专题15 基因工程（10年汇编）（浙江专用）2017-2026年高考生物真题分类汇编

专题15 基因工程 10年汇编1年模拟 考点分类 浙江考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2026浙江（1题） ·情境设置：以细菌抵御噬菌体等真实生物学现象为背景。 ·考查重点：限制酶、甲基化酶的作用及特异性识别。 ·命题趋势：联系防御机制，强化对工具酶作用机理的理解。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026浙江（1题）、2025浙江（1题）、2024浙江（1题）、2023浙江（1题） ·情境设置：结合遗传育种、疾病诊断和转基因动物研究。 ·考查重点：基因提取、样本库构建、扩增检测及结果分析。 ·命题趋势：突出技术流程与遗传信息分析的综合应用。 考点3 基因工程综合 2026浙江（1题）、2025浙江（1题）、2024浙江（2题）、2023浙江（1题）、2022浙江（1题）、2021浙江（1题）、2020浙江（3题）、2019浙江（1题）、2018浙江（1题） ·情境设置：覆盖微生物发酵、植物改良、动物基因敲除等。 ·考查重点：基因获取、载体构建、表达调控及工程菌筛选。 ·命题趋势：强化多技术整合，突出基因工程解决实际问题的能力。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 2026浙江（1题）、2018浙江（1题） ·情境设置：围绕抗病、耐低温等农业性状改良。 ·考查重点：外源基因导入及转基因技术的应用价值。 ·命题趋势：联系农业生产，考查基因工程育种的特点。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2026·浙江·6月高考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） （2024·浙江·6月高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 3．（2023·浙江·6月高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 4．（2026·浙江·6月高考真题）科研人员取无籽和有籽葡萄植株若干，分别提取单株基因组DNA，取等量混合后，分别构建无籽组和有籽组样本库。利用A、T、G、C随机组合且长度为10个碱基的随机引物，对无籽组和有籽组进行PCR扩增，获得与无籽性状相关的特异性DNA条带，以便于无籽葡萄的快速筛选。已知随机引物在葡萄基因组DNA上有若干结合位点。回答下列问题： （1）基因组DNA的提取：葡萄叶片用液氮速冻后研磨成粉末状，添加提取液后离心，最后在上清液中加入预冷的乙醇溶液，用于______。在提取中，液氮速冻叶片的作用是使组织脆化以便于研磨，及______以保证DNA的完整性。 （2）PCR扩增：为更准确获得与无籽基因相关的DNA条带，实验中需对无籽组和有籽组的样本库而非单株进行分析，原因是为了消除______的干扰。制备50μL PCR反应体系时，若试剂总量不足50μL，需添加______补足。用某一种随机引物进行PCR，电泳结果如图1所示，下列叙述正确的是______。 A．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA所含有的碱基对数量更多 B．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA上可能多2个该引物的结合位点 C．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加3个碱基对 D．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加6个碱基对 （3）特异性条带DNA的测序：已知Taq DNA聚合酶会在合成的DNA链端非特异性多加1个A。为使PCR扩增出的DNA能与克隆载体连接，克隆载体经限制酶切割产生平末端后，需要______（A．在端加1个T  B．在端加1个T  C．在端加1个A  D．在端加1个A）。回收图1箭头所指特异性条带DNA，连接到克隆载体形成______，经克隆后测序。 （4）PCR重扩增：根据测定的DNA两端序列再设计长度为24个碱基的1对引物，对无籽组和有籽组进行PCR重扩增，电泳结果如图2所示。通过与______比对，可推测扩增出的DNA大小。与用随机引物扩增相比，PCR重扩增的特异性显著增强，其原因是提高了退火温度以及______。 5．（2025·浙江·6月高考真题）玉米（2n=20）雌雄同株异花。从玉米某自交系（甲）中选育出2个雄性不育突变体（乙和丙）。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代（丁和戊）基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： （1）E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 （2）雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 （3）写出丁×戊获得F1的遗传图解。 （4）雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________（答出2点即可）。 （5）利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 考点3 基因工程综合 1．（2020·浙江·7月高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（    ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 2．（2026·浙江·1月高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： （1）表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 （2）假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 （3）重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 3．（2025·浙江·1月高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    （1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要__________________。 （2）若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 （3）为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________（A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有________功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与____________________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·浙江·1月高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： （1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 （2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 （3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 （4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 5．（2024·浙江·1月高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： （1）F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生______，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行______和______。 （2）从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第______泳道和第______泳道。 （3）g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______，则g和f是非等位基因；若杂交结果是______，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） （4）确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______。 6．（2023·浙江·6月高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： （1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 （2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 7．（2022·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： （1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 （2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 （4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 （6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 8．（2021·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （4）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。 （5）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。 （6）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 9．（2020·浙江·7月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题： （1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。 （2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。 （4）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。 （5）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。 （6）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。 10．（2020·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与泡菜制作有关的问题： （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。 （6）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （7）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。 11．（2019·浙江·4月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与果胶和果胶酶有关的问题： （1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为______。 （2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行______。 （3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使______。果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入______。使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。 （4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有______和可连续处理等。在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有______和______。 （二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 （6）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A.质粒载体  B.转录产物  C.抗性基因  D.病原微生物）。 （7）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 （8）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。 12．（2018·浙江·4月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与果胶、淀粉等提取和利用有关的问题： 某植物富含果胶、淀粉、蛋白质和纤维素成分。某小组开展了该植物综合利用的研究。 （1）果胶提取工艺研究结果表明，原料先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率（提取得到的果胶占原料质量的百分率）显著高于常温水漂洗的果胶得率，最主要原因是沸水漂洗_______ （A．有助于清洗杂质和去除可溶性糖  B．使植物组织变得松散  C．使有关酶失活  D．有利细胞破裂和原料粉碎制浆）。 （2）在淀粉分离生产工艺研究中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂（乳酸菌菌液），其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用_______，进行单菌落分离，然后将其_______，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。 （3）在用以上提取过果胶和淀粉后的剩渣加工饮料工艺研究中，将剩渣制成的汁液经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，发现仍存在浑浊和沉淀问题,可添加_______使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加_______，以解决汁液浑浊和沉淀问题。 （4）在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的_______（答出2点即可）、反应液pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过_______来调节。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题。 （1）将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR I酶切，在切口处形成_______。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接。在两个片段相邻处形成_______，获得重组质粒。 （6）已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_______实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_______，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。 （7）取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_______，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_______形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_______（答 2点即可）。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（2026·浙江·1月高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 2．（2018·浙江·4月高考真题）将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，这种导入外源基因的方法属于 A．杂交育种 B．转基因技术 C．单倍体育种 D．多倍体育种 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】C 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】D 2.【答案】B 3.【答案】B 4.【答案】（1）沉淀 DNA 降低DNA酶的活性 （2）遗传背景（单株存在个体差异） 无菌水 B （3）A 重组DNA （4）DNA marker（DNA相对分子质量标准物） 引物长度（变长） 5.【答案】（1）碱基对替换 终止密码子提前 （2）隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 （3） （4）测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 （5）C 考点3 基因工程综合 1.【答案】D 2.【答案】（1）感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ （2）超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 （3）提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 3.【答案】（1）密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 （2）C （3）预冷的体积分数为95%的酒精 D 调控 （4）基因数据库/序列数据库 表达载体 4.【答案】（1）根 解旋酶 磷酸基团 变长 （2）DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 （3）划线分离 振荡培养 （4）梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 5.【答案】（1）编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 （2） 3 2 （3） 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 （4） 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 6.【答案】（1）负反馈调节 过量赖氨酸类似物 （2）基因数据库 融合 核受体细胞 激活 桑椹胚或囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 7.【答案】（1）无菌水 活化 离心 破碎 （2）其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 （3）灭菌 资源化 （4）逆转录 核酸探针 （5）抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 （6）脾 动物血清 8.【答案】 涂布分离 单菌落 筛选 未固定的细菌 降解富营养化污水污染物的能力 包埋法和吸附法 特定介质能为菌株繁殖提供X 遗传 间种 DNA聚合酶 愈伤组织 继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 9.【答案】 澄清度 95%乙醇 较小 抽滤 细菌悬液 灭菌 较小 粘性 抗性基因 全能性表达充分 显微注射 短 脱分化 生长素 根的分生组织 B 10.【答案】 果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生 11.【答案】 腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离（或划线分离） 水果组织软化疏松及细胞受损 95%乙醇 提高果胶酶的稳定性 固定化的方法 固定化所用的介质 单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养 12.【答案】 C 划线分离法（或涂布分离法） 扩大培养 果胶酶和果胶甲酯酶 淀粉酶使淀粉分解 固定化酶的量、反应液温度 控制反应器液体流量（或体积） 黏性末端 磷酸二酯键 转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】D 2.【答案】B 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 10年汇编1年模拟 考点分类 浙江考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2026浙江（1题） ·情境设置：以细菌抵御噬菌体等真实生物学现象为背景。 ·考查重点：限制酶、甲基化酶的作用及特异性识别。 ·命题趋势：联系防御机制，强化对工具酶作用机理的理解。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026浙江（1题）、2025浙江（1题）、2024浙江（1题）、2023浙江（1题） ·情境设置：结合遗传育种、疾病诊断和转基因动物研究。 ·考查重点：基因提取、样本库构建、扩增检测及结果分析。 ·命题趋势：突出技术流程与遗传信息分析的综合应用。 考点3 基因工程综合 2026浙江（1题）、2025浙江（1题）、2024浙江（2题）、2023浙江（1题）、2022浙江（1题）、2021浙江（1题）、2020浙江（3题）、2019浙江（1题）、2018浙江（1题） ·情境设置：覆盖微生物发酵、植物改良、动物基因敲除等。 ·考查重点：基因获取、载体构建、表达调控及工程菌筛选。 ·命题趋势：强化多技术整合，突出基因工程解决实际问题的能力。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 2026浙江（1题）、2018浙江（1题） ·情境设置：围绕抗病、耐低温等农业性状改良。 ·考查重点：外源基因导入及转基因技术的应用价值。 ·命题趋势：联系农业生产，考查基因工程育种的特点。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2026·浙江·6月高考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 【答案】C 【解析】A、由图可知，细菌的甲基化酶仅对自身DNA进行甲基化，避免自身DNA被限制酶切割，不会对噬菌体DNA进行甲基化，A错误； B、酶的专一性指一种酶只能催化一种或一类化学反应，限制酶和甲基化酶是两种不同的酶，二者作用于相同底物不能体现酶的专一性，B错误； C、由图可知，噬菌体DNA未被甲基化，可被细菌的限制酶特异性切割，C正确； D、DNA甲基化属于表观遗传的修饰方式，该修饰是可以遗传给子代的，D错误。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） （2024·浙江·6月高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】1．D 2．B 【解析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 1．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 2．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 3．（2023·浙江·6月高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】B 【解析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 4．（2026·浙江·6月高考真题）科研人员取无籽和有籽葡萄植株若干，分别提取单株基因组DNA，取等量混合后，分别构建无籽组和有籽组样本库。利用A、T、G、C随机组合且长度为10个碱基的随机引物，对无籽组和有籽组进行PCR扩增，获得与无籽性状相关的特异性DNA条带，以便于无籽葡萄的快速筛选。已知随机引物在葡萄基因组DNA上有若干结合位点。回答下列问题： （1）基因组DNA的提取：葡萄叶片用液氮速冻后研磨成粉末状，添加提取液后离心，最后在上清液中加入预冷的乙醇溶液，用于______。在提取中，液氮速冻叶片的作用是使组织脆化以便于研磨，及______以保证DNA的完整性。 （2）PCR扩增：为更准确获得与无籽基因相关的DNA条带，实验中需对无籽组和有籽组的样本库而非单株进行分析，原因是为了消除______的干扰。制备50μL PCR反应体系时，若试剂总量不足50μL，需添加______补足。用某一种随机引物进行PCR，电泳结果如图1所示，下列叙述正确的是______。 A．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA所含有的碱基对数量更多 B．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA上可能多2个该引物的结合位点 C．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加3个碱基对 D．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加6个碱基对 （3）特异性条带DNA的测序：已知Taq DNA聚合酶会在合成的DNA链端非特异性多加1个A。为使PCR扩增出的DNA能与克隆载体连接，克隆载体经限制酶切割产生平末端后，需要______（A．在端加1个T  B．在端加1个T  C．在端加1个A  D．在端加1个A）。回收图1箭头所指特异性条带DNA，连接到克隆载体形成______，经克隆后测序。 （4）PCR重扩增：根据测定的DNA两端序列再设计长度为24个碱基的1对引物，对无籽组和有籽组进行PCR重扩增，电泳结果如图2所示。通过与______比对，可推测扩增出的DNA大小。与用随机引物扩增相比，PCR重扩增的特异性显著增强，其原因是提高了退火温度以及______。 【答案】（1）沉淀 DNA 降低DNA酶的活性 （2）遗传背景（单株存在个体差异） 无菌水 B （3）A 重组DNA （4）DNA marker（DNA相对分子质量标准物） 引物长度（变长） 【解析】（1）DNA不溶于预冷的乙醇，加入预冷的乙醇溶液后，可以让DNA从溶液中析出（沉淀DNA）；液氮的低温除了脆化组织便于研磨，还能降低DNA酶的活性，避免DNA被降解，保证DNA的完整性。 （2）混合多株的DNA建库，可以避免单个植株自身和无籽/有籽性状无关的随机遗传差异干扰，确保筛选到的条带是和无籽性状普遍关联的。 PCR体系需要用无核酸酶的无菌水补足体积，避免引入杂质影响反应。 A、电泳条带是扩增出的片段，不能代表整个基因组的碱基对总数差异，A错误； B、扩增一个片段需要两个引物，图1无籽组比有籽组多1条特异性扩增条带，说明无籽基因组上可能多了2个该随机引物的结合位点，扩增出对应片段，B正确； C、扩增一个片段需要两个引物，所以在引物5'端添加3个碱基，新合成的两条互补链都会对应多出3个碱基，总共使扩增片段增加6个碱基对，C错误； D、DNA聚合酶是从引物的3'端连接核苷酸，所以在该引物的端增加3个碱基，若引物仍能与原位置配对，则只是改变了引物的长度，扩增出的DNA条带长度不变，D错误。 （3）PCR产物的3'端多出1个A（A末端），为了实现互补的粘性末端连接，需要将载体的平末端处理后在3'端加1个T，即T-A克隆的原理，A正确，BCD错误。 （4）电泳图的M是DNA分子量标准（Marker），通过和Marker的条带比对，就可以估算扩增出的DNA片段的大小；相比10个碱基的随机引物，新设计的24碱基引物序列更长，和基因组DNA发生非特异性互补结合的概率大幅降低，同时更高的退火温度也进一步减少错配，因此扩增特异性显著增强。 5．（2025·浙江·6月高考真题）玉米（2n=20）雌雄同株异花。从玉米某自交系（甲）中选育出2个雄性不育突变体（乙和丙）。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代（丁和戊）基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： （1）E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 （2）雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 （3）写出丁×戊获得F1的遗传图解。 （4）雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________（答出2点即可）。 （5）利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 【答案】（1）碱基对替换 终止密码子提前 （2）隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 （3） （4）测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 （5）C 【解析】PCR全称为聚合酶链式反应，过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 （1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 考点3 基因工程综合 1．（2020·浙江·7月高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（    ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 【答案】D 【解析】基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。 A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误； B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误； C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误； D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。 故选D。 2．（2026·浙江·1月高考真题）农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： （1）表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 （2）假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 （3）重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 【答案】（1）感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ （2）超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 （3）提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 【解析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （1）用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞（可导入外源DNA分子的农杆菌）。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 （2）为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台（或无菌实验室或灭菌的操作台）的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因（Zeoᴿ）。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 （3）从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 3．（2025·浙江·1月高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    （1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要__________________。 （2）若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 （3）为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________（A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有________功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与____________________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】（1）密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 （2）C （3）预冷的体积分数为95%的酒精 D 调控 （4）基因数据库/序列数据库 表达载体 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1） 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2） 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。（3） 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4） 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C符合题意； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2序列位于模板链上，从左向右为5’→3’，引物P3与P4的序列从右向左为5’→3’， 以环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P2和P3，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·浙江·1月高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： （1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 （2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。 （3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 （4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。 注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。 【答案】（1）根 解旋酶 磷酸基团 变长 （2）DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢 （3）划线分离 振荡培养 （4）梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 【解析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 锌转运蛋白基因M、N克隆 PCR技术扩增目的基因 PCR的原理是DNA分子的复制，包括变性、复性、延伸过程，变性过程类似于体内的解旋酶解旋的过程，利用高温将双链DNA解开 重组表达载体构建 基因表达载体的构建过程 利用限制性内切酶处理后的质粒和目的基因具有黏性末端或者平末端，用DNA连接酶进行连接 转基因酵母功能鉴定 目的基因的检测与鉴定 检测目的基因，需要区分出空白的受体细胞、导入目的基因的受体细胞和导入空白载体的受体细胞 （2）逻辑推理与论证 【解析】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。 （2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于PCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。 （3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。 （4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量多，说明N转运Zn2+能力更强。 5．（2024·浙江·1月高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示） 回答下列问题： （1）F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生______，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行______和______。 （2）从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第______泳道和第______泳道。 （3）g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______，则g和f是非等位基因；若杂交结果是______，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示） （4）确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______。 【答案】（1）编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 （2） 3 2 （3） 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1 （4） 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 【解析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 mRNA提前出现终止密码子 基因突变对性状的影响 基因的编码区插入DNA片段，引起基因产生编码序列错位，导致mRNA提前出现终止密码子，合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性 DNA片段位置判断 PCR及电泳 野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢 （2）逻辑推理与论证 【解析】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。 （2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。 （3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。 （4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。 6．（2023·浙江·6月高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： （1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 （2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 【答案】（1）负反馈调节 过量赖氨酸类似物 （2）基因数据库 融合 核受体细胞 激活 桑椹胚或囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 【解析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。 （2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 7．（2022·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下： （1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。 （2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。 （二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。 （4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。 （6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 【答案】（1）无菌水 活化 离心 破碎 （2）其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液 （3）灭菌 资源化 （4）逆转录 核酸探针 （5）抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 （6）脾 动物血清 【解析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 （1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。 （2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。 （3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。 （4）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。 （6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。 【点睛】本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。 8．（2021·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。 （1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。 （2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。 （3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。 （二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。 （4）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。 （5）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。 （6）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 【答案】 涂布分离 单菌落 筛选 未固定的细菌 降解富营养化污水污染物的能力 包埋法和吸附法 特定介质能为菌株繁殖提供X 遗传 间种 DNA聚合酶 愈伤组织 继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 【解析】1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。 1、固定化酶（ insoluble enzyme）就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。 2、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。 3、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。 （一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。 （1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。 （2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。 （3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。 （二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。 （2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。 （3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 【点睛】本题考查了特定微生物的分离、固定化技术及基因工程、植物组织培养的应用等相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，准确判断问题的能力。 9．（2020·浙江·7月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题： （1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。 （2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。 （4）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。 （5）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。 （6）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。 【答案】 澄清度 95%乙醇 较小 抽滤 细菌悬液 灭菌 较小 粘性 抗性基因 全能性表达充分 显微注射 短 脱分化 生长素 根的分生组织 B 【解析】发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。 生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。 （一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。 （2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。 （二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。 （2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。 （3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。 【点睛】本题主要考查果胶的降解、基因工程及植物克隆知识，要求学生熟悉教材，并能将理论知识与实际应用相结合。 10．（2020·浙江·1月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与泡菜制作有关的问题： （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。 （6）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （7）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。 【答案】 果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生 【解析】泡菜制作： ①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。 （一） （1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。 （2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。 （3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。 （4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。 （二） （1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。 （2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。 （3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。 【点睛】本题考查选修教材中的相关知识，在学习本部分内容时，要求考生对所学知识进行对比、归纳，然后建立知识间的联系，做到夯实基础，学会融会贯通。 11．（2019·浙江·4月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与果胶和果胶酶有关的问题： （1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为______。 （2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行______。 （3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使______。果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入______。使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。 （4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有______和可连续处理等。在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有______和______。 （二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 （6）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A.质粒载体  B.转录产物  C.抗性基因  D.病原微生物）。 （7）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 （8）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。 【答案】 腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离（或划线分离） 水果组织软化疏松及细胞受损 95%乙醇 提高果胶酶的稳定性 固定化的方法 固定化所用的介质 单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养 【解析】（一）果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散；果胶不溶于乙醇，是鉴别果胶的一种简易方法。 （二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。 （一） （1）腐烂的水果通常细胞壁被分解较多，所以含有能产生果胶酶的微生物较多； （2）获取单菌落的方式有划线分离法和涂布分离法两种，本题中两种方式均可； （3）果胶酶的作用是水解果胶，果胶位于植物细胞壁中，故水解果胶会使得水果组织软化疏松及使细胞受损；果胶不溶于酒精，故提取回收果胶需要使用95%乙醇，使果胶形成絮状物回收； （4）固定化的果胶酶在处理含果胶的污水时，可提高果胶酶的稳定性并可连续处理；在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的因素有固定化的方法和固定化所用的介质。 （二） （1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因； （2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B； （3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选； （4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。 【点睛】本题考察①果胶和果胶酶的性质以及果胶酶的固定；②基因工程以及变异品种的筛选，考察学生对课本知识的理解和题干的阅读能力，考查理解能力和科学思维能力。在变异品种的筛选中，要求获得的是抗致病真菌能力强的细胞，则只加入致病真菌只能筛选具有抗致病真菌能力的细胞，需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，则需要添加高浓度的致病真菌，这对考查学生对筛选培养基的理解有一定的要求。 12．（2018·浙江·4月高考真题）回答下列（一）、（二）小题： （一）回答与果胶、淀粉等提取和利用有关的问题： 某植物富含果胶、淀粉、蛋白质和纤维素成分。某小组开展了该植物综合利用的研究。 （1）果胶提取工艺研究结果表明，原料先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率（提取得到的果胶占原料质量的百分率）显著高于常温水漂洗的果胶得率，最主要原因是沸水漂洗_______ （A．有助于清洗杂质和去除可溶性糖  B．使植物组织变得松散  C．使有关酶失活  D．有利细胞破裂和原料粉碎制浆）。 （2）在淀粉分离生产工艺研究中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂（乳酸菌菌液），其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用_______，进行单菌落分离，然后将其_______，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。 （3）在用以上提取过果胶和淀粉后的剩渣加工饮料工艺研究中，将剩渣制成的汁液经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，发现仍存在浑浊和沉淀问题,可添加_______使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加_______，以解决汁液浑浊和沉淀问题。 （4）在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的_______（答出2点即可）、反应液pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过_______来调节。 （二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题。 （1）将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR I酶切，在切口处形成_______。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接。在两个片段相邻处形成_______，获得重组质粒。 （6）已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_______实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_______，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。 （7）取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_______，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_______形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_______（答 2点即可）。 【答案】 C 划线分离法（或涂布分离法） 扩大培养 果胶酶和果胶甲酯酶 淀粉酶使淀粉分解 固定化酶的量、反应液温度 控制反应器液体流量（或体积） 黏性末端 磷酸二酯键 转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数 【解析】试题分析：熟记并理解酶的研究与应用、微生物的实验室培养与分离、基因工程的基本操作程序、植物组织培养技术等相关基础知识，形成清晰的知识网络。在此基础上，从题意中提取有效信息并对相关的问题情境进行作答。 （一）（1）沸水漂洗，因高温会破坏蛋白质的空间结构，进而使有关酶失活，C正确，A、C、D均错误。     （2）为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用划线分离法（或涂布分离法）进行单菌落分离，然后将其扩大培养，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。     （3）蛋白酶和纤维素酶可分别催化蛋白质和纤维素分解。在将以上提取过果胶和淀粉后的剩渣制成的汁液，经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，仍存在浑浊和沉淀问题，说明该汁液中仍有少量的果胶和淀粉，可添加果胶酶和果胶甲酯酶使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加淀粉酶使淀粉分解，以解决汁液浑浊和沉淀问题。    （4）在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的固定化酶的量、反应液温度、反应液pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过控制反应器液体流最（或体积）来调节。    （二）（1） 用限制性核酸内切酶EcoR I酶切含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121，可在切口处形成黏性末端。用DNA连接酶连接含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121，可在两个片段相邻处形成磷酸二酯键，获得重组质粒。 （2） 取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是：使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。 （3）在进行植物组织培养时，取田间不同品种水稻的幼胚，先进行消毒，以清除其表面附着的微生物；然后接种到培养基中培养，幼胚发生脱分化形成愈伤组织，并进行继代培养。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及水稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。 考点4 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（2026·浙江·1月高考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【解析】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误； B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误； C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误； D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 故选D。 2．（2018·浙江·4月高考真题）将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，这种导入外源基因的方法属于 A．杂交育种 B．转基因技术 C．单倍体育种 D．多倍体育种 【答案】B 【解析】基因工程又叫转基因技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 将一种生物的基因导入另一种生物体内需要采用基因工程技术。因此，将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，需要采用转基因技术，这样可以培育出在冬天也能长期保存的西红柿。 故选B。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $