复性和延伸 12 4 （2）增强子E1、E2和E3在启动子（或SV40终止序列）的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著；E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达 BamH I、Sal I （3）原扩增E1增强子的引物无法与半夏蛋白cDNA片段的两条模板链充分配对，实现复性 对半夏蛋白cDNA两端进行测序，重新设计引物 37.【答案】（1）持续的2′-FL合成影响了菌体正常生长 pfkA基因高表达，futC基因低表达 （2）37℃时荧光强度高于30℃ 温度诱导型、持续表达型 37℃时荧光强度低于30℃ （3）futC基因 靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向pfkA基因的crRNA基因 38.【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合 核糖体 （2）探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响 A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 （3）外源基因表达及苏氨酸大量合成消耗菌体中的物质和能量 （4）氯霉素抗性基因 终止子 活性低的启动子 39.【答案】（1）L39、R1 HindⅢ、EcoRⅠ （2）肝脏细胞特异性表达的启动子 G418和DHPG （3）FLAG抗体 R 研发能抑制PM蛋白与C3A酶R功能区结合的药物 40.【答案】（1）EcoRI、HindIII 耐高温的DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA子链 将同一菌落的沙门氏菌分别用含氨苄青霉素和卡那霉素培养基进行培养，在含卡那霉素的培养基生长，在含氨苄青霉素的培养基中不生长的则为筛出的目的沙门氏菌 （2）M蛋白-c-di-GMP复合物依赖型启动子 （3）黑暗时，P酶光响应活性低，催化产生c-di-GMP少，Y酶降解c-di-GMP，使c-di-GMP与M蛋白结合少，启动子难以驱动荧光素酶基因表达 近红外光光照强度为6mWcm-2、光照时间为1小时 41.【答案】（1）Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶） 3′端 （2）限制 载体P和H基因两端都是A-T配对，连接无方向性；H基因可能产生正反两种连接方式 （3）BamH I  和  EcoR I 能 第①组 -actin条带正常，且H蛋白电泳条带比另外2组更粗 （4）乙、丙 42.【答案】（1）信号 解除 （2）FLs基因 Nde Ⅰ和Sma Ⅰ 丙组不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤，但是该酵母菌能正常生存，说明重组质粒1、2成功导入酵母菌，同时表达了FLs蛋白与CRY2能够结合，启动组氨酸和腺嘌呤基因的表达 甲组和乙组均长出菌落，丙组无菌落产生 43.【答案】（1）引物（对）、Taq DNA聚合酶（耐高温DNA聚合酶） 引物与模板结合效率低 质粒（运载体） （2）BamHⅠ EcoRⅠ 激活 反对，因待测组细胞中无与TOC1结合的特定蛋白，说明报告基因的激活，可能是 BD-TOC1蛋白独立作用，并不需要与AD蛋白拉近（或：只需TOC1蛋白就可拉近BD与AD），与上述观点不同 44.【答案】（1）SacI和XhoI 避免目的基因、载体自身环化或反向连接（保证目的基因与载体正确连接） 对应终止密码子的序列 B （2）荧光素 有荧光出现 3′端 （3） 1和4 实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有 45.【答案】（1） ①总mRNA 启动子、终止子 LldR二聚体分解，解除对启动子R的抑制，gfp-ClyA基因表达 探究工程菌中的乳酸感应模块对乳酸浓度的响应情况 （2）减少对正常细胞的损伤 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $