专题15 基因工程（6年汇编）（江苏专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 江苏考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025江苏（1题） · 情境设置：以基因突变和限制酶切位点为背景。 · 考查重点：限制酶识别序列、切割特点及应用。 · 命题趋势：联系基因诊断，考查信息推理能力。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026江苏（2题）、2025江苏（1题） · 情境设置：结合酵母表达、珍稀动物保护等实例。 · 考查重点：PCR原理、酶的作用及筛选鉴定。 · 命题趋势：强化实验流程分析与综合判断。 考点3 基因工程综合 2026江苏（1题）、2024江苏（1题）、2023江苏（1题）、2022江苏（1题） · 情境设置：围绕抗体、酶、荧光蛋白及细胞功能。 · 考查重点：重组载体构建、表达、筛选与纯化。 · 命题趋势：突出多技术融合及工程应用。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【解析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。 A 、对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误； B、HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C 错误； D、因为正常基因 A 和致病基因 a 的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D 正确。 故选BD。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（2026·江苏·高考真题）（多选）利用酵母表达外源蛋白时，构建的质粒通常需在大肠杆菌中扩增，鉴定后再转入酵母细胞中表达。图示色氨酸营养缺陷型酵母筛选系统的表达质粒结构。下列叙述正确的有（     ） A．Ori在完成质粒构建和表达过程中不起作用 B．该质粒在酵母细胞中复制时需识别2μ Ori C．MCS含有多个酶切位点，便于设计目的基因插入位点 D．用不添加色氨酸的培养基筛选成功导入质粒的酵母 【答案】BCD 【解析】A、Ori是细菌复制原点，题干提到质粒需要先在大肠杆菌中扩增，质粒在大肠杆菌内复制扩增必须依赖Ori，因此Ori发挥重要作用，A错误； B、题图注释标明2μ Ori是酵母质粒复制原点，复制原点是DNA复制起始位点，质粒在酵母细胞中进行复制，需要识别2μ Ori，B正确； C、MCS即多克隆位点，集中了多种限制酶的识别切割位点，便于选择合适限制酶，将目的基因插入质粒，C正确； D、酵母是色氨酸营养缺陷型，自身无法合成色氨酸；质粒携带TRP1色氨酸合成相关基因。成功导入质粒的酵母可以合成色氨酸，能在无色氨酸培养基存活；未导入质粒的酵母不能合成色氨酸，无法存活，以此完成筛选，D正确。 2．（2026·江苏·高考真题）基因工程中需要使用多种酶，下列叙述正确的是（     ） A．逆转录酶催化形成磷酸二酯键 B．Taq酶催化形成氢键和肽键 C．限制酶有专一性而Taq酶没有专一性 D．Taq酶催化新链合成时以双链DNA为模板 【答案】A 【解析】A、逆转录酶以RNA为模板，利用脱氧核苷酸合成DNA，脱氧核苷酸之间依靠磷酸二酯键相连，逆转录酶催化磷酸二酯键的生成，A正确； B、Taq酶是热稳定DNA聚合酶，仅催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键；氢键在DNA复性时自发形成，不需要酶催化；肽键是翻译过程形成，与Taq酶无关，B错误； C、专一性是酶的基本特性。限制酶专一识别特定DNA序列；Taq酶只能催化DNA子链合成，同样具有专一性，C错误； D、PCR反应中，高温变性使双链DNA解旋为单链，延伸阶段Taq酶以单链DNA作为模板合成DNA新链，D错误。 3．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： （1）川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有______。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有______。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成______关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①______，加入乙醇 ②______ 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③______、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基______。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有______。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 （5）依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______（填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 【答案】（1）捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 （2）互利共生 （3）上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 （4）互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 （5）ab 【解析】生态系统中信息的种类（1）物理信息：生态系统中的光、声、温度、湿度、磁力等，通过物理过程传递的信息，如蜘蛛网的振动频率；（2）化学信息：生物在生命活动中，产生了一些可以传递信息的化学物质，如植物的生物碱、有机酸，动物的性外激素等；（3）行为信息：动物的特殊行为，对于同种或异种生物也能够传递某种信息，如孔雀开屏。 （1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。 （5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确； b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确； c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误； d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。 故选ab。 考点3 基因工程综合 1．（2026·江苏·高考真题）驼源抗体（VHH）具有分子量小、与人源抗体同源性高等优点，科研人员将其作为抗原受体改造T细胞，开发出新型CAR-T细胞（V-CAR-T细胞）用于肿瘤治疗。请回答下列问题： （1）CAR-T细胞通过抗原受体直接识别肿瘤细胞表面上的靶点进而裂解肿瘤细胞，在免疫方式上属于______。 （2）早期CAR-T细胞受靶细胞刺激后，难以分裂、分化为______细胞杀伤肿瘤细胞。V-CAR-T细胞中增加了两个协同刺激结构域（图1），以促进T细胞分泌______加速其增殖和分化。V-CAR-T细胞表面的______可作为其标记，用于验证输注V-CAR-T细胞治疗后，机体内是否存在V-CAR-T细胞。 （3）非小细胞肺癌细胞高表达Trop2，科研人员研发新型识别Trop2的V-CAR-T细胞。为筛选获得抗Trop2的VHH，构建VHH基因文库，流程如下： 步骤 实验目的 实验操作 ⅰ 制备cDNA模板 用①______免疫羊驼，分离获得外周血淋巴细胞，提取②______，反转录成cDNA； ⅱ 扩增VHH基因 用③______端加入SfiⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增； ⅲ 构建文库 质粒载体与VHH基因片段经SfiⅠ酶切后，用④______酶连接，转化感受态细胞。 （4）筛选出高亲和力的抗Trop2的VHH，构建获得特异识别Trop2的V-CAR-T细胞（Trop2 CAR-T细胞）。为验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，建立肺癌小鼠模型，随机分为3组开展实验，实验结果见图2、图3。 ①设置未改造T细胞组作对照的目的是______。 ②根据图2、图3结果，可得出结论______。 【答案】（1）细胞免疫 （2）活化的细胞毒性T细胞 细胞因子 VHH （3）Trop2蛋白 总RNA 5′端 DNA连接 （4）检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强 Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期 【解析】（1）CAR-T细胞属于改造后的T细胞，直接裂解肿瘤靶细胞，符合细胞免疫的特征，因此属于细胞免疫。 （2）CAR-T细胞受抗原刺激后，需增殖分化为活化的细胞毒性T细胞才能发挥杀伤肿瘤的功能；协同刺激结构域可促进T细胞分泌细胞因子，加速自身增殖分化；V-CAR-T特有的驼源VHH结构是其区别于普通T细胞的独有标记，可用于检测体内是否存在输注的V-CAR-T细胞。 （3）要获得抗Trop2的VHH，首先需要用抗原Trop2蛋白免疫羊驼，使羊驼体内产生能表达抗Trop2VHH的B淋巴细胞；从淋巴细胞中提取总RNA（或mRNA），通过反转录得到cDNA；PCR扩增目的基因时，需要在引物的5'端引入酶切位点，保证扩增出的VHH基因带有SfiⅠ酶切位点；酶切后的载体和目的基因需要用DNA连接酶连接形成重组质粒。 （4）①实验目的是验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，所以设置未改造T细胞组是为了检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强； ②对比三组实验结果：缓冲液组和未改造T细胞组的肿瘤体积大、小鼠生存期短，Trop2CAR-T组肿瘤体积显著降低、小鼠生存率和生存时间明显提升，可证明Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期。 2．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 （2）步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。    （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 【答案】（1）EcoR I、Hind Ⅲ （2）CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R （3）启动子 C （4）SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【解析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 （1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 3．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 （2）CD （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 （4）ABC （5）P2、P4 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 4．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 （1）纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________________。 （2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物_____________； ②PCR目的产物约为_____________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。 （4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。 【答案】（1）脂质和蛋白质 与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） （2）溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' （3）a、b 1100 Q4 蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部 （4）逆转录 32 【解析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 （1）由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质组成。中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。 （2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0mol/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据EcoR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部。 （4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。 1．（2026·江苏南通通州·二模）葛根素是一种具有药用价值的植物活性成分，传统葛根素的提取依赖葛根块根，产量低且资源消耗大。科研团队利用生物技术，获得了能产生葛根素合成关键酶的酵母菌，下图展示了部分技术路线。相关叙述正确的是（    ） A．过程①为脱分化过程，利用了植物细胞的全能性 B．过程②和过程③均以dNTP为原料合成脱氧核苷酸链 C．过程④通过高Ca2+-高pH处理法将目的基因导入酵母菌 D．对酵母菌进行鉴定和筛选是发酵工程的中心环节 【答案】B 【解析】A、过程①为脱分化，仅使高度分化的植物叶片细胞恢复分裂能力形成愈伤组织，未发育为完整植株，未体现植物细胞的全能性，A错误； B、过程②为逆转录，以RNA为模板合成cDNA，过程③为PCR扩增目的基因，合成子代DNA链，二者合成的产物均为脱氧核苷酸链，原料均为脱氧核苷三磷酸，B正确； C、将目的基因导入酵母菌等微生物细胞时，采用高Ca2+-低pH的处理方法制备感受态细胞，C错误； D、发酵工程的中心环节是发酵过程，D错误。 2．（2026·江苏盐城·模拟预测）下图为同一质粒（不同形态）和不同长度的PCR产物（目的基因大小为0.65kb）的琼脂糖凝胶电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．依据电泳迁移方向判断DNA分子在缓冲液中带正电 B．同一质粒的开环形态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关 C．样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内 D．依据电泳结果确定最右侧泳道为目的基因 【答案】C 【解析】A、依据图中显示的电泳迁移方向可判断DNA分子在缓冲液中带负电，A错误； B、结合图示可知，同一质粒的线性状态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关，B错误； C、样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内，此后根据待检的DNA大小设计好相应的参数进行电泳，C正确； D、目的基因大小为0.65kb，通过比对电泳结果确定最右侧泳道中应该含有目的基因，D错误。 3．（2027·江苏南通·一模）（多选）植物生物反应器是一种新兴的重组蛋白表达系统，研究人员按下图流程制备抗F蛋白的抗体。相关叙述正确的是（     ） A．制备杂交瘤细胞需将免疫小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合 B．对杂交瘤细胞进行克隆化培养时，培养液中通常需添加血清 C．农杆菌中的Ti质粒的T-DNA负责转移目的基因 D．可用PCR检测植物叶片中是否含有抗F蛋白的抗体 【答案】ABC 【解析】A、制备杂交瘤细胞的过程为将经F蛋白免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，A正确； B、杂交瘤细胞的克隆化培养属于动物细胞培养，由于尚未明确细胞所需的全部营养物质，培养液中通常需添加血清等天然成分满足细胞生长需求，B正确； C、农杆菌Ti质粒的T-DNA为可转移DNA，能够携带插入的目的基因转移至植物受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，负责目的基因的转移，C正确； D、PCR技术用于检测核酸（目的基因或对应的mRNA），抗F蛋白的抗体本质为蛋白质，需使用抗原-抗体杂交法检测，D错误。 4．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）植物生物反应器可利用植株、组织或悬浮细胞生产药物蛋白，叶绿体遗传转化借助同源重组将外源基因整合进叶绿体基因组，该转化方式表达量高、安全性好。下列说法错误的是（     ） A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B．把目的基因导入叶绿体DNA中，产生的配子一定含有此目的基因 C．植物叶绿体表达体系可防止目的基因通过花粉在自然界中扩散 D．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只在叶绿体中表达 【答案】B 【解析】A、植物生物反应器需要通过基因工程将外源目的基因导入受体细胞，再借助植物细胞工程（如植物组织培养、细胞悬浮培养）获得植株、组织或悬浮细胞生产药物蛋白，涉及基因工程和植物细胞工程技术，A正确； B、叶绿体基因属于细胞质基因，植物产生的雄配子（花粉中的精子）几乎不含细胞质，无叶绿体，因此产生的雄配子不含有该目的基因，并非所有配子都含目的基因，B错误； C、花粉中的精子几乎无细胞质，不含叶绿体，因此叶绿体中的目的基因不会随花粉扩散到其他植物，安全性好，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因的转录，叶绿体特异启动子只能被叶绿体内的RNA聚合酶识别，因此可使目的基因只在叶绿体中表达，D正确。 5．（2026·如皋中学·模拟预测）下列生物技术操作能达成预期目标的是（    ） A．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 B．发酵工程中通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 D．胚胎工程中利用胚胎分割技术可以大大提高移植胚胎的成活率 【答案】A 【解析】1、基因工程的应用： （1）基因工程在农牧业方面的应用：用于改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量等。如获取转基因的抗虫植物、转基因的抗病植物、转基因的抗除草剂植物以及改良植物的品质，我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导人矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值。改善畜产品品质，如科学家将肠乳糖酶基因导人奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。 （2）基因工程在医药卫生领域的应用：对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。 1、基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 A、将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，可以识别特定的癌细胞，从而进行癌症治疗，A正确； B、以乙醇为底物进行果醋发酵时，不会产生气体，因此不能通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止，B错误； C、将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，如果导入奶牛乳腺细胞则不能达成预期目标，C错误； D、胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，因此胚胎分割技术不能提高移植胚胎的成活率，D错误。 故选A。 6．（2026·如皋中学·模拟预测）（多选）载体是基因工程中携带外源 DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是（    ） A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体 B．载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因 C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间 D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异 【答案】AB 【解析】分析题图：图中重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体。 A、重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确； B、作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点（便于目的基因的插入）、复制原点（便于目的基因的扩增）及标记基因（便于筛选含有目的基因的受体细胞）等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确； C、培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启动子和终止子之间，C错误； D、培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。 故选AB。 7．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基对的相对含量有关 B．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 【答案】C 【解析】A、引物长度越长、GC碱基对相对含量越高，引物与模板链结合的稳定性越强，所需的复性温度越高，因此PCR复性温度与引物长度、GC含量有关，A正确； B、为避免外源DNA等杂质污染影响实验结果，实验所用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，B正确； C、凝胶载样缓冲液中的指示剂只能指示电泳的迁移进度，避免样品跑出凝胶，无法指示DNA分子的具体位置，DNA的位置需要经染色后才能观察到，C错误； D、凝胶电泳时，凝胶起到分子筛作用，同一电场下，DNA片段越长，在凝胶中受到的阻力越大，迁移速率越慢，D正确。 8．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）我国科学家研发的蛋白质生成大模型NewOrigin能通过AI高精度生成蛋白质的氨基酸序列，推动了蛋白质工程的发展。下列相关叙述正确的是（　　） A．设计新的蛋白质时首先应从其基因的碱基序列出发 B．AI可通过改变氨基酸序列设计符合预期功能的蛋白质 C．模型NewOrigin可生产出满足人类特定需求的蛋白质 D．该模型能分析基因组数据进而精准找到遗传病的病因 【答案】B 【解析】A、蛋白质工程设计新蛋白质时，首先要从预期的蛋白质功能出发，而非直接从基因的碱基序列出发，A错误； B、蛋白质的功能由结构决定，氨基酸序列是蛋白质结构的基础，AI可通过调整、生成氨基酸序列，设计出符合预期功能的蛋白质，B正确； C、模型NewOrigin仅能生成蛋白质的氨基酸序列，蛋白质的生产还需要借助基因工程的表达系统（如构建表达载体、导入受体细胞表达等）完成，该模型本身无法直接生产蛋白质，C错误； D、该模型的功能是生成蛋白质的氨基酸序列，不具备分析基因组数据、查找遗传病病因的作用，D错误。 9．（2026·徐州三中·一模）肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需插入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 【答案】C 【解析】在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放 入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。 A、酪氨酸血症是由于肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变，导致酶不能正常合成，进而影响代谢过程，这说明基因能通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物性状，而不是控制蛋白质的结构，A错误； B、动物细胞培养过程中，培养液中需要添加葡萄糖、动物血清等物质，但不需要添加琼脂，琼脂是用于植物组织培养的凝固剂，B错误； C、过程③基因编辑是为了纠正病人来源肝细胞，所以需要插入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，同时敲除相关抗原基因，以避免免疫排斥反应，C正确； D、基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠后，是通过肝细胞发挥正常功能来治疗小鼠酪氨酸血症，而不是分化为完整肝脏，D错误。 故选C。 10．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）某先天性耳聋是单基因遗传病，科研人员拟通过载体向细胞内导入正常基因治疗先天性耳聋患者，所用载体含启动子、标记基因、HindⅢ（5´-AAGCTT-3´）和BamHⅠ（5´-GGATCC-3´）酶切位点。下列分析正确的是（    ） A．该种先天性耳聋为显性遗传病 B．借助标记基因的表达情况可筛选出正常基因成功表达的细胞 C．用HindⅢ和BamHⅠ切割上述载体，可以防止载体的自身环化 D．为便于将正常基因与载体连接，扩增正常基因时，需在引物3´端添加限制酶识别序列 【答案】C 【解析】A、该病可通过导入正常基因实现治疗，说明该病为隐性遗传病，A错误； B、标记基因的作用是筛选出成功导入载体的受体细胞，无法判断正常基因是否成功表达，正常基因的表达情况需通过抗原-抗体杂交等技术检测，B错误； C、HindⅢ和BamHⅠ是识别序列不同的两种限制酶，切割载体后会产生不同的黏性末端，载体两端的黏性末端无法互补配对，可防止载体自身环化，C正确； D、PCR扩增时，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链，因此限制酶识别序列需添加在引物的5'端，若添加在3'端会导致无法正常扩增目的基因，D错误。 11．（2026·江苏盐城·模拟预测）（多选）CAR-T免疫疗法通过基因工程给患者T细胞膜装上“嵌合抗原受体”（CAR），再回输到患者体内使其能精准识别肿瘤抗原。下列叙述错误的有（　　） A．改造T细胞过程中，直接将CAR基因导入T细胞 B．CAR蛋白在改造后的T细胞游离的核糖体上合成 C．CAR-T细胞接触癌细胞后诱导癌细胞凋亡，属于细胞免疫 D．取患者的T细胞改造可避免患者对回输的CAR-T细胞发生免疫排斥 【答案】AB 【解析】A、基因工程操作中，不能直接将目的基因导入受体细胞，需要先将CAR基因与载体结合构建基因表达载体后，再导入T细胞，A错误； B、CAR是位于T细胞膜上的受体蛋白，属于膜蛋白，需先在游离的核糖体上合成，核糖体后附着于内质网的上，还需要内质网、高尔基体加工后运输到细胞膜上，游离核糖体仅合成胞内可溶性蛋白，B错误； C、CAR-T细胞是经改造的T细胞，其接触癌细胞后诱导癌细胞凋亡，属于细胞毒性T细胞裂解靶细胞的过程，属于细胞免疫，C正确； D、取自患者自身的T细胞改造后，细胞表面的组织相容性抗原与患者自身完全匹配，可避免患者对回输的CAR-T细胞产生免疫排斥，D正确。 12．（2026·南通·一调）利用基因工程改变与植物激素相关基因的表达，具有广泛的应用。相关叙述错误的是（　　） A．在杨树保卫细胞中过表达脱落酸受体基因，可增强抗旱能力 B．敲除番茄果实中乙烯合成酶基因，可延缓果实成熟便于储运 C．在黄瓜子房壁中特异性表达生长素合成酶基因，可诱导获得无籽果实 D．拟南芥愈伤组织中导入细胞分裂素合成酶基因的反义基因，可促进芽的分化 【答案】D 【解析】A、脱落酸可以促进气孔关闭，减少植物蒸腾作用，增强抗旱性。在保卫细胞中过表达脱落酸受体基因，会提高细胞对脱落酸的敏感性，增强抗旱能力，A正确； B、乙烯的作用是促进果实成熟，乙烯合成酶是乙烯合成的关键酶，敲除该基因后乙烯合成减少，可延缓果实成熟，便于储运，B正确； C、生长素可以促进子房发育成果实，若在黄瓜子房壁中特异性表达生长素合成酶基因，子房可在未受精的情况下依靠自身合成的生长素发育为无籽果实，C正确； D、反义基因会抑制原基因的表达，导入细胞分裂素合成酶基因的反义基因后，愈伤组织中细胞分裂素合成减少；而细胞分裂素的作用是促进芽的分化，细胞分裂素减少会抑制芽的分化，D错误。 13．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。如图所示，已知引物1为5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，AccⅠ酶的识别位点为5′-GTATAC-3′，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述正确的是（    ）    A．该实验中需设计的引物2为5′一TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3′ B．若电泳结果只能观察到530bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同 【答案】C 【解析】用PCR扩增DNA片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氢核苷酸单链片段作引物。 A、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，A错误； B、若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，GAI 该水稻品种为GG型，B错误； C、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确； D、组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。 故选C。 14．（2026·徐州一中·一模）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 【答案】B 【解析】A、PCR每次循环一 般可以分为变性（超过90℃）、复性（50℃左右）和延伸（72℃左右）三步，PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高，A正确； B、PCR扩增过程中，一条为突变引物，一条为正常引物，经过2轮循环即可得到目标基因，30轮PCR后，得到230个DNA分子，其中一个DNA分子只含有正常引物，一个DNA分子只含有突变引物，剩下的DNA分子既含有正常引物又含有突变引物，可见突变基因多于正常基因，B错误； C、根据图示，正常引物延伸方向是从5'到3'，突变引物延伸方向也是从5'到3'，按照碱基互补配对原则，最终得到的突变序列应该是5'-AAGCCC-3’，C正确； D、PCR 产物电泳主要是用于检测 PCR 扩增是否成功，即是否得到了预期大小的 DNA 片段。但仅通过电泳检测 PCR 产物，并不能确定基因是否改造成功。基因改造成功与否不仅取决于是否扩增出特定片段，还涉及到基因序列的精确改变、是否插入或缺失特定碱基对、基因表达情况以及是否产生预期的功能变化等多方面。电泳只能直观呈现 DNA 片段的大小和数量，无法反映基因内部序列的精确改变以及功能上的变化，D正确。 故选B。 15．（2026·天一中学·模拟预测）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。请分析回答： （1）无缝克隆原理图中，过程①中T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成_______。过程③所需的酶有________。 （2）与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB官方的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于50bp小片段的原因：________ （3）图中利用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1与________互补。 （4）图中利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，应选用的限制酶为________。扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列（5'→3'）的设计依据为________（填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P基因的部分序列④GUS基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物________。 ①5'-TAAGTTGTCT……-3'    ②5'-CTTGGATGAT……-3' ③5'-TCTGTTGAAT……-3'    ④5'-ATTCAACAGA……-3' （5）利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用________对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是________，该激素的生理作用是________。 【答案】（1）5'→3' 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 （2）小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高 （3）R2引物5'端序列 （4）BclI和SmaI ②③ ②③ （5）草甘膦 根 促进植物对磷元素的吸收 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 （1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （2）无缝克隆技术不适合连接小于50bp的小片段，原因可能是小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高。此外，小片段的DNA在操作过程中也更容易丢失或损坏，进一步降低了连接的成功率。因此，NEB官方的无缝克隆线上设计软件会强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp，以确保连接的效率和准确性。 （3）DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F13'端序列与R2引物5'端序列互补。 （4）利用双酶切法将GUS-P融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamHI，会破坏抗性基因Tet'和抗性基因Amp，故选择BclI和SmaI。扩增GUS−P融合基因所需的引物R1序列的设计需要依据P基因的部分序列和限制酶的识别序列，故选②③。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与③5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与②5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为②③。 （5）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收，促进葡萄糖苷酸酶合成，水解X-Gluc呈蓝色。 16．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）赤藓糖醇（四碳糖有机物）是一种广泛使用的甜味剂，传统生产方法是利用葡萄糖通过酵母菌发酵获得。研究人员将合成赤藓糖醇所需的赤藓糖醇还原酶（G）基因和磷酸酶（Y）基因编码区首尾相连构建成GY融合基因，并导入蓝细菌中形成蓝细菌工程菌，大量生产赤藓糖醇，具体过程如下图所示，相关限制酶识别序列和切割位点如下表所示。回答下列问题： 限制酶类型 BamHI Sac I HindⅢ 识别序列和切割位点 （1）在PCR扩增1体系中，加入的物质除引物1、引物2、四种脱氧核苷酸外，还必须加入_________，上述物质中随反应的进行在溶液中含量逐渐减少的有________。 （2）为使PCR扩增1和PCR扩增2体系中得到的产物能彼此连接形成GY融合基因，应在引物2和引物3的________（填“3’”或“5’”）端添加部分互补的序列。PCR扩增GY融合基因时在反应体系中添加的引物是________。 （3）为保证GY融合基因按照正确的方向连接到质粒T上，可在GY融合基因的左右两端分别添加限制酶________的识别序列。PCR扩增产物可根据________不同，可以用________技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的原因有________。 A．引物特异性不强  B．退火温度过低 C．模板DNA污染   D．引物碱基序列过长 （4）已知启动子具有物种特异性，则质粒T中启动子应来自________。筛选蓝细菌工程菌时，培养基中除必需营养物质外还需添加________。 （5）最终检测到蓝细菌工程菌能合成赤藓糖醇，这属于在________水平上进行的鉴定。相比通过酵母菌发酵葡萄糖产生赤藓糖醇，用蓝细菌作为工程菌的优点是________（答出1点即可）。 【答案】（1）G基因、耐高温的DNA聚合酶 引物1、引物2、四种脱氧核苷酸 （2）5' 引物1和引物4 （3）BamHⅠ和HindⅢ DNA分子的大小和构象 琼脂糖凝胶电泳 ABC （4）蓝细菌 壮观霉素 （5）个体（生物学） 不需要在培养基中添加葡萄糖，节省了原料，蓝细菌可以吸收环境中的二氧化碳合成赤藓糖醇，有利于环境保护 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1） 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2） 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）基因的检测与鉴定。 （1）在PCR扩增1体系中，加入的物质除引物1、引物2、四种脱氧核苷酸外，还必须加入G基因、耐高温的DNA聚合酶，其中G基因作为扩增的模板，上述物质中随反应的进行在溶液中含量逐渐减少的有引物1、引物2、四种脱氧核苷酸，因为这些物质随着DNA的合成过程被消耗。 （2）为使PCR扩增1和PCR扩增2体系中得到的产物能彼此连接形成GY融合基因，应在引物2和引物3的5'端添加部分互补的序列，进而可以实现两个基因的融合。PCR扩增GY融合基因时在反应体系中添加的引物是引物1和引物4，这两个因为可以实现融合基因的扩增。 （3）为保证GY融合基因按照正确的方向连接到质粒T上，可在GY融合基因的左右两端分别添加限制酶BamHⅠ和HindⅢ的识别序列，这样可以保证目的基因的正向连接。PCR扩增产物可根据DNA分子的大小和构象不同，可以用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的原因有引物特异性不强、退火温度过低、模板DNA污染，故选ABC。 （4）已知启动子具有物种特异性，则质粒T中启动子应来自蓝细菌，因为目的基因需在蓝细菌中表达。筛选蓝细菌工程菌时，培养基中除必需营养物质外还需添加壮观霉素，因为重组质粒中的标记基因是壮观霉素的抗性基因，能在该培养基上生长的蓝细菌是成功导入重组质粒的蓝细菌。 （5）最终检测到蓝细菌工程菌能合成赤藓糖醇，说明工程菌培育成功，这属于在个体生物学水平上进行的鉴定。相比通过酵母菌发酵葡萄糖产生赤藓糖醇，用蓝细菌作为工程菌的优点表现在，蓝细菌是自养生物，因此不需要在培养基中添加葡萄糖，节省了原料，此外蓝细菌可以吸收环境中的二氧化碳合成赤藓糖醇，有利于环境保护，缓解了温室效应。 17．（2026·江浦高级中学·二模）有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： （1）PCR技术的中文名称是________，其主要优势是_______。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的TaqDNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是_______。 （2）热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的_______。 A．Taq酶最适催化温度范围为50~60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5'端向3'端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 （3）为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有_______。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中_______，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有_______。 （4）一般地，首轮PCR之前预变性的目的是_________。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是_______。 【答案】（1）聚合酶链式反应 可在细胞外实现微量DNA分子的大幅增加 其耐高温的特性是PCR可循环进行的重要原因 （2）BC （3）胰岛素基因两侧（3'端）的序列、在5'添加同源序列 甲、丙 可只扩增目的基因部分特异性序列，引物不必包含同源序列 （4）增加大分子DNA彻底变性的概率，得到单链DNA 使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列 【解析】1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 1、原理：DNA复制。 2、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 3、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 （1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA半保留的复制，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加，可以实现细胞外微量DNA分子的大幅增加。相比较人体细胞中的DNA聚合酶，参与PCR扩增的酶是TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，可实现高温变性下DNA复制的循环进行。 （2）A、Taq酶最适催化温度范围为60—70℃，即延伸时的温度，A错误； B、分析题意可知，热启动PCR进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，故可减少反应起始时引物错配形成的产物，B正确； C、DNA分子两条链反向平行，PCR扩增时引物加到3'端，复制时子链只能是从5′端向到3'端延伸，C正确； D、PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果，不能体现TaqDNA聚合酶的特异性，D错误。 故选BC。 （3）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。因此为了便于PCR扩增的胰岛素基因与表达载体连接，需要确定胰岛素基因的3'端边界的DNA序列，且在两条引物上设计加入特定的限制酶识别序列，即在5'端添加合适的酶切位点或同源序列。识图分析可知，而用PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为图中的引物甲和引物丙，这样扩增出的DNA片段含有目的基因。这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有：鉴定时所用的引物与目的DNA进行碱基互补配对后，需要能够延伸并复制目的基因的部分特异性序列，因此引物不必包含酶切位点或同源序列；而扩增时的引物与目的基因3'端边界进行碱基互补配对后，必须能延伸并复制完整的目的DNA片段，必须包含酶切位点或同源序列。 （4）在PCR可扩增过程中，首轮PCR之前预变性的目的是增加大分子DNA彻底变性的概率，最后一轮PCR结束后维持最适温度（72℃7min）一段时间，目的是使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列。 18．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶（Luc）基因（无启动子）的载体（如图2）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光。请回答下列问题。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列；图2中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、EcoRI、HindⅢ、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 （1）为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶______切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为______。 A．5′-AACTAT-3′  B．5′-GAATTCAACTAT-3′ C．5′-TTGATA-3′  D．5′-AAGCTTAACTAT-3′ （2）将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含______的培养基中；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加______进行检测。 （3）Luc基因载体上有一段P2A序列，其表达产生的2A肽的功能如图3所示。P2A序列能与vtg基因、Luc基因一起完成______过程。Luc基因载体上有一段P2A序列的意义是______。 （4）进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子中的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到E蛋白在启动子上的结合位点，请运用本题研究成果完成设计思路： ①用限制酶将______切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的______游，形成多种重组载体。 ②将每种重组载体分别导入斑马鱼的______中，待发育成熟后添加荧光素等进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中______（填“含有”或“不含有”）能与E蛋白结合的序列。 ③将该片段继续切割成多个长度，重复上述操作，进一步缩小该特定序列的位点区域。 【答案】（1）EcoRI、HindIII B （2）氨苄青霉素 雌激素、荧光素 （3）基因的表达（转录和翻译） P2A序列产生的2A肽能将融合蛋白切割成独立的两种蛋白，有助于序列两侧的基因平衡表达成两种独立的蛋白质 （4）启动子 上 受精卵 含有 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、钙离子处理法）； （4）目的基因的检测与鉴定（分子水平和个体水平检测，前者包括DNA分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交；后者如抗虫抗病接种实验）。 （1）为降低“空载”概率,需要选用双酶切法，根据图2信息可知基因载体存在2个BamH Ⅰ酶切位点，不能使用，BsrG Ⅰ会把P2A序列切掉，因此也不能使用。所以使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ；依据图1推测引物1是以3’-TTGATA-5’为模板的，并与其互补，所以引物1碱基序列中应该含有5’ -AACTAT-3 ’，以及EcoR Ⅰ的识别序列（5’ -GAATTC-3 ’），故引物1包含的碱基序列为5’ -GAATTCAACTAT-3 ’，B符合题意，故选B； （2）vtg-Luc基因重组载体中含Ampr抗性基因与Luc荧光素酶基因，所以将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基中。若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素，因为雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白从而激活vtg-Luc基因重组载体在转基因斑马鱼细胞中的表达。利用-Luc基因表达出的荧光素酶催化荧光素氧化产生荧光，以此实现判断斑马鱼转基因是否成功的目的，故水体中需要添加雌激素和荧光素； （3）P2A序列能与vtg基因、Luc基因一起完成基因的表达（转录和翻译）过程。Luc基因载体上有一段P2A序列的意义是P2A序列产生的2A肽能将融合蛋白切割成独立的两种蛋白，有助于序列两侧的基因平衡表达成两种独立的蛋白质； （4）①vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到 E蛋白在启动子上的结合位点，可以用限制酶将vtg基因启动子切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的上游（或ori与P2A序列之间），形成多种重组载体； ②将每种重组载体分别导入斑马鱼受精卵，待发育成熟后添加雌激素和荧光素后进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中含有能与E蛋白结合的序列。 19．（2026·江苏南京栖霞名校联盟·一模）CBF基因是一类转录调节因子，其与植物的生长发育密切相关。科学家将马铃薯CBF基因导入烟草中获得转基因烟草。回答下列问题： （1）获取和扩增目的基因：对马铃薯幼苗进行取样，每株幼苗取6~8片叶，从叶片中提取总RNA，再经____________过程合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，利用PCR技术进行扩增。扩增完成后，利用____________检测产物，其结果如图1所示，若CBF基因片段的长度为775bp，则在图1中CBF基因片段位于第____________泳道。 （2）构建基因表达载体：CBF基因片段和Ti质粒的酶切位点如图2、3所示，为使PCR扩增出的CBF基因片段能插入T-DNA中，需在两个引物的____________（填“5'”或“3'”）端分别添加限制酶____________的识别序列。构建重组Ti质粒时，需要利用____________将CBF基因与Ti质粒连接起来。 （3）用____________处理农杆菌，使其处于____________，再将重组质Ti粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化。 （4）使用农杆菌转化法将重组Ti质粒中的CBF基因片段导入烟草细胞中，之后可通过向培养基中加入____________来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞；对导入目的基因的烟草细胞进行组织培养时，烟草细胞先经脱分化形成____________，该过程____________（填“需要”或“不需要”）光照。 【答案】（1）逆转录/反转录 琼脂糖凝胶电泳 4 （2）5' SacⅠ和NotⅠ DNA连接酶 （3）Ca2+ 感受态 （4）潮霉素 愈伤组织 不需要 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 （1）利用RNA合成DNA的过程叫作逆转录（或反转录）；可以利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR技术的扩增产物；CBF基因片段的长度为775bp，其电泳后的片段应位于标准样品750bp与1000bp之间，且更接近标准样品750bp，据图可知CBF基因片段应位于图1中的第4泳道。 （2）在构建重组质粒时，为确保CBF基因片段不被破坏，应选用限制酶SacⅠ和NotⅠ切割质粒和目的基因所在片段，所以CBF基因片段两端添加的序列所对应的限制酶是SacⅠ和NotⅠ；为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端；CBF基因片段与Ti质粒还需要使用DNA连接酶进行连接，形成重组Ti质粒。 （3）农杆菌是微生物，需要用Ca2+处理使其成为感受态细胞，易于吸收环境中DNA分子。 （4）由图2可知，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA中，随T-DNA整合到烟草细胞的染色体DNA上，故在培养基中需加入潮霉素来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞。植物组织培养技术中细胞或组织需经脱分化而形成愈伤组织，光照会影响愈伤组织的形成，故该过程不需要光照。 20．（2026·江苏南京六合名校联盟·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： （1）为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生________。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，________（填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是________。 （2）为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带________最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________。 （3）若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶________识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是________。 （4）转化时常用________处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有________的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 【答案】（1）碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） （2）3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） （3）EcoR I RNA聚合酶 （4）Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因便于目的基因的鉴定和筛选；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生碱基互补配对。这是因为为了将B2L基因和F1L基因成功连接，需要通过引物设计使得两个基因的末端能够互补配对，从而在PCR扩增过程中形成融合基因。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，不能延伸获得B2L-FIL融合基因。原因是DNA聚合酶只能从3'端向5'端延伸，DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端），而链①与链⑧杂交后，链⑧的3'端无法提供合适的引物结合位点，因此无法进行延伸。 （2）条带3最可能表示B2L-F1L融合基因。在琼脂糖凝胶电泳中，条带3的大小与预期的B2L-F1L融合基因大小相符，因此最可能是融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA片段的大小，不能确定碱基序列（及是否产生突变），进而无法确定其序列的准确性，基因测序可以精确地确定DNA序列，确保融合基因的正确性。 （3）在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶EcoRI识别序列。这是因为B2L-F1L融合基因转录的模板链是a其链，。其3'端应与启动子一侧接近。转录时，与启动子结合的酶是RNA聚合酶。RNA聚合酶能够识别启动子序列，并在启动子的指导下开始转录过程。 （4）转化时常用CaCl₂处理大肠杆菌。CaCl₂处理可以使大肠杆菌细胞壁的通透性增加，从而更容易吸收周围环境中的DNA分子。用含有氨苄青霉素和X-gal的培养基筛选大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（Ampr）是质粒上的一个标记基因，只有含有重组质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。同时，X-gal可以用于鉴定LacZ基因的存在与否，含有LacZ基因的菌落呈蓝色，而LacZ基因被破坏或缺失的菌落呈白色。挑选白色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。这是因为含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色，而含有空质粒的大肠杆菌菌落呈蓝色。 21．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： （1）构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 （2）为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 （3）将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 【答案】（1）dNTP、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链上（复性） （2）5' NdeI、SmaI（顺序可颠倒） T4DNA连接酶 （3）质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因 腺嘌呤和组氨酸 排除AD与ECL蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能 能 丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达 【解析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 （1）扩增目的基因的PCR反应体系，除了模板、含Mg²⁺的缓冲液、引物外，还需要加入Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）和dNTP（脱氧核苷酸）。 当温度下降到55℃时，PCR反应体系中发生的反应是引物结合到互补DNA链上（复性）。 （2）分析图2pBD载体上的酶切位点，选择NdeI、SmaI限制酶可以保证ELC基因正确插入pBD。故利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的5'端分别添加NdeI、SmaI限制酶的识别序列，再用T4DNA连接酶（既可以连接黏性末端，又连接平末端）将其与pBD载体连接。 （3）①三组酵母菌都能在只缺少色氨酸（Trp）和亮氨酸（Leu）的培养基（培养基1）上生长，说明质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因。该实验的报告基因为腺嘌呤（Ade）和组氨酸（His）的合成基因，因为培养基2同时缺少这两种物质，只有报告基因表达时酵母菌才能生长。设置甲、乙组的目的是作为对照，排除AD与ELC蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能； ② 根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白能相互作用，理由是丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达。 22．（2027·海门中学·一调）炎症性肠病（IBD）患者肠道内会产生硫代硫酸盐，生成量与疾病的严重程度呈正相关。图1是科研人员利用大肠杆菌（EcN）建立的响应硫代硫酸盐的益生菌传感器的部分结构，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。请回答下列问题。 （1）图1中，R基因的表达______（“受”或“不受”）硫代硫酸盐的诱导。由于硫代硫酸盐能_____，科研人员可通过检测粪便中_____来判定肠道内硫代硫酸盐的浓度，诊断IBD的发病程度。 （2）为构建图1传感器，科研人员利用PCR技术扩增图2中的R基因时，在引物_____的5＇端分别添加限制酶_____的识别序列。 （3）为了防止EcN工程菌治疗后存在基因转移和抗性基因污染环境的风险，科研人员构建一种如图3的自毁开关系统，该系统能够在诱导条件下激活自毁机制，从而导致细菌无法生长，可用于治疗后EcN的清除。 ①经过人工改造的自毁开关系统由Cascade蛋白、gRNA和Cas3核酸酶组成，Cascade蛋白与：gRNA结合成复合体，gRNA通过与目标DNA部分序列进行_____来识别目标DNA，随后复合体招募Cas3核酸酶切割目标DNA的_____键，诱发细菌死亡。 ②为测试上述自毁开关系统在动物肠道环境中的效果，科研人员制备一些肠道无菌小鼠并将小鼠分为两组：对照组给予重组EcN且正常饮水：实验组_____。一段时间后，收集两组小鼠的_____样本，将其处理后采用_____法接种并统计两组平板上的菌落数。 【答案】（1）不受 促进R蛋白形成二聚体，并启动GFP基因的表达（或解除R蛋白对启动子B的抑制） 绿色荧光强度 （2）1、4 BglⅡ、HindⅢ （3）碱基互补配对 磷酸二酯 给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水 粪便 稀释涂布平板 【解析】（1）从图1可知，R基因自身由启动子A持续驱动表达，不受硫代硫酸盐调控；硫代硫酸盐的作用是和R蛋白结合形成二聚体，解除原本R蛋白对启动子B的抑制，启动GFP基因的转录翻译，合成绿色荧光蛋白。由于硫代硫酸盐生成量和IBD严重程度正相关，最终GFP的表达量和硫代硫酸盐浓度正相关，因此可通过检测粪便中的绿色荧光强度判定硫代硫酸盐浓度，诊断IBD发病程度。 （2）PCR 扩增目的基因，引物分别结合模板两条链的 3' 端；引物1在 R 基因启动子A上游，引物 4 在R基因终止子下游，用引物 1、4 才能完整扩增R基因（既包括启动子也包括终止子）片段。BglⅡ、HindⅢ 两个酶切位点，切割后产生不同黏性末端，防止目的基因自身环化、反向连接，它们又在启动子和终止子附近便于转录，Xam Ⅰ比较远，没有BglⅡ、HindⅢ更合适。Pst Ⅰ和Sau3A在质粒启动子和终止子内部，会破坏转录。BamHⅠ 会破坏R基因，Sam Ⅰ会切掉终止子。所以限制酶用BglⅡ、HindⅢ。 （3）①gRNA识别目标DNA依靠核酸序列的碱基互补配对原则；核酸酶的作用是切割DNA骨架的磷酸二酯键，破坏细菌基因组/关键基因，诱发细菌死亡。 ② 实验遵循单一变量原则，对照组给予重组EcN且正常饮水，实验组需要给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水，激活自毁机制。由于肠道益生菌会随粪便排出，因此收集粪便样本，采用稀释涂布平板法接种，通过统计菌落数反映肠道内存活的工程菌数量，验证自毁开关的清除效果。 23．（2026·如皋中学·模拟预测）BCL11A蛋白是一种转录抑制因子，能与γ珠蛋白基因启动子上游的调控序列中特异性结合位点结合，抑制γ珠蛋白基因的表达。为确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员利用下列多对引物扩增了γ基因上游7种不同长度的片段，分别将这些片段插入载体中并导入受体细胞，一段时间后进行荧光检测，相关信息如图所示。请回答： （1）PCR扩增γ珠蛋白基因上游不同长度的片段过程中，在缓冲体系除需要加入含Mg2+的缓冲液和原料外，还需要添加的主要成分有___________，预变性时94℃持续5min的目的是___________。 （2）载体上P的基本组成单位是_________。构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因转录时的模板链______（填“在”或“不在”）同一条DNA链上。据图可知，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是_________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是__________。 （3）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞后，含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞均有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白，无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白的原因是____________。 （4）若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列所对应序列之间的区段上，若向培养液中添加适量的雌激素，则含_________（选填“F1~F6”）与R扩增产物的受体细胞有荧光。 （5）科研人员用基因编辑技术对造血干细胞中BCL11A蛋白结合位点进行定点诱变，然后回输给地中海贫血症患者（血红蛋白中β链异常），一段时间后患者症状明显好转，据下图并结合上述信息，分析患者症状明显好转的原因是___________。 【答案】（1）模板、耐高温DNA聚合酶、引物 使DNA充分变性 （2）4种脱氧核苷酸 不在 SalⅠ EcoRⅠ （3）F7与R扩增产物不含启动子（或完整的启动子），荧光蛋白基因不表达 （4）F3、F1、F6 （5）定点诱变导致BCL11A蛋白不能与结合位点结合，γ珠蛋白合成增多，则患者体内的胎儿血红蛋白（HbF）增多从而缓解症状 【解析】（1）PCR扩增的条件包括：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等。所以在缓冲体系除需要加入含Mg2+的缓冲液和原料（四种脱氧核苷酸）外，还需要添加的主要成分有模板、耐高温DNA聚合酶、引物。 预变性时94℃持续5min，是因为高温能使DNA变性，高温持续5min能使DNA充分变性。 （2）载体上P启动子，是一段DNA，DNA的基本单位是4种脱氧核苷酸；模板链作为转录的模板，从启动子到终止子的方向进行转录，表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因启动子到终止子的方向相反， 因此转录时的模板链不在同一条链上；为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ，与载体上Xho I酶切后的黏性末端相同，在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，与载体上Mun Ⅰ 切割后的黏性末端一样，载体上不能用EcoRⅠ进行切割，会破坏荧光蛋白基因，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体，且保证目的基因接入载体时启动子和终止子的方向与荧光蛋白基因的启动子和终止子的方向相同。 （3）含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含启动子（或完整的启动子），荧光蛋白基因不表达。 （4）若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列上所对应序列之间的区段上，F4-R、F5-R、F6-R扩增出来的片段中都不包含BCL11A蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达，都会发荧光。 （5）结合上述信息，用基因编辑技术对造血干细胞中BCL11A蛋白结合位点进行定点诱变，导致BCL11A蛋白不能与结合位点结合，γ珠蛋白合成增多，则患者体内的胎儿血红蛋白（HbF）增多从而缓解症状。 24．（2026·盐城中学·模拟预测）科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取人的血清白蛋白（HSA）。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为转录的模板链。回答下列问题： （1）PCR扩增HSA基因时，为激活DNA聚合酶活性，缓冲液里一般还需要添加___________；利用琼脂糖凝胶电泳分离出的符合要求的PCR扩增产物后，通常还需要进行基因测序，原因是___________。 （2）在②操作后得到的农杆菌，有的没有导入质粒，有的导入了空的Ti质粒，有的导入了重组Ti质粒。在构建重组Ti质粒时，若HSA基因两端没有图示中相应限制酶的酶切位点，为确保HSA基因与Ti质粒正向连接，同时便于导入重组表达载体的农杆菌的筛选，在PCR扩增HSA基因前，需要在引物1的5'末端引入___________（填“BclI”、“BamHI”或“HindIII”）酶的识别与切割序列，在引物2的5'末端引入___________（填“BclI”、“BamHI”或“HindIII”）酶的识别与切割序列。 （3）将HSA基因导入水稻细胞进行遗传改造的途径除图示方法外，也可以将含HSA基因的重组表达载体包裹在人工合成的脂质体中，与经过___________酶处理所得到的水稻细胞原生质体融合。 （4）在图示③操作后还要进行目的基因的检测，可通过___________等技术检测水稻的染色体DNA上是否插入了HSA基因或检测HSA基因是否转录出了___________；再利用___________方法，从水稻细胞产物中鉴定是否表达出所需的HAS。 【答案】（1）Mg2+ 琼脂糖凝胶电泳仅能分析DNA分子的大小，无法确定DNA分子碱基序列 （2）Bcl I Hind Ⅲ （3）纤维素（纤维素酶和果胶） （4）PCR mRNA 抗原-抗体杂交 【解析】（1）PCR反应缓冲液中需要添加Mg²⁺（镁离子），因为Mg2+是Taq DNA 聚合酶的激活剂，也是维持酶活性和反应体系稳定的关键离子。利用琼脂糖凝胶电泳分离出的符合要求的PCR扩增产物后，通常还需要进行基因测序，原因是琼脂糖凝胶电泳仅能分析DNA分子的大小，无法确定DNA分子碱基序列。 （2）启动子下游的第一个酶切位点是Hind Ⅲ，终止子上游的是Bcl I，HSA基因两端没有限制酶Bcl I、Hind Ⅲ的酶切位点，要使目的基因插入启动子和终止子之间且方向正确，同时为便于对导入重组表达载体的农杆菌的筛选（需破坏抗四环素基因），HSA基因的b链为转录模板链，模板链的3'端应与启动子相连，因此引物2的5'端应引入Hind Ⅲ酶的识别与切割序列，模板链的5'端与终止子相连，即引物1的5'端应引入Bcl I酶的识别与切割序列。 （3）水稻细胞有细胞壁，需先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，得到原生质体，才能与包裹了重组质粒的脂质体融合。 （4）检测水稻的染色体DNA上是否插入了HSA基因，可采用PCR技术；检测HSA基因是否转录出了mRNA，可采用分子杂交技术；从水稻细胞产物中鉴定是否表达出所需的HSA，可利用抗原-抗体杂交方法，因为抗原与抗体能特异性结合。 25．（2026·南京&镇江·模拟预测）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图所示。 注：linker为编码6个氨基酸的基因序列 引物名称 引物序列（方向5′→3′下划线处为限制酶识别序列） P1 GGATCCGATGATGATGATGATGAG P2 GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT P3 AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC P4 GCGGCCGCTGAGGAGACGGT （1）上图中由杂交链获得融合基因的②过程，________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是___________。引物P2中linker的碱基序列是5′-________-3'。 （2）对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。利用图中质粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶________对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 （4）科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图。检测结果显示_______，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 【答案】（1）不需要 可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸 GACCCCAGCTCCAAAGCT （2）P1和P4 6 BclⅠ、NotⅠ （3）Ca2+ 转化 （4）Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异 【解析】（1）杂交链的两条链在DNA聚合酶作用下可以互为模板进行延伸形成完整的融合基因，所以不需要添加引物，可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸。结合图示可知，先分别用（P1、P2）与（P3、P4）扩增得到目的链1和目的链2，而引物需要与模板的3'端结合，据图可知，杂交链的两条链需要互为模板进行延伸才能形成完整的融合基因，所以引物P2中linker的碱基序列与引物P3中linker的碱基序列能够碱基互补配对，引物P2中5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′与引物P3中5′-AGCTTTGGAGCTGGGGTC-3′能够碱基互补配对，因此引物P2中决定linker的碱基序列是5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′。 （2）对融合基因扩增时，需要用位于两端的引物P1和P4，这样才能扩增出完整的融合基因。设该过程扩增了n次，根据DNA分子复制时引物的消耗规律，最初的1个融合基因不含引物，每扩增一次，DNA分子数量翻倍，新合成的DNA单链都需要引物，总共消耗引物分子数为2n+1−2，已知共消耗了126个引物分子，则2n+1−2=126，即2n+1=128，解得n=6。图1中融合基因右端应与启动子接近，融合基因右端具有Not I酶切位点，左端具有BamH Ⅰ酶切位点，而BamH Ⅰ与Bcl Ⅰ切割后末端相同，所以可以用限制酶BclⅠ、NotⅠ对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为转化。 （4）检测结果显示Nb205-48与加入cRBC、FMDV后的亲和免疫反应性能值均较高，说明双特异纳米抗体Nb205-48既能与FMDV反应，又能与cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异，构建成功。 26．（2026·丹阳中学&淮阴中学·模拟预测）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S—L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S—L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。请回答下列问题： （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S—L融合基因时，最好使用限制酶________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因；将S—L融合基因连接至AVV载体时，需利用限制酶________对S—L融合基因进行切割。 （2）AAV作为基因表达载体，其组成除图2所示结构外还有复制原点、________（答出两点）。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S—L融合基因的大肠杆菌为________（填“甲”或“乙”）；条带③为用引物________扩增的产物。若要排除PCR体系污染导致的假阳性，还应增设________组作为阴性对照。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S—L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是________。获得成功整合S-L融合基因的工程菌后，需要验证其功能是否符合预期。研究人员设计了如下实验，请完成下表： 实验步骤目的 简要操作过程 癌细胞培养 适宜条件下培养癌细胞后，随机均分为A、B、C、D四组。 实验处理 A组：工程菌+正常氧培养（21%O2） B组：________ C组：等量的普通大肠杆菌（不含S-L融合基因）+低氧培养（1%O2） D组：等量的普通大肠杆菌+正常氧培养（21%O2） 检测指标 培养液中大肠杆菌的密度、大肠杆菌裂解酶的活性、________。 【答案】（1）XbaI、SpeI PstI、BglII （2）有目的基因、标记基因 （3）乙 1和2 不加模板DNA的空白对照 （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放 等量的工程菌+低氧培养（1%O2） 培养液中抗癌药物的含量和癌细胞数量 【解析】（1）构建S-L融合基因需保证两个基因转录方向一致（S基因以b链为模板、L基因以a链为模板），XbaI和 SpeI切割后可使S、L基因产生互补黏性末端，实现定向连接，避免反向连接导致基因表达异常，因此最好使用限制酶XbaI、SpeI分别切割S蛋白基因和L蛋白基因实现连接，因为这两种限制酶为同尾酶，将S—L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶PstI、BglII对S—L融合基因进行切割。这样可以保证融合基因的完整，避免自身环化或载体自连。 （2） 基因工程载体需满足目的基因的装载、传递、稳定遗传和筛选等核心需求，AAV作为基因表达载体，其组成除图2所示结构外还有复制原点、目的基因、标记基因，标记基因用于筛选出成功导入目的基因的受体细胞。 （3）甲种大肠杆菌提取DNA加入引物进行PCR只有一条条带，说明应该是未导入S-L融合基因（此时引物1和引物3可以发挥作用）；乙种大肠杆菌提取DNA加入引物进行PCR有两条条带，说明是成功导入S-L融合基因的工程菌（此时引物1和2，引物1和3均可以发挥作用扩增区间DNA片段）。PCR扩增产物的长度由引物结合的模板位置决定，引物1和引物3扩增的DNA片段长度最长，对应条带①；电泳中DNA片段越长，迁移速率越慢；最短的扩增产物对应条带③（条带③为引物1和引物2扩增的短片段，迁移速率更快）。若要排除PCR体系污染导致的假阳性，还应增设不加模板DNA的空白对照组作为阴性对照，若没有DNA条带，则可证明实验操作可信。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S—L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送， 该过程依托S蛋白和L蛋白的特异性功能，实现抗癌药物的靶向定位和定向释放，即相关机理可描述为：工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放；要验证其功能是否符合预期。研究人员设计了如下实验，即本实验的目的是验证低氧环境中，抗癌药物注入含S—L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，则实验的自变量为是否用工程菌和供氧是否正常，相关步骤如下： 实验处理为：A组：工程菌+正常氧培养（21%O2）；B组：等量的工程菌+低氧培养（21%O2）C组：等量的普通大肠杆菌（不含S-L融合基因）+低氧培养（1%O2）D组：等量的普通大肠杆菌+正常氧培养（21%O2）。 实验的检测指标，即因变量应该为：培养液中大肠杆菌的密度、大肠杆菌裂解酶的活性，培养液中抗癌药物的含量和癌细胞数量等，这些指标均为与药物相关的癌细胞的生理指标。 27．（2027·江苏南通·一模）毛木耳是一种可分解纤维素的真菌。为提高毛木耳对纤维素的降解能力，科研人员利用限制酶BsmB I构建了毛木耳特异性启动子（Gpd）、福寿螺纤维素酶基因（Mfcsg）与潮霉素抗性基因（Hpt）的融合基因，并导入毛木耳细胞中。已知潮霉素对细菌、真菌均具有毒性，可作为筛选标记。限制酶BsmB I具有偏移剪切的特性，其切割位点位于接头序列两侧，可实现多个DNA片段的无缝连接。实验流程及相关酶切原理如下图所示。请回答下列问题。 （1）为获取Mfcsg基因，可先从福寿螺胃组织细胞中提取______，通过RT-PCR扩增获得目的基因，该扩增过程中需要加入______酶。 （2）过程①可实现在各DNA片段末端添加______。过程②构建融合基因，除限制酶BsmB I外，还需要______酶催化。限制酶BsmB I对切割位点______（选填“有”“无”）特异性，该酶切割后产生的两个黏性末端______（选填“相同”“不相同”“可能相同”）。 （3）Mfcsg基因和Hpt基因的部分序列如下表所示，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNCGACCAAAT-3′，请依据碱基互补配对原则，以尽可能少的碱基补充完善引物F3的序列：5′-______GTGCTG-3′。 Mfcsg基因两端的部分序列 5′-AGCGTGCT……ATTTGGTCG-3′ Hpt基因两端的部分序列 5′-GTGCTGTA……GTATCTACG-3′ （4）为检测Mfcsg基因在毛木耳细胞中的表达效果，科研人员设计相关实验（已知刚果红可与纤维素结合呈现红色，纤维素被降解后会在菌落周围形成透明圈）。 ①取等量且长势一致的野生型毛木耳菌丝体，经______筛选获得的转基因毛木耳菌丝体，分别接种于含有等量的______的固体培养基上，依次设置对照组和实验组，且每组设置3组平行重复； ②在相同且适宜的条件下培养一段时间后，测量并计算每组______，取平均值； ③对实验数据进行统计分析。 【答案】（1）总mRNA 逆转录酶、TaqDNA聚合酶 （2）BsmB Ⅰ的识别序列和接头序列 DNA连接 无 可能相同 （3）5'CGTCTCNGTCG3' （4）潮霉素 纤维素和刚果红 透明圈直径与菌落直径的比值 【解析】（1）RT-PCR是以mRNA为模板逆转录合成cDNA再扩增目的基因的技术，因此首先需要从福寿螺胃组织细胞中提取mRNA，RT-PCR过程需要逆转录酶催化逆转录合成cDNA，还需要Taq（热稳定DNA聚合）酶催化后续的PCR扩增，因此需要加入逆转录酶和Taq（热稳定DNA聚合）酶。 （2）过程①为PCR扩增，可实现在各DNA片段末端添加BsmB Ⅰ识别序列和接头序列，以便后续无缝连接。过程②构建融合基因，除限制酶BsmB I切割产生互补黏性末端外，还需要DNA连接酶催化DNA片段之间形成磷酸二酯键，完成连接。根据限制酶BsmB I的识别序列可知，其对切割位点无特异性，BsmB I切割位点在识别序列外侧，识别序列为5’- CGTCTCN.…. -3'，其中N可代表任意碱基，这样导致该酶切割后产生的两个黏性末端可能相同也可能不同。 （3）已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNCGACCAAAT-3′，被BsmB I切割后产生的黏性末端为5'-CGAC-3'，引物F3需设计为切割后产生互补的5'-GTCG-3'末端，因此F3的5'端需依次添加BsmB I识别序列（CGTCTC）、任意碱基N和互补接头序列（CGAC），最终序列为5'-CGTCTCNGTCGGTGCTG-3'。 （4）因为Hpt基因表示潮霉素抗性基因，潮霉素对真菌细胞有毒性，所以将重组质粒的农杆菌导入毛木耳细胞后，转移至含有潮霉素的培养基中，能正常生长的是符合要求的受体细胞。为检测Mfcsg基因在毛木耳细胞中的表达效果，且已知刚果红染料可与纤维素结合呈红色，而纤维素被降解后会形成透明圈，根据对照原则和单一变量原则，实验步骤如下： ①取等量且长势一致的野生型毛木耳菌丝体，经潮霉素筛选获得的转基因毛木耳菌丝体，并接种到含等量的纤维素和刚果红的固体培养基上，依次设置对照组和实验组，且每组设置3个平行重复； ②在相同且适宜条件下培养一段时间后，测量并计算每组透明圈直径与菌落直径的比值，取平均值； ③对实验数据进行统计分析。 28．（2026·江苏东海高级中学·模拟预测）转基因抗虫玉米LD05的培育过程中，将抗虫融合基因m2cryAb-vip3A导入受体玉米，利用PCR技术进行纯合子与杂合子鉴定，再经抗性检测后获得优良品系．请回答下列问题： （1）构建基因表达载体时，除目的基因、标记基因外，还包含的元件有________。 Ti质粒上的T-DNA的作用是________。 （2）将转基因玉米LD05与原品种杂交，筛选出性状符合预期的F1，F1自交，得到F2，对F2进行纯合子与杂合子鉴定。 ①用以下流程提取叶片中的基因组DNA，液氮研磨使植物细胞破碎的优点为________，乙醇沉淀后得到的DNA可用________试剂进行鉴定。 ②以提取的DNA为模板，设计如图所示的引物，进行PCR扩增．PCR反应体系需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶．DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。若要鉴定目的基因是否正确插入，可选引物的组合为________。 ③纯合子与杂合子鉴定．若选用引物1与4扩增，经电泳后最多可得到________种清晰条带，若得到________种清晰条带，则是杂合子。 （3）为检测m2cryAb-vip3A基因在纯合子与杂合子株系中的表达差异，利用RT-PCR和ELISA方法（酶联免疫吸附测定法，可对蛋白质定量或定性测定）对得到的株系进行检测，结果如下图所示．请结合检测结果，得出相关结论：________。 【答案】（1）启动子、终止子 将目的基因转移并插入（整合）到玉米 细胞的染色体 DNA上 （2）冷冻处理后细胞更容易破碎，同时抑制核酸酶活性，防止 DNA 降解 二苯胺 四种脱氧核苷酸 延伸 引物 1 和引物 2（或引物 3 和引物 4） 2 2 （3）在检测的不同组织器官中，纯合株系中m2cryAb-vip3A基因在转录和翻译水平 的表达量普遍高于杂合植株 【解析】（1）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还包含启动子、终止子（启动子是 RNA 聚合酶结合位点，驱动目的基因转录；终止子终止转录过程）。 ② Ti 质粒上的 T-DNA（可转移 DNA）的作用是：可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体 DNA 上（农杆菌转化法的核心原理，使目的基因随 T-DNA 稳定整合到宿主基因组中）。 （2）液氮研磨的优点：低温能抑制核酸酶的活性，防止 DNA 被降解；同时低温使细胞脆性增加，研磨更易破碎细胞，释放 DNA。DNA 鉴定试剂：二苯胺（在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺反应呈现蓝色）。PCR 反应体系除模板 DNA、引物外，还需dNTP（四种脱氧核苷酸，作为合成 DNA 的原料）、含 Mg²⁺的缓冲液和耐高温的 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶在 PCR 的延伸步骤中起作用（PCR 三步：变性→复性（退火）→延伸，DNA 聚合酶在延伸阶段催化脱氧核苷酸聚合形成子链）。鉴定目的基因是否正确插入，可选引物组合为引物 1 和引物 2（或引物 3 和引物 4），引物1为左侧翼基因组序列，引物2为抗虫融合基因内部序列，二者扩增产物仅当目的基因存在且方向正确时出现，可鉴定正确插入，同理，引物4为左侧翼基因组序列，引物3为抗虫融合基因内部序列，二者扩增产物仅当目的基因存在且方向正确时出现，可鉴定正确插入。引物1和4分别位于插入片段两侧的基因组上。无插入时扩增出短片段（S），有插入时因片段长度增加扩增出长片段（S+L）。纯合子（两个等位基因均插入）：只产生长片段 → 1种条带，杂合子（一个插入、一个不插入）：同时产生长片段和短片段 → 2种条带，野生型：只产生短片段 → 1种条带因此最多出现2种条带，且出现2种条带时为杂合子。 （3）图中左侧RT-PCR结果显示纯合子（3、7、17）的mRNA相对表达量（约2.5~3）高于杂合子（1、5、8、20，约0.5~1.5）；右侧ELISA结果显示纯合子的蛋白含量（约40~55）也明显高于杂合子（约10~20）。说明纯合子中双拷贝基因的表达叠加效应更强，可能赋予更高的抗虫性。同一株系中，不同组织（根、茎、叶）的基因和蛋白表达量存在差异，说明目的基因的表达具有组织特异性。 29．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图所示。 注：linker为编码6个氨基酸的基因序列 引物名称 引物序列（下划线处为限制酶识别序列） P1 5′GGATCCGATGATGATGATGATGAG3′ P2 5′GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT3′ P3 5′AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC3′ P4 5′GCGGCCGCTGAGGAGACGGT3′ （1）上图中由杂交链获得融合基因的②过程________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是_________________。引物P2中linker的碱基序列是5′-_________________-3'。 （2）对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了______次。利用图中质粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶______________对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理，基因表达载体导入大肠杆菌目的是______________________________。基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 （4）科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图。检测结果显示_________________________，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 【答案】（1）不需要 可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸 GACCCCAGCTCCAAAGCT （2）P1和P4 6 Bcl Ⅰ、Not Ⅰ （3）Ca2+ 随大肠杆菌大量增殖时实现重组DNA的大量扩增 转化 （4）Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异 【解析】（1）杂交链的两条链在DNA聚合酶作用下可以互为模板进行延伸形成完整的融合基因，所以不需要添加引物，可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸。结合图示可知，先分别用（P1、P2）与（P3、P4）扩增得到目的链1和目的链2，而引物需要与模板的3'端结合，据图可知，杂交链的两条链需要互为模板进行延伸才能形成完整的融合基因，所以引物P2中linker的碱基序列与引物P3中linker的碱基序列能够碱基互补配对，引物P2中5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′与引物P3中5′-AGCTTTGGAGCTGGGGTC-3′能够碱基互补配对，因此引物P2中决定linker的碱基序列是5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′。 （2）对融合基因扩增时，需要用位于两端的引物P1和P4，这样才能扩增出完整的融合基因。设该过程扩增了n次，根据DNA分子复制时引物的消耗规律，最初的1个融合基因不含引物，每扩增一次，DNA分子数量翻倍，新合成的DNA单链都需要引物，总共消耗引物分子数为2n+1−2，已知共消耗了126个引物分子，则2n+1−2=126，即2n+1=128，解得n=6。图1中融合基因右端应与启动子接近，融合基因右端具有Not I酶切位点，左端具有BamH Ⅰ酶切位点，而BamH Ⅰ与Bcl Ⅰ切割后末端相同，所以可以用限制酶Bcl Ⅰ、Not Ⅰ对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。基因表达载体导入大肠杆菌目的是随大肠杆菌大量增殖时实现重组DNA的大量扩增。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为转化。 （4）检测结果显示Nb205-48与加入cRBC、FMDV后的亲和免疫反应性能值均较高，说明双特异纳米抗体Nb205-48既能与FMDV反应，又能与cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 30．（2026·江苏南通通州·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： （1）利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 （2）已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGGTTCCGCCAGCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ （3）过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 （4）转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 （5）将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 【答案】（1）4种脱氧核苷酸（dNTP）、TaqDNA聚合酶 CUP1基因左端的序列和Bgl Ⅱ的识别序列 （2）③ （3）扩增质粒2 （4）一定浓度硫酸铜 引物2 琼脂糖凝胶电泳 1330bp （5）增强（或提高） ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中该基因表达被抑制，双乙酰合成减少，故含量更低 【解析】本题图1展示基因工程流程：通过PCR扩增目的基因，构建含CLPI和GSH1基因的重组质粒，导入大肠杆菌扩增后转化啤酒酵母。图2显示工程菌谷胱甘肽含量显著高于对照，双乙酰含量低于对照，说明工程菌抗氧化能力增强且双乙酰产量降低，达到育种目标。 （1）PCR技术需要的条件包括模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）和缓冲液。P1需扩增含CUP1左端的目的片段，故依据CUP1基因左端序列设计；同时为便于后续与载体连接，需在引物5'端引入BglⅡ识别序列。因此，P1设计依据是CUP1基因左端序列和BglⅡ识别序列的组合。 （2）P3序列5'端为TGCC...，其反向互补序列应以...GGCA结尾。选项③（5'-CGCT...GCA...-3'）的3'端含GCA，能与P3的5'端TGC形成互补配对（C-G, G-C, A-T）。在重叠延伸PCR中，这种3'端互补是引物退火并延伸的关键，使P2能作为P3的“搭档”扩增出融合基因片段，而其他选项无此互补特征，故选③。 （3）质粒2含CUP1-GSH1融合基因。大肠杆菌繁殖快、易培养，导入后可利用其快速分裂大量复制重组质粒，从而获得足量DNA用于后续转化酵母，解决直接转化酵母效率低、获量少的问题。 （4）CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”，因此CUP1相当于标记基因，培养基中添加硫酸铜可进行初步筛选；验证CUP1和GSH1已整合，应选引物1和引物2，若扩增出条带则证明存在；引物3在质粒上，即使未插入目的基因，也能扩增出来产物。PCR产物需经琼脂糖凝胶电泳分离检测；已知:引物1：30bp； ILV2-左边界: 270 bp ，CUP1 : 1030 bp ，整合成功时，扩增产物包含以上所有片段，总长度为: 30+270 + 1030 = 1330 bp 。 这说明CUP1和GSH1已通过同源重组整合到酵母染色体ILV2位点，PCR可扩增出该特征长度片段。 （5）据图2分析，工程菌谷胱甘肽含量显著高于未转化受体菌，因此啤酒抗老化能力增强（提高）；工程菌双乙酰含量变化曲线：整体低于未转化受体菌，呈先上升后下降趋势，峰值更低。理由：ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中 ILV2基因被抑制（或敲低），双乙酰合成减少，故含量低于受体菌。 31．（2026·江苏盐城联盟校·模拟预测）植物中的γ-氨基丁酸（GABA）在非生物胁迫响应过程中发挥重要作用，例如外源添加GA-BA能够显著缓解砷对水稻根系伸长的抑制作用。为了进一步阐明GABA在解砷毒过程中的作用机制，研究人员将GABA合成基因OsGADs与质粒拼接后，导入普通水稻，具体过程如图甲-丁所示。质粒上的LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶能分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。 回答下列问题： （2）γ-氨基丁酸（GABA）在植物体中起____作用。 （2）将OsGADs和质粒连接时，需用限制酶____对质粒进行切割，选用理由是____。为了筛选含有重组质粒的农杆菌，应在基本培养基的基础上添加______________，成功导入重组质粒的农杆菌能在该培养基上形成菌落且呈现____色。 （3）研究发现转基因水稻比普通水稻解砷毒能力显著提升，表明转基因水稻OsGADs表达量显著提升。从基因表达调控的角度，结合图丙中质粒的结构分析，OsGADs能在转基因水稻中高效表达的可能原因是____。 （4）上图中获得转基因水稻的过程主要运用了基因工程、____等现代生物技术。 【答案】（1）抗逆（缓解非生物胁迫） （2）Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ 这两种酶可产生与酶切后OsGADs片段相匹配的末端，便于连接 氨苄青霉素和X‐gal 白 （3）外源基因与强启动子等调控元件相连，从而显著提高转录与翻译效率 （4）植物组织培养 【解析】基因工程的基本操作程序主要包括以下四个步骤：  目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）由题干可知，γ‐氨基丁酸（GABA）在植物体中起抗逆（缓解非生物胁迫）的作用； （2）由图甲可知，改良基因的左侧和右侧是分别用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割后产生的黏性末端，因此需用限制酶XmaⅠ和BglⅡ对质粒进行切割，理由是这两种酶可产生与酶切后OsGADs片段相匹配的末端，便于连接。由题意知LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶能分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，为了筛选含重组质粒的农杆菌，应在基本培养基中添加“氨苄青霉素和X‐gal”，成功导入重组质粒的农杆菌由于lacZ基因被插入片段打断而呈白色菌落； （3）转基因水稻中OsGADs高效表达的可能原因是外源基因与强启动子等调控元件相连，从而显著提高转录与翻译效率； （4）由图可知获得转基因水稻的过程主要运用了基因工程、植物组织培养等现代生物技术。 32．（2026·江苏盐城·模拟预测）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 （1）用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供______和维生素。可利用______的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 （2）基因工程操作中核心步骤是______。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体部分结构，C基因表达的C蛋白有抗肿瘤作用。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，______，从而发挥抗肿瘤作用。 （3）T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是______。 （4）工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，实现在短时间的超声波刺激后维持长时间治疗的目的。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项完善表达载体的构建，I：______、II：______、III：______、VII：______。（填数字序号） ①P1启动子  ②P3启动子（持续表达型启动子）  ③C基因  ④B基因 （5）与一般化疗药物相比，“响应超声波的药物递送系统”细菌实现癌症治疗的优点有哪些？______。 【答案】（1）碳源、氮源 显微镜直接计数（或显微计数法） （2）构建基因表达载体 解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达 （3）温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达强度变化幅度最大 （4）② ③ ① ④ （5）通过超声精准触发药物释放，实现深层治疗，且副作用极低 【解析】（1）蛋白胨是由蛋白质水解得到的产物，含有多种氨基酸、多肽等，可为细菌生长提供碳源、氮源（合成蛋白质、核酸等的原料），同时也可提供部分碳源和维生素。可利用显微镜直接计数法（如血球计数板法），通过显微镜直接观察并计数菌体，该操作无需培养，因而可以快速测定酵母菌的数量。 （2）基因表达载体的构建是基因工程操作的核心步骤。工程菌1的基因表达载体中，C基因由P1启动子驱动，且T基因（编码T蛋白）由持续表达型启动子P2驱动。37℃时，T蛋白可能抑制P1启动子活性，导致C基因不表达；当超声波刺激升温至42℃，解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达，产生具有抗肿瘤作用的C蛋白。 （3）图2纵坐标为C蛋白表达量，横坐标为温度。观察不同T蛋白亚型（T1、T2、T3）对应的曲线，T3亚型在37℃时表达量最低，42℃时表达量最高，可见，温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达强度变化幅度最大。