3.2.2 基因工程的基本操作程序 课件 2025—2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 目的基因的导入、检测与鉴定 3 第三步：将目的基因导入受体细胞 【自主学习】阅读教材P81，思考下列问题： 1.将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？ 2.简述农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程。 3.将目的基因导入动物细胞的常用的方法是什么？ 4.简述将目的基因导入大肠杆菌的基本过程。 第三步：将目的基因导入受体细胞 （一）目的基因导入植物细胞 1.方法： 花粉管通道法、农杆菌转化法 花粉管通道法 ——我国科学家独创的一种方法 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 农杆菌转化法 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 1.农杆菌特点： （1）农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 （2）农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。 T-DNA Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的Ti质粒 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现新性状的植物 植物细胞 染色体DNA 转入农杆菌 2.利用农杆菌进行转化的思路： 目的基因 插入 Ti质粒的T-DNA中 转化 进入植物细胞 整合到 受体细胞的染色体DNA上（使目的基因能够维持稳定和表达） 3.过程： 思考：该过程有几次拼接，几次导入？ Ti质粒 T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的Ti质粒 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现新性状的植物 植物细胞 染色体DNA 转入农杆菌 第一次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上 第二次拼接 含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上(非人工操作) 第一次导入 第二次导入 含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞(非人工操作) 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 该过程经过____次拼接、____次导入 两 两 方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 4.转化方法： 思考： 农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA？ T-DNA不是目的基因。 但只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 ——受体细胞为体细胞 ——受体细胞为受精卵 第三步：将目的基因导入受体细胞 （二）目的基因导入动物细胞 1.方法： 显微注射法 ——受体细胞是受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 2.过程： 思考：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 1.体积大，易操作。 2.全能性高，易培养成完整个体。 第三步：将目的基因导入受体细胞 （三）目的基因导入原核细胞 1.方法： 感受态细胞转化法（Ca2+处理法） 2.受体细胞： 原核细胞（常选择大肠杆菌） 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 原因：繁殖周期短、体积小易于培养操作，多为单细胞、遗传物质相对较少 3.过程： Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收重组DNA 1.某科研团队欲将抗虫基因（Bt基因）导入棉花细胞，培育抗虫棉。现有以下两种导入方案： ①用农杆菌转化法将Bt基因导入棉花细胞； ②在棉花授粉后，将含Bt基因的溶液注入花粉管通道。 下列叙述错误的是（     ） A．方案①普遍适用于双子叶植物和裸子植物，一般单子叶植物不宜使用 B．方案①将Bt基因随机插入Ti质粒后，要先将重组质粒转入农杆菌 C．方案①的最终目的是将Bt基因整合到棉花细胞的染色体DNA上 D．相比方案①，方案②的优势是无需进行植物组织培养即可得到抗虫棉 B 课 堂 检 测 2.玉米螟是我国玉米的主要害虫。研究人员通过基因工程育种将抗虫基因（cry1Ab13）和抗除草剂基因（Bar）一起转入玉米中，以提升其抗虫和抗除草剂的能力，过程如图所示。下列叙述错误的是（     ） A．需在步骤①获取的cry1Ab13 基因两端添加BamHI识别的碱基 序列 B．步骤②应将cry1Ab13基因插 入表达载体的启动子1和终止子 1之间 C．步骤③时应先用Ca2+处理农杆菌，农杆菌能将T-DNA整合到玉米的染色体DNA上 D．步骤⑤为再分化，所得转基因玉米通过喷除草剂筛选出的个体均能稳定遗传抗虫性状 D 课 堂 检 测 农杆菌浸染植物细胞后，如何判断导入是否成功？ 利用标记基因筛选 农杆菌细胞 未转化的农杆菌 转化的农杆菌 含目的基因 含目的基因-质粒（重组质粒） 含质粒 加四环素的培养基 √ × √ × 即使质粒导入成功，如何判断是否含目的基因？目的基因是否可以正常表达？ 4 第四步：目的基因的检测与鉴定 【自主学习】阅读教材P82，思考下列问题： 1.目的基因检测技术包括哪些？ 2.目的基因插入受体细胞的染色体DNA上，为什么要进行转录和翻译水平的检测？ 3.目的基因的鉴定方法是？ 第四步：目的基因的检测与鉴定 （一）目的基因的检测——分子水平 1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 方法： PCR技术 DNA分子杂交 提取细胞DNA PCR扩增目的基因 产物检测 琼脂糖凝胶电泳检测 ① 提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针； ② 使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。 15N 15N 变性 变性 杂交DNA分子 转基因生物的DNA 2.检测目的基因是否转录出了mRNA 方法： PCR技术 分子杂交技术 用探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA. 15N 15N 变性 转基因生物的mRNA 杂交分子 3.检测目的基因是否翻译成为蛋白质 方法： 抗原-抗体杂交技术 ①一抗与目的基因表达的蛋白质进行特异性结合。 ②第二抗体（二抗）的抗体可以与一抗结合，并带有特定的标记物。如果目的基因成功表达出蛋白质，则二抗标记物会在硝酸纤维素膜上显现出特定的条带，从而表明反应为阳性。 4.目的基因的检测 — — 个体水平 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 观察是否赋予个体生物新的特性或抗性 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 1.目的基因的筛选与获取（前提） 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 4.目的基因的检测与鉴定（保证） 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 课堂小结 3.为了降低人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）缺乏症的治疗成本，研究人员构建了含有hGC基因的重组Ti质粒，并通过农杆菌转化法将hGC基因导入烟草中，并高效表达，其过程如下图所示。下列叙述错误的是（     ） A．在基因工程中，构建基因表达载 体是基因工程的核心步骤 B．含重组Ti质粒的农杆菌表达的 hGC蛋白可以直接用于疾病治疗 C．从愈伤组织中提取蛋白质作为抗 原进行抗原-抗体杂交检测hGC基因是否翻译 D．将含有hGC基因的重组质粒导入受体细胞后，还需要利用植物组织培养技术 B 课 堂 检 测 4.靶向肽是可以与靶分子或靶细胞表面受体特异性结合的多肽。研究人员以肿瘤靶向肽的编码基因为目的基因（结构如图甲），结合PBC1载体（结构如图乙）构建重组DNA分子，用于肿瘤靶向治疗。P1为小鼠乳腺细胞特异性启动子，P2为诱导型启动子，限制酶MboⅠ、XbaⅠ、ScaⅠ切割（切割位点见图）后产生的末端不同。请回答下列问题。 (1)本实验选择限制酶 切 割目的基因和PBC1载体。 (2)为了培育转基因小鼠，应选择小鼠 作为受体细胞；将目的基因导入小鼠受体细胞时，最常用的方法是_____。 Sca Ⅰ、Xba Ⅰ 受精卵 显微注射法 课 堂 检 测 (3)将获得的重组DNA导入动物细胞后，含空载体（未插入目的基因）的细胞_____（填“会”或“不会”）发出蓝色荧光；含重组载体的细胞发出红色荧光的前提是 。 (4)验证目的基因表达产物（靶向肽）的肿瘤靶向性时，需将荧光标记的靶向肽与 混合培养；通过观察 判断其靶向性强弱。 会 添加P2启动子对应的诱导物 肿瘤细胞 细胞表面带荧光标记的肿瘤细胞数 课 堂 检 测 一、实验原理 1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理： PCR利用了 和 的原理。 2.DNA片段电泳鉴定的原理： DNA分子具有 ，在一定的 下，这些基团可以带上 ，在_____的作用下，这些_____________会向着__________________的电极移动，这个过程就是________。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 电场 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________________、________________和_____等有关 凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 探究 · 实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 PCR仪 自动控温，实现DNA的扩增 微量离心管 实际上是进行PCR反应的场所 微量移液器 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 一次性吸液枪头 微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头 电泳装置 包括电泳仪、电泳槽等 1 2 3 4 5 试剂： 4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板 DNA、扩增缓冲液、无菌水。 电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 移液 离心 反应 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 三、实验步骤 1.DNA片段的扩增 → PCR技术 制备凝胶 融化 倒模 凝固 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 2.DNA片段的电泳鉴定 进行电泳 加样 电泳 观察 1.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 2.留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 3.指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 观察鉴定：紫外灯下观察和照相 特别注意 1 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 四、结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增不成功，可能的原因有： 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 5. 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　) A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理 B.PCR利用了DNA的热变性原理 C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化 D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换 C 课 堂 检 测 6..P24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白（大小约为26KD），是P24基因的表达产物。P24单克隆抗体在HIV感染的诊断、治疗等方面有重要意义，P24单克隆抗体的制备主要包括三个阶段：利用基因工程生产P24蛋白：利用细胞融合技术生产单克隆抗体；单克隆抗体活性的鉴定。请回答下列问题： (1)提取HIV的总RNA，经_______过程获得总cDNA．通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出P24基因的cDNA． (2)在构建重组质粒时，需对质粒和P24基因的cDNA用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，双酶切的优点除了防止质粒和目的基因的自身环化外还可以防止______。研究发现，P24基因的cDNA缺乏这两种限制酶的识别序列。为此，在设计PCR引物时，需要在引物的_____端加入限制酶的识别序列。 逆转录 反向连接 5' 课 堂 检 测 (3)将重组质粒（含卡那霉素抗性基因）导入宿主菌体细胞后，进行的部分操作及结果如下图所示。图中①②两处的接种方法______（填“相同”或“不同”）。蛋白凝胶分析结果图中，1为蛋白Marker，2为不含物质A的菌液，3为含物质A的菌液，实验结果说明P24较高的是______（填“2”或“3”），据此推测物质A的作用是 。 不同 3 物质A能诱导P24基因的表达 课 堂 检 测 $