3.2.2 基因工程的基本操作程序课件-2026-2027学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2 基因工程的基本操作程序 （第2课时） 将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？ 基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞 思考 三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞的常用方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 ②植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 目的基因 目的基因 子房注射 花柱滴加 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法（采用最多） 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 农杆菌Ti质粒 T-DNA区域 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法（采用最多） 原理： 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 Ti质粒 目的基因 构建基因表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 导入植物细胞 表现出新性状的植物 将目的基因插入染色体DNA中 （2）农杆菌转化法过程 T-DNA 植物组织培养 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法小结： Ti质粒 目的基因 构建 基因表达载体 转入 农杆菌 导入 植物细胞 T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中 表达 新性状 该过程经过____次拼接、____次导入？ (1)第一次拼接___________________________ (2)第二次拼接___________________________ (3)第一次导入___________________________ (4)第二次导入___________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 重点剖析 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？ 得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养 1.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是 A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 √ 三、将目的基因导入受体细胞 2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法 受精卵 注射器 固定吸管 显微注射仪 注意：导入动物细胞通常选择受精卵 ①体积大，易操作。 ②全能性高，易培养成完整个体。 三、将目的基因导入受体细胞 3.将目的基因导入微生物细胞 原核细胞（常选择大肠杆菌） （1）受体细胞： （2）常用方法： Ca2+处理法（感受态细胞法） 繁殖快 单细胞 遗传物质少 Ca2+处理大 肠杆菌细胞 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态 将重组的基因表达载体导入 CaCl2 感受态细胞 吸收 Ca2+的作用：增加细胞膜的通透性 将目的基因导入受体细胞方法 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 花粉管通道法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？ 即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 思考 不一定！ 检查目的基因进入受体细胞后，是否维持稳定和表达其遗传特性。 四、目的基因的检测与鉴定 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 （一）分子水平检测 （二）个体生物学水平鉴定 方法： 抗虫或抗病接种实验 PCR等技术 ——“抗原—抗体杂交技术” 概念 （1）基因探针： 一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异单链核苷酸序列。 可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。 （2）核酸杂交： 可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。 互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。 四、目的基因的检测与鉴定 检测内容及方法: （一）分子水平的检测 检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因 方法1:检测目的基因是否导入 ——通过PCR等技术检测 提取棉花细胞DNA 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 对扩增产物进行检测 DNA半保留复制 四、目的基因的检测与鉴定 基本思路： ①制作基因探针，并用PCR扩增； ②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液； ③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 探针与受体中的DNA分子杂交 出现杂交带： 不出现杂交带： 已插入 未插入 方法2：检测目的基因是否导入 ——DNA分子交杂技术 四、目的基因的检测与鉴定 检测Bt基因是否翻译出mRNA 提取棉花细胞mRNA 逆转录 产生DNA 对扩增产物进行检测 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 方法1：检测目的基因是否转录 ——通过PCR等技术检测 （一）分子水平的检测 方法2：检测目的基因是否转录 ——分子杂交技术 变性 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 杂交分子 （可检测） 四、目的基因的检测与鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 （一）分子水平检测 3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法： 抗原— 抗体杂交 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 抗原与抗体的特异性结合 原理： 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 抗原 抗体 杂交 脱分化 四、目的基因的检测与鉴定 （二）个体水平检测 检测目的基因是否表现出相应的性状 检测抗虫棉是否具有抗虫性状 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 ——抗虫或抗病接种实验 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 个体水平检测：抗性以及抗性程度 还记得吗？ 必修二P52 指纹图是如何获得的呢？ 琼脂糖凝胶电泳鉴定 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环； 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳； ②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小 和构象等有关（迁移速率与其呈负相关） ④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 凝胶电泳原理示意图 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 移液 离心 扩增 1.DNA片段的扩增 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 2.DNA片段的电泳鉴定 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 琼脂糖凝胶电泳演示实验 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意： ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 3、结果分析与评价： 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 3、结果分析与评价： 课堂小结 　 (2022·天津一中高二期中)下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 例1 √ 例2 　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是（ ） A.PCR产物的分子大小在250～500 bp 之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号确定反应体系等对结果没有干扰 √ 例3 (2022·河南郑州高二期中)在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是（ ） A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子 B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点 C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp C Lavf58.51.100 $