即T3在超声波升温（37℃→42℃）后，其驱动的C基因表达量激增最明显，能更高效地发挥抗肿瘤作用，因而选择T3。 （4）工程菌2需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗，即通过一次刺激启动持续表达。B酶可识别位点a和b，使中间DNA片段倒转。倒转后，启动子方向需与转录方向一致。因此，载体设计方案为：P2启动子之后应连接T3基因；a、b之间应为持续表达型启动子，即②P3启动子，其后应连接的是③C基因；中间应为①P1启动子和④B基因，超声刺激升温后，P1启动子的抑制解除，启动B基因转录，表达的B酶使a、b之间DNA片段逆转，进而启动C基因的持续表达。 （5）与一般化疗药物相比，“响应超声波的药物递送系统可实现癌症的精准治疗，通过超声精准触发药物释放，实现深层治疗，且副作用极低。 33．（2026·江苏南京鼓楼·一模）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： （1）根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是________。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非_______关系。 （2）据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物_______的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程_______（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应_______（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是_______。 （3）一般用_______处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有_______。 （4）科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有_________。 a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用 b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应 c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达 d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 【答案】（1）基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状 （简单的）一一对应 （2）2和3 不可以 大于 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担） （3）Ca2+ 壮观霉素和卡那霉素和琼脂 （4）cd 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 （1）从图1中PCB的合成过程可知，血红素转化为PCB需要血红素氧化酶（HO1）和胆绿素还原酶（pcyA）的催化，这体现了基因表达产物与性状之间的关系是基因通过控制相关酶的合成间接控制生物的性状。APC的合成受到APC-α基因、APC-β基因等多种基因的控制，说明基因和性状之间并非一一对应关系。 （2）由图1可知，APC-α基因表达的APC-α肽链和APC-β基因表达的APC-β肽链最终需要连接和组装，再结合图2可知，需要在APC-α基因的下游和APC-β基因的上游添加Sac Ⅰ识别序列，所以在构建双质粒表达系统时，引物2、3的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程不可以在同一反应体系中进行，原因是目的基因上含有相同的酶切位点，如果在同一反应体系进行，可能造成目的基因相连。启动子1在目的基因（APC）的上游，启动子2在目的基因（HO1\pcyA\cpcs\cpcu）的上游，要获得的是APC（αβ）3，说明每个这个三聚体需要3个α和β，而合成其的裂合酶可能可以重复使用，所以为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应大于启动子。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限）。 （3）一般用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态，以提高转化效率。过程④是筛选含重组质粒的大肠杆菌，过程⑤是克隆化培养，前者比后者多出的成分有壮观霉素、卡那霉素和琼脂，用于筛选成功导入质粒的大肠杆菌。 （4）a、rAPC组与对照组对比，低、中、高剂量组的抑癌率均大于对照组，才能说明rAPC具有抑癌作用，a错误； b、由表中数据可知，随着rAPC剂量增加，抑癌率逐渐升高，说明rAPC能抑制肿瘤的生长，且抑制作用具有剂量效应，b错误； c、根据注“细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小”，rAPC组和CY组中COX-2、VEGF和PCNA的细胞灰度值均大于对照组，所以rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达，c正确； d、因为COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关，它们在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用，d正确。 故选cd 34．（2026·镇江一中&镇江中学·模拟预测）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 （1）PCR扩增目的基因时，需要______、引物、耐高温的DNA聚合酶以及含Mg2+的缓冲液。DNA聚合酶在PCR的______（填具体名称）步骤中起作用。 （2）可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的______（填“5′端”或“3′端”）分别添加______和______限制酶识别序列。选用限制酶______切割质粒pYL，酶切后的基因N和质粒pYL经纯化和连接构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （3）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组______（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是______。 （4）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。下图所示a、b、c、d是引物序列，其中a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 （5）后进一步检测转基因酵母菌发酵得到的______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】（1）模板DNA、4种脱氧核苷酸（dNTP） 延伸 （2）5′端 XhoⅠ XbaⅠ SpeⅠ和XhoⅠ （3）检验PCR反应体系中是否有外源DNA的污染 1 目的基因N大小约为2.3kb （4）GCC （5）香树脂醇 【解析】 PCR技术的原理与操作：包括PCR扩增的原料组成（模板、引物、dNTP、酶、缓冲液），及PCR三个步骤（变性、复性、延伸）中DNA聚合酶的作用阶段。 （1） PCR扩增目的基因的核心原料包括：模板DNA（含基因N的DNA片段）、4种脱氧核苷酸（dNTP） 、引物、耐高温的DNA聚合酶及含Mg²+的缓冲液。 PCR的三个步骤为变性（90-95℃，DNA解旋）、复性（55-60℃，引物与模板结合）、延伸（72℃，DNA聚合酶合成子链）。 （2）引物的3'端用于延伸子链，因此需在引物1和引物2的5'端添加限制酶识别序列，以实现目的基因与质粒的定向连接。 为避免目的基因和质粒自身环化，需选用两种不同的限制酶切割。由于质粒上位于启动子和终止子之间的的酶切位点是SpeⅠ、XhoⅠ，但目的基因N上存在SpeⅠ的识别位点，因此选择与SpeⅠ能产生相同粘性末端的XbaⅠ添加至目的基因一侧。因此引物分别添加XhoⅠ、XbaⅠ识别序列。 质粒pYL用SpeⅠ和XhoⅠ 切割。 （3）第5组用无菌水代替模板DNA，属于空白对照，目的是检验PCR反应体系中是否有外源DNA污染（若出现扩增条带，说明体系污染，结果不可信）。重组质粒大小约 9.5kb，质粒pYL大小基本不变约 7.2kb，推测目的基因 N 大小约 2.3kb。电泳结果中，1号菌株的PCR产物大小与目的基因N一致（约2.3kb），说明其质粒中成功插入了基因N；2、3、4号菌株无对应条带，未插入目的基因。 （4） 密码子位于mRNA上，与DNA模板链互补，与引物（DNA链）部分相同。a引物的诱变序列为GCA（DNA链），对应mRNA密码子GCA。 根据引物a的GCA为第240位密码子对应序列，可知a引物第244位密码子开始对应的序列（TGG/CTG/TTT……），观察其与c引物上最前面一位密码子对应序列之后的完全一致，可知c引物最前面的GCC即是第243位密码子，也就是丙氨酸诱变序列，即丙氨酸的另一个密码子为GCC。 （5）实验目的是高效生产香树脂醇，香树脂醇合酶基因N表达的酶催化合成香树脂醇，因此需检测转基因酵母菌发酵产物中香树脂醇的含量，比较不同改造方案的效果，选出最优方案。 35．（2026·徐州一中·一模）平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。 （1）SMC由胚胎发育过程中的中胚层细胞分化而来，其细胞表达的________（填“周期蛋白p53”或“肌动蛋白”）可作为中胚层细胞分化为SMC的标志。在SMC中M蛋白含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，根本原因是________。 （2）为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠用于研究，研究人员进行了下列实验，如图1所示。 Stop：阻止其后基因转录的序列 tdT：红色荧光蛋白基因 CE：Cre重组酶-雌激素受体融合基因 注：loxP不影响任何基因功能 ①利用PCR技术获得CE，为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠的________之后，以获得小鼠A。 ②构建含Stop和tdT的表达载体，导入小鼠的________细胞，获得小鼠B。将A与B杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C（CE/+）。 ③在外源药物他莫昔芬的诱导下，可使定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核。Cre重组酶可识别DNA分子中的loxP序列，且可将两个同向loxP之间的DNA序列切除。用药物他莫昔芬饲喂小鼠C后，可观察到________现象。 （3）为利用工具鼠研究血管SMC中S基因表达的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠（flox/+）后，将其与C鼠作为亲本进行系列杂交（仅标出flox和CE的遗传情况）流程如图2所示。 已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为________，经他莫昔芬诱导后，该小鼠SMC中________。从中筛选出________的个体，观察血管SMC是否有改变。 （4）为评估血管SMC标记是否具有组织特异性和药物他莫昔芬的外源诱导性，使研究更具有科学性，需要对C鼠做的检测有________。 A．检测SMC中是否具有loxP序列 B．检测多种组织中S基因的表达情况 C．检测多种组织中tdT基因的表达情况 D．检测饲喂与不饲喂他莫昔芬条件下tdT的表达情况 【答案】（1）肌动蛋白 基因的选择性表达 （2）M基因启动子 受精卵 SMC发出红色荧光 （3）1/8 SMC中S基因被敲除 能发出红色荧光 （4）CD 【解析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）细胞分化是指在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。细胞分化过程遗传物质不变，只是基因选择性表达的结果。由题干信息已知，平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，与肌肉收缩相关的肌动蛋白表达可作为中胚层细胞分化为SMC的标志。M蛋白在SMC中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，是由于分化导致的，其根本原因是基因的选择性表达。 （2）①将CE插入小鼠M基因的启动子之后，可保证CE在SMC中特异性表达，从而获得小鼠A。 ②动物受精卵的分化程度低，全能性高，欲获得目标个体，应将构建好的表达载体导入受精卵中。 ③在外源药物他莫昔芬的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列切除，则Stop序列切除，tdT表达出红色荧光蛋白，由于CE在SMC中特异性表达，经杂交后，小鼠C同时含有CE和tdT，所以可观察到SMC发出红色荧光。 （3）已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为1/4×1/2=1/8。外源药物他莫昔芬的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，所以经他莫昔芬诱导后，SMC中S基因被敲除。从中筛选出能发出红色荧光的个体，观察血管SMC是否有改变，以此来探究血管 SMC 中 S 基因表达在主动脉瘤形成中的作用。 （4）ABCD、分析题意可知，目的是评估血管SMC标记是否具有组织特异性和药物他莫昔芬的外源诱导性，通过检测C鼠多种组织中tdT的表达情况，若只有血管 SMC 组织中 tdT 表达，其他组织不表达，可说明血管 SMC 标记具有组织特异性；检测 C 鼠饲喂与不饲喂他莫昔芬条件下 tdT 的表达情况，若饲喂他莫昔芬后 tdT 表达，不饲喂他莫昔芬时 tdT 不表达，可说明药物他莫昔芬具有外源诱导性，CD正确。 故选CD。 36．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）噬菌体展示技术是制备全人源单克隆抗体的主流技术之一。研究人员结合单个 B 细胞技术，针对某新型病原体表面抗原获取抗体基因；其中VH基因、VL基因分别编码抗体重链可变区和轻链可变区。请回答下列问题 （1）采集康复者外周血，筛选________的B细胞，提取________，根据抗体基因通用序列设计引物进行RT-PCR，筛选获得VH基因和VL基因。 （2）据图1分析，获得VH基因和VL基因后，应在引物________上添加柔性肽基因序列，使两个基因序列连接起来，且两个引物上添加的序列应为________（填“相同”或“互补”）序列。还需在引物_________的5'端添加限制酶切序列，以便插入质粒中。 （3）据图2分析，用融合基因（目的基因）构建重组质粒，导入大肠杆菌，用________进行筛选。再用缺陷型噬菌体侵染筛选出的大肠杆菌，缺陷型噬菌体的特点是_________，因此无法独立组装成完整的噬菌体颗粒。缺陷型噬菌体侵染大肠杆菌后，在大肠杆菌内发生同源重组。构建重组质粒的目的是使目的基因编码的蛋白展示在噬菌体的________获得展示抗体的噬菌体。可利用__________技术对得到噬菌体进行筛选，再用得到的噬菌体侵染大肠杆菌得到子代噬菌体。这样的淘选过程需要重复3~4轮 。 （4）为避免氨苄青霉素抗性基因扩散影响其他生物，实验完成后需敲除大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性基因。构建表达载体时，需在该抗性基因两侧插入 2 个 loxP 序列；据图分析，这两个loxP序列的方向是________（填“同向”或”反向“）的，可利用酶将其敲除，loxP序列具有方向性的原因是________________________。 【答案】（1）能产生特定抗体结合特定抗原（已免疫） 总RNA （2）4、5 互补 1、8 （3）含氨苄青霉素的培养基 无（完整的）尾部蛋白合成基因 尾部（蛋白） 抗原-抗体杂交 （4）同向 loxP 序列中间的核心间隔区为不对称序列，只能按特定方向识别和特异性重组 【解析】（1）实验目的是获取针对新型病原体的抗体基因，因此需要筛选出能产生对应特异性抗体的B细胞，即已免疫的B细胞；RT-PCR（反转录PCR）需要以RNA为模板反转录得到目的基因，因此需要提取B细胞的mRNA（总RNA）。 （2）根据图1，柔性肽基因连接在VH基因和VL基因之间，子链延伸的方向为5′→3′，因此需要在VH基因下游的引物4、VL基因上游的引物5上添加柔性肽序列；两个引物添加的序列需要互补，才能通过重叠PCR将两个基因连接为完整的融合基因；整个融合基因最外侧的引物是上游的引物1、下游的引物8，因此需要在这两个引物的5'端添加限制酶切序列，方便后续将融合基因插入质粒。 （3）重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因，因此导入大肠杆菌后，可利用含氨苄青霉素的选择培养基筛选出含重组质粒的大肠杆菌；根据图2可知，缺陷型噬菌体缺失尾部蛋白基因，无法合成组装噬菌体所需的尾部蛋白，因此无法独立组装成完整噬菌体；重组质粒中目的基因（抗体基因）与尾部蛋白基因融合表达，因此抗体蛋白会随尾部蛋白一起展示在噬菌体的表面；要筛选出能特异性结合目标抗原的噬菌体，可利用抗原-抗体杂交技术筛选。 （4）根据图3，两个loxP为同向时，重组后中间的氨苄青霉素抗性基因形成闭环，实现敲除；loxP具有方向性的原因是：DNA本身具有方向性，loxP 序列中间的核心间隔区为不对称序列，只能按特定方向识别和特异性重组，5′→3′方向改变后，碱基序列也会改变，会影响重组酶的识别，因此loxP序列具有方向性。 37．（2026·江苏南京·二模）热不对称交错PCR（TAIL-PCR）是一种克隆已知序列旁侧未知序列的分子生物学技术。请回答下列问题： （1）TAIL-PCR原理：以基因组为模板，利用三个较长的嵌套特异性引物（SP1、SP2、SP3，按已知序列设计）和较短的随机简并引物AD（特异性较低，可与模板多个位置结合）组合，通过三轮热不对称温度循环的PCR反应扩增产物，如下图所示。 ①第一轮PCR反应体系中，除在含Mg2+的PCR缓冲液中添加SP1、AD外，还需加入_____及Taq酶等。根据第一轮PCR反应流程及产物类型推测，在低温退火中_____（从“SP1”“AD”“SP1与AD”中选填）可与模板DNA发生结合。 ②第一轮及第二轮PCR反应结束后，分别对产物稀释1000倍的目的是_____下一轮PCR反应中特异性产物的比例。 ③第三轮PCR扩增反应结束后，得到的产物长度_____（从“能”“不能”中选填）确定，原因是_____。 （2）应用：某科研小组利用TAIL-PCR技术进行了小麦耐盐基因（TaSC）启动子的克隆及功能研究，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 方法步骤要点 DNA的提取 提取小麦叶片的基因组DNA TAIL-PCR 根据TaSC序列设计三条特异性引物，分别与AD引物进行TAIL-PCR，对扩增产物进行电泳、回收并测序，再通过检索①_____进行比对 分段启动子克隆 根据②_____序列设计引物，以小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到不同长度的5'端渐进缺失的启动子 ③_____及转化 将各启动子片段与含有报告基因GUS的载体进行拼接，分别导入农杆菌后侵染拟南芥 检测启动子的活性中心 将含不同启动子片段的拟南芥进行GUS染色，确定其活性 注：GUS为葡萄糖苷酸酶基因，其表达产物可水解X-Gluc呈蓝色。 （3）结果分析：在上述实验中，利用多对引物（如下图）扩增了5种不同长度的片段，为将扩增后的片段定向插入载体T-DNA中启动GUS基因的表达，在F1~F5与R末端添加的序列所对应的限制酶分别为_____。将目的基因导入拟南芥细胞后进行植物组织培养，用含_____的培养基对组培苗进行筛选，再进行GUS染色。结果显示，含F1~F3与R扩增产物的转基因拟南芥呈GUS阳性（其中F2、F3对应的拟南芥呈弱阳性），而F4、F5与R扩增产物的转基因拟南芥无显色反应。该实验结果表明：_____。 【答案】（1）4 种游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），模板DNA SP1与AD 提高 不能 AD与模板结合的位置不确定 （2）序列（或基因）数据库 TaSC 启动子 基因表达载体的构建 （3）BamH 1，Hind III 潮霉素 耐盐基因（TaSC）启动子的活性中心位于F3与F4对应序列之间，F1与F2对应序列之间可能存在增强启动子功能的调控序列 【解析】（1）PCR反应体系：除缓冲液、引物、Taq酶外，还需要4 种游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），模板DNA；SP1是长特异性引物（Tm更高），AD是短简并引物（Tm更低），低温退火时两种引物都可以和模板DNA结合。 一轮二轮PCR后稀释产物，是为了降低非特异性产物的浓度，提高下一轮反应中特异性产物的比例。AD是随机简并引物，AD与模板结合的位置不确定，因此第三轮PCR产物长度不能确定。 （2）基因工程中，TAIL-PCR测序得到序列后，需要再通过检索序列（或基因）数据库进行比对；分段克隆启动子需要根据TaSC启动子序列设计引物；得到启动子片段后，需要先构建基因表达载体，再进行转化。 （3）启动子F端含有Kpn I，为了使启动子序列正确插入T-DNA区域，应选择BamH I和Hind III切割质粒，并在启动子序列两侧添加这两种酶；为了定向插入启动子使其启动GUS表达，则启动子F端在上游（离GUS远），R端在下游（靠近GUS），对应载体GUS上游酶切位点，F端对应BamH 1，R端对应最靠近GUS的Hind III，保证方向正确；载体T-DNA上的标记基因是潮霉素抗性基因，因此用含潮霉素的培养基筛选转基因组培苗。实验结果显示，越长的启动子片段（F1~F3，包含上游更多序列）活性越高，片段越短（F4、F5缺失上游核心区）完全没有活性，说明耐盐基因（TaSC）启动子的活性中心位于F3与F4对应序列之间，F1与F2对应序列之间可能存在增强启动子功能的调控序列。 38．（2026·江苏南京&盐城·一模）可编程染色体工程（PCE）是基于迭代Cre-Lox重组系统发展起来的一种前沿基因组编辑技术，能够实现对染色体上大片段DNA的精准操作。科研人员利用该技术对水稻中一段315kb的基因组片段进行倒位操作（该倒位片段命名为inv-315H），成功将OsHIS1基因的启动子与OsRPL27．3基因的启动子互换（图1）。图2为Cre-Lox系统作用原理简图，其中a部分显示LoxP位点序列组成，b、c部分示意Cre酶介导的删除与倒位重组机制。图3为PCE系统在植物中实现大片段DNA倒位的完整工作流程示意图。请回答下列问题： 【相关序列信息】LoxAR2：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TTTCCGATGTTAT-3′ Lox71：5′-TACCGTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′ （1）据图2分析，LoxP位点的方向由其____________序列决定；当Cre酶持续存在时，其对位于反向平行排列的LoxP位点间的片段所介导的DNA倒置重组反应具有____________性。 （2）PCE系统由经AI辅助工程化改造的高效Cre酶、新型Lox位点（LoxAR2和Lox71）以及一个可编程基因编辑系统共同构成。其中，基因编辑系统负责将新型Lox位点精准插入基因组目标位置。与传统loxP位点相比，LoxAR2和Lox71的改造主要发生在____________区域。结合图3分析，在第2步中，由基因编辑系统在目标区域两端精准插入LoxAR2与Lox71位点，这两个位点的方向____________，这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 （3）为验证该315kb片段是否成功倒位，科研人员首先在大量T0代再生植株中，利用针对倒位连接处的特异性引物进行初步PCR筛选，从中选出若干候选阳性植株（编号H1～H16）。进一步提取这些候选植株及野生型（WT）的DNA进行PCR验证，电泳结果如图4所示。根据图4结果，可初步判断____________。为进一步验证该倒位操作是否赋予植株除草剂抗性，科研人员将T0代阳性植株与野生型对照一并移栽至含除草剂硝磺草酮的培养基中，持续培养1～2周后观察生长状况。若观察到____________现象，说明倒位成功赋予水稻硝磺草酮的抗性。硝磺草酮通过抑制HPPD酶的活性来阻断类胡萝卜素的合成，从而使植物死亡，而水稻中的OsHIS1基因能编码一种可以分解硝磺草酮的解毒酶。分析倒位操作使水稻获得抗性的原因：倒位使____________连接，导致OsHIS1基因表达水平显著提高，从而合成了更多的解毒酶；当硝磺草酮存在时，过量合成的解毒酶可以____________，使水稻得以正常生长，表现出抗性。 （4）为探究该倒位性状的遗传稳定性，他们将T0代植株自交获得T1代群体。首先，通过PCR检测inv-315H倒位连接处和野生型OsHIS1位点以鉴定基因型；同时，利用T-DNA特异性引物检测外源转基因元件的残留情况，电泳结果见图5。T1代群体中，具有____________条带的植株为纯合倒位植株，该类型植株在T1代群体中约占____________。图中用三角形标记的植株与用箭头标记植株相比在农业应用中的核心优势是____________。 【答案】（1）间隔 可逆（双向） （2）反向重复序列 相反 （3）植株均成功实现了倒位（均为阳性植株） 阳性植株正常生长，野生型植株生长受抑制或死亡 OsHIS1基因与OsRPL27.3基因启动子 高效分解硝磺草酮，保护HPPD酶的活性，从而保障类胡萝卜素的合成 （4）inv-315H倒位连接处条带且无野生型OsHIS1位点条带 1/4 不含外源转基因成分（T-DNA），避免了转基因生物安全风险，有利于推广应用 【解析】（1）由题意得知，Cre酶特异性识别LoxP序列，并在图中所示位置进行切割，结合图示可知，LoxP具有方向性主要由图2中a部分标出的间隔序列所决定。当两个LoxP位点反向平行排列时，Cre酶介导的重组反应具有可逆性，即倒位后若Cre酶仍存在，可再次催化复位。 （2）LoxAR2和Lox71的工程化改造主要发生在反向重复序列，核心间隔序列保持不变以维持Cre酶识别功能。在目标片段两端插入LoxAR2与Lox71时，二者必须方向相反（反向平行），这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 （3）PCR技术中，阳性植株能扩增出目标片段，野生型没有该倒位连接序列，无法扩增出对应条带。从图4电泳结果看，H1~H16都出现了和M对应的inv-315H条带，而WT没有，说明H1~H16都是候选阳性植株，即这些植株中发生了倒位。如果倒位成功赋予水稻硝磺草酮抗性，那么阳性植株能在含硝磺草酮的培养基中正常生长，野生型因为没有抗性，会因为硝磺草酮抑制HPPD酶活性，阻断类胡萝卜素合成而死亡，所以预期观察到阳性植株正常生长，野生型植株死亡或生长受抑制的现象。基因表达受启动子等调控序列的影响，倒位操作应该是使OsHIS1基因与OsRPL27.3基因启动子连接，从而让OsHIS1基因表达水平显著提高，合成更多解毒酶。硝磺草酮的作用是抑制HPPD酶活性阻断类胡萝卜素合成使植物死亡，而OsHIS1基因编码的解毒酶能分解硝磺草酮，过量的解毒酶可以高效分解培养基中的硝磺草酮，或解除硝磺草酮对HPPD酶的抑制作用，使得HPPD酶能正常发挥功能，类胡萝卜素合成正常，水稻正常生长。 （4）纯合倒位植株的基因组中只有inv-315H倒位位点，没有野生型OsHIS1位点，同时无外源T-DNA残留，所以电泳后只有inv-315H的634bp这1条条带。T0代是倒位杂合子，自交后根据孟德尔遗传规律，子代基因型及比例为纯合倒位:杂合:野生型=1:2:1，所以纯合倒位植株占1/4。观察电泳图，三角形标记的植株无T-DNA条带，说明不含外源转基因元件残留；箭头标记的植株有T-DNA条带，存在外源转基因元件。在农业应用中，无外源转基因元件残留的植株不会引发转基因生物安全问题，更适合农业生产推广。 39．（2026·海安高级中学·模拟预测）真核细胞转座子有逆转座子和DNA转座子之分，可在染色体间和染色体内部转移。R2逆转座子倾向于整合在真核生物28S rDNA（核糖体DNA，转录产生rRNA）基因组位点，这一位点在人基因组中拷贝数目很多。图1是R2逆转座子的机制图。 （1）R2复合体能够识别DNA中的特定片段并进行切割，与基因工程中的_____酶功能相似，除此之外R2复合体还具______酶的活性。 （2）图1过程③以_____为模板，基因组DNA α链的右端为_____（填3'或5'）端。 （3）下面关于TPRT机制与PCR技术的说法错误的是_____（填字母）。 A．TPRT机制和PCR过程中都涉及氢键的破坏和形成 B．TPRT机制中需要RNA引物，PCR过程中需要DNA引物 C．TPRT机制和PCR过程中子链都是从引物的5'端开始合成 D．TPRT机制和PCR过程所用的原料依次是核糖核苷酸和脱氧核苷酸 （4）天然存在的R2逆转座子在精准识别基因组DNA上存在一些不足，科研团队利用人工智能辅助的蛋白质工程对R2蛋白质进行了改造，获取新的R2逆转座子工具——donor-R2复合体，并以斑马鱼为对象进行了实验，具体过程如图2。合理的蛋白质改造流程为：⑦→④→_____→⑥（选择正确编号并排序）。 ①将重组DNA导入受体细胞 ②将改变后的R2蛋白的基因与载体重组 ③对突变的R2蛋白进行结构功能分析 ④定点突变改变R2蛋白的基因序列 ⑤培养细胞后提纯突变的R2蛋白 ⑥选择合适的突变基因投入后续使用 ⑦利用AlphaFold预测R2蛋白三维结构 （5）构建图2中的DNA片段2时，目的基因左右两侧的限制酶识别位点分别为HpaII（5'-C↓CGG-3'）和BamHⅠ（5'-G↓GATCC-3'），GFP基因左右两侧的限制酶识别位点分别为 ‌BglⅡ‌ （5'-A↓GATCT-3'）和Sau3AⅠ（5'-↓GATC-3'），则两基因融合处的核苷酸序列为5'_____3。 （6）结合图1和图2，简述donor-R2复合体实现将目的基因整合到受体细胞的机制：_____。 （7）根据R2逆转座子的插入特点，可将其作为载体携带目的基因，开展安全的基因治疗，理由是_____。 【答案】（1）限制酶 DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶 （2）R2 RNA 3’ （3）BCD （4）②→①→⑤→③ （5）5’-GGATCT-3’ （6）R2蛋白识别特定序列并切割，以供体RNA为模板合成cDNA，实现目的基因写入 （7）R2逆转座子整合在rDNA基因组位点，不会破坏除28S rDNA外的基因；这一位点在人基因组中拷贝数目很多，对rDNA的功能影响不大 【解析】（1）R2复合体与基因工程中的限制酶功能相似，都是识别DNA特定片段，并进行切割断裂磷酸二酯键；R2是逆转座子，需要以RNA为模板合成DNA，因此R2复合体还具有逆转录酶的活性，由图可知，R2复合体能催化子链的形成，具有DNA聚合酶的活性，且能连接DNA片段，具有DNA连接酶的活性。 （2）图1中过程③是以RNA为模板合成DNA，属于逆转录过程，模板是R2 RNA；DNA合成只能从3'端延伸，因此被切割后基因组DNA α链的切口（右端）为3'端。 （3）A、TPRT 中 DNA 双链会解开（氢键破坏），新链合成时碱基配对（氢键形成）；PCR 中变性（氢键破坏）、退火 / 延伸（氢键形成），A正确； B、TPRT 中以切开的基因组DNA 作为引物（DNA引物）；但 PCR过程中用的是DNA引物，不是 RNA 引物（体内 DNA复制才用RNA引物），B错误； C、无论是TPRT还是PCR，DNA新链的合成方向都是5'→3'，所以是从引物的3' 端延伸，而不是 5' 端，C错误； D、TPRT过程合成的是DNA，原料是脱氧核苷三磷酸；PCR合成的也是DNA，原料同样是脱氧核苷三磷酸，D错误。 （4）蛋白质工程的基本流程是：预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→改造基因（定点突变）→表达与验证→筛选突变体。合理的蛋白质改造流程为：⑦利用AlphaFold预测R2蛋白三维结构→④（定点突变改变 R2 蛋白的基因序列）→②将改变后的 R2 蛋白的基因与载体重组→①将重组 DNA 导入受体细胞→⑤培养细胞后提纯突变的R2蛋白→③对突变的R2蛋白进行结构功能分析→⑥选择合适的突变基因投入后续使用，即正确顺序是：⑦→④→②→①→⑤→③→⑥。 （5）目的基因右端被BamHⅠ切割后序列为−CCTAG，BglⅡ‌ 基因左端被HindⅢ切割后序列为GATCT−3′，连接后融合处序列为5′−GGATCT−3′。 （6）donor-R2复合体可特异性识别并切割受体细胞基因组的28S rDNA位点，随后以携带目的基因和GFP基因的donor-RNA为模板，经逆转录合成含目的基因的DNA，最终将目的基因整合到受体细胞的基因组中。 即R2蛋白识别特定序列并切割，以供体RNA为模板合成cDNA，实现目的基因写入，从而将目的基因整合到受体细胞。 （7）R2逆转座子能特异性将目的基因整合到 rDNA位点，不会破坏除28S rDNA外的基因；这一位点在人基因组中拷贝数目很多，对rDNA的功能影响不大，插入目的基因一般不会干扰宿主细胞其他正常基因的表达，安全性高。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 江苏考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025江苏（1题） · 情境设置：以基因突变和限制酶切位点为背景。 · 考查重点：限制酶识别序列、切割特点及应用。 · 命题趋势：联系基因诊断，考查信息推理能力。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026江苏（2题）、2025江苏（1题） · 情境设置：结合酵母表达、珍稀动物保护等实例。 · 考查重点：PCR原理、酶的作用及筛选鉴定。 · 命题趋势：强化实验流程分析与综合判断。 考点3 基因工程综合 2026江苏（1题）、2024江苏（1题）、2023江苏（1题）、2022江苏（1题） · 情境设置：围绕抗体、酶、荧光蛋白及细胞功能。 · 考查重点：重组载体构建、表达、筛选与纯化。 · 命题趋势：突出多技术融合及工程应用。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2025·江苏·高考真题）（多选）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（2026·江苏·高考真题）（多选）利用酵母表达外源蛋白时，构建的质粒通常需在大肠杆菌中扩增，鉴定后再转入酵母细胞中表达。图示色氨酸营养缺陷型酵母筛选系统的表达质粒结构。下列叙述正确的有（     ） A．Ori在完成质粒构建和表达过程中不起作用 B．该质粒在酵母细胞中复制时需识别2μ Ori C．MCS含有多个酶切位点，便于设计目的基因插入位点 D．用不添加色氨酸的培养基筛选成功导入质粒的酵母 2．（2026·江苏·高考真题）基因工程中需要使用多种酶，下列叙述正确的是（     ） A．逆转录酶催化形成磷酸二酯键 B．Taq酶催化形成氢键和肽键 C．限制酶有专一性而Taq酶没有专一性 D．Taq酶催化新链合成时以双链DNA为模板 3．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： （1）川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有______。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有______。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成______关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①______，加入乙醇 ②______ 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③______、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基______。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有______。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 （5）依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______（填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 考点3 基因工程综合 1．（2026·江苏·高考真题）驼源抗体（VHH）具有分子量小、与人源抗体同源性高等优点，科研人员将其作为抗原受体改造T细胞，开发出新型CAR-T细胞（V-CAR-T细胞）用于肿瘤治疗。请回答下列问题： （1）CAR-T细胞通过抗原受体直接识别肿瘤细胞表面上的靶点进而裂解肿瘤细胞，在免疫方式上属于______。 （2）早期CAR-T细胞受靶细胞刺激后，难以分裂、分化为______细胞杀伤肿瘤细胞。V-CAR-T细胞中增加了两个协同刺激结构域（图1），以促进T细胞分泌______加速其增殖和分化。V-CAR-T细胞表面的______可作为其标记，用于验证输注V-CAR-T细胞治疗后，机体内是否存在V-CAR-T细胞。 （3）非小细胞肺癌细胞高表达Trop2，科研人员研发新型识别Trop2的V-CAR-T细胞。为筛选获得抗Trop2的VHH，构建VHH基因文库，流程如下： 步骤 实验目的 实验操作 ⅰ 制备cDNA模板 用①______免疫羊驼，分离获得外周血淋巴细胞，提取②______，反转录成cDNA； ⅱ 扩增VHH基因 用③______端加入SfiⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增； ⅲ 构建文库 质粒载体与VHH基因片段经SfiⅠ酶切后，用④______酶连接，转化感受态细胞。 （4）筛选出高亲和力的抗Trop2的VHH，构建获得特异识别Trop2的V-CAR-T细胞（Trop2 CAR-T细胞）。为验证Trop2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用，建立肺癌小鼠模型，随机分为3组开展实验，实验结果见图2、图3。 ①设置未改造T细胞组作对照的目的是______。 ②根据图2、图3结果，可得出结论______。 2．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 （2）步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。    （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 3．（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 （2）有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 4．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 （1）纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________________。 （2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物_____________； ②PCR目的产物约为_____________bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。 （4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。 1．（2026·江苏南通通州·二模）葛根素是一种具有药用价值的植物活性成分，传统葛根素的提取依赖葛根块根，产量低且资源消耗大。科研团队利用生物技术，获得了能产生葛根素合成关键酶的酵母菌，下图展示了部分技术路线。相关叙述正确的是（    ） A．过程①为脱分化过程，利用了植物细胞的全能性 B．过程②和过程③均以dNTP为原料合成脱氧核苷酸链 C．过程④通过高Ca2+-高pH处理法将目的基因导入酵母菌 D．对酵母菌进行鉴定和筛选是发酵工程的中心环节 2．（2026·江苏盐城·模拟预测）下图为同一质粒（不同形态）和不同长度的PCR产物（目的基因大小为0.65kb）的琼脂糖凝胶电泳结果。下列相关叙述正确的是（　　） A．依据电泳迁移方向判断DNA分子在缓冲液中带正电 B．同一质粒的开环形态电泳迁移速率最快，说明迁移率与构象有关 C．样品与凝胶载样缓冲液混合后，缓慢注入加样孔内 D．依据电泳结果确定最右侧泳道为目的基因 3．（2027·江苏南通·一模）（多选）植物生物反应器是一种新兴的重组蛋白表达系统，研究人员按下图流程制备抗F蛋白的抗体。相关叙述正确的是（     ） A．制备杂交瘤细胞需将免疫小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合 B．对杂交瘤细胞进行克隆化培养时，培养液中通常需添加血清 C．农杆菌中的Ti质粒的T-DNA负责转移目的基因 D．可用PCR检测植物叶片中是否含有抗F蛋白的抗体 4．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）植物生物反应器可利用植株、组织或悬浮细胞生产药物蛋白，叶绿体遗传转化借助同源重组将外源基因整合进叶绿体基因组，该转化方式表达量高、安全性好。下列说法错误的是（     ） A．植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B．把目的基因导入叶绿体DNA中，产生的配子一定含有此目的基因 C．植物叶绿体表达体系可防止目的基因通过花粉在自然界中扩散 D．构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只在叶绿体中表达 5．（2026·如皋中学·模拟预测）下列生物技术操作能达成预期目标的是（    ） A．将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗 B．发酵工程中通过观察发酵液是否有气泡产生判断醋酸发酵是否终止 C．将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛 D．胚胎工程中利用胚胎分割技术可以大大提高移植胚胎的成活率 6．（2026·如皋中学·模拟预测）（多选）载体是基因工程中携带外源 DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是（    ） A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体 B．载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因 C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间 D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异 7．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．PCR复性温度与引物的长度以及引物中GC碱基对的相对含量有关 B．实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 C．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在同一电场作用下，通常DNA片段越长，在凝胶中迁移速率越慢 8．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）我国科学家研发的蛋白质生成大模型NewOrigin能通过AI高精度生成蛋白质的氨基酸序列，推动了蛋白质工程的发展。下列相关叙述正确的是（　　） A．设计新的蛋白质时首先应从其基因的碱基序列出发 B．AI可通过改变氨基酸序列设计符合预期功能的蛋白质 C．模型NewOrigin可生产出满足人类特定需求的蛋白质 D．该模型能分析基因组数据进而精准找到遗传病的病因 9．（2026·徐州三中·一模）肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需插入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 10．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）某先天性耳聋是单基因遗传病，科研人员拟通过载体向细胞内导入正常基因治疗先天性耳聋患者，所用载体含启动子、标记基因、HindⅢ（5´-AAGCTT-3´）和BamHⅠ（5´-GGATCC-3´）酶切位点。下列分析正确的是（    ） A．该种先天性耳聋为显性遗传病 B．借助标记基因的表达情况可筛选出正常基因成功表达的细胞 C．用HindⅢ和BamHⅠ切割上述载体，可以防止载体的自身环化 D．为便于将正常基因与载体连接，扩增正常基因时，需在引物3´端添加限制酶识别序列 11．（2026·江苏盐城·模拟预测）（多选）CAR-T免疫疗法通过基因工程给患者T细胞膜装上“嵌合抗原受体”（CAR），再回输到患者体内使其能精准识别肿瘤抗原。下列叙述错误的有（　　） A．改造T细胞过程中，直接将CAR基因导入T细胞 B．CAR蛋白在改造后的T细胞游离的核糖体上合成 C．CAR-T细胞接触癌细胞后诱导癌细胞凋亡，属于细胞免疫 D．取患者的T细胞改造可避免患者对回输的CAR-T细胞发生免疫排斥 12．（2026·南通·一调）利用基因工程改变与植物激素相关基因的表达，具有广泛的应用。相关叙述错误的是（　　） A．在杨树保卫细胞中过表达脱落酸受体基因，可增强抗旱能力 B．敲除番茄果实中乙烯合成酶基因，可延缓果实成熟便于储运 C．在黄瓜子房壁中特异性表达生长素合成酶基因，可诱导获得无籽果实 D．拟南芥愈伤组织中导入细胞分裂素合成酶基因的反义基因，可促进芽的分化 13．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物，对PCR扩增产物经AccI酶切后电泳。如图所示，已知引物1为5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，AccⅠ酶的识别位点为5′-GTATAC-3′，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述正确的是（    ）    A．该实验中需设计的引物2为5′一TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3′ B．若电泳结果只能观察到530bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同 14．（2026·徐州一中·一模）人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因（下图），下列说法错误的是（　　） A．PCR过程中复性所需温度最低，变性所需温度最高 B．30轮PCR后，所得突变基因和正常基因含量相当 C．上述方法可将待突变序列改造成5'-AAGCCC-3' D．通过电泳检测PCR产物，不能确定基因是否改造成功 15．（2026·天一中学·模拟预测）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。请分析回答： （1）无缝克隆原理图中，过程①中T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成_______。过程③所需的酶有________。 （2）与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB官方的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于50bp小片段的原因：________ （3）图中利用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1与________互补。 （4）图中利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，应选用的限制酶为________。扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列（5'→3'）的设计依据为________（填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P基因的部分序列④GUS基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物________。 ①5'-TAAGTTGTCT……-3'    ②5'-CTTGGATGAT……-3' ③5'-TCTGTTGAAT……-3'    ④5'-ATTCAACAGA……-3' （5）利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用________对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是________，该激素的生理作用是________。 16．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）赤藓糖醇（四碳糖有机物）是一种广泛使用的甜味剂，传统生产方法是利用葡萄糖通过酵母菌发酵获得。研究人员将合成赤藓糖醇所需的赤藓糖醇还原酶（G）基因和磷酸酶（Y）基因编码区首尾相连构建成GY融合基因，并导入蓝细菌中形成蓝细菌工程菌，大量生产赤藓糖醇，具体过程如下图所示，相关限制酶识别序列和切割位点如下表所示。回答下列问题： 限制酶类型 BamHI Sac I HindⅢ 识别序列和切割位点 （1）在PCR扩增1体系中，加入的物质除引物1、引物2、四种脱氧核苷酸外，还必须加入_________，上述物质中随反应的进行在溶液中含量逐渐减少的有________。 （2）为使PCR扩增1和PCR扩增2体系中得到的产物能彼此连接形成GY融合基因，应在引物2和引物3的________（填“3’”或“5’”）端添加部分互补的序列。PCR扩增GY融合基因时在反应体系中添加的引物是________。 （3）为保证GY融合基因按照正确的方向连接到质粒T上，可在GY融合基因的左右两端分别添加限制酶________的识别序列。PCR扩增产物可根据________不同，可以用________技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的原因有________。 A．引物特异性不强  B．退火温度过低 C．模板DNA污染   D．引物碱基序列过长 （4）已知启动子具有物种特异性，则质粒T中启动子应来自________。筛选蓝细菌工程菌时，培养基中除必需营养物质外还需添加________。 （5）最终检测到蓝细菌工程菌能合成赤藓糖醇，这属于在________水平上进行的鉴定。相比通过酵母菌发酵葡萄糖产生赤藓糖醇，用蓝细菌作为工程菌的优点是________（答出1点即可）。 17．（2026·江浦高级中学·二模）有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： （1）PCR技术的中文名称是________，其主要优势是_______。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的TaqDNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是_______。 （2）热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的_______。 A．Taq酶最适催化温度范围为50~60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5'端向3'端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 （3）为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有_______。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中_______，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有_______。 （4）一般地，首轮PCR之前预变性的目的是_________。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是_______。 18．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶（Luc）基因（无启动子）的载体（如图2）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光。请回答下列问题。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列；图2中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、EcoRI、HindⅢ、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 （1）为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶______切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为______。 A．5′-AACTAT-3′  B．5′-GAATTCAACTAT-3′ C．5′-TTGATA-3′  D．5′-AAGCTTAACTAT-3′ （2）将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含______的培养基中；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加______进行检测。 （3）Luc基因载体上有一段P2A序列，其表达产生的2A肽的功能如图3所示。P2A序列能与vtg基因、Luc基因一起完成______过程。Luc基因载体上有一段P2A序列的意义是______。 （4）进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子中的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到E蛋白在启动子上的结合位点，请运用本题研究成果完成设计思路： ①用限制酶将______切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的______游，形成多种重组载体。 ②将每种重组载体分别导入斑马鱼的______中，待发育成熟后添加荧光素等进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中______（填“含有”或“不含有”）能与E蛋白结合的序列。 ③将该片段继续切割成多个长度，重复上述操作，进一步缩小该特定序列的位点区域。 19．（2026·江苏南京栖霞名校联盟·一模）CBF基因是一类转录调节因子，其与植物的生长发育密切相关。科学家将马铃薯CBF基因导入烟草中获得转基因烟草。回答下列问题： （1）获取和扩增目的基因：对马铃薯幼苗进行取样，每株幼苗取6~8片叶，从叶片中提取总RNA，再经____________过程合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，利用PCR技术进行扩增。扩增完成后，利用____________检测产物，其结果如图1所示，若CBF基因片段的长度为775bp，则在图1中CBF基因片段位于第____________泳道。 （2）构建基因表达载体：CBF基因片段和Ti质粒的酶切位点如图2、3所示，为使PCR扩增出的CBF基因片段能插入T-DNA中，需在两个引物的____________（填“5'”或“3'”）端分别添加限制酶____________的识别序列。构建重组Ti质粒时，需要利用____________将CBF基因与Ti质粒连接起来。 （3）用____________处理农杆菌，使其处于____________，再将重组质Ti粒与处理后的农杆菌混合，使重组质粒进入农杆菌，完成转化。 （4）使用农杆菌转化法将重组Ti质粒中的CBF基因片段导入烟草细胞中，之后可通过向培养基中加入____________来初步筛选出含有目的基因的烟草细胞；对导入目的基因的烟草细胞进行组织培养时，烟草细胞先经脱分化形成____________，该过程____________（填“需要”或“不需要”）光照。 20．（2026·江苏南京六合名校联盟·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： （1）为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生________。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，________（填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是________。 （2）为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带________最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________。 （3）若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶________识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是________。 （4）转化时常用________处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有________的培养基筛选大肠杆菌，挑选________色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 21．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： （1）构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 （2）为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 （3）将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 22．（2027·海门中学·一调）炎症性肠病（IBD）患者肠道内会产生硫代硫酸盐，生成量与疾病的严重程度呈正相关。图1是科研人员利用大肠杆菌（EcN）建立的响应硫代硫酸盐的益生菌传感器的部分结构，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。请回答下列问题。 （1）图1中，R基因的表达______（“受”或“不受”）硫代硫酸盐的诱导。由于硫代硫酸盐能_____，科研人员可通过检测粪便中_____来判定肠道内硫代硫酸盐的浓度，诊断IBD的发病程度。 （2）为构建图1传感器，科研人员利用PCR技术扩增图2中的R基因时，在引物_____的5＇端分别添加限制酶_____的识别序列。 （3）为了防止EcN工程菌治疗后存在基因转移和抗性基因污染环境的风险，科研人员构建一种如图3的自毁开关系统，该系统能够在诱导条件下激活自毁机制，从而导致细菌无法生长，可用于治疗后EcN的清除。 ①经过人工改造的自毁开关系统由Cascade蛋白、gRNA和Cas3核酸酶组成，Cascade蛋白与：gRNA结合成复合体，gRNA通过与目标DNA部分序列进行_____来识别目标DNA，随后复合体招募Cas3核酸酶切割目标DNA的_____键，诱发细菌死亡。 ②为测试上述自毁开关系统在动物肠道环境中的效果，科研人员制备一些肠道无菌小鼠并将小鼠分为两组：对照组给予重组EcN且正常饮水：实验组_____。一段时间后，收集两组小鼠的_____样本，将其处理后采用_____法接种并统计两组平板上的菌落数。 23．（2026·如皋中学·模拟预测）BCL11A蛋白是一种转录抑制因子，能与γ珠蛋白基因启动子上游的调控序列中特异性结合位点结合，抑制γ珠蛋白基因的表达。为确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员利用下列多对引物扩增了γ基因上游7种不同长度的片段，分别将这些片段插入载体中并导入受体细胞，一段时间后进行荧光检测，相关信息如图所示。请回答： （1）PCR扩增γ珠蛋白基因上游不同长度的片段过程中，在缓冲体系除需要加入含Mg2+的缓冲液和原料外，还需要添加的主要成分有___________，预变性时94℃持续5min的目的是___________。 （2）载体上P的基本组成单位是_________。构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因转录时的模板链______（填“在”或“不在”）同一条DNA链上。据图可知，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是_________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是__________。 （3）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞后，含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞均有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白，无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白的原因是____________。 （4）若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列所对应序列之间的区段上，若向培养液中添加适量的雌激素，则含_________（选填“F1~F6”）与R扩增产物的受体细胞有荧光。 （5）科研人员用基因编辑技术对造血干细胞中BCL11A蛋白结合位点进行定点诱变，然后回输给地中海贫血症患者（血红蛋白中β链异常），一段时间后患者症状明显好转，据下图并结合上述信息，分析患者症状明显好转的原因是___________。 24．（2026·盐城中学·模拟预测）科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取人的血清白蛋白（HSA）。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为转录的模板链。回答下列问题： （1）PCR扩增HSA基因时，为激活DNA聚合酶活性，缓冲液里一般还需要添加___________；利用琼脂糖凝胶电泳分离出的符合要求的PCR扩增产物后，通常还需要进行基因测序，原因是___________。 （2）在②操作后得到的农杆菌，有的没有导入质粒，有的导入了空的Ti质粒，有的导入了重组Ti质粒。在构建重组Ti质粒时，若HSA基因两端没有图示中相应限制酶的酶切位点，为确保HSA基因与Ti质粒正向连接，同时便于导入重组表达载体的农杆菌的筛选，在PCR扩增HSA基因前，需要在引物1的5'末端引入___________（填“BclI”、“BamHI”或“HindIII”）酶的识别与切割序列，在引物2的5'末端引入___________（填“BclI”、“BamHI”或“HindIII”）酶的识别与切割序列。 （3）将HSA基因导入水稻细胞进行遗传改造的途径除图示方法外，也可以将含HSA基因的重组表达载体包裹在人工合成的脂质体中，与经过___________酶处理所得到的水稻细胞原生质体融合。 （4）在图示③操作后还要进行目的基因的检测，可通过___________等技术检测水稻的染色体DNA上是否插入了HSA基因或检测HSA基因是否转录出了___________；再利用___________方法，从水稻细胞产物中鉴定是否表达出所需的HAS。 25．（2026·南京&镇江·模拟预测）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图所示。 注：linker为编码6个氨基酸的基因序列 引物名称 引物序列（方向5′→3′下划线处为限制酶识别序列） P1 GGATCCGATGATGATGATGATGAG P2 GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT P3 AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC P4 GCGGCCGCTGAGGAGACGGT （1）上图中由杂交链获得融合基因的②过程，________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是___________。引物P2中linker的碱基序列是5′-________-3'。 （2）对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。利用图中质粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶________对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 （4）科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图。检测结果显示_______，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 26．（2026·丹阳中学&淮阴中学·模拟预测）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S—L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S—L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。请回答下列问题： （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S—L融合基因时，最好使用限制酶________分别切割S蛋白基因和L蛋白基因；将S—L融合基因连接至AVV载体时，需利用限制酶________对S—L融合基因进行切割。 （2）AAV作为基因表达载体，其组成除图2所示结构外还有复制原点、________（答出两点）。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S—L融合基因的大肠杆菌为________（填“甲”或“乙”）；条带③为用引物________扩增的产物。若要排除PCR体系污染导致的假阳性，还应增设________组作为阴性对照。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S—L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是________。获得成功整合S-L融合基因的工程菌后，需要验证其功能是否符合预期。研究人员设计了如下实验，请完成下表： 实验步骤目的 简要操作过程 癌细胞培养 适宜条件下培养癌细胞后，随机均分为A、B、C、D四组。 实验处理 A组：工程菌+正常氧培养（21%O2） B组：________ C组：等量的普通大肠杆菌（不含S-L融合基因）+低氧培养（1%O2） D组：等量的普通大肠杆菌+正常氧培养（21%O2） 检测指标 培养液中大肠杆菌的密度、大肠杆菌裂解酶的活性、________。 27．（2027·江苏南通·一模）毛木耳是一种可分解纤维素的真菌。为提高毛木耳对纤维素的降解能力，科研人员利用限制酶BsmB I构建了毛木耳特异性启动子（Gpd）、福寿螺纤维素酶基因（Mfcsg）与潮霉素抗性基因（Hpt）的融合基因，并导入毛木耳细胞中。已知潮霉素对细菌、真菌均具有毒性，可作为筛选标记。限制酶BsmB I具有偏移剪切的特性，其切割位点位于接头序列两侧，可实现多个DNA片段的无缝连接。实验流程及相关酶切原理如下图所示。请回答下列问题。 （1）为获取Mfcsg基因，可先从福寿螺胃组织细胞中提取______，通过RT-PCR扩增获得目的基因，该扩增过程中需要加入______酶。 （2）过程①可实现在各DNA片段末端添加______。过程②构建融合基因，除限制酶BsmB I外，还需要______酶催化。限制酶BsmB I对切割位点______（选填“有”“无”）特异性，该酶切割后产生的两个黏性末端______（选填“相同”“不相同”“可能相同”）。 （3）Mfcsg基因和Hpt基因的部分序列如下表所示，已知引物R2的碱基序列为5′-CGTCTCNCGACCAAAT-3′，请依据碱基互补配对原则，以尽可能少的碱基补充完善引物F3的序列：5′-______GTGCTG-3′。 Mfcsg基因两端的部分序列 5′-AGCGTGCT……ATTTGGTCG-3′ Hpt基因两端的部分序列 5′-GTGCTGTA……GTATCTACG-3′ （4）为检测Mfcsg基因在毛木耳细胞中的表达效果，科研人员设计相关实验（已知刚果红可与纤维素结合呈现红色，纤维素被降解后会在菌落周围形成透明圈）。 ①取等量且长势一致的野生型毛木耳菌丝体，经______筛选获得的转基因毛木耳菌丝体，分别接种于含有等量的______的固体培养基上，依次设置对照组和实验组，且每组设置3组平行重复； ②在相同且适宜的条件下培养一段时间后，测量并计算每组______，取平均值； ③对实验数据进行统计分析。 28．（2026·江苏东海高级中学·模拟预测）转基因抗虫玉米LD05的培育过程中，将抗虫融合基因m2cryAb-vip3A导入受体玉米，利用PCR技术进行纯合子与杂合子鉴定，再经抗性检测后获得优良品系．请回答下列问题： （1）构建基因表达载体时，除目的基因、标记基因外，还包含的元件有________。 Ti质粒上的T-DNA的作用是________。 （2）将转基因玉米LD05与原品种杂交，筛选出性状符合预期的F1，F1自交，得到F2，对F2进行纯合子与杂合子鉴定。 ①用以下流程提取叶片中的基因组DNA，液氮研磨使植物细胞破碎的优点为________，乙醇沉淀后得到的DNA可用________试剂进行鉴定。 ②以提取的DNA为模板，设计如图所示的引物，进行PCR扩增．PCR反应体系需要模板DNA、引物、________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶．DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。若要鉴定目的基因是否正确插入，可选引物的组合为________。 ③纯合子与杂合子鉴定．若选用引物1与4扩增，经电泳后最多可得到________种清晰条带，若得到________种清晰条带，则是杂合子。 （3）为检测m2cryAb-vip3A基因在纯合子与杂合子株系中的表达差异，利用RT-PCR和ELISA方法（酶联免疫吸附测定法，可对蛋白质定量或定性测定）对得到的株系进行检测，结果如下图所示．请结合检测结果，得出相关结论：________。 29．（2026·江苏淮北中学·模拟预测）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图所示。 注：linker为编码6个氨基酸的基因序列 引物名称 引物序列（下划线处为限制酶识别序列） P1 5′GGATCCGATGATGATGATGATGAG3′ P2 5′GACCCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCAACGGTCACTTGGGT3′ P3 5′AGCTTTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC3′ P4 5′GCGGCCGCTGAGGAGACGGT3′ （1）上图中由杂交链获得融合基因的②过程________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是_________________。引物P2中linker的碱基序列是5′-_________________-3'。 （2）对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了______次。利用图中质粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶______________对该质粒进行酶切。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理，基因表达载体导入大肠杆菌目的是______________________________。基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 （4）科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图。检测结果显示_________________________，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 30．（2026·江苏南通通州·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： （1）利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 （2）已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGGTTCCGCCAGCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ （3）过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 （4）转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 （5）将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 31．（2026·江苏盐城联盟校·模拟预测）植物中的γ-氨基丁酸（GABA）在非生物胁迫响应过程中发挥重要作用，例如外源添加GA-BA能够显著缓解砷对水稻根系伸长的抑制作用。为了进一步阐明GABA在解砷毒过程中的作用机制，研究人员将GABA合成基因OsGADs与质粒拼接后，导入普通水稻，具体过程如图甲-丁所示。质粒上的LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶能分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。 回答下列问题： （2）γ-氨基丁酸（GABA）在植物体中起____作用。 （2）将OsGADs和质粒连接时，需用限制酶____对质粒进行切割，选用理由是____。为了筛选含有重组质粒的农杆菌，应在基本培养基的基础上添加______________，成功导入重组质粒的农杆菌能在该培养基上形成菌落且呈现____色。 （3）研究发现转基因水稻比普通水稻解砷毒能力显著提升，表明转基因水稻OsGADs表达量显著提升。从基因表达调控的角度，结合图丙中质粒的结构分析，OsGADs能在转基因水稻中高效表达的可能原因是____。 （4）上图中获得转基因水稻的过程主要运用了基因工程、____等现代生物技术。 32．（2026·江苏盐城·模拟预测）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 （1）用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供______和维生素。可利用______的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 （2）基因工程操作中核心步骤是______。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体部分结构，C基因表达的C蛋白有抗肿瘤作用。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，______，从而发挥抗肿瘤作用。 （3）T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择T3基因进行后续研究，判断的依据是______。 （4）工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，实现在短时间的超声波刺激后维持长时间治疗的目的。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项完善表达载体的构建，I：______、II：______、III：______、VII：______。（填数字序号） ①P1启动子  ②P3启动子（持续表达型启动子）  ③C基因  ④B基因 （5）与一般化疗药物相比，“响应超声波的药物递送系统”细菌实现癌症治疗的优点有哪些？______。 33．（2026·江苏南京鼓楼·一模）别藻蓝蛋白（APC）是蓝细菌及藻类中的一种色素蛋白，其生物合成过程如图1。通过构建双质粒表达系统，实现重组别藻蓝蛋白（rAPC）合成通路在大肠杆菌中的完整表达，如图2，请回答下列问题： （1）根据图1中PCB的合成过程可判断，基因表达产物与性状之间的关系是________。APC的合成受到多种基因的控制，说明基因和性状之间并非_______关系。 （2）据图2可知，构建双质粒表达系统时，引物_______的5′端分别引入相同的限制酶识别序列，并且构建过程_______（选填“可以”或“不可以”）在同一反应体系中进行。为使不同目的基因的表达量达到适宜比例，启动子1的强度应_______（选填“大于”或“等于”或“小于”）启动子2。将APC合成通路中的关键基因分别导入两个不同质粒的优点是_______。 （3）一般用_______处理大肠杆菌以提高转化的效率。比较图2中过程④和⑤使用的培养基，前者比后者多出的成分有_______。 （4）科研人员为探究rAPC对小鼠肝癌的影响，进行了相关实验。下表为部分实验结果： 组别 抑癌率% 细胞灰度值 COX-2 VEGF PCNA 对照组 0 148.3 151.1 155.7 rAPC 低剂量组 25.2 156.2 159.2 157.5 中剂量组 36.7 161.2 159.9 162.3 高剂量组 43.1 165.1 163.5 164.9 化疗药物（CY）组 51.0 165.2 166.2 206.8 注：COX-2、VEGF和PCNA基因与肿瘤生长有关；细胞灰度值越大，相对应的基因表达量越小。 下列关于实验结果的分析，合理的有_________。 a.rAPC组与CY组对比，能说明rAPC具有抑癌作用 b.rAPC能抑制肿瘤的生长，但抑制作用不具有剂量效应 c.rAPC和CY均能抑制肿瘤细胞中COX-2、VEGF和PCNA基因的表达 d.COX-2、VEGF和PCNA在肝癌的发生和发展过程中可能具有协同作用 34．（2026·镇江一中&镇江中学·模拟预测）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 （1）PCR扩增目的基因时，需要______、引物、耐高温的DNA聚合酶以及含Mg2+的缓冲液。DNA聚合酶在PCR的______（填具体名称）步骤中起作用。 （2）可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的______（填“5′端”或“3′端”）分别添加______和______限制酶识别序列。选用限制酶______切割质粒pYL，酶切后的基因N和质粒pYL经纯化和连接构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （3）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是______。初步判断实验组______（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是______。 （4）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。下图所示a、b、c、d是引物序列，其中a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有______。 （5）后进一步检测转基因酵母菌发酵得到的______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 35．（2026·徐州一中·一模）平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。 （1）SMC由胚胎发育过程中的中胚层细胞分化而来，其细胞表达的________（填“周期蛋白p53”或“肌动蛋白”）可作为中胚层细胞分化为SMC的标志。在SMC中M蛋白含量较高，而在其他细胞中几乎不存在，根本原因是________。 （2）为获得血管SMC被特异性标记的工具鼠用于研究，研究人员进行了下列实验，如图1所示。 Stop：阻止其后基因转录的序列 tdT：红色荧光蛋白基因 CE：Cre重组酶-雌激素受体融合基因 注：loxP不影响任何基因功能 ①利用PCR技术获得CE，为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠的________之后，以获得小鼠A。 ②构建含Stop和tdT的表达载体，导入小鼠的________细胞，获得小鼠B。将A与B杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C（CE/+）。 ③在外源药物他莫昔芬的诱导下，可使定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核。Cre重组酶可识别DNA分子中的loxP序列，且可将两个同向loxP之间的DNA序列切除。用药物他莫昔芬饲喂小鼠C后，可观察到________现象。 （3）为利用工具鼠研究血管SMC中S基因表达的作用，在S基因两侧分别引入一个loxP位点，这样的S基因称为flox基因，获得flox杂合小鼠（flox/+）后，将其与C鼠作为亲本进行系列杂交（仅标出flox和CE的遗传情况）流程如图2所示。 已知S基因和CE位于非同源染色体上，从F1中筛选出双杂合子（flox/+；CE/+）与flox杂合小鼠（flox/+）进行回交，F2中flox纯合且CE阳性的小鼠（flox/flox；CE/+）所占比例为________，经他莫昔芬诱导后，该小鼠SMC中________。从中筛选出________的个体，观察血管SMC是否有改变。 （4）为评估血管SMC标记是否具有组织特异性和药物他莫昔芬的外源诱导性，使研究更具有科学性，需要对C鼠做的检测有________。 A．检测SMC中是否具有loxP序列 B．检测多种组织中S基因的表达情况 C．检测多种组织中tdT基因的表达情况 D．检测饲喂与不饲喂他莫昔芬条件下tdT的表达情况 36．（2026·江苏徐州一中·模拟预测）噬菌体展示技术是制备全人源单克隆抗体的主流技术之一。研究人员结合单个 B 细胞技术，针对某新型病原体表面抗原获取抗体基因；其中VH基因、VL基因分别编码抗体重链可变区和轻链可变区。请回答下列问题 （1）采集康复者外周血，筛选________的B细胞，提取________，根据抗体基因通用序列设计引物进行RT-PCR，筛选获得VH基因和VL基因。 （2）据图1分析，获得VH基因和VL基因后，应在引物________上添加柔性肽基因序列，使两个基因序列连接起来，且两个引物上添加的序列应为________（填“相同”或“互补”）序列。还需在引物_________的5'端添加限制酶切序列，以便插入质粒中。 （3）据图2分析，用融合基因（目的基因）构建重组质粒，导入大肠杆菌，用________进行筛选。再用缺陷型噬菌体侵染筛选出的大肠杆菌，缺陷型噬菌体的特点是_________，因此无法独立组装成完整的噬菌体颗粒。缺陷型噬菌体侵染大肠杆菌后，在大肠杆菌内发生同源重组。构建重组质粒的目的是使目的基因编码的蛋白展示在噬菌体的________获得展示抗体的噬菌体。可利用__________技术对得到噬菌体进行筛选，再用得到的噬菌体侵染大肠杆菌得到子代噬菌体。这样的淘选过程需要重复3~4轮 。 （4）为避免氨苄青霉素抗性基因扩散影响其他生物，实验完成后需敲除大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性基因。构建表达载体时，需在该抗性基因两侧插入 2 个 loxP 序列；据图分析，这两个loxP序列的方向是________（填“同向”或”反向“）的，可利用酶将其敲除，loxP序列具有方向性的原因是________________________。 37．（2026·江苏南京·二模）热不对称交错PCR（TAIL-PCR）是一种克隆已知序列旁侧未知序列的分子生物学技术。请回答下列问题： （1）TAIL-PCR原理：以基因组为模板，利用三个较长的嵌套特异性引物（SP1、SP2、SP3，按已知序列设计）和较短的随机简并引物AD（特异性较低，可与模板多个位置结合）组合，通过三轮热不对称温度循环的PCR反应扩增产物，如下图所示。 ①第一轮PCR反应体系中，除在含Mg2+的PCR缓冲液中添加SP1、AD外，还需加入_____及Taq酶等。根据第一轮PCR反应流程及产物类型推测，在低温退火中_____（从“SP1”“AD”“SP1与AD”中选填）可与模板DNA发生结合。 ②第一轮及第二轮PCR反应结束后，分别对产物稀释1000倍的目的是_____下一轮PCR反应中特异性产物的比例。 ③第三轮PCR扩增反应结束后，得到的产物长度_____（从“能”“不能”中选填）确定，原因是_____。 （2）应用：某科研小组利用TAIL-PCR技术进行了小麦耐盐基因（TaSC）启动子的克隆及功能研究，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 方法步骤要点 DNA的提取 提取小麦叶片的基因组DNA TAIL-PCR 根据TaSC序列设计三条特异性引物，分别与AD引物进行TAIL-PCR，对扩增产物进行电泳、回收并测序，再通过检索①_____进行比对 分段启动子克隆 根据②_____序列设计引物，以小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到不同长度的5'端渐进缺失的启动子 ③_____及转化 将各启动子片段与含有报告基因GUS的载体进行拼接，分别导入农杆菌后侵染拟南芥 检测启动子的活性中心 将含不同启动子片段的拟南芥进行GUS染色，确定其活性 注：GUS为葡萄糖苷酸酶基因，其表达产物可水解X-Gluc呈蓝色。 （3）结果分析：在上述实验中，利用多对引物（如下图）扩增了5种不同长度的片段，为将扩增后的片段定向插入载体T-DNA中启动GUS基因的表达，在F1~F5与R末端添加的序列所对应的限制酶分别为_____。将目的基因导入拟南芥细胞后进行植物组织培养，用含_____的培养基对组培苗进行筛选，再进行GUS染色。结果显示，含F1~F3与R扩增产物的转基因拟南芥呈GUS阳性（其中F2、F3对应的拟南芥呈弱阳性），而F4、F5与R扩增产物的转基因拟南芥无显色反应。该实验结果表明：_____。 38．（2026·江苏南京&盐城·一模）可编程染色体工程（PCE）是基于迭代Cre-Lox重组系统发展起来的一种前沿基因组编辑技术，能够实现对染色体上大片段DNA的精准操作。科研人员利用该技术对水稻中一段315kb的基因组片段进行倒位操作（该倒位片段命名为inv-315H），成功将OsHIS1基因的启动子与OsRPL27．3基因的启动子互换（图1）。图2为Cre-Lox系统作用原理简图，其中a部分显示LoxP位点序列组成，b、c部分示意Cre酶介导的删除与倒位重组机制。图3为PCE系统在植物中实现大片段DNA倒位的完整工作流程示意图。请回答下列问题： 【相关序列信息】LoxAR2：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TTTCCGATGTTAT-3′ Lox71：5′-TACCGTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′ （1）据图2分析，LoxP位点的方向由其____________序列决定；当Cre酶持续存在时，其对位于反向平行排列的LoxP位点间的片段所介导的DNA倒置重组反应具有____________性。 （2）PCE系统由经AI辅助工程化改造的高效Cre酶、新型Lox位点（LoxAR2和Lox71）以及一个可编程基因编辑系统共同构成。其中，基因编辑系统负责将新型Lox位点精准插入基因组目标位置。与传统loxP位点相比，LoxAR2和Lox71的改造主要发生在____________区域。结合图3分析，在第2步中，由基因编辑系统在目标区域两端精准插入LoxAR2与Lox71位点，这两个位点的方向____________，这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 （3）为验证该315kb片段是否成功倒位，科研人员首先在大量T0代再生植株中，利用针对倒位连接处的特异性引物进行初步PCR筛选，从中选出若干候选阳性植株（编号H1～H16）。进一步提取这些候选植株及野生型（WT）的DNA进行PCR验证，电泳结果如图4所示。根据图4结果，可初步判断____________。为进一步验证该倒位操作是否赋予植株除草剂抗性，科研人员将T0代阳性植株与野生型对照一并移栽至含除草剂硝磺草酮的培养基中，持续培养1～2周后观察生长状况。若观察到____________现象，说明倒位成功赋予水稻硝磺草酮的抗性。硝磺草酮通过抑制HPPD酶的活性来阻断类胡萝卜素的合成，从而使植物死亡，而水稻中的OsHIS1基因能编码一种可以分解硝磺草酮的解毒酶。分析倒位操作使水稻获得抗性的原因：倒位使____________连接，导致OsHIS1基因表达水平显著提高，从而合成了更多的解毒酶；当硝磺草酮存在时，过量合成的解毒酶可以____________，使水稻得以正常生长，表现出抗性。 （4）为探究该倒位性状的遗传稳定性，他们将T0代植株自交获得T1代群体。首先，通过PCR检测inv-315H倒位连接处和野生型OsHIS1位点以鉴定基因型；同时，利用T-DNA特异性引物检测外源转基因元件的残留情况，电泳结果见图5。T1代群体中，具有____________条带的植株为纯合倒位植株，该类型植株在T1代群体中约占____________。图中用三角形标记的植株与用箭头标记植株相比在农业应用中的核心优势是____________。 39．（2026·海安高级中学·模拟预测）真核细胞转座子有逆转座子和DNA转座子之分，可在染色体间和染色体内部转移。R2逆转座子倾向于整合在真核生物28S rDNA（核糖体DNA，转录产生rRNA）基因组位点，这一位点在人基因组中拷贝数目很多。图1是R2逆转座子的机制图。 （1）R2复合体能够识别DNA中的特定片段并进行切割，与基因工程中的_____酶功能相似，除此之外R2复合体还具______酶的活性。 （2）图1过程③以_____为模板，基因组DNA α链的右端为_____（填3'或5'）端。 （3）下面关于TPRT机制与PCR技术的说法错误的是_____（填字母）。 A．TPRT机制和PCR过程中都涉及氢键的破坏和形成 B．TPRT机制中需要RNA引物，PCR过程中需要DNA引物 C．TPRT机制和PCR过程中子链都是从引物的5'端开始合成 D．TPRT机制和PCR过程所用的原料依次是核糖核苷酸和脱氧核苷酸 （4）天然存在的R2逆转座子在精准识别基因组DNA上存在一些不足，科研团队利用人工智能辅助的蛋白质工程对R2蛋白质进行了改造，获取新的R2逆转座子工具——donor-R2复合体，并以斑马鱼为对象进行了实验，具体过程如图2。合理的蛋白质改造流程为：⑦→④→_____→⑥（选择正确编号并排序）。 ①将重组DNA导入受体细胞 ②将改变后的R2蛋白的基因与载体重组 ③对突变的R2蛋白进行结构功能分析 ④定点突变改变R2蛋白的基因序列 ⑤培养细胞后提纯突变的R2蛋白 ⑥选择合适的突变基因投入后续使用 ⑦利用AlphaFold预测R2蛋白三维结构 （5）构建图2中的DNA片段2时，目的基因左右两侧的限制酶识别位点分别为HpaII（5'-C↓CGG-3'）和BamHⅠ（5'-G↓GATCC-3'），GFP基因左右两侧的限制酶识别位点分别为 ‌BglⅡ‌ （5'-A↓GATCT-3'）和Sau3AⅠ（5'-↓GATC-3'），则两基因融合处的核苷酸序列为5'_____3。 （6）结合图1和图2，简述donor-R2复合体实现将目的基因整合到受体细胞的机制：_____。 （7）根据R2逆转座子的插入特点，可将其作为载体携带目的基因，开展安全的基因治疗，理由是_____。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】BD 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】BCD 2.【答案】A 3.【答案】（1）捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 （2）互利共生 （3）上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 （4）互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 （5）ab 考点3 基因工程综合 1.【答案】（1）细胞免疫 （2）活化的细胞毒性T细胞 细胞因子 VHH （3）Trop2蛋白 总RNA 5′端 DNA连接 （4）检验Trop2CAR-T细胞的抗肿瘤能力是否增强 Trop2CAR-T细胞可抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期 2.【答案】（1）EcoR I、Hind Ⅲ （2）CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R （3）启动子 C （4）SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 3.【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 （2）CD （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 （4）ABC （5）P2、P4 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 4.【答案】（1）脂质和蛋白质 与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） （2）溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' （3）a、b 1100 Q4 蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部 （4）逆转录 32 1.【答案】B 2.【答案】C 3.【答案】ABC 4.【答案】B 5.【答案】A 6.【答案】AB 7.【答案】C 8.【答案】B 9.【答案】C 10.【答案】C 11.【答案】AB 12.【答案】D 13.【答案】C 14.【答案】B 15.【答案】（1）5'→3' 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 （2）小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高 （3）R2引物5'端序列 （4）BclI和SmaI ②③ ②③ （5）草甘膦 根 促进植物对磷元素的吸收 16.【答案】（1）G基因、耐高温的DNA聚合酶 引物1、引物2、四种脱氧核苷酸 （2）5' 引物1和引物4 （3）BamHⅠ和HindⅢ DNA分子的大小和构象 琼脂糖凝胶电泳 ABC （4）蓝细菌 壮观霉素 （5）个体（生物学） 不需要在培养基中添加葡萄糖，节省了原料，蓝细菌可以吸收环境中的二氧化碳合成赤藓糖醇，有利于环境保护 17.【答案】（1）聚合酶链式反应 可在细胞外实现微量DNA分子的大幅增加 其耐高温的特性是PCR可循环进行的重要原因 （2）BC （3）胰岛素基因两侧（3'端）的序列、在5'添加同源序列 甲、丙 可只扩增目的基因部分特异性序列，引物不必包含同源序列 （4）增加大分子DNA彻底变性的概率，得到单链DNA 使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列 18.【答案】（1）EcoRI、HindIII B （2）氨苄青霉素 雌激素、荧光素 （3）基因的表达（转录和翻译） P2A序列产生的2A肽能将融合蛋白切割成独立的两种蛋白，有助于序列两侧的基因平衡表达成两种独立的蛋白质 （4）启动子 上 受精卵 含有 19.【答案】（1）逆转录/反转录 琼脂糖凝胶电泳 4 （2）5' SacⅠ和NotⅠ DNA连接酶 （3）Ca2+ 感受态 （4）潮霉素 愈伤组织 不需要 20.【答案】（1）碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） （2）3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） （3）EcoR I RNA聚合酶 （4）Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 21.【答案】（1）dNTP、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链上（复性） （2）5' NdeI、SmaI（顺序可颠倒） T4DNA连接酶 （3）质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因 腺嘌呤和组氨酸 排除AD与ECL蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能 能 丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达 22.【答案】（1）不受 促进R蛋白形成二聚体，并启动GFP基因的表达（或解除R蛋白对启动子B的抑制） 绿色荧光强度 （2）1、4 BglⅡ、HindⅢ （3）碱基互补配对 磷酸二酯 给予重组EcN且饮用等量添加诱导剂aTc和cumate的水 粪便 稀释涂布平板 23.【答案】（1）模板、耐高温DNA聚合酶、引物 使DNA充分变性 （2）4种脱氧核苷酸 不在 SalⅠ EcoRⅠ （3）F7与R扩增产物不含启动子（或完整的启动子），荧光蛋白基因不表达 （4）F3、F1、F6 （5）定点诱变导致BCL11A蛋白不能与结合位点结合，γ珠蛋白合成增多，则患者体内的胎儿血红蛋白（HbF）增多从而缓解症状 24.【答案】（1）Mg2+ 琼脂糖凝胶电泳仅能分析DNA分子的大小，无法确定DNA分子碱基序列 （2）Bcl I Hind Ⅲ （3）纤维素（纤维素酶和果胶） （4）PCR mRNA 抗原-抗体杂交 25.【答案】（1）不需要 可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸 GACCCCAGCTCCAAAGCT （2）P1和P4 6 BclⅠ、NotⅠ （3）Ca2+ 转化 （4）Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异 26.【答案】（1）XbaI、SpeI PstI、BglII （2）有目的基因、标记基因 （3）乙 1和2 不加模板DNA的空白对照 （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放 等量的工程菌+低氧培养（1%O2） 培养液中抗癌药物的含量和癌细胞数量 27.【答案】（1）总mRNA 逆转录酶、TaqDNA聚合酶 （2）BsmB Ⅰ的识别序列和接头序列 DNA连接 无 可能相同 （3）5'CGTCTCNGTCG3' （4）潮霉素 纤维素和刚果红 透明圈直径与菌落直径的比值 28.【答案】（1）启动子、终止子 将目的基因转移并插入（整合）到玉米 细胞的染色体 DNA上 （2）冷冻处理后细胞更容易破碎，同时抑制核酸酶活性，防止 DNA 降解 二苯胺 四种脱氧核苷酸 延伸 引物 1 和引物 2（或引物 3 和引物 4） 2 2 （3）在检测的不同组织器官中，纯合株系中m2cryAb-vip3A基因在转录和翻译水平 的表达量普遍高于杂合植株 29.【答案】（1）不需要 可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸 GACCCCAGCTCCAAAGCT （2）P1和P4 6 Bcl Ⅰ、Not Ⅰ （3）Ca2+ 随大肠杆菌大量增殖时实现重组DNA的大量扩增 转化 （4）Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异 30.【答案】（1）4种脱氧核苷酸（dNTP）、TaqDNA聚合酶 CUP1基因左端的序列和Bgl Ⅱ的识别序列 （2）③ （3）扩增质粒2 （4）一定浓度硫酸铜 引物2 琼脂糖凝胶电泳 1330bp （5）增强（或提高） ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中该基因表达被抑制，双乙酰合成减少，故含量更低 31.【答案】（1）抗逆（缓解非生物胁迫） （2）Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ 这两种酶可产生与酶切后OsGADs片段相匹配的末端，便于连接 氨苄青霉素和X‐gal 白 （3）外源基因与强启动子等调控元件相连，从而显著提高转录与翻译效率 （4）植物组织培养 32.【答案】（1）碳源、氮源 显微镜直接计数（或显微计数法） （2）构建基因表达载体 解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达 （3）温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达强度变化幅度最大 （4）② ③ ① ④ （5）通过超声精准触发药物释放，实现深层治疗，且副作用极低 33.【答案】（1）基因通过控制酶的合成控制代谢过程，进而控制生物的性状 （简单的）一一对应 （2）2和3 不可以 大于 分别调控不同基因的表达（降低载体构建的难度、避免单个载体容量有限、减轻受体细胞在代谢上的负担） （3）Ca2+ 壮观霉素和卡那霉素和琼脂 （4）cd 34.【答案】（1）模板DNA、4种脱氧核苷酸（dNTP） 延伸 （2）5′端 XhoⅠ XbaⅠ SpeⅠ和XhoⅠ （3）检验PCR反应体系中是否有外源DNA的污染 1 目的基因N大小约为2.3kb （4）GCC （5）香树脂醇 35.【答案】（1）肌动蛋白 基因的选择性表达 （2）M基因启动子 受精卵 SMC发出红色荧光 （3）1/8 SMC中S基因被敲除 能发出红色荧光 （4）CD 36.【答案】（1）能产生特定抗体结合特定抗原（已免疫） 总RNA （2）4、5 互补 1、8 （3）含氨苄青霉素的培养基 无（完整的）尾部蛋白合成基因 尾部（蛋白） 抗原-抗体杂交 （4）同向 loxP 序列中间的核心间隔区为不对称序列，只能按特定方向识别和特异性重组 37.【答案】（1）4 种游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），模板DNA SP1与AD 提高 不能 AD与模板结合的位置不确定 （2）序列（或基因）数据库 TaSC 启动子 基因表达载体的构建 （3）BamH 1，Hind III 潮霉素 耐盐基因（TaSC）启动子的活性中心位于F3与F4对应序列之间，F1与F2对应序列之间可能存在增强启动子功能的调控序列 38.【答案】（1）间隔 可逆（双向） （2）反向重复序列 相反 （3）植株均成功实现了倒位（均为阳性植株） 阳性植株正常生长，野生型植株生长受抑制或死亡 OsHIS1基因与OsRPL27.3基因启动子 高效分解硝磺草酮，保护HPPD酶的活性，从而保障类胡萝卜素的合成 （4）inv-315H倒位连接处条带且无野生型OsHIS1位点条带 1/4 不含外源转基因成分（T-DNA），避免了转基因生物安全风险，有利于推广应用 39.【答案】（1）限制酶 DNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶 （2）R2 RNA 3’ （3）BCD （4）②→①→⑤→③ （5）5’-GGATCT-3’ （6）R2蛋白识别特定序列并切割，以供体RNA为模板合成cDNA，实现目的基因写入 （7）R2逆转座子整合在rDNA基因组位点，不会破坏除28S rDNA外的基因；这一位点在人基因组中拷贝数目很多，对rDNA的功能影响不大 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $