专题14 基因工程（3年汇编）（广西专用）2024-2026年高考生物真题分类汇编

专题14 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 广西考情 命题规律 考点2 基因工程综合 2025广东（1题）、2025广西（1题）、2024广西（1题） · 情境设置：结合工业菌株、肿瘤治疗和动物模型等真实应用。 · 考查重点：基因表达调控、重组细胞构建及转基因实验分析。 · 命题趋势：突出基因工程与医学、工业及实验探究的综合融合。 考点1 基因工程综合 1．（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】（1）EcoR Ⅰ、Not Ⅰ （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 【解析】1、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。 1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，表达CAR基因的T细胞能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，可知新的重组质粒中①是CAR序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶1基因序列，④是溶解酶2基因序列。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物______（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是______；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是______。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行______。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是______（至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是______。 【答案】（1）5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 【解析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 1．（2026·广西河池·二模）环境DNA（eDNA）技术是指从环境中提取DNA片段（水生动物细胞DNA），经扩增后进行DNA测序，常用于测定某一水域中鱼类的物种丰富度。下列叙述正确的是（　　） A．不同种类的鱼的所有DNA序列完全不同 B．与传统捕捞法相比，该方法更易检出稀有物种 C．eDNA的基本骨架由磷酸、脱氧核糖与碱基构成 D．扩增的序列不能太长，否则可能会高估物种丰富度 【答案】B 【解析】A、不同种类的鱼属于不同物种，但存在同源的保守DNA序列，比如控制呼吸相关酶合成的基因序列相似度较高，A错误； B、传统捕捞法对种群数量极低的稀有物种捕获概率很低，而eDNA技术只需提取水域中稀有物种脱落的少量DNA即可完成检测，因此更易检出稀有物种，B正确； C、DNA的基本骨架由磷酸和脱氧核糖交替连接构成，碱基排列在双螺旋结构内侧，不属于基本骨架的组成，C错误； D、环境中的eDNA多为降解后的短片段，若扩增的序列太长，很多物种的eDNA无法被成功扩增，会导致检测到的物种数少于实际值，低估物种丰富度，D错误。 2．（2026·广西南宁·二模）几丁质酶是一类糖苷水解酶，可有效降解病原生物中的几丁质，在农作物病虫害防治中具有广泛应用前景。科研人员利用蛋白质工程技术对源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶进行改造：保留氨基端功能区域，同时在其羧基端融合陆生真菌几丁质结合保守域。改造后的几丁质酶与几丁质的结合能力显著提升，酶活性和抑菌能力也明显增强。下列相关说法错误的是（　　） A．几丁质和几丁质酶均属于以碳链为骨架的生物大分子 B．几丁质酶的结构差异取决于氨基端和羧基端之间氨基酸的连接方式 C．上述对几丁质酶的改造实质是改造溶珊瑚弧菌相关基因的结构 D．用几丁质酶取代杀虫剂应对农作物病虫害可有效避免生物富集 【答案】B 【解析】A、几丁质属于多糖，几丁质酶属于蛋白质，二者都是以碳链为骨架的生物大分子，A正确； B、所有蛋白质中氨基酸之间的连接方式都是通过肽键相连，蛋白质结构差异取决于氨基酸的种类、数目、排列顺序，以及肽链盘曲折叠形成的空间结构，并非氨基酸的连接方式，B错误； C、蛋白质工程改造蛋白质的实质是改造编码蛋白质的基因结构，C正确； D、化学杀虫剂难以降解，会沿食物链发生生物富集，几丁质酶本质是蛋白质，可被生物降解，取代杀虫剂能避免生物富集，D正确。 故选B。 3．（2026·广西·模拟预测）微生物DNA分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列 甲基化前 甲基化后 TaqⅠ 5'-T↓CGA-3' 切割 不切割 DpnⅠ 5'-GA↓TC-3' 不切割 切割 ClaⅠ 5'-AT↓CGAT-3' 切割 不切割 BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' 切割 切割 A．DNA腺嘌呤的甲基化并不会改变生物基因的碱基序列 B．限制酶ClaⅠ所识别的酶切位点，也能被限制酶TaqⅠ识别并切割 C．用表格中四种限制酶分别处理同一DNA片段，甲基化后可被切割的位点总数，不一定比甲基化前少 D．限制酶切割的特异性由其识别的碱基序列决定，与碱基修饰无关 【答案】D 【解析】A、DNA腺嘌呤的甲基化属于表观遗传修饰，仅在腺嘌呤分子上连接甲基基团，不会改变基因的碱基排列序列，A正确； B、限制酶ClaⅠ的识别序列为5'-ATCGAT-3'，该序列中包含TaqⅠ的识别序列5'-TCGA-3'，无甲基化修饰时该位点可被TaqⅠ识别并切割，B正确； C、若处理的DNA片段仅含DpnⅠ的识别位点，甲基化前DpnⅠ无法切割，甲基化后可正常切割，此时甲基化后可被切割的位点总数多于甲基化前，因此总数不一定比甲基化前少，C正确； D、由表格可知，TaqⅠ、DpnⅠ、ClaⅠ对相同碱基序列的切割情况随腺嘌呤甲基化发生改变，说明限制酶切割的特异性不仅和识别的碱基序列有关，也与碱基修饰有关，D错误。 4．（2026·广西河池市高级中学·模拟预测）根据材料回答问题： 材料一：科学家研究发现新型冠状病毒S蛋白（Spike protein，棘突蛋白）可与宿主细胞的病毒受体结合，是决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。 （1）以S蛋白作为______ 可制备单克隆抗体生产快速检测新冠病毒的试剂盒。单克隆抗体制备过程中有两次筛选，第一次筛选的目的是得到 ______________________的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞还需进行_____________________________________，经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 材料二：新型冠状病毒核酸检测采用荧光定量PCR仪，通过检测荧光信号的累积（以Ct值表示）来确定样本中是否有病毒核酸。新冠病毒的遗传物质为RNA，科学家先将病毒RNA逆转录，再将得到的cDNA进行多聚酶链式反应扩增得到了大量DNA片段（如图所示）。 （2）在上述技术中，用到的酶有_______________________________（至少写出两种）。 （3）科学家已测出新冠病毒的核酸序列，据图分析，Ⅰ、Ⅱ过程需要根据病毒的核苷酸序列设计 __________。过程Ⅱ中以cDNA为模板经过_____________________三步循环扩增得到多个DNA片段，第____次复制后就能获得两条链等长的DNA序列 。 （4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述PCR过程，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的靶基因越多，观察到的 Ct值就越 _____________。 【答案】 抗原 既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体 克隆化培养和抗体检测 逆（反）转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、热稳定DNA聚合酶（Taq或耐高温的TaqDNA聚合酶）、核酸酶 引物 变性、复性、延伸 一 强 【解析】单克隆抗体的制备： （1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞； （2）获得杂交瘤细胞 ①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合； ②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。 （3）克隆化培养和抗体检测。 （4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。 （5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。 PCR技术： 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 1、原理：DNA复制。 2、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 1、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 （1）由于S蛋白是决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白，所以可以以S蛋白作为抗原制备单克隆抗体生产快速检测新冠病毒的试剂盒，单克隆抗体制备过程中有两次筛选，第一次筛选的目的是得到既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞还需要经过克隆化培养和抗体检测。 （2）从图中看出有逆转录的过程所以有逆转录酶、同时进行PCR技术，所以有热稳定DNA聚合酶（Taq或耐高温的TaqDNA聚合酶）、和核酸酶。 （3）PCR技术中需要根据病毒的核苷酸序列设计引物，PCR的过程是经过变性、复性、延伸三步循环扩增得到多个DNA片段，由于DNA分子进行半保留复制，所以第一次复制后就能获得两条链等长的DNA序列。 （4）由于Ct值表示荧光信号的累积，来确定样本中是否有病毒核酸，因此扩增出来的靶基因越多Ct值就越强。 【点睛】本题考查单克隆技术和PCR技术，识记各个实验操作的步骤是解题的关键，理解Ct值的含义进行分析。 5．（2026·广西河池市高级中学·模拟预测）新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎疫情，对我国民生健康和经济造成极大影响。新型冠状病毒相关的实验室检测技术，对新型冠状病毒的诊断与防控尤为重要。新型冠状病毒的检测最常见方法的是荧光定量RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应），RT-PCR的具体过程如图。回答下列问题： （1）过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是_______________，________________。 （2）RT-PCR过程通过对_____________的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。 （3）过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要_______个引物B。 （4）新型冠状病毒的检测方法还可采用病毒抗原检测、病毒抗体检测，这些检测方法的原理是_____________。检测到新冠病毒感染者抗体滞后于病毒核酸和抗原的理由是____________________________________，因此__________检测对传染性极高的新型冠状病毒（2019 - nCoV）疑似患者早期确诊意义不大。 【答案】 逆（反）转录酶 热稳定性高的DNA聚合酶（Taq酶） 温度（或温度、pH） 2n-1 抗原和抗体发生特异性结合 病毒进入人体后，刺激人体免疫系统产生相应的抗体需要一段时间 病毒抗体 【解析】1、分析图示，过程I是由mRNA形成cDNA的过程，表示逆转录。过程Ⅱ先使mRNA-cDNA杂合双链解开，再以单链的DNA合成双链的DNA，最后利用RCR技术进行DNA复制。 1、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变形原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，DNA分子体内复制过程DNA的解旋是在解旋酶的作用下实现的；PCR扩增DNA片段过程最高经过n次扩增，形成的DNA分子数是2n个，其中只有2条单链不含有引物。 （1）过程I是由mRNA形成cDNA的过程，表示逆转录过程，需要加入逆转录酶，过程Ⅱ是PCR过程，需要加入热稳定性高的DNA聚合酶（Taq酶）。 （2）RT-PCR过程通过对温度的控制影响确的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。 （3）过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n-1个引物B。 （4）新型冠状病毒的检测方法还可采用病毒抗原-抗体检测，其原理是抗原和抗体发生特异性结合。病毒进入人体后，刺激人体免疫系统产生相应的抗体需要一段时间，故检测到新冠病毒感染者抗体滞后于病毒核酸和抗原，因此病毒抗体检测对传染性极高的新型冠状病毒疑似患者早期确诊意义不大。 【点睛】本题考查了基因工程和PCR技术及其应用过程，对于RNA的逆转录、DNA分子复制、多聚酶链式反应扩增DNA片的理解把握知识点间的内在联系及碱基互补配对原则的应用是解题的关键。 6．（2026·广西南宁·二模）小麦条锈病是由条形柄锈菌引起并主要危害小麦叶片的真菌病害。科研人员拟将广谱抗病Yr15基因（编码WTK1蛋白）和Ti质粒构建成重组质粒，再通过其他基因工程技术培育出抗条锈病的小麦新品种。Yr15基因和Ti质粒的部分结构以及限制酶的识别序列和酶切位点如图所示，回答下列问题： （1）据图分析，需选用SmaⅠ对目的基因进行完全酶切，再选择SmaⅠ和_______对Ti质粒进行完全酶切，该限制酶切割后会产生黏性末端，可以使用_______酶将黏性末端补平为平末端，最后利用DNA连接酶构建成重组质粒。经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用SmaⅠ和SpeⅠ进行完全酶切并电泳检测出两条条带，若较短的电泳条带长度为_______bp，则是正向重组质粒。 （2）科研人员对某株抗条锈病小麦的核基因进行检测后发现，其Yr15基因存在多位点插入现象（如图2所示）。该株小麦自交后，能稳定遗传的抗条锈病子代的比例为______。注：图中仅展示含Yr15基因的染色体。（不考虑交叉互换、基因突变和染色体变异）。 （3）某实验小组欲通过WTK1蛋白的氨基酸序列推导获得Yr15基因的碱基序列，结果发现推导所得的碱基序列与Yr15基因的实际碱基序列存在差异，原因是_______（答出2点即可）。 （4）推广抗条锈病小麦可减少化学农药的使用，但若长期大面积种植抗条锈病小麦，条形柄锈菌种群对WTK1蛋白的抗性基因频率会_______。为避免或有效延缓该过程，在同一地块的同一生长季内，可采用的种植策略是________（答出1点即可）。 【答案】（1）XbaⅠ DNA聚合 400（bp） （2）37/64 （3）密码子具有简并性，一种氨基酸可对应多种密码子；基因存在非编码序列，通过氨基酸序列反向获得的DNA序列中不含有启动子、终止子以及终止密码子对应的DNA序列 （4）上升 将抗条锈病小麦与普通小麦混合种植（间作）【将不同抗病基因的小麦品种混合种植】 【解析】（1）要将目的基因插入Ti质粒的启动子和终止子之间，用SmaⅠ酶切目的基因后，需选择SmaⅠ和Ti质粒上SmaⅠ上游的黏性末端限制酶（XbaⅠ）双酶切Ti质粒；黏性末端补平为平末端需要DNA聚合酶填补单链缺口；DNA聚合酶只能从3'端延伸子链，PstⅠ酶切后黏性末端的突出端为3'端，无法用DNA聚合酶进行抹平。 图1中目的基因的上方链为模板链，也就是基因右侧应靠近启动子，在Ti质粒上Sma Ⅰ位点靠近终止子，若目的基因正向插入Ti质粒中，SpeⅠ距离终止子侧的SmaⅠ位点为400bp，因此SmaⅠ和SpeⅠ酶切后，较短条带为400bp。 （2）图2所示3对同源染色体中每对只有一条有Yr15基因，稳定遗传的抗条锈病子代必须至少有一对同源染色体是Yr15基因纯合（其余的可以是杂合）。自交情况下，依据分离定律，每对同源染色体的子代Yr15基因纯合占比为1/4（能稳定遗传），其余为3/4（不能稳定遗传），所以子代不能稳定遗传的=3/4×3/4×3/4=27/64，则能稳定遗传的抗条锈病子代的比例=1-27/64=37/64。 （3）通过WTK1蛋白的氨基酸序列推导获得Yr15基因的碱基序列，结果发现推导所得的碱基序列与Yr15基因的实际碱基序列存在差异，可能的原因有：密码子具有简并性，同一种氨基酸对应多种密码子，因此根据氨基酸推导的碱基序列不唯一；通过氨基酸序列反向获得的DNA序列中不含有启动子、终止子以及终止密码子对应的DNA序列。 （4）长期大面积种植抗条锈病小麦，条形柄锈菌种群中对WTK1蛋白具有抗性的个体容易生存下来并繁殖后代，导致抗性基因频率会上升；为避免或有效延缓该过程，在同一地块的同一生长季内，可采用的种植策略是通过将抗条锈病小麦与普通小麦混合种植（将不同抗病基因的小麦品种混合种植）等策略，延缓抗性基因频率升高。 7．（2026·广西河池·二模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如下图），为环境污染治理提供新方法。请回答: （1）Pc和Ps启动子可被________酶识别并结合后驱动基因的表达。分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活_______启动子进一步促进相关基因的表达。表达载体上连接mrfp基因的目的是________。 （2）水杨酸羟化酶可催化水杨酸分解。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的_____、_____（填字母）位点。 （3）科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是_______。诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其________特性仍然存在。 （4）结果显示该智能工程菌的检测灵敏度未达到预期，为提升nahR蛋白对水杨酸的亲和力，科研人员计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，请按正确顺序排列:_______。 ①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ②采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ③推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 【答案】（1）RNA聚合酶 PS 表达红色荧光蛋白，通过红色荧光检测水体中的水杨酸 （2）C B （3）刺激小鼠免疫系统产生能分泌抗nahR蛋白抗体的B淋巴细胞 抗原 （4）①③②④ 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，所以Pc和Ps启动子可被RNA聚合酶识别并结合后驱动基因的表达。从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸 - 调控蛋白复合物可激活Ps启动子，进一步促进相关基因的表达。因为mrfp基因是红色荧光蛋白基因，所以表达载体上连接mrfp基因的目的是作为报告基因，表达红色荧光蛋白，通过红色荧光检测水体中的水杨酸。 （2）已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效。为保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入受水杨酸调控的Ps启动子之后，即图中的C位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白；当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入不受水杨酸调控的Pc启动子控制的区域，所以应插入B位点。 （3）特定抗原可诱导机体产生特定的B细胞，进而产生特异性抗体，故制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是刺激小鼠免疫系统产生能分泌抗nahR蛋白抗体的B淋巴细胞；诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其抗原结构未被破坏，其特性依然存在。 （4）蛋白质工程是按照相反的思路进行的，确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→基因中的碱基序列，可以创造自然界不存在的蛋白质：①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构→③推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点→②采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列→④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性。所以相关步骤正确排列顺序为：①③②④。 8．（2026·广西河池·一模）溶瘤病毒是极具潜力的抗肿瘤工具。新城疫病毒（NDV）天然具有靶向裂解肿瘤、对正常细胞无感染性的特点，是研发溶瘤病毒的理想载体。科研团队将猪α1，3半乳糖基转移酶（α1，3-GT）基因插入NDV基因组，构建重组溶瘤病毒（NDV-GT）（见下图1），NDV-GT通过直接溶瘤、超急性排斥反应和免疫激活的三重机制发挥抗肿瘤作用。结合该研究及基因工程相关知识，回答下列问题： （1）采用PmeⅠ限制性内切酶对NDV LaSota株质粒进行单酶切获得线性化NDV载体，若直接用DNA连接酶将线性化NDV载体与α1，3-GT基因连接构建重组载体，常因_________（答出两点）等问题导致构建成功率极低，因此科研团队采用重叠延伸PCR同源重组法构建重组质粒。 （2）科学家将α1，3-GT基因与线性化NDV载体进行重叠延伸PCR同源重组，形成重组NDV-GT质粒。重叠延伸PCR引物必须按照载体与基因序列设计，引物是一小段_________________________________。 为了使α1，3-GT基因与线性化NDV载体形成重叠序列，图中特异性引物2．3的设计原则是：_________。 （3）该表达载体采用双启动子/双终止子设计，一套驱动NDV_________的转录以保障病毒复制与增殖能力，维持溶瘤活性；另一套驱动_________的转录，实现抗肿瘤基因的高效稳定表达。 （4）科研团队构建食蟹猴原发性肝癌模型以验证重组溶瘤病毒的疗效，实验中用到的食蟹猴为动物体细胞克隆猴，由于同一个体的体细胞克隆出的后代_________，用于药物对照实验能够更准确地评估药效。 【答案】（1）载体自身重新环化、目的基因反向插入载体、多个目的基因插入同一载体 （2）一小段能与模板链互补配对的短单链核酸 引物2（扩增载体的引物）携带目的基因的同源序列，引物3（扩增目的基因的引物）携带载体的同源序列 （3）自身复制必需的核心基因 目的基因α1,3−GT （4）核遗传物质（基因型）基本一致 【解析】（1）单酶切后，载体和目的基因的末端均为相同的黏性末端，连接时容易出现载体自身重新环化、目的基因反向插入载体、多个目的基因插入同一载体这些问题，导致重组载体构建成功率极低。 （2）根据PCR技术的基本原理，引物是一小段能与模板链互补配对的短单链核酸，多数为DNA、少数为RNA；重叠延伸PCR需要两个PCR产物产生重叠同源序列才能后续重组，因此需要引物2（扩增载体的引物）携带目的基因的同源序列，引物3（扩增目的基因的引物）携带载体的同源序列，保证扩增后两个片段末端有互补重叠区。 （3）双启动子/双终止子分别驱动两类基因：一套驱动病毒（NDV）自身复制必需的核心基因的转录，保证病毒的复制增殖和溶瘤活性；另一套驱动插入的目的基因α1,3−GT的转录，保证目的基因正常表达，发挥抗肿瘤作用。 （4）体细胞克隆属于无性繁殖，同一个体的体细胞克隆获得的后代核遗传物质（基因型）基本一致，可以排除个体遗传差异对药物实验的干扰，让实验结果更准确。 9．（2026·广西桂林·模拟预测）研究人员构建了含绿色荧光蛋白基因（GFP）、抗肿瘤活性蛋白C基因、温敏型转录抑制蛋白T基因的基因表达载体，如图所示，并将其导入受体菌，获得工程菌，用于癌症精准治疗。分析回答下列问题： 注：P1启动子为温度诱导型启动子（在温度达到42℃时才会启动下游基因的转录）；P2启动子为持续表达型启动子；表示抑制。 （1）在基因表达过程中，启动子发挥着_______的作用；除了图9中所含元件外，表达载体还必须具有_______________等元件。（请写出2种） （2）据图9分析，将GFP基因与C基因共享启动子的目的是_______；在37℃，几乎检测不到荧光强度，其原因是_____________。 （3）研究人员筛选出3种温敏型转录抑制蛋白T基因（T1、T2、T3），构建好表达载体后导入受体菌，检测在不同温度下的荧光强度，结果如图所示。最终选择T3来构建工程菌的理由是_______________。 （4）有学者认为：从生物安全角度，该技术可能引发“基因污染”。请提出一条改造上述表达载体，解决“基因污染”的思路_______________。 【答案】（1）结合RNA聚合酶，驱动基因转录 复制原点、标记基因、限制酶酶切位点（答2点即可） （2）让两个基因同时表达，通过荧光强度检测反映C基因的表达量； 37℃时，蛋白T形成二聚体，与启动子结合抑制了其下游GFP基因的转录 （3）37℃下T3荧光强度很低，蛋白C表达少，安全性高，而在42℃下T3荧光强度提高倍数最大，蛋白C表达多，灵敏度高 （4）在表达载体中增加一个受温度诱导的裂解基因（或“自毁基因”），当工程菌完成抗肿瘤蛋白释放后（C蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时），通过二次升温使其自我清除 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。基因表达载体的基本组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等；图9中已经存在启动子、终止子，还需要复制原点、标记基因、限制酶酶切位点。 （2）从图示看，P1是温度诱导型启动子，只在42°C激活；GFP和C基因共用P1，意味着它们同步表达，这样GFP可作为报告基因，通过荧光强度检测反映C基因的表达量。在37°C时，T蛋白形成二聚体，与P1启动子结合抑制GFP和C基因转录，因此无荧光。 （3）T1：37°C和42°C下荧光强度差异小 ，说明菌株T1在不同温度下的蛋白C表达量无差异， 灵敏度不高。 T2：37°C下有部分荧光，说明菌株T2在37°C下抑制蛋白C表达的作用太弱。 T3：37℃下T3荧光强度很低，蛋白C表达少，安全性高，而在42℃下T3荧光强度提高倍数最大，蛋白C表达多，灵敏度高，故选择T3来构建工程菌。 （4）在表达载体中增加一个受温度诱导的裂解基因（或“自毁基因”），当工程菌完成抗肿瘤蛋白释放后（C蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时），通过二次升温使其自我清除，从而解决“基因污染”。 10．（2026·广西·模拟预测）虾青素是一种强效、高效的天然抗氧化剂，在医药、化妆品和饲料行业应用广泛。雨生红球藻是天然虾青素的最佳生物来源，但是野生藻株存在虾青素产量低、易受环境胁迫（如氧化应激）影响生长、发酵后菌体与产物分离困难等问题。科研人员拟通过基因工程改造，获得高产虾青素、高抗逆、可诱导沉降的工程藻株。请回答下列问题： （1）科研人员对雨生红球藻进行活化培养。配制培养基，经________灭菌冷却后接种，置于摇床振荡实现扩大培养。 （2）研究发现，bkt基因编码的β-胡萝卜素酮化酶，是雨生红球藻合成虾青素的关键酶。为提高虾青素产量，科研人员利用定点突变技术改造bkt基因，获得bkt*基因（表达的β-胡萝卜素酮化酶催化效率更高）。在设计bkt*基因的碱基序列时，需先从___________出发，推测所需基因的碱基序列。 （3）为解决雨生红球藻“抗逆性”的问题，科研人员使用RT-PCR技术，以马尔尼菲青霉菌的RNA为模板通过多个反应获得SKN7基因的cDNA。该反应过程需要的酶有____________。在PCR反应体系中需设置一组空白对照（使用无菌水代替模板DNA），目的是_______。 （4）为构建工程藻，科研人员将含bkt*和SKN7调控元件的表达载体导入雨生红球藻中。 ①常用的导入方法有：方法甲——农杆菌介导转化，方法乙——基因枪转化（通过高速微弹将包裹的DNA直接送入细胞）。若要将外源基因导入雨生红球藻的叶绿体基因组，使其在叶绿体内稳定复制和表达，则应选用方法______（填“甲”或“乙”）。 ②若将表达载体分别导入工程藻的核基因组和叶绿体基因组，在相同培养条件下，后者虾青素产量更高，原因是__________。 （5）研究表明，gla基因（胞外多糖合成关键基因）高表达可使细胞分泌多糖、彼此黏连并快速沉降，便于产物分离。为解决发酵后菌体和产物分离困难的问题，科研人员在工程藻中引入蓝光激活系统，并在其基因组中插入两个E基因（如图甲），使gla基因的表达受到蓝光调控（调控原理见图乙）。请分析在工程藻的基因组DNA中插入两个E基因的意义是：_________。 【答案】（1）高压蒸汽灭菌法或湿热灭菌法 （2）预期的蛋白质功能 （3）逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶/逆转录酶、RNA酶和耐高温的DNA聚合酶 检测PCR反应体系是否被污染 （4）乙 叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量 （5）左侧E基因的启动子是CYC，照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活gla基因表达；右侧E基因的启动子是ACT，为组成型表达的弱启动子，使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力 【解析】（1）对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法或湿热灭菌法。 （2）利用定点突变技术改造bkt基因，获得bkt*基因，这是蛋白质工程，首先从预期的蛋白质功能出发，推测所需基因的碱基序列。 （3）以马尔尼菲青霉菌的RNA为模板通过多个反应获得SKN7基因的cDNA，涉及逆转录技术和PCR技术，所以需要逆转录酶（还需要RNA酶水解RNA模板）、耐高温的DNA聚合酶，PCR反应体系中需设置一组空白对照，使用无菌水代替模板DNA，可以检测PCR反应体系是否被污染，如果被污染，则会有产物，如果没有被污染，则不会有产物。 （4）农杆菌介导转化法是利用农杆菌的Ti质粒上的T-DNA片段可以将目的基因转入宿主细胞的染色体上，现要将外源基因导入雨生红球藻的叶绿体基因组，应该选择乙基因枪转化法。 叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量，所以转入叶绿体基因组的虾青素产量更高。 （5）从图中看出：左侧E基因的启动子是CYC，照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活gla基因表达；右侧E基因的启动子是ACT，为组成型表达的弱启动子，使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力。 11．（2026·广西柳州·二模）天然胰岛素在体内易形成二聚体，需解离为单体才能发挥降糖作用，这导致了起效延迟。为解决此问题，科学家利用蛋白质工程对胰岛素进行精准改造，将胰岛素B链第28位上的脯氨酸（Pro）与第29位上的赖氨酸（Lys）互换，进而获得目标胰岛素（INS，长度为330bp）。图1为天然胰岛素B链的部分DNA序列，图2表示利用PCR技术获取目标胰岛素基因的部分过程，图3为pET-INS表达载体构建示意图，图4为凝胶电泳结果图。据图分析，回答下列问题： （1）蛋白质工程构建目标胰岛素需从_________出发。根据图1、图2（黑框代表天然胰岛素B链基因突变位置，R1、R2、F1与F2为对应的引物）综合分析，利用PCR技术获取目标胰岛素基因时，所用突变引物R1和F2对应的序列分别为______（填选项）。 A.3′—ACACACCCAAGACCC—5′    B.5′—GGGTGGGCTTTGTGT—3′ C.5′—ACACAAAGCCCACCC—3′    D.3′—GGGTCTTGGGTGTGT—5′ （2）质粒中启动子的作用是_________。为确保INS正确插入图3的质粒pET-MCS中，经相应酶切割后，质粒pET保留的黏性末端序列应为_______。 （3）将重组质粒pET-INS导入感受态大肠杆菌，并置于含________的培养基中，挑取8个长势良好的单菌落进行PCR扩增以及扩增产物的凝胶电泳，结果见图4.8个条带大小均为330bp左右，说明_______。其中2号菌落条带相较不明显，可能的原因是__________。 （4）为提高在大肠杆菌中目标胰岛素基因的表达量，请从密码子的简并性和偏好性的角度，提出一条可行性强的措施：_______________。 【答案】（1）预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用） BC （2）RNA聚合酶的结合位点，驱动下游基因转录 5′-TA-3′和5′-AGCT-3′ （3）卡那霉素 目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌 目标DNA含量不高 （4）根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）蛋白质工程与基因工程的核心区别在于“逆向设计”——基因工程是从基因到蛋白质（中心法则正向），而蛋白质工程是先明确目标蛋白质的功能需求，再反向推导对应的基因序列。题目中目标胰岛素的核心需求是“不形成二聚体，快速解离为单体发挥降糖作用”，这是改造的核心目的。所以蛋白质工程需从预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用）出发。天然胰岛素B链的碱基序列为： 5′……ACACACCCAAGACCC……3′ 3′……TGTGTGGGTTCTGGG……5′ 突变后，编码第28、29位氨基酸的碱基发生改变（B28为Pro，B29 为Lys），序列变为：5′……ACACAAAGCCCACCC……3′，分析图2的引物方向引物F1和F2是正向引物，与模板链的3′ 端互补，方向为5′→3′。 引物R1和R2是反向引物，与编码链的3′ 端互补，方向为5′→3′。 与突变后的模板链（3′→5′）互补，突变后序列为，因此F2的 5′→3′ 序列为：5′—ACACAAAGCCCACCC—3′ → 对应选项C；引物R1：与突变后的编码链（5′→3′）互补，因此R1的 5′→3′ 序列为：5′—GGGTGGGCTTTGTGT—3′ → 对应选项B。 （2）启动子的作用是RNA聚合酶的结合位点，驱动下游基因转录。目的基因INS插入质粒pET-MCS时，需用相同限制酶切割质粒和目的基因，确保黏性末端互补。图3中目的基因两侧的限制酶为NdeⅠ和HindⅢ（pUC-INS中目的基因两端酶切位点与pET-MCS的MCS区域对应）。限制酶切割规则：NdeⅠ识别序列为CATATG，切割后产生黏性末端5’—TA—3’（CATATG切割位点：C↓ATATG，产生5’—CATATG—3’和3’—GTATAC—5’，黏性末端为5’—TA—3’）；HindⅢ识别序列为AAGCTT，切割后产生黏性末端5’—AGCT—3’（AAGCTT切割位点：A↓AGCTT，产生5’—AAGCT—3’和3’—TTCGA—5’，黏性末端为5’—AGCT—3’）。 （3）图3分析：重组质粒pET-INS中含有的抗性基因是Kan（卡那霉素抗性基因）（Amp基因在酶切过程中被破坏，因目的基因插入MCS区域，而Amp基因可能位于MCS下游或被酶切破坏，需以重组质粒保留的抗性基因为准）。含重组质粒的大肠杆菌能抵抗卡那霉素，因此培养基需添加卡那霉素，淘汰未导入重组质粒的大肠杆菌。图4分析：DNAMarker显示330bp左右的条带为目的基因INS的长度，8个菌落的PCR扩增产物均为330bp，说明目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌（每个单菌落均含重组质粒，PCR扩增出目的基因）。条带亮度反映DNA扩增产物的量，条带不明显说明扩增产物少，可能原因包括：菌落中重组质粒拷贝数低（目标DNA含量不高）；PCR反应中模板DNA加入量不足；菌落培养过程中细菌生长状态差，DNA提取量少。核心原因：最可能是目标DNA含量不高（重组质粒拷贝数低或提取量少）。 （4）目标胰岛素的氨基酸序列固定（需保证功能不变），可利用密码子简并性，将人源胰岛素基因的密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子，提高翻译效率，进而增加表达量。可行性措施为根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列（即密码子优化）。 12．（2026·广西贵港·模拟预测）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒（结构如图甲），并导入受体细胞。用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测受体细胞中蛋白的表达情况，结果如图乙。 请回答下列问题： （1）图甲中，启动子的功能是__________。 （2）为验证J基因已正确插入质粒且方向无误，某同学选用引物F1和R1进行PCR检测。你认为该方案是否合理？___（填“合理”或“不合理”），理由是_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____链（填“a”或“b”）相应部分的序列相同。 （3）图乙中，条带1和条带2分别是用______抗体和______抗体检测的结果。据此判断，条带2所检出的蛋白______（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的，理由是_________。 （4）若想进一步证明条带2对应的蛋白确实由重组质粒上的J基因编码，请设计一个简要的实验思路：______________。 【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA （2）不合理 引物F1和R1都位于J基因的内部，无论J基因是否正确插入质粒，PCR都会扩增出相应片段，无法验证J基因是否正确插入质粒且方向无误。 a （3）抗 J 蛋白 抗 V5 不是 抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2 （4）进行氨基酸序列测定；构建仅含V5编码序列的质粒，导入受体细胞，用抗J蛋白抗体检测 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，从而开启基因的表达过程。 （2）引物F1和R1都位于J基因的内部，无论J基因是否正确插入质粒，PCR都会扩增出相应片段，无法验证J基因是否正确插入质粒且方向无误。图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）图乙用抗 J 蛋白抗体检测，结果出现了条带1和条带2，说明都含有J蛋白 ，用抗V5抗体检测，结果只出现了条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白，则条带2只含有J蛋白。说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 （4）提取条带2对应的蛋白质，进行氨基酸序列测定，与J基因编码的氨基酸序列进行比对；或者构建仅含V5编码序列的质粒，导入受体细胞，用抗J蛋白抗体检测，观察是否出现条带2（排除V5序列的干扰）。 13．（2026·广西崇左·二模）Cre-loxP系统表达的Cre酶可将两个同向loxP序列之间的基因片段切除，其作用机制如图1所示。ATF4基因与肝脏代谢疾病的发生密切相关。为探究该基因的作用，研究人员使用Cre-loxP系统对小鼠肝脏的ATF4基因进行特异性敲除。回答下列问题： （1）Cre酶与基因工程常用的工具酶_____（答出2种）的作用效果相似。设计loxP序列时，应确保使用的loxP序列不能编码蛋白，目的是_____（答出1点）。 （2）研究人员制备了质粒甲（含有启动子和Cre基因）、质粒乙（含有同向loxP序列、ATF4基因序列及ATF4基因上下游序列），将其分别导入不同小鼠体内并培育成品系①、品系②，从两种小鼠的杂交子代中选育目标小鼠品系③，各品系小鼠如图2所示。当两个DNA分子含有相似（或相同）序列时，可发生基因重组，类似同源染色体联会时发生的交换，即同源重组替换，ATF4基因上下游序列可用于同源重组替换。 ①质粒甲中的启动子能被肝细胞特有的转录因子识别，目的是_____。 ②两种质粒不能同时导入同一小鼠胚胎细胞中，理由是_____。 （3）loxP序列和ATF4基因序列长度如图3所示，其中bp表示碱基对。为检测ATF4基因敲除效果，从小鼠的不同类型细胞中提取DNA后，用引物P1和P2进行PCR扩增和电泳检测。请将图4中相应的条带涂黑，表示成功制备模型小鼠的检测结果。 （4）上述模型小鼠可应用于肝脏疾病研究，但开展实验需要大量的模型小鼠。某同学认为核移植技术是获得大量模型小鼠的有效途径，你是否支持该观点？请说明理由：_____。 【答案】（1）限制酶、DNA连接酶 避免loxP序列对其他基因的功能或细胞的代谢或动物的表型或正常的生命活动造成影响 （2）使小鼠仅在肝细胞中表达Cre酶（或保证Cre-loxP系统对小鼠肝脏的ATF4基因进行特异性敲除） 质粒甲表达的Cre酶可使质粒乙中的ATF4基因被敲除，不能达到敲除肝细胞中ATF4基因的目的 （3） （4）不支持，核移植技术的技术流程复杂（成本高）、成功率低，且绝大多数克隆动物存在健康问题；不支持，通过品系①和②杂交获得模型小鼠的操作更为简便；支持，核移植技术能培育出细胞核遗传背景完全一致的模型小鼠 【解析】（1）Cre酶能切割并连接DNA片段，故与基因工程常用的工具酶限制酶、DNA连接酶的作用效果相似。设计loxP序列时，确保其不能编码蛋白，目的是避免loxP序列对其他基因的功能或细胞的代谢或动物的表型或正常的生命活动造成影响。 （2）实验目的是使用Cre-loxP系统对小鼠肝脏的ATF4基因进行特异性敲除，意味着只敲除肝脏细胞中的ATF4基因，其他细胞中的ATF4基因不被切除，故使用的质粒甲中的启动子使小鼠仅在肝细胞中表达Cre酶。若两种质粒同时导入同一小鼠胚胎细胞中，质粒甲表达的Cre酶可使质粒乙中的ATF4基因被敲除，不能达到敲除肝细胞中ATF4基因的目的。 （3）根据loxP序列和ATF4基因序列长度，用引物P1和P2进行PCR扩增，成功制备模型小鼠时，肝脏细胞中ATF4基因被敲除，电泳条带应与标准对照中肝脏对应的条带一致，即心脏、脾脏、肾脏对应的条带为标准对照中的条带，肝脏对应的条带为涂黑的210bp条带：。 （4）不支持该观点，核移植技术的技术流程复杂（成本高）、成功率低，且绝大多数克隆动物存在健康问题。不支持，通过品系①和②杂交获得模型小鼠的操作更为简便；支持，核移植技术能培育出细胞核遗传背景完全一致的模型小鼠 14．（2026·广西·一模）将红色荧光蛋白（dsred2）基因与某功能蛋白基因首尾相连，并置于同一套调控序列（包括启动子、终止子等）控制之下，构成融合基因，通过对红色荧光蛋白的跟踪观察，可以研究功能基因的表达、定位和动态变化。围绕下列两种构建dsred2-amy融合基因（红色荧光蛋白基因-α-淀粉酶基因融合基因）的方法，回答下列问题： （1）方法1（如图1所示）： 注：I～IV各表示一种引物，X、H、S分别表示一种限制酶识别序列。 ①限制酶的识别序列要添加在引物的___________端。为了保证两个基因能够正确连接，限制酶S的识别序列位于pMG36e-dsred2质粒的___________（填“a”或“b”）处。“？”表示的处理主要是用限制酶___________（填“H和X”或“X和S”或“S和H”）分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ与引物Ⅳ的碱基序列___________（填“是”或“不是”）完全互补的，原因是___________。 （2）方法2（如图2所示，其中引物Ⅵ和引物Ⅶ中的部分序列，即黑色区域，可互补配对）： ①利用PCR技术扩增dsred2基因或amy基因时，不需要解旋酶来打开DNA双链，原因是___________。 ②dsred2基因和amy基因混合后可得到2种类型的杂交链，其中只有图2所示的杂交链能扩增得到融合基因，另一种杂交链不能。图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要___________的参与。另一种杂交链不能合成延伸得到dsred2-amy融合基因，原因是___________。 【答案】（1）5’ a X和S 不是 引物Ⅰ是扩增dsred2基因的上游引物，引物Ⅳ是扩增amy基因的上游引物。由于dsred2和amy是两个不同的基因，它们的DNA序列不同，因此对应的引物序列也不同，自然不是互补的。 （2）PCR过程中通过高温变性使DNA双链解开，无需解旋酶 Taq DNA聚合酶/耐高温DNA聚合酶 另一种杂交链的3’端没有与模板互补的序列，无法被DNA聚合酶延伸 【解析】本题图像展示两种构建dsred2-amy融合基因的方法。图1为传统克隆法：通过PCR扩增dsred2和amy基因，分别插入质粒，再用限制酶切割后连接。图2为重叠延伸PCR法：设计引物使两基因产物末端互补，混合退火后由DNA聚合酶延伸形成融合基因。 （1）①PCR引物的延伸方向是5'→3'，因此外源酶切位点序列必须加在引物的5'端，这样扩增出的产物两端才会有这些位点；为保证dsred2基因与amy基因首尾相连，限制酶S的识别序列应位于pMG36e-dsred2质粒的a处；因为X是两个片段的连接位点，S是保证amy定向插入质粒的位点，H只存在于dsred2一侧，无法作为共同酶，故主要是用限制酶X和S分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ是扩增dsred2基因的上游引物，引物Ⅳ是扩增amy基因的上游引物。由于dsred2和amy是两个不同的基因，它们的DNA序列不同，因此对应的引物序列也不同，自然不是互补的。 （2）①PCR技术利用高温使DNA双链间的氢键断裂，实现变性解旋，无需解旋酶参与。 ②图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要Taq DNA聚合酶（或耐高温DNA聚合酶）‍的参与。DNA聚合酶只能沿着模板链的3'→5'方向，从引物的3'端延伸子链。图2中所示的正确杂交链，其单链部分有3'端伸出，可以作为引物结合位点进行延伸。而另一种杂交链（未画出的反向连接），其单链末端可能没有合适的3'端结构，或者延伸方向与基因序列不符，导致DNA聚合酶无法结合或无法正确延伸，从而不能形成融合基因。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 考点1 基因工程综合 1.【答案】（1）EcoR Ⅰ、Not Ⅰ （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）减少CAR-T细胞表面PD-1的表达 CAR序列 终止子 溶解酶1基因序列 溶解酶2基因序列 2.【答案】（1）5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 1.【答案】B 2.【答案】B 3.【答案】D 4.【答案】 抗原 既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体 克隆化培养和抗体检测 逆（反）转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、热稳定DNA聚合酶（Taq或耐高温的TaqDNA聚合酶）、核酸酶 引物 变性、复性、延伸 一 强 5.【答案】 逆（反）转录酶 热稳定性高的DNA聚合酶（Taq酶） 温度（或温度、pH） 2n-1 抗原和抗体发生特异性结合 病毒进入人体后，刺激人体免疫系统产生相应的抗体需要一段时间 病毒抗体 6.【答案】（1）XbaⅠ DNA聚合 400（bp） （2）37/64 （3）密码子具有简并性，一种氨基酸可对应多种密码子；基因存在非编码序列，通过氨基酸序列反向获得的DNA序列中不含有启动子、终止子以及终止密码子对应的DNA序列 （4）上升 将抗条锈病小麦与普通小麦混合种植（间作）【将不同抗病基因的小麦品种混合种植】 7.【答案】（1）RNA聚合酶 PS 表达红色荧光蛋白，通过红色荧光检测水体中的水杨酸 （2）C B （3）刺激小鼠免疫系统产生能分泌抗nahR蛋白抗体的B淋巴细胞 抗原 （4）①③②④ 8.【答案】（1）载体自身重新环化、目的基因反向插入载体、多个目的基因插入同一载体 （2）一小段能与模板链互补配对的短单链核酸 引物2（扩增载体的引物）携带目的基因的同源序列，引物3（扩增目的基因的引物）携带载体的同源序列 （3）自身复制必需的核心基因 目的基因α1,3−GT （4）核遗传物质（基因型）基本一致 9.【答案】（1）结合RNA聚合酶，驱动基因转录 复制原点、标记基因、限制酶酶切位点（答2点即可） （2）让两个基因同时表达，通过荧光强度检测反映C基因的表达量； 37℃时，蛋白T形成二聚体，与启动子结合抑制了其下游GFP基因的转录 （3）37℃下T3荧光强度很低，蛋白C表达少，安全性高，而在42℃下T3荧光强度提高倍数最大，蛋白C表达多，灵敏度高 （4）在表达载体中增加一个受温度诱导的裂解基因（或“自毁基因”），当工程菌完成抗肿瘤蛋白释放后（C蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时），通过二次升温使其自我清除 10.【答案】（1）高压蒸汽灭菌法或湿热灭菌法 （2）预期的蛋白质功能 （3）逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶/逆转录酶、RNA酶和耐高温的DNA聚合酶 检测PCR反应体系是否被污染 （4）乙 叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量 （5）左侧E基因的启动子是CYC，照射蓝光后受到正反馈调控，快速表达大量E蛋白，进而激活gla基因表达；右侧E基因的启动子是ACT，为组成型表达的弱启动子，使细胞中始终含有少量E蛋白，保持接受蓝光信号的能力 11.【答案】（1）预期蛋白质的功能（不形成二聚体，能迅速发挥作用） BC （2）RNA聚合酶的结合位点，驱动下游基因转录 5′-TA-3′和5′-AGCT-3′ （3）卡那霉素 目标胰岛素基因INS已经成功导入大肠杆菌 目标DNA含量不高 （4）根据胰岛素中氨基酸序列和大肠杆菌偏好的密码子，改变相应脱氧核苷酸序列 12.【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA （2）不合理 引物F1和R1都位于J基因的内部，无论J基因是否正确插入质粒，PCR都会扩增出相应片段，无法验证J基因是否正确插入质粒且方向无误。 a （3）抗 J 蛋白 抗 V5 不是 抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2 （4）进行氨基酸序列测定；构建仅含V5编码序列的质粒，导入受体细胞，用抗J蛋白抗体检测 13.【答案】（1）限制酶、DNA连接酶 避免loxP序列对其他基因的功能或细胞的代谢或动物的表型或正常的生命活动造成影响 （2）使小鼠仅在肝细胞中表达Cre酶（或保证Cre-loxP系统对小鼠肝脏的ATF4基因进行特异性敲除） 质粒甲表达的Cre酶可使质粒乙中的ATF4基因被敲除，不能达到敲除肝细胞中ATF4基因的目的 （3） （4）不支持，核移植技术的技术流程复杂（成本高）、成功率低，且绝大多数克隆动物存在健康问题；不支持，通过品系①和②杂交获得模型小鼠的操作更为简便；支持，核移植技术能培育出细胞核遗传背景完全一致的模型小鼠 14.【答案】（1）5’ a X和S 不是 引物Ⅰ是扩增dsred2基因的上游引物，引物Ⅳ是扩增amy基因的上游引物。由于dsred2和amy是两个不同的基因，它们的DNA序列不同，因此对应的引物序列也不同，自然不是互补的。 （2）PCR过程中通过高温变性使DNA双链解开，无需解旋酶 Taq DNA聚合酶/耐高温DNA聚合酶 另一种杂交链的3’端没有与模板互补的序列，无法被DNA聚合酶延伸 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 3年汇编1年模拟 考点分类 广西考情 命题规律 考点1 基因工程综合 2025广西（1题）、2024广西（1题） · 情境设置：结合工业菌株、肿瘤治疗和动物模型等真实应用。 · 考查重点：基因表达调控、重组细胞构建及转基因实验分析。 · 命题趋势：突出基因工程与医学、工业及实验探究的综合融合。 考点1 基因工程综合 1．（2025·广西·高考真题）CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物______（选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是______；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是______。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行______。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是______（至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为______实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是______。 1．（2026·广西河池·二模）环境DNA（eDNA）技术是指从环境中提取DNA片段（水生动物细胞DNA），经扩增后进行DNA测序，常用于测定某一水域中鱼类的物种丰富度。下列叙述正确的是（　　） A．不同种类的鱼的所有DNA序列完全不同 B．与传统捕捞法相比，该方法更易检出稀有物种 C．eDNA的基本骨架由磷酸、脱氧核糖与碱基构成 D．扩增的序列不能太长，否则可能会高估物种丰富度 2．（2026·广西南宁·二模）几丁质酶是一类糖苷水解酶，可有效降解病原生物中的几丁质，在农作物病虫害防治中具有广泛应用前景。科研人员利用蛋白质工程技术对源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶进行改造：保留氨基端功能区域，同时在其羧基端融合陆生真菌几丁质结合保守域。改造后的几丁质酶与几丁质的结合能力显著提升，酶活性和抑菌能力也明显增强。下列相关说法错误的是（　　） A．几丁质和几丁质酶均属于以碳链为骨架的生物大分子 B．几丁质酶的结构差异取决于氨基端和羧基端之间氨基酸的连接方式 C．上述对几丁质酶的改造实质是改造溶珊瑚弧菌相关基因的结构 D．用几丁质酶取代杀虫剂应对农作物病虫害可有效避免生物富集 3．（2026·广西·模拟预测）微生物DNA分子中腺嘌呤会被甲基化酶修饰，腺嘌呤的甲基化会影响不同限制酶的切割情况，下表是腺嘌呤甲基化前后某些限制酶切割的情况。下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列 甲基化前 甲基化后 TaqⅠ 5'-T↓CGA-3' 切割 不切割 DpnⅠ 5'-GA↓TC-3' 不切割 切割 ClaⅠ 5'-AT↓CGAT-3' 切割 不切割 BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' 切割 切割 A．DNA腺嘌呤的甲基化并不会改变生物基因的碱基序列 B．限制酶ClaⅠ所识别的酶切位点，也能被限制酶TaqⅠ识别并切割 C．用表格中四种限制酶分别处理同一DNA片段，甲基化后可被切割的位点总数，不一定比甲基化前少 D．限制酶切割的特异性由其识别的碱基序列决定，与碱基修饰无关 4．（2026·广西河池市高级中学·模拟预测）根据材料回答问题： 材料一：科学家研究发现新型冠状病毒S蛋白（Spike protein，棘突蛋白）可与宿主细胞的病毒受体结合，是决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。 （1）以S蛋白作为______ 可制备单克隆抗体生产快速检测新冠病毒的试剂盒。单克隆抗体制备过程中有两次筛选，第一次筛选的目的是得到 ______________________的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞还需进行_____________________________________，经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 材料二：新型冠状病毒核酸检测采用荧光定量PCR仪，通过检测荧光信号的累积（以Ct值表示）来确定样本中是否有病毒核酸。新冠病毒的遗传物质为RNA，科学家先将病毒RNA逆转录，再将得到的cDNA进行多聚酶链式反应扩增得到了大量DNA片段（如图所示）。 （2）在上述技术中，用到的酶有_______________________________（至少写出两种）。 （3）科学家已测出新冠病毒的核酸序列，据图分析，Ⅰ、Ⅱ过程需要根据病毒的核苷酸序列设计 __________。过程Ⅱ中以cDNA为模板经过_____________________三步循环扩增得到多个DNA片段，第____次复制后就能获得两条链等长的DNA序列 。 （4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述PCR过程，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的靶基因越多，观察到的 Ct值就越 _____________。 5．（2026·广西河池市高级中学·模拟预测）新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎疫情，对我国民生健康和经济造成极大影响。新型冠状病毒相关的实验室检测技术，对新型冠状病毒的诊断与防控尤为重要。新型冠状病毒的检测最常见方法的是荧光定量RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应），RT-PCR的具体过程如图。回答下列问题： （1）过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是_______________，________________。 （2）RT-PCR过程通过对_____________的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。 （3）过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要_______个引物B。 （4）新型冠状病毒的检测方法还可采用病毒抗原检测、病毒抗体检测，这些检测方法的原理是_____________。检测到新冠病毒感染者抗体滞后于病毒核酸和抗原的理由是____________________________________，因此__________检测对传染性极高的新型冠状病毒（2019 - nCoV）疑似患者早期确诊意义不大。 6．（2026·广西南宁·二模）小麦条锈病是由条形柄锈菌引起并主要危害小麦叶片的真菌病害。科研人员拟将广谱抗病Yr15基因（编码WTK1蛋白）和Ti质粒构建成重组质粒，再通过其他基因工程技术培育出抗条锈病的小麦新品种。Yr15基因和Ti质粒的部分结构以及限制酶的识别序列和酶切位点如图所示，回答下列问题： （1）据图分析，需选用SmaⅠ对目的基因进行完全酶切，再选择SmaⅠ和_______对Ti质粒进行完全酶切，该限制酶切割后会产生黏性末端，可以使用_______酶将黏性末端补平为平末端，最后利用DNA连接酶构建成重组质粒。经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用SmaⅠ和SpeⅠ进行完全酶切并电泳检测出两条条带，若较短的电泳条带长度为_______bp，则是正向重组质粒。 （2）科研人员对某株抗条锈病小麦的核基因进行检测后发现，其Yr15基因存在多位点插入现象（如图2所示）。该株小麦自交后，能稳定遗传的抗条锈病子代的比例为______。注：图中仅展示含Yr15基因的染色体。（不考虑交叉互换、基因突变和染色体变异）。 （3）某实验小组欲通过WTK1蛋白的氨基酸序列推导获得Yr15基因的碱基序列，结果发现推导所得的碱基序列与Yr15基因的实际碱基序列存在差异，原因是_______（答出2点即可）。 （4）推广抗条锈病小麦可减少化学农药的使用，但若长期大面积种植抗条锈病小麦，条形柄锈菌种群对WTK1蛋白的抗性基因频率会_______。为避免或有效延缓该过程，在同一地块的同一生长季内，可采用的种植策略是________（答出1点即可）。 7．（2026·广西河池·二模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如下图），为环境污染治理提供新方法。请回答: （1）Pc和Ps启动子可被________酶识别并结合后驱动基因的表达。分析上图可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活_______启动子进一步促进相关基因的表达。表达载体上连接mrfp基因的目的是________。 （2）水杨酸羟化酶可催化水杨酸分解。工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的_____、_____（填字母）位点。 （3）科研人员利用细胞工程技术制备了抗nahR蛋白的单克隆抗体，制备过程中给小鼠注射nahR蛋白的目的是_______。诱导细胞融合时所用到的灭活病毒失去了感染能力，但其________特性仍然存在。 （4）结果显示该智能工程菌的检测灵敏度未达到预期，为提升nahR蛋白对水杨酸的亲和力，科研人员计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤，请按正确顺序排列:_______。 ①通过X射线衍射技术分析原始nahR蛋白的空间结构 ②采用定点突变技术修改nahR基因的脱氧核苷酸序列 ③推导出提高生物学活性功能所需的关键氨基酸替换位点 ④将改造后的nahR基因导入受体细胞并检测其生物学活性 8．（2026·广西河池·一模）溶瘤病毒是极具潜力的抗肿瘤工具。新城疫病毒（NDV）天然具有靶向裂解肿瘤、对正常细胞无感染性的特点，是研发溶瘤病毒的理想载体。科研团队将猪α1，3半乳糖基转移酶（α1，3-GT）基因插入NDV基因组，构建重组溶瘤病毒（NDV-GT）（见下图1），NDV-GT通过直接溶瘤、超急性排斥反应和免疫激活的三重机制发挥抗肿瘤作用。结合该研究及基因工程相关知识，回答下列问题： （1）采用PmeⅠ限制性内切酶对NDV LaSota株质粒进行单酶切获得线性化NDV载体，若直接用DNA连接酶将线性化NDV载体与α1，3-GT基因连接构建重组载体，常因_________（答出两点）等问题导致构建成功率极低，因此科研团队采用重叠延伸PCR同源重组法构建重组质粒。 （2）科学家将α1，3-GT基因与线性化NDV载体进行重叠延伸PCR同源重组，形成重组NDV-GT质粒。重叠延伸PCR引物必须按照载体与基因序列设计，引物是一小段_________________________________。 为了使α1，3-GT基因与线性化NDV载体形成重叠序列，图中特异性引物2．3的设计原则是：_________。 （3）该表达载体采用双启动子/双终止子设计，一套驱动NDV_________的转录以保障病毒复制与增殖能力，维持溶瘤活性；另一套驱动_________的转录，实现抗肿瘤基因的高效稳定表达。 （4）科研团队构建食蟹猴原发性肝癌模型以验证重组溶瘤病毒的疗效，实验中用到的食蟹猴为动物体细胞克隆猴，由于同一个体的体细胞克隆出的后代_________，用于药物对照实验能够更准确地评估药效。 9．（2026·广西桂林·模拟预测）研究人员构建了含绿色荧光蛋白基因（GFP）、抗肿瘤活性蛋白C基因、温敏型转录抑制蛋白T基因的基因表达载体，如图所示，并将其导入受体菌，获得工程菌，用于癌症精准治疗。分析回答下列问题： 注：P1启动子为温度诱导型启动子（在温度达到42℃时才会启动下游基因的转录）；P2启动子为持续表达型启动子；表示抑制。 （1）在基因表达过程中，启动子发挥着_______的作用；除了图9中所含元件外，表达载体还必须具有_______________等元件。（请写出2种） （2）据图9分析，将GFP基因与C基因共享启动子的目的是_______；在37℃，几乎检测不到荧光强度，其原因是_____________。 （3）研究人员筛选出3种温敏型转录抑制蛋白T基因（T1、T2、T3），构建好表达载体后导入受体菌，检测在不同温度下的荧光强度，结果如图所示。最终选择T3来构建工程菌的理由是_______________。 （4）有学者认为：从生物安全角度，该技术可能引发“基因污染”。请提出一条改造上述表达载体，解决“基因污染”的思路_______________。 10．（2026·广西·模拟预测）虾青素是一种强效、高效的天然抗氧化剂，在医药、化妆品和饲料行业应用广泛。雨生红球藻是天然虾青素的最佳生物来源，但是野生藻株存在虾青素产量低、易受环境胁迫（如氧化应激）影响生长、发酵后菌体与产物分离困难等问题。科研人员拟通过基因工程改造，获得高产虾青素、高抗逆、可诱导沉降的工程藻株。请回答下列问题： （1）科研人员对雨生红球藻进行活化培养。配制培养基，经________灭菌冷却后接种，置于摇床振荡实现扩大培养。 （2）研究发现，bkt基因编码的β-胡萝卜素酮化酶，是雨生红球藻合成虾青素的关键酶。为提高虾青素产量，科研人员利用定点突变技术改造bkt基因，获得bkt*基因（表达的β-胡萝卜素酮化酶催化效率更高）。在设计bkt*基因的碱基序列时，需先从___________出发，推测所需基因的碱基序列。 （3）为解决雨生红球藻“抗逆性”的问题，科研人员使用RT-PCR技术，以马尔尼菲青霉菌的RNA为模板通过多个反应获得SKN7基因的cDNA。该反应过程需要的酶有____________。在PCR反应体系中需设置一组空白对照（使用无菌水代替模板DNA），目的是_______。 （4）为构建工程藻，科研人员将含bkt*和SKN7调控元件的表达载体导入雨生红球藻中。 ①常用的导入方法有：方法甲——农杆菌介导转化，方法乙——基因枪转化（通过高速微弹将包裹的DNA直接送入细胞）。若要将外源基因导入雨生红球藻的叶绿体基因组，使其在叶绿体内稳定复制和表达，则应选用方法______（填“甲”或“乙”）。 ②若将表达载体分别导入工程藻的核基因组和叶绿体基因组，在相同培养条件下，后者虾青素产量更高，原因是__________。 （5）研究表明，gla基因（胞外多糖合成关键基因）高表达可使细胞分泌多糖、彼此黏连并快速沉降，便于产物分离。为解决发酵后菌体和产物分离困难的问题，科研人员在工程藻中引入蓝光激活系统，并在其基因组中插入两个E基因（如图甲），使gla基因的表达受到蓝光调控（调控原理见图乙）。请分析在工程藻的基因组DNA中插入两个E基因的意义是：_________。 11．（2026·广西柳州·二模）天然胰岛素在体内易形成二聚体，需解离为单体才能发挥降糖作用，这导致了起效延迟。为解决此问题，科学家利用蛋白质工程对胰岛素进行精准改造，将胰岛素B链第28位上的脯氨酸（Pro）与第29位上的赖氨酸（Lys）互换，进而获得目标胰岛素（INS，长度为330bp）。图1为天然胰岛素B链的部分DNA序列，图2表示利用PCR技术获取目标胰岛素基因的部分过程，图3为pET-INS表达载体构建示意图，图4为凝胶电泳结果图。据图分析，回答下列问题： （1）蛋白质工程构建目标胰岛素需从_________出发。根据图1、图2（黑框代表天然胰岛素B链基因突变位置，R1、R2、F1与F2为对应的引物）综合分析，利用PCR技术获取目标胰岛素基因时，所用突变引物R1和F2对应的序列分别为______（填选项）。 A.3′—ACACACCCAAGACCC—5′    B.5′—GGGTGGGCTTTGTGT—3′ C.5′—ACACAAAGCCCACCC—3′    D.3′—GGGTCTTGGGTGTGT—5′ （2）质粒中启动子的作用是_________。为确保INS正确插入图3的质粒pET-MCS中，经相应酶切割后，质粒pET保留的黏性末端序列应为_______。 （3）将重组质粒pET-INS导入感受态大肠杆菌，并置于含________的培养基中，挑取8个长势良好的单菌落进行PCR扩增以及扩增产物的凝胶电泳，结果见图4.8个条带大小均为330bp左右，说明_______。其中2号菌落条带相较不明显，可能的原因是__________。 （4）为提高在大肠杆菌中目标胰岛素基因的表达量，请从密码子的简并性和偏好性的角度，提出一条可行性强的措施：_______________。 12．（2026·广西贵港·模拟预测）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒（结构如图甲），并导入受体细胞。用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测受体细胞中蛋白的表达情况，结果如图乙。 请回答下列问题： （1）图甲中，启动子的功能是__________。 （2）为验证J基因已正确插入质粒且方向无误，某同学选用引物F1和R1进行PCR检测。你认为该方案是否合理？___（填“合理”或“不合理”），理由是_________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____链（填“a”或“b”）相应部分的序列相同。 （3）图乙中，条带1和条带2分别是用______抗体和______抗体检测的结果。据此判断，条带2所检出的蛋白______（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的，理由是_________。 （4）若想进一步证明条带2对应的蛋白确实由重组质粒上的J基因编码，请设计一个简要的实验思路：______________。 13．（2026·广西崇左·二模）Cre-loxP系统表达的Cre酶可将两个同向loxP序列之间的基因片段切除，其作用机制如图1所示。ATF4基因与肝脏代谢疾病的发生密切相关。为探究该基因的作用，研究人员使用Cre-loxP系统对小鼠肝脏的ATF4基因进行特异性敲除。回答下列问题： （1）Cre酶与基因工程常用的工具酶_____（答出2种）的作用效果相似。设计loxP序列时，应确保使用的loxP序列不能编码蛋白，目的是_____（答出1点）。 （2）研究人员制备了质粒甲（含有启动子和Cre基因）、质粒乙（含有同向loxP序列、ATF4基因序列及ATF4基因上下游序列），将其分别导入不同小鼠体内并培育成品系①、品系②，从两种小鼠的杂交子代中选育目标小鼠品系③，各品系小鼠如图2所示。当两个DNA分子含有相似（或相同）序列时，可发生基因重组，类似同源染色体联会时发生的交换，即同源重组替换，ATF4基因上下游序列可用于同源重组替换。 ①质粒甲中的启动子能被肝细胞特有的转录因子识别，目的是_____。 ②两种质粒不能同时导入同一小鼠胚胎细胞中，理由是_____。 （3）loxP序列和ATF4基因序列长度如图3所示，其中bp表示碱基对。为检测ATF4基因敲除效果，从小鼠的不同类型细胞中提取DNA后，用引物P1和P2进行PCR扩增和电泳检测。请将图4中相应的条带涂黑，表示成功制备模型小鼠的检测结果。 （4）上述模型小鼠可应用于肝脏疾病研究，但开展实验需要大量的模型小鼠。某同学认为核移植技术是获得大量模型小鼠的有效途径，你是否支持该观点？请说明理由：_____。 14．（2026·广西·一模）将红色荧光蛋白（dsred2）基因与某功能蛋白基因首尾相连，并置于同一套调控序列（包括启动子、终止子等）控制之下，构成融合基因，通过对红色荧光蛋白的跟踪观察，可以研究功能基因的表达、定位和动态变化。围绕下列两种构建dsred2-amy融合基因（红色荧光蛋白基因-α-淀粉酶基因融合基因）的方法，回答下列问题： （1）方法1（如图1所示）： 注：I～IV各表示一种引物，X、H、S分别表示一种限制酶识别序列。 ①限制酶的识别序列要添加在引物的___________端。为了保证两个基因能够正确连接，限制酶S的识别序列位于pMG36e-dsred2质粒的___________（填“a”或“b”）处。“？”表示的处理主要是用限制酶___________（填“H和X”或“X和S”或“S和H”）分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ与引物Ⅳ的碱基序列___________（填“是”或“不是”）完全互补的，原因是___________。 （2）方法2（如图2所示，其中引物Ⅵ和引物Ⅶ中的部分序列，即黑色区域，可互补配对）： ①利用PCR技术扩增dsred2基因或amy基因时，不需要解旋酶来打开DNA双链，原因是___________。 ②dsred2基因和amy基因混合后可得到2种类型的杂交链，其中只有图2所示的杂交链能扩增得到融合基因，另一种杂交链不能。图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要___________的参与。另一种杂交链不能合成延伸得到dsred2-amy融合基因，原因是___________。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $