专题15 基因工程（6年汇编）（重庆专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 1年汇编1年模拟 考点分类 重庆考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2023重庆（1题） · 情境设置：以目的基因扩增和酶切操作为背景。 · 考查重点：聚合酶链式反应、引物设计及限制酶作用特点。 · 命题趋势：注重结合序列信息判断扩增产物和酶切结果。 考点2 基因工程综合 2026重庆（1题）、2025重庆（1题）、2024重庆（1题）、2022重庆（1题） · 情境设置：围绕农业育种、动物适应性和疾病治疗创设真实情境。 · 考查重点：综合考查基因功能探究、表达调控、实验设计及技术应用。 · 命题趋势：突出多环节推理，强化实验结果分析与证据链构建。 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 2022重庆（1题） · 情境设置：以人工长效胰岛素的研发为载体。 · 考查重点：蛋白质结构改变、功能优化及蛋白质工程基本思路。 · 命题趋势：加强基因工程与蛋白质工程的辨析及应用联系。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 考点2 基因工程综合 1．（2026·重庆·高考真题）研究者用改造过的巨噬细胞膜包裹药物治疗患乳腺癌的小鼠，实验设计如图甲所示。 （1）过程①获得的巨噬细胞来源于小鼠骨髓中的___________。 （2）据下表所示，最适合被M蛋白识别的膜蛋白是___________。 细胞类型 高表达的细胞膜蛋白 乳腺癌细胞 H蛋白 T蛋白 上皮细胞 R蛋白 E蛋白 成纤维细胞 F蛋白 T蛋白 （3）图乙是限制酶酶切后的M基因序列、载体部分结构及酶切位点（不考虑未标明序列）。要构建正确的重组载体，用于切割载体的限制酶应是___________。载体与M基因片段连接时需使用的酶是___________。 （4）研究者将上述重组载体转入巨噬细胞后，能检测到M基因但没有M蛋白。因此研究者更换了载体的启动子，成功获得了表达M蛋白的巨噬细胞。更换启动子可使M基因表达的原因是______________________________________。 （5）研究者用含有M蛋白的巨噬细胞膜包裹药物治疗乳腺癌小鼠，结果显示：同样的药物，用含M蛋白的巨噬细胞膜包裹的治疗效果优于未改造的巨噬细胞膜包裹的治疗效果，前者的优点是____________（多选）。 A．保护药物不被降解 B．可靶向乳腺癌细胞 C．降低药物对健康细胞的毒性 D．可吞噬乳腺癌细胞 2．（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 （1）研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ①________； ②将_______分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定_______，明确蛋白之间的差异。 （2）树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是________。 （3）树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是________。 3．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 （1）基因S启动子的基本组成单位是____________。 （2）通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是____________。 （3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有______________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。 （4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________。 4．（2022·重庆·高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。 步骤I： 步骤II： （1）花药培养能缩短育种年限，原因是________。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含________的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是________。 （2）步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是________；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有________。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加________。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的________，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是________，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产 1．（2026·重庆好教育·二诊）纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、可溶性、低生产成本且能结合多种表位等优势，在疾病的预防、诊断和治疗方面有着广阔的应用前景。利用噬菌体展示技术制备纳米抗体（抗体展示在噬菌体表面）的流程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．同一个体不同细胞中的遗传物质相同，因此过程①可分离B或T淋巴细胞提取总RNA B．过程②逆转录PCR中，利用逆转录酶即可获得编码纳米抗体的基因双链片段 C．过程②纳米抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因融合插入载体中，利用抗原一抗体特异性结合筛选噬菌体 D．过程③可选择转化骨髓瘤细胞，利用骨髓瘤细胞无限增殖的特点生产足够数量的纳米抗体 2．（2026·重庆一中·模拟预测）重组DNA技术在为人们提供需要的生物新品种或新产品方面发挥了重要作用，下图为该技术在其中一些方面应用实例的流程图，下列说法正确的是（　　）    A．①过程常采用的技术是Ca²⁺处理法，原理是Ca²⁺可以让细胞处于易吸收外界DNA的状态 B．细胞Ⅰ主要从动物脾脏中获取，一种病原体能激活机体形成多种细胞Ⅰ C．细胞Ⅱ还可通过动物细胞融合技术获得，检测筛选细胞Ⅱ时需要使用特异性抗体 D．为保证植物叶绿素的正常合成和植物组织的正常发育，④整个过程必须要在光照下完成 3．（2026·重庆第二外国语学校·模拟预测）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左往右。为使乳酸杆菌产生该酶，以图中质粒为载体进行转基因，下列说法不正确的是（    ） 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT A．家禽肠道内乳酸杆菌细胞呼吸产生的物质可抑制某些微生物生长 B．限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来，种类繁多且具有专一性 C．在受体细胞中，W基因转录时以乙链为模板，可以边转录边翻译 D．为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒 4．（2026·重庆八中·一模）近年来,里氏木霉（常作为纤维素酶工业生产菌株）被改造为高效生产药用蛋白的“细胞工厂”。操作流程如图所示,下列有关叙述正确的是（    ） A．敲除内源纤维素酶基因的核心目的是避免发酵产物被降解 B．转入人源溶酶体酶基因后,可通过PCR等技术检测其是否整合到里氏木霉的基因组中 C．配制图中培养基时可以以蛋白胨为氮源、纤维素为碳源 D．相比该工程菌,大肠杆菌合成的药用蛋白更接近于人体细胞产物 5．（2026·重庆八中·模拟预测）研究表明80%的结直肠癌患者的A基因（肿瘤抑制基因）突变产生A-基因，A-表达的错误蛋白不行使正常功能且会干扰正常A蛋白发挥作用。Cre-loxP系统可通过删除DNA特定位点的Stop序列，调控目标基因的表达，原理如下图。科研人员利用该系统构建A基因杂合突变的结直肠癌模型鼠，且只允许突变基因A-在该鼠肠上皮细胞表达。具体操作中，研究人员需对两只野生型鼠分别转基因，然后从它们的杂交后代中筛选目标个体。下列相关叙述错误的是（　　）    A．启动子和目标基因间插入loxP-Stop-IoxP序列后，目标基因不表达 B．Cre酶可通过识别loxP位点敲除Stop序列，实现目标基因的表达 C．导入一只野生型鼠的基因及调控序列为   D．导入另一只野生型鼠的基因及调控序列为   6．（2026·重庆九龙坡·二调）如图，  pBI121是人工构建的双元表达载体，由大肠杆菌质粒、农杆菌 Ti质粒 T-DNA转移元件及植物表达调控元件组合而成。我国科学家将 Bt抗虫基因插入 pBI121后，通过花粉管注射或农杆菌介导法转化，成功培育出可稳定遗传的抗虫棉。下列相关说法错误的是（    ） A．在植物细胞中含有抗虫基因的pBI121 重组质粒能正常复制和增殖 B．抗虫基因需重组到棉花细胞的染色体上才能传代抗虫性状 C．通过GUS 水解X-Gluc产生蓝色可以检测抗虫基因的表达 D．棉铃虫对抗虫棉产生的显性抗性比隐性抗性的基因频率增加更快 7．（2026·重庆巴蜀中学·一模）科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 8．（2026·重庆八中·模拟预测）为探究猪流行性腹泻病毒蛋白Nsp15是否与宿主蛋白SLC25a3结合，研究人员构建两种重组质粒分别表达融合蛋白Flag-Nsp15和Myc-SLC25a3，转化后获得三组细胞（①、②、③）。利用抗Flag抗体分别收集各组中能与之结合的蛋白，再分别用抗Flag、抗Myc的单克隆抗体检测，同时取各组细胞总蛋白进行相同检测，结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．制备抗Flag单克隆抗体时需在已免疫动物体内分离得到记忆B细胞作为材料 B．若使用抗Myc抗体收集蛋白，则①组中同样会出现Flag条带 C．②组IP产物中无Myc条带，说明细胞内不表达SLC25a3蛋白 D．③组IP产物中有Myc条带，表明Nsp15能与SLC25a3结合 9．（2026·重庆彭水第一中学校·模拟预测）口服α—干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。请回答下列问题： （1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______。由于DNA复制时，子链只能由5'向3’方向延伸，故可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______作为引物。 （2）步骤②用到的农杆菌Ti质粒的功能是：______。图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和______，后者利用了细胞______的原理。 （3）如果将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，早期胚胎培养至______阶段，然后进行胚胎移植，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为______。 （4）干扰素体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70℃条件下保存半年，给广大患者带来福音。对蛋白质进行改造，应该直接对基因进行操作来实现对蛋白质的改造。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过______或______，对______进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产或生活需要。 10．（2026·重庆南开中学·模拟预测）科学家研究发现，小麦的抗旱性跟 TaPPR13 基因的表达水平呈正相关，科研人员欲将强启动子SV40插入 TaPPR13 基因上游，构建重组表达载体以提高其表达量。下图为载体结构及目标基因编辑区域示意图（注: SalⅠ、EcoRⅠ、 BsaⅠ、 Xho Ⅰ、 NocⅠ、 MonⅠ为限制酶, NocⅠ、 MonⅠ为非回文序列的稀有限制酶；LacZ基因表达的酶可催化X-gal物质转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则呈白色；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题： （1）首先需要将TaPPR13 基因插入到质粒上,需要用限制酶 XhoⅠ与 SalⅠ分别对TaPPR13 基因和质粒分别酶切。连接时基因与质粒以相同限制酶切割位点进行连接为正向连接，以不相同限制酶切割位点进行连接为反向连接。为获得反向连接的重组质粒，可用______酶对连接产物进行鉴定，不能酶切的即是。 （2）科研人员需通过PCR 技术扩增强启动子SV40片段，设计PCR 引物时，需确保两端的引物序列分别与SV40片段的______（填“5'端”或“3'端”）序列互补,若b链为 TaPPR13 基因的模板链,要使扩增的SV40片段能定向插入TaPPR13 基因上游的特定区域，还需分别在两种引物的5'端添加______酶和 EcoR I酶的识别序列。 （3）需将导入重组表达载体的大肠杆菌接种到含______的选择培养基上培养，培养后筛选出______（填“蓝色”或“白色”）菌落。 （4）将构建成功的重组表达载体成功导入小麦细胞后，需检测TaPPR13基因的表达水平，检测结果若为______，则说明强启动子SV40发挥作用，TaPPR13 基因表达量比非转基因小麦高。 11．（2026·重庆八中·模拟预测）科学家通过 PCR 技术可诱导干扰素基因的中间位点发生突变，即定点突变PCR 技术（重叠延伸 PCR），是通过带突变位点的引物扩增出两段含突变重叠区的片段，再通过片段杂交、延伸获得完整突变基因，过程如图。根据信息回答下列问题： （1）利用此方法获得突变基因，设计引物2和引物3的序列的要求是_____。（答两点） （2）PCR1和PCR2_____（填“能”或“不能”）在同一个反应体系里面进行，主要原因是_____。 （3）④混合、变性后，杂交会产生_____种新的产物，画出不可以扩增出目标突变基因的杂交产物_____。 （4）过程⑤是否需要加入引物和模板，原因是_____。 12．（2026·重庆第二外国语学校·模拟预测）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白相互作用的研究 蛋白相互作用是指蛋白质之间相互结合并发挥特定的生物学功能的现象，是生物分子之间交互作用的重要形式。IKK 复合体由IKKα、IKKβ和 NEMO 三个亚基组成，细胞周期调控激酶 PLK1是一种催化蛋白质磷酸化的酶。PLK1 可通过磷酸化 IKKβ抑制IKK复合体的活化，为研究 PLK1 与 IKK 的互作，进而确定IKK 的作用机制，进行了如下实验。 研究人员通过免疫共沉淀技术进行研究。该技术的原理是，在细胞内如果 A蛋白能够与B蛋白结合，若用预先固定在琼脂糖珠子上的蛋白A 的抗体去沉淀 A蛋白，则B也会一起沉淀下来。通过检测沉淀中是否存在B蛋白，即可确定 A和B蛋白是否存在相互作用。研究人员向人胚肾 H细胞中转入分别含有Flag—PLK1融合基因和Myc-NEMO融合基因的表达载体，将细胞裂解后，用含有抗 Flag 抗体的琼脂糖珠子进行沉淀。检测细胞裂解液和沉淀中蛋白情况，结果如图 1。用同样方法研究了 PLK1 与 IKKα、IKKβ相互作用的情况，结果如图2。      Pull-down实验也是研究蛋白质相互作用的方法。将细胞裂解，获得含有待测蛋白的细胞裂解液。在体外，利用一种带有特定蛋白标签（如GST）的纯化融合蛋白作为钓饵，与细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，利用抗体检测并鉴定沉淀中的蛋白。研究人员利用该技术验证了PLK1与NEMO的相互作用情况，结果见图3。 利用上述两种技术，研究人员初步确定了PLK1发挥作用的分子机制。 （1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个_____和终止子，翻译时所用起始密码子和终止密码子_____。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，研究人员通过_____技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是_____。免疫共沉淀实验结果表明_____。 （3）根据 Pull--down 实验结果推测 PLK1 不能与 NEMO 直接结合。请补充Pull-down实验的操作步骤（从下列选项中选择）：纯化_____蛋白→将含有_____基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定。 A.GST-PLK1   B.His-PLK1   C.GST-NEMO   D.His-NEMO   E.GST （4）依据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果，请尝试解释PLK1蛋白作用于IKK复合体的机制_____。 13．（2026·重庆·模拟预测）微藻中的SqME基因在烟草（双子叶植物）中异源表达后，可增强光合效率并促进脂质积累。而在SqME基因下游插入DNA片段N（转录后会被剪接）可显著提升SqME的表达量，进而提高脂质产量。某研究单位构建了SqME超表达载体，将其导入烟草用于生产生物柴油，流程如图所示。 （1）运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是______。若该引物较长且G-C碱基对比例高，在PCR扩增过程中可适当______复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 （2）为了使DNA片段N正确插入Ti-SqME的表达载体上，需要在扩增N时所用的两种引物的5′端加上______（填限制酶）的识别序列。 （3）若采用农杆菌转化法将Ti-SqME-N表达载体导入烟草，需先将Ti-SqME-N表达载体导入农杆菌，在培养农杆菌的培养基加入______和______分别有利于提高转化效率和筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。为将农杆菌中Ti-SqME-N表达载体导入烟草，具体的转化方法可以是__________（填一种即可）。另外还可以采用我国科学家独创的方法：______________，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 14．（2026·重庆八中·模拟预测）人乳铁蛋白（hLF）是一种具有抗菌、抗病毒功能的珍贵药用蛋白，天然存在于人乳汁中，但提取困难且成本高昂。科学家计划利用乳腺生物反应器技术，将人乳铁蛋白基因导入山羊基因组中，使其在乳腺细胞中高效表达，从而通过收集羊奶来工业化生产该蛋白。已知只有将过程①获得的hLF基因置于 BLG 基因调控区下游，才能使其在动物乳腺组织中特异性表达。下图是科研人员构建基因表达载体及培育转基因山羊的部分流程示意图。 请回答下列问题。 （1）图1中，为确保过程①获取的hLF 基因能正确插入BLG 基因调控区下游，还需要在 hLF基因上、下游引物的5'端分别插入__________酶的识别序列。图2中C的发育阶段通常为___________。 （2）为了检测转基因山羊是否培育成功，科研人员进行了多层面的检测： ①分子水平检测：提取转基因山羊乳腺细胞的DNA，除PCR 外，还可利用______________技术检测 hLF基因是否整合到染色体DNA 上；提取___________，利用抗原—抗体杂交技术检测是否产生了人乳铁蛋白。 ②个体水平鉴定：若检测到乳汁中含有活性的人乳铁蛋白，说明转基因动物制备成功。与传统的大肠杆菌发酵工程生产相比，利用乳腺生物反应器生产的优势在于____________（答两点）。 （3）在实际操作中，科研人员发现部分转基因克隆羊虽然基因组中整合了hLF基因，但其乳汁中并未检测到目标蛋白，或者蛋白产量极低。请结合表观遗传学或基因表达调控的知识，分析造成这种现象的可能原因有___________（答两点）。 15．（2026·重庆西南大学附属中学·模拟预测）研究者将红球菌中两种合成类胡萝卜素的关键酶基因B及基因C导入衣藻，使其成为生产类胡萝卜素的“细胞工厂”，图1为基因表达载体的构建过程和相应限制酶的识别序列。 （1）选用限制酶分别对质粒1和质粒2进行酶切，并将基因B插入具有高表达启动子的质粒2中构建重组质粒。质粒2中高表达启动子位于_______（填“Ⅰ”或“Ⅱ”）处，理由是____________。 （2）用EcoR Ⅴ处理质粒3产生________末端；用EcoR Ⅰ处理重组质粒获得具有黏性末端且含基因B的DNA片段；为使含基因B的DNA片段与质粒3相连，可利用_______酶处理黏性末端，再利用____________酶使两者高效连接构建基因表达载体。 （3）将载体导入衣藻后，初步在含________的培养基上培养，得到衣藻转化体1、2，研究者依据目的基因B和C的序列设计引物，利用PCR技术分别确定基因表达载体上目的基因B和C的导入情况，电泳结果如下图所示： 通过电泳结果可得知成功导入基因表达载体的是衣藻转化体______（填“1”或“2”）。为检测两种基因的表达情况，后续可进行的操作是______________。 16．（2026·重庆大足中学&名校联盟·模拟预测）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和切割位点如表所示），其中LacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色，否则为白色。回答下列问题。 限制酶 BamH I EcoR I Sau3A I Sma I Xma I 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- ↓GATC- -CCC↓GGG- -C↓CCGGG- （1）科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于__________，该方法得到的DNA片段有多种可能。 （2）利用PCR技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物碱基序列为（注明序列的5′和3′端）________。 （3）为将目的基因准确插入质粒中，最好选用__________酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用__________（填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。 （4）为了筛选获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入________，培养一段时间挑选出呈__________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量的目的菌。 17．（2026·重庆康德·模拟预测）苏云金芽孢杆菌中含有一种抗虫基因 Bt基因，通过产生 Bt抗虫蛋白，杀死鳞翅目昆虫。科学家将从苏云金芽孢杆菌细胞内获取的 Bt基因与质粒1结合构建重组质粒2，然后导入普通棉花中，获得T₀代植株。 （1）已知 Bt基因两端的酶切位点如图1所示，P为启动子。研究者采用引物P₁（含 EcoRI识别序列）和P₂（含 BamHI识别序列） 对质粒1进行扩增,使质粒1线性化，再经酶切、连接，使Bt基因与质粒1重组为质粒2。请在图1质粒1处标出引物P₁和P₂的位置及方向。 （2）对不同T₀代植株进行PCR 检测，结果如下图。 代4号植株表现为非抗虫，但PCR 检测结果为____（填“阳性”或“阴性”），可能的原因是____。 a. Bt基因未导入 b. Bt基因所在染色体片段缺失 c. Bt基因突变 d. Bt基因表达效率太低 （3）将T₀代2号植株与普通棉花杂交获得T₁代，对T₁代进行抗虫鉴定，结果发现抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3：1，推测导入的 Bt基因位于_____上（填“同源染色体”或“非同源染色体”）。T₀代2号棉花自交，子代的性状分离比为____。 （4）长期单一种植抗虫棉可能会导致棉铃虫数量增加甚至爆发。科研人员借鉴传统农业中“间作”的方法，在转基因棉田中混种棉铃虫的寄主作物，作为棉田的“庇护所”，请用现代生物进化理论解释其原理____。 18．（2026·重庆九龙坡·二调）利用PET 降解酶（PETase）分解废弃PET塑料应用前景广阔。实验室拟分离纯化高效降解PET的微生物并提取相关酶，流程如图1所示。研究人员通过卷积神经网络机器学习辅助的蛋白质工程技术对其改造，获得性能更优的突变型 PET 降解酶，改造思路如图2所示。请回答下列问题： （1）图1 中样品可采集自 。 A．未被塑料污染的土壤 B．废旧塑料填埋场的土壤 C．能消化塑料的黄粉虫肠道内容物 D．生长于塑料填埋场的植物根组织 （2）关于图1中培养基及培养过程的说法，下列叙述正确的是 。 A．在培养基灭菌前制备平板 B．①号培养基的作用是使微生物富集 C．②③培养基应以PET为唯一碳源 D．③中PET 量最低的微生物为目标菌 （3）据图2，为获得性能更优 PET 降解酶，其技术路线依次为 （用字母和箭头表示） A．重组DNA分子导入大肠杆菌 B．改变的PET 酶基因与质粒重组 C．分析最优突变体的氨基酸序列 D．改变PET 酶基因的特定序列 E．利用工程菌发酵生产突变蛋白 （4）人工构建突变体时需要大量的目的基因和载体（质粒），其中扩增质粒常用的方法是______，构建好的重组表达载体导入大肠杆菌时常用的方法是______。 （5）科学家获得了 PET 酶突变体（PETaseS121E/D186H/R224/N233K）, 经测定在50°C, 酶活性提升了数十倍。请结合以上信息，推测突变体酶活性大幅提升的原因_________。 19．（2026·重庆八中·模拟预测）植物对盐胁迫形成了一系列适应机制，其中SOS信号途径是植物耐盐性的重要信号通路。禾本科植物谷子是一种抗逆耐贫瘠作物，探究其体内的SOS2蛋白和SOS3蛋白是否存在相互作用，能为培育抗逆作物新品种奠定基础。部分研究过程如下。 （1）首先从GenBank数据库中查询SOS2基因和SOS3基因的碱基序列，设计并合成特异性_____________，用于PCR扩增获得目的基因。若PCR产物符合预期结果，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的________________。 （2）研究者利用荧光性酶互补技术研究SOS2蛋白和SOS3蛋白是否存在相互作用，该技术中使用的荧光素酶被切割为无活性的氨基端片段（N端）和羧基端片段（C端），它们不能自发重组发挥作用，只有当它们分别融合能够相互作用的蛋白时，才能引发重组并能激发荧光素酶活性，从而产生荧光（其机理见图甲）。 ①研究者用Kpn Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切获得的SOS2基因和SOS3基因，分别插入p1载体、p2载体。SOS2基因两端的黏性末端分别为5′-GTAC-3′和5′-_______-3′，SOS3基因应插入p2载体的_____（填“Ⅰ”或“Ⅱ”）位点。 ②将载体导入叶片细胞（见图丙），荧光信号的检测结果见图丁。 图丙中ⅰ、ⅱ分别对应的基因是______、_____（填“cLUC”“nLUC”“cLUC-SOS2”或“nLUC-SOS3”）。图丁中_____可作为证据说明该区域叶肉细胞能合成SOS2-C端融合蛋白和SOS3-N端融合蛋白。 综上所述，谷子体内的SOS2蛋白和SOS3蛋白存在相互作用。 （3）研究表明Na+逆向转运蛋白SOS1对于植物耐盐性非常重要，它是抗盐胁迫的关键蛋白。根据图戊所示机制，解释盐胁迫下植物能实现Na+外排的原因是_______________。 20．（2026·重庆好教育·二诊）RNA沉默技术利用hpRNA（如图1所示）的双链部分（与靶基因的序列相同）特异性结合靶基因的mRNA，将其降解而抑制靶基因的表达。ZmHAK1基因在玉米的钾离子吸收、离子平衡、胁迫响应及生长发育中起关键作用。研究人员欲利用RNA沉默技术研究ZmHAK1基因的功能，进行了相关实验。回答下列问题： （1）研究人员需构建玉米ZmHAK1基因的hpRNA干扰载体，干扰载体中需含有如图2所示的目的片段。构建干扰载体的过程中需要使用的植物表达载体结构及其上的限制酶切割位点如图3所示，限制酶的识别序列和切割位点如表1所示。载体结构中，除了图3所示结构元件外，还未标明的结构元件有________。启动子的功能是________。 注：潮霉素抑制蛋白质合成后，叶绿素合成相关酶的含量不足，导致叶绿素无法正常合成，叶片就会逐渐变黄。 图3植物表达载体 限制酶 识别序列和切割位点 SmaI 5'-CCC↓GGG-3' ApaI 5'-GGGCC↓C-3' SpeI 5'-A↓CTAGT-3' XbaI 5'-T↓CTAGA-3' HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3' 表1 （2）研究人员获取ZmHAK1基因后，设计了如表2所示的引物F1和F2，利用PCR技术获取反向片段后，将获取的反向片段与酶切后的植物表达载体连接成重组载体1.为使正向片段与重组载体1正确连接形成重组载体2，用于PCR扩增正向片段的引物R1和R2的5′端应该分别增加限制酶________的识别序列。据题中信息分析，下列能正确表示引物R1序列的是________（填序号）。 A．5'-ACTAGTACCACTTGCGTCTGAGTCA-3′ B．5'-TCTAGAGCATCATCTACGGCGACAT-3' C．5'-TCTAGAACCACTTGCGTCTGAGTCA-3' D．5'-AAGCTTGCATCATCTACGGCGACAT-3' 引物名称 引物序列 F1 5'-GGGCCCGCATCATCTACGGCGACAT-3' F2 5'-ACTAGTACCACTTGCGTCTGAGTCA-3' 表2 （3）研究人员利用________法将目的基因导入玉米细胞中，经过脱分化形成________，经过再分化形成转基因玉米植株。 （4）在个体生物学水平上筛选转基因玉米植株，根据载体结构信息，设计一种可行的筛选方案：________。 21．（2026·重庆·二模）韧皮部杆菌（CLas）可引起柑橘黄龙病并导致柑橘植株死亡。西南大学柑橘研究所的科研人员发现，CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。为培育抗黄龙病柑橘，研究人员进行了相关实验。 （1）据图1分析，应选限制酶________切割质粒，为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因A端引物的________（填“5′”或“3′”）端添加________（填“SphI”“Sau3AI”或“MunI”）的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）将Ti质粒转入农杆菌，在含氨苄青霉素的培养基上培养得到多个单菌落。欲鉴定某单菌落是否为重组农杆菌从而用于柑橘外植体的感染，有两种鉴定方案。方案①：挑取该单菌落提取质粒，对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。方案②：挑取该单菌落转入3mL培养液，振荡培养12小时后取1mL提取质粒，再对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。你建议选择方案________（填“①”或“②”），理由是________。 （3）为鉴定获得的转基因柑橘植株是否抗病，研究人员对甲、乙、丙三组植株进行CLas菌接种实验，一段时间后检测剩余细菌相对数量。结果如图2所示。丙组抗病效果最好，结合题干信息分析机理为________。 22．（2026·渝西中学·模拟预测）科研人员将耐低磷基因（Pho基因）与抗虫基因（Bt基因）拼接成 Pho-Bt 融合基因，构建了含 Pho-Bt融合基因的表达载体，培育出耐低磷且抗豆荚螟的大豆新品种（如图）。 （1）与细胞内 DNA复制相比，融合PCR 构建融合基因时无需解旋酶参与，其特殊的解旋机制是_______；反应体系中dNTP 除作为DNA 合成原料外，还能_______。 （2）引物 2和引物 3的重叠区碱基序列必须_______，才能实现两基因的搭桥连接；搭桥杂交后的延伸过程，不需要额外添加引物，原因是_______；PCR1中，至少经过_______轮循环才能获得两端均含引物 1和引物 2的目标DNA 片段①。 （3）据载体图谱，为避免融合基因与质粒连接时发生自身环化和反向连接，需在引物 1和引物 4的 5'端分别添加_______、_______的识别序列。 23．（2026·重庆第十一中学校教育集团·模拟预测）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3' 3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3' 3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3' 3' CAGCT↑G5' （1）可从______中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。基因表达载体含有多个重要元件，其中启动子的作用是______。 （2）为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5'端和3'端分别添加限制酶______的酶切序列。若基因E11转录模板链的3'端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是______。 （3）使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有______的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。若1号菌落含有重组质粒，则其他菌落的条带出现的原因可能是______。 （4）将纯化得到的蛋白E11添加到含有______（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 24．（2026·重庆育才中学·模拟预测）人血清白蛋白（HSA）是一种血浆蛋白，在临床上应用广泛，需求量大。武汉大学开发出水稻胚乳生物反应器生产HSA。 （1）与利用转基因大肠杆菌相比，利用水稻胚乳生物反应器生产HSA的优点是_____________。 （2）为确保HSA基因只在胚乳中表达，筛选出基因Glua1和Sbe1，三种基因在水稻叶、根和胚乳中的表达量如表所示。 基因表达 叶 根 胚乳 Glua1表达量 0.5 3 101978 Sbe1表达量 27 25 1461 Xa1表达量 0.6 8 0 Xa1基因作为__________（阳性/阴性）对照组，构建表达载体时，应将HSA基因插入到_____________基因启动子之后，原因是___________________。 （3）GFP基因表达蛋白能够在紫外线照射下发出绿色荧光，为便于筛选成功导入的细胞，欲将GFP基因插入HSA基因下游形成融合基因，GFP及HSA基因的部分序列如下图所示： HSA GFP 5’ATG AAG TGG GTA……TTT CAT GAC AAT3’ 5’ATGAGTAAAAGA……TTGTCTCAAGAT3’ 3’TAC TTC ACC CAT……AAA GTA CTG TTA5’ 3’TACTCATTTCCT……AACAGAGTTCTA5’ 应选用的引物组合为_____________。 3’CTG TTA GAA GTA 5’ 3’GAA GTA TAC TTC 5’ 5’CTT CAT ATG AGT 3’ 5’CAA GAT CTT CAT 3’ 甲 乙 5’ATGAAG 3’ 3’TACTTC 5’ 3’GTTCTA 5’ 3’CAAGAT 5’ 丙 丁 注：所有引物只写出部分序列 （4）将融合后的目的基因导入到农杆菌，再侵染水稻的愈伤组织，培育出水稻胚乳生物反应器，紫外线照射后，_____________表示HSA基因在水稻胚乳中特异性表达。 （5）由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，科学家将α-淀粉酶基因与HAS基因一起转入水稻，目的是_____________。 25．（2026·重庆八中·模拟预测）苏云金芽孢杆菌中含有一种抗虫基因 Bt基因，通过产生 Bt抗虫蛋白，杀死鳞翅目昆虫。科学家将 Bt基因与质粒1结合构建重组质粒2，然后导入普通棉花中，获得T0代植株。 （1）由于Bt基因序列已知，可以从___________中快速检索获取其完整序列。 （2）已知 Bt基因两端的酶切位点如图1所示，P为启动子。 研究者采用引物P1（含 EcoRI 识别序列）和P2（含 BamHI 识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使Bt基因与质粒1重组为质粒2。请从下列选项中选出正确的引物P1和P2的位置及方向___________（单选）。 a.   b. c.  d. （3）对不同 T₀代植株进行 PCR 检测，结果如图2。T₀代4号植株表现为非抗虫，但 PCR 检测结果为___________（填“阳性”或“阴性”），可能的原因是___________（多选）。 a． Bt基因未导入 b． Bt 基因所在染色体片段缺失 c． Bt基因突变 d．Bt基因表达效率太低 （4）已知向 T0代2号植株中成功导入两个 Bt 基因，现将其与普通棉花杂交获得T1代，T1代中抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3：1，据此推测导入的 Bt基因位于___________上填（“同源染色体”或“非同源染色体”）。T0代2号植株自交，子代的性状分离比为___________。 26．（2026·重庆巴蜀中学校·二模）司美格鲁肽被当作“减肥神药”在社会上遭到热议，其有效成分为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物。某团队将相关基因连入载体后导入人源HEK-293细胞，再将导入成功的细胞移植至小鼠体内，成功构建出光照下可合成GLP-1的糖尿病治疗模型小鼠，机制如图所示。请回答下列问题： （1）哺乳动物肠道L细胞会分泌GLP-1，可通过提取哺乳动物肠道L细胞RNA，逆转录生成DNA，再利用_____（填写中文全称）扩增GLP-1基因。 （2）GLP-1基因及选择质粒的结构如图甲、乙所示，为保证GLP-1基因能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2．GLP-1基因的转录方向为_____（填“从左往右”或“从右往左”）；引物1序列为5′—_____—3′（写10个碱基即可）。 （3）构建载体时选用组成型启动子（核心特点是驱动基因持续表达，不受外界条件、细胞类型及发育阶段影响）和诱导型启动子（基础状态下驱动基因低表达或不表达，仅受特定外界信号诱导后才启动或增强转录）。启动子1、2、3依次是_____（填“组成型”或“诱导型”）启动子。 （4）从免疫角度推测，用水凝胶囊包裹人源HEK-293细胞的目的是_____。 27．（2026·重庆南开中学·模拟预测）白桦是我国重要的绿化树种，BpMYB5基因是调控白桦耐盐性的关键基因，为验证该基因的耐盐功能，研究人员利用无缝克隆技术，将BpMYB5基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP过表达载体，开展相关实验研究。回答下列问题： 注：KanR为卡那霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。 （1）过程①是利用PCR技术将质粒线性化，传统方法是利用限制酶在对应酶切位点进行切割，与限制酶切方法相比，过程①的优点是______，该过程中引物应选择______。 （2）为确保BpMYB5基因与eGFP基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物设计时，应去除BpMYB5基因中编码终止密码子的序列。已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA链）的部分序列如下表（AUG为起始密码子，UAG、UAA、UGA为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1的碱基序列应为5'-_______-3'（写出15个碱基）。融合基因必须插入到T-DNA内部的原因是______。 BpMYB5基因序列 5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3' eGFP基因序列 5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3' （3）实验人员对农杆菌感染后的白桦愈伤组织进行筛选，应该在培养基中添加的抗生素为______，将筛选得到的转基因愈伤组织经培养可获得转基因白桦植株，通过观察______以了解BpMYB5基因的表达水平和表达部位。 28．（2026·重庆巴蜀中学·模拟预测）天仙子植株产生的托品烷类生物碱是临床上广泛应用的抗胆碱药物，其生物合成可能与天仙子植株的根中大量表达的T3 基因有关。为鉴定T3 基因的功能，可通过病毒诱导法改变T3基因的表达，并测定托品烷类生物碱的含量。结果如图所示。 （1）根据上述研究结果，说明病毒诱导法__________（填“促进”或“抑制”）T3基因表达，进而影响托品烷类生物碱的合成量。 （2）基因表达量的检测方法是对天仙子根的RNA 进行处理从而得到的_________作为荧光定量PCR 检测模板，在PCR 反应体系中加入一种 Taqman 探针，该探针5'端标记荧光基团 （R），3'端标记淬灭剂 （Q）。当探针保持完整时，荧光基团与淬灭剂距离较近，荧光被淬灭，检测不到荧光信号；当PCR 进行延伸反应时，TaqDNA聚合酶将探针进行酶切，使荧光基团与淬灭剂分离，荧光不再被淬灭。荧光信号可被仪器检测，过程如图所示。荧光定量PCR 仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与核酸浓度有关，核酸浓度越高，Ct值越______，进而根据Ct值检测各基因的相对表达量。 （3）科学家获得一株托品烷类高表达的天仙子（突变株甲），其性状改变与5号染色体DNA 的880kb~903kb区间相关。根据野生型天仙子的该区间设计连续的重叠引物，提取突变株天仙子和野生型的基因组 DNA 进行PCR，产物扩增结果如图所示。 据图推测5号染色体上第________对引物对应的区间内碱基对的_________是突变体甲出现的根本原因。为后续高效构建高表达目的基因的表达载体，扩增目的基因设计引物时，可在引物的_______端添加不同的限制酶的识别序列，以适合不同的质粒。 29．（2026·重庆一中·一模）科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因（位于小鼠5号染色体）融合,形成Gata3-GFP融合基因,构建并筛选只含一个融合基因的基因表达载体。载体注射到小鼠受精卵后,会替代原Gata3基因整合到染色体上。科研人员最后筛选获得能正常表达融合蛋白的雌､雄小鼠各一只。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图1注所示,A､B､C､F､R为不同引物,回答相关问题: （1）为了使GFP基因能正确插入载体,在PCR扩增GFP编码序列前,需要设计引物F和R,其序列分别为________和________（填序号）。 ①5′-CCCCTCGAGAAAAACACTTTTTGATATTCG-3′ ②5′-CCCGAATTCTTCTAGATGACCACAAGATAG-3′ ③5′-CCCCAATTGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3′ ④5′-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3′ （2）若要确定小鼠细胞中是否只导入了一个融合基因,可选择引物________（从“A”､“B”､“C”中选择）用于PCR扩增并电泳（如图2）,结果________（填“甲”､“乙”或“丙”）可说明小鼠细胞中只导入了一个融合基因,原因是_____________。 （3）已知上述两只小鼠细胞中都只导入了一个融合基因,杂交后获得F1若干,将体细胞中都含有两个融合基因的雌雄个体杂交,不考虑变异,则F2中荧光小鼠理论上约占________。 （4）不对称PCR技术可获得特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针来检测特定基因,其基本原理是采用不等量的一对引物P1和P2,经若干次循环后,低浓度的引物P1被耗尽,以后的循环只产生含高浓度引物P2的延伸产物。若反应体系中原有m个模板DNA,最初8次循环后P1耗尽,此时消耗了________个引物P1,再进行10次循环后一共消耗了________个引物P2。 30．（2026·重庆巴蜀中学·一模）某家系中有个体患甲病（由A/a控制）和乙病（由B/b控制），图1是该家系的系谱图，图2是该家系中部分成员的基因检测结果（条带①②代表一对等位基因，③④代表另一对等位基因）。同一对等位基因的常规引物可通用。已知Ⅱ-4只患乙病。请回答下列问题： （1）乙病为____遗传病，Ⅲ2和Ⅲ3患病情况分别是____。 （2）现欲通过PCR检测IV1的基因组成情况，利用孕妇外周血中胎儿游离DNA（cfDNA）进行筛查。但cfDNA只占母体血液总DNA的5%~10%，且高度降解，完好模板数量极微，普通PCR难以扩增出目的条带。因此选择巢式PCR进行扩增（如图3），在PCR常规引物的基础上设计补充内引物，利用两对引物进行两次PCR扩增，极大提升了检验的灵敏度。 ①第一次PCR利用____（填“常规”或“补充内”）引物进行扩增；第一次PCR扩增产物作为模板加入第二次PCR扩增体系，请从引物的角度分析，在第二次扩增前稀释第一次扩增产物的原因是____。 ②巢式PCR能在初始模板浓度很低的情况下仍能获得明显的目的条带，检验灵敏度高、特异性强的原因是____。 ③由PCR检验及其他产前筛查结果得知，IV1为健康男性，PCR检验结果出现三个条带，请在图1lii中画出这三个条带的位置__________。 31．（2026·重庆一中·模拟预测）球孢白僵菌是一种应用广泛的昆虫病原真菌，科研人员欲利用同源重组技术敲除球孢白僵菌中M基因（利用同源臂之间的序列会发生交换的特性，用抗氯嘧磺隆基因sur置换M基因以实现基因敲除）。回答下列问题： （1）通过PCR技术大量获得sur基因，该过程中使用的酶为________，为了激活该酶，需要在PCR反应缓冲液中添加________。为将sur基因正确连接进质粒1，在引物设计时应分别往引物1与引物2的5'端添加________的识别序列（图甲）。 （2）将成功插入sur的重组质粒1导入球孢白僵菌，在含有________的固体培养基上进行培养。为了排除宿主基因组外的sur表达对抗性筛选的影响，对球孢白僵菌的培养应在________（填“大于”或“小于”）23℃的温度条件下进行。结果发现部分长出菌落的菌株中M基因仍存在，经过分析发现，sur基因整合到球孢白僵菌基因组中时，除了同源重组的方式外，还能发生T-DNA随机插入，导致目的基因未被敲除但菌株能通过抗性筛选进而出现假阳性（图乙）。 （3）为避免假阳性对实验结果的干扰，现将OpS3基因插入质粒2（图丙），再利用质粒2通过同源重组的方式将“启动子-OpS3-终止子”片段插入重组质粒1中（OpS3基因可使球孢白僵菌合成红色卵孢素）。若质粒2上的LB₂片段的序列设计成与质粒1中的RB₁片段相同，那么RB₂的序列应与质粒1中________（从“A~D”中选填）之间的部分片段相同。 A．复制原点与左边界 B．左边界与LB₁。 C．LB₁与RB₁ D．RB₁与右边界 （4）将改造后的重组质粒1导入野生型球孢白僵菌中，在适宜温度条件下于抗性筛选平板上进行稀释涂布培养，在培养基上呈现________（填“红色”或“白色”）的菌株为M基因成功敲除菌株。 32．（2026·重庆大足中学&七校联盟·模拟预测）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）基因工程的核心步骤是________。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5’端分别引入________限制酶识别序列。本实验中，从基因N扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。 （2）构建完成的重组质粒大小约9.5 kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。为进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳检测结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA、GCC、GCU、GCG。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，_______是诱变第243位苯丙氨酸的引物。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ c：5′-…GCT/CCC/GAG/CGT/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ d：5′-…GAG/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ 33．（2026·重庆一中·二模）辣椒遗传转化的成功率低，筛选难度大｡研究人员以甜菜红素合成基因RUBY为核心构建了可视化载体pKSE-RUBY，使重组细胞在愈伤组织阶段即可表现出肉眼可见的红色，大幅提高了辣椒转化､筛选的效率｡载体构建过程如下图所示： 根据图中信息回答以下问题： （1）扩增基因：基因扩增时需要引物，原因是____；扩增RUBY时，上游引物应选择引物____（填序号）｡ （2）处理载体：线性化的载体能提高同源重组的效率，图中以EcoRI切开质粒pKSE，再用DNA聚合酶将黏性末端补平，获得线性化载体｡另外，用____的方法也能获得线性化载体｡ （3）同源重组：由于目的基因与线性化载体的同源区段可发生交换，因此在RUBY两侧需引入同源臂｡ ①同源臂包含限制酶识别序列及15个碱基对组成的特异性序列，为保证EcoRI能在重组质粒上RUBY基因两侧进行切割，下游引物的5'端需添加____个核苷酸，写出下游引物额外添加序列中3'端的10个碱基：5'-____-3'｡ ②常规的基因表达载体构建过程会用到两种不同的限制酶，图中同源重组的过程中只用到EcoRI一种限制酶，但仍能高效地构建重组质粒，且目的基因能正确连接，原因是____｡ （4）鉴定质粒：已知pKSE的全长为16437bp，RUBY基因全长为3951bp，则重组质粒经EcoRI切割后，再将黏性末端补平，会得到长度为____的片段｡ 34．（2026·重庆育才中学·模拟预测）丙酮酸作为细胞呼吸的中间产物，常作为高价值化合物合成的重要调控靶点，大肠杆菌的PdhR蛋白可作为丙酮酸响应的抑制因子，但其应用局限于原核生物。为在酵母菌中构建基于大肠杆菌PdhR蛋白的丙酮酸响应生物传感器，研究人员进行了系列研究。请回答下列问题： （1）研究人员构建了NLS—PdhR—CLN2融合基因（如图1）。为确保NLS基因连接的准确性，需使用限制酶________切割启动子A和PdhR基因间的序列。改造后的PdhR蛋白既可以调控酵母菌核基因的表达，又能维持PdhR蛋白含量的稳态，已知NLS是核定位信号，那么CLN2基因的作用可能是促进PdhR蛋白________（填“合成”或“降解”）。 （2）图2是丙酮酸响应生物传感器。组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的活性，据图2可知，当丙酮酸浓度升高时，酵母菌会发绿色荧光，原因是________。 （3）启动子B由天然启动子B0改造而来。研究表明，PdhR蛋白不能识别并结合天然启动子B0；科研人员通过在B0下游插入特定序列，获得了图2所示的改造启动子B，并通过实验（如图3）证明PdhR蛋白能特异性识别并结合启动子B，由此推测，实验中P是指无荧光标记的_________（填“启动子B”或“无关启动子”），并在泳道5的方框中补充可能的条带宽度_________。 （4）成功转化丙酮酸响应生物传感器的酵母菌适宜在_________（填“固体”或“液体”）培养基中扩大培养。 35．（2026·重庆西南大学附中·模拟预测）病毒诱导的基因沉默（VIGS）是将某植物的特定内源基因片段通过重组病毒载体导入该植物，从而抑制体内相应内源基因表达的技术；其原理是载体携带的该目的基因片段在植物体内产生的RNA，会引导细胞内同源的内源mRNA降解。为在外来入侵物种刺萼龙葵中建立VIGS技术体系，研究人员拟利用一种TRV病毒—质粒融合载体（pTRV）（图1），对其八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因进行沉默实验。PDS基因沉默会导致叶片出现光漂白（变白）现象。 回答下列问题： （1）PDS基因片段的克隆。提取刺萼龙葵叶片细胞的总RNA，经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，用引物F1（5′-CGGGATCCGCGATAGGGTGACAGATGA-3′）和R1（5′-CGGAATTCACACACTGACAGCAACG-3′）进行PCR扩增。PCR过程中，将温度加热至90~95℃的目的是_______。 （2）pTRV-PDS重组载体的构建。为将上述PDS基因片段准确插入pTRV载体的相应酶切位点，应选用______对Ti质粒和PDS基因片段进行双酶切，然后连接。 （3）对重组载体进行鉴定。结果如图2，泳道1、2是pTRV-PDS的双酶切产物，泳道5、6是以pTRV-PDS为模板、用PDS基因片段特异性引物进行PCR的产物（外源PDS基因片段长度为498bp）。 ①泳道1、2的500bp条带比泳道5、6的暗，原因是_________。 ②泳道3、4是出于某种目的设置的对照组，根据电泳结果图推测其样本处理方式应为_________（填字母）。 A.空载pTRV质粒的双酶切产物 B.空载pTRV质粒经相同引物的PCR产物 C.重组pTRV-PDS质粒的单酶切产物 D.重组pTRV-PDS质粒的未酶切产物 （4）基因沉默效果的鉴定。将携带介导细胞间转移的运动蛋白基因的pTRV-PDS重组载体导入农杆菌，并通过叶片注射进行侵染。基于该载体的这一特性，使沉默效应系统性扩散_________（填“需要”或“不需要”）经过植物组织培养阶段。植株出现光漂白症状后，为从分子水平证实PDS基因被沉默，可从叶片细胞提取总RNA，经逆转录后，用PCR技术检测。此时，用于PCR的引物应依据______（填“插入载体的PDS基因片段内部区域”或“插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域”）进行设计，理由是_______。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】B 考点2 基因工程综合 1.【答案】（1）造血干细胞 （2）H蛋白 （3）Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ DNA连接酶 （4）更换后的启动子可以被巨噬细胞内的RNA聚合酶识别并结合，启动M基因的转录，进而翻译产生M蛋白 （5）BC 2.【答案】（1）克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因 目的基因与载体 氨基酸序列 （2）利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。 （3）树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择 3.【答案】（1）脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） （2）EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接） （3）酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR （4）品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 4.【答案】（1）单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 （2）cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】A 1.【答案】C 2.【答案】B 3.【答案】D 4.【答案】B 5.【答案】D 6.【答案】A 7.【答案】B 8.【答案】D 9.【答案】（1）干扰素基因两端的部分核苷酸序列 B、C （2）将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上 植物细胞工程 增殖 （3）桑椹胚或囊胚 乳房生物反应器（或乳腺生物反应器） （4）基因修饰 基因合成 现有蛋白质 10.【答案】（1）XhoⅠ和SalⅠ （2）3'端 MonⅠ （3）X-gal和氨苄青霉素 白色 （4）转基因小麦中TaPPR13蛋白含量高于非转基因小麦 11.【答案】（1）都带有突变位点的突变序列；二者碱基序列可以互补配对 （2）不能 引物2和引物3可以互补配对，会相互结合，无法和模板DNA结合发挥引物作用 （3）2 （4）不需要，杂交后的重叠单链可以互为引物和模板，直接完成延伸 12.【答案】（1）启动子 相同 （2）抗原抗体杂交 检测并鉴定导入的Flag-PLK1和Myc-NEMO基因是否正常表达 PLK1 与 NEMO 存在相互作用， PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用 （3）EA D （4）PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化 13.【答案】（1）S-F和S-R 提高 （2）EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ （3）Ca2+ 卡那霉素 方案1：将农杆菌与烟草组织共同培养，利用植物组织培养技术获得烟草植株，再进行筛选、鉴定。方案2：将烟草花直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。（填一种即可） 花粉管通道法 14.【答案】（1）NheⅠ和SalⅠ（或BamHⅠ） 桑葚胚或囊胚期 （2）DNA分子杂交 山羊乳腺细胞中的蛋白质 产物具有生物活性、提取方便 （3）乳腺特异性启动子被甲基化修饰，无法启动转录，表达受阻；hLF 基因发生甲基化修饰，转录被抑制；mRNA稳定性差、翻译效率低；或蛋白无法正常分泌，导致乳汁中检测不到 15.【答案】（1）Ⅱ 基因B的转录方向为从PamC Ⅰ到Xba Ⅰ，高表达启动子必须位于质粒2的PamC Ⅰ处（即Ⅱ处），才能驱动基因B的转录；若位于Ⅰ处（Xba Ⅰ处），则无法启动转录。 （2）平 DNA聚合酶 T4DNA连接酶 （3）链霉素 1 提取转化体总RNA进行核酸分子杂交检测mRNA（或提取蛋白质用抗原抗体杂交技术检测目的蛋白） 16.【答案】（1）一种氨基酸可能有多种密码子编码 （2）5′-TCTGTT-3′和5′-CTTGGA-3′ （3）BamH Ⅰ和Xma Ⅰ T4或E.coli （4）卡那霉素和X-gal 白色 17.【答案】（1）/ （2）阳性 cd （3）非同源染色体 抗虫︰非抗虫（普通）＝15︰1 （4）“庇护所”能为敏感型棉铃虫提供生存条件，使得种群中保留一定数量的敏感型个体，敏感型个体随机交配，可将敏感基因传给后代，可以防止种群抗性基因频率增长过快，避免抗性个体的数量快速增加，进而避免棉铃虫爆发。 18.【答案】（1）BC （2）BCD （3）C→D→B→A→E （4）在宿主细菌中增殖 感受态细胞法 （5）4个氨基酸位点的替换，导致酶的空间结构发生改变，增强了酶的热稳定性和催化速率 19.【答案】（1）引物 碱基序列（脱氧核苷酸序列） （2）TCGA Ⅱ nLUC-SOS3 nLUC 只有区域2出现荧光 （3）盐胁迫下，SOS2与SOS3结合后到达细胞膜，与细胞膜上的Na+逆向转运蛋白SOS1相互作用，使SOS1磷酸化，实现Na+外排 20.【答案】（1）复制原点 作为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA （2）XbaI、HindⅢ C （3）农杆菌转化 愈伤组织 （4）取适量一定浓度的潮霉素溶液均匀涂抹在待检测玉米植株的叶片上，一段时间后观察玉米植株叶片的颜色变化，叶片颜色无明显变化的是转基因玉米植株 21.【答案】（1）EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ 5′ Mun Ⅰ （2）② 方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验 （3）茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果 22.【答案】（1）通过高温变性破坏氢键实现双链解旋 为DNA子链的延伸提供能量 （2）互补配对 搭桥杂交形成的互补单链3´端可直接作为DNA合成的引物启动延伸 2 （3）EcoRI BclI 23.【答案】（1）序列数据库 RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA （2）NsiⅠ，SalⅠ 选择SalⅠ和PstⅠ对质粒进行完全酶切，利用DNA聚合酶将SalⅠ产生的黏性末端补平 （3）四环素 2号、3号导入的重组载体是两个pET质粒环化形成，4号导入的是空白pET质粒 （4）U-DPG和RA 24.【答案】（1）水稻胚乳为真核细胞，可对 HSA 进行翻译后加工，使其具有生物活性；产量高、成本低、易规模化生产（大肠杆菌为原核细胞，无内质网、高尔基体等细胞器，无法对HSA进行正常加工） （2）阴性 Glua1 Sbe1基因与Glua1基因在胚乳中的表达水平均高于叶和根，但Glua1基因在胚乳中的表达量显著高于Sbe1基因 （3）甲和丙 （4）水稻植物中胚乳发出绿色荧光 （5）防止转基因花粉的传播（防止基因污染） 25.【答案】（1）序列数据库 （2）a （3）阳性 cd （4）非同源染色体 抗虫︰非抗虫（普通）＝15︰1 26.【答案】（1）聚合酶链式反应 （2）从右往左 5'-TCTAGACCTA-3' 。 （3）组成型、组成型、诱导型 （4）避免小鼠免疫系统识别、攻击、排斥移植的人源 HEK-293 细胞（降低免疫排斥反应） 27.【答案】（1）不受酶切位点序列的限制，可以在质粒任意位点进行开环；避免限制酶破坏质粒上功能区域；在对质粒线性化的同时可以进行大量扩增 引物2和引物3 （2）GCTGGACATAAACAC T-DNA可携带融合基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上 （3）卡那霉素 绿色荧光强度和分布 28.【答案】（1）抑制 （2）cDNA 小 （3）4 缺失 5' 29.【答案】（1）④ ② （2）AC 甲 只导入了一个融合基因的细胞中一条染色体有融合基因，其同源染色体只有Gata3基因，因此使用引物A、C可以同时扩增融合基因的大部分（大片段）和几乎全部Gata3基因（小片段） （3）100% （4）255m 2815m 30.【答案】（1）伴X染色体隐性 患甲病、患甲病和乙病（两病都患） （2）常规 降低第一次PCR 中残留常规引物的浓度，避免与补充内引物共同扩增出非目标片段 两轮扩增实现信号二次放大，内引物特异性靶向第一轮产物内部，错误扩增的产物内部拥有内引物互补序列的概率极低，抑制了非特异性扩增从而检出极微量模板 31.【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ KpnI、EcoRI （2）氯嘧磺隆 大于 （3）B （4）红色 32.【答案】（1）基因表达载体的构建 XhoⅠ和XbaⅠ 5 （2）外源DNA 1 只有1号菌株的PCR产物条带大小（约2.3kb）与目的基因N的大小一致 （3）b 33.【答案】（1）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链 ③ （2）PCR扩增 （3）21 TTACGAATTC 目的基因两端的同源臂与线性化载体两端的序列特异性同源，可通过同源交换定向连接目的基因，避免了自身环化和反向连接 （4）16441 bp和3961 bp 34.【答案】（1）BamHI、SpeⅠ 降解 （2）当丙酮酸浓度升高时，丙酮酸会抑制PdhR蛋白与pdhO识别并结合，解除对启动子B的抑制作用，从而促进gfp基因表达绿色荧光蛋白 （3）启动子B （4）液体 35.【答案】（1）使模板DNA解聚为单链 （2）BamHⅠ和EcoRⅠ （3）泳道5、6是PCR扩增产物的电泳结果，目标DNA（PDS基因片段）被特异性大量扩增，含量高，故条带亮；泳道1、2是酶切产物的电泳结果，目标DNA（PDS基因片段）含量低，故条带暗 B （4）不需要 插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域 引物依据插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域进行设计，可以确保扩增的模板仅来自植物内源的PDS基因的mRNA，从而真实反映其表达量是否下降。若引物是依据插入载体的PDS基因片段内部区域进行设计，则会同时扩增出病毒载体自身转录的PDSmRNA序列，无法区分信号来源，会干扰对植物内源基因沉默效果的判断 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 重庆考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2023重庆（1题） · 情境设置：以目的基因扩增和酶切操作为背景。 · 考查重点：聚合酶链式反应、引物设计及限制酶作用特点。 · 命题趋势：注重结合序列信息判断扩增产物和酶切结果。 考点2 基因工程综合 2026重庆（1题）、2025重庆（1题）、2024重庆（1题）、2022重庆（1题） · 情境设置：围绕农业育种、动物适应性和疾病治疗创设真实情境。 · 考查重点：综合考查基因功能探究、表达调控、实验设计及技术应用。 · 命题趋势：突出多环节推理，强化实验结果分析与证据链构建。 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 2022重庆（1题） · 情境设置：以人工长效胰岛素的研发为载体。 · 考查重点：蛋白质结构改变、功能优化及蛋白质工程基本思路。 · 命题趋势：加强基因工程与蛋白质工程的辨析及应用联系。 考点1 基因工程的基本工具 1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 【答案】B 【解析】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。 故选B。 考点2 基因工程综合 1．（2026·重庆·高考真题）研究者用改造过的巨噬细胞膜包裹药物治疗患乳腺癌的小鼠，实验设计如图甲所示。 （1）过程①获得的巨噬细胞来源于小鼠骨髓中的___________。 （2）据下表所示，最适合被M蛋白识别的膜蛋白是___________。 细胞类型 高表达的细胞膜蛋白 乳腺癌细胞 H蛋白 T蛋白 上皮细胞 R蛋白 E蛋白 成纤维细胞 F蛋白 T蛋白 （3）图乙是限制酶酶切后的M基因序列、载体部分结构及酶切位点（不考虑未标明序列）。要构建正确的重组载体，用于切割载体的限制酶应是___________。载体与M基因片段连接时需使用的酶是___________。 （4）研究者将上述重组载体转入巨噬细胞后，能检测到M基因但没有M蛋白。因此研究者更换了载体的启动子，成功获得了表达M蛋白的巨噬细胞。更换启动子可使M基因表达的原因是______________________________________。 （5）研究者用含有M蛋白的巨噬细胞膜包裹药物治疗乳腺癌小鼠，结果显示：同样的药物，用含M蛋白的巨噬细胞膜包裹的治疗效果优于未改造的巨噬细胞膜包裹的治疗效果，前者的优点是____________（多选）。 A．保护药物不被降解 B．可靶向乳腺癌细胞 C．降低药物对健康细胞的毒性 D．可吞噬乳腺癌细胞 【答案】（1）造血干细胞 （2）H蛋白 （3）Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ DNA连接酶 （4）更换后的启动子可以被巨噬细胞内的RNA聚合酶识别并结合，启动M基因的转录，进而翻译产生M蛋白 （5）BC 【解析】（1）巨噬细胞属于免疫细胞，由骨髓中的造血干细胞增殖分化而来，因此过程①获得的巨噬细胞来源于小鼠骨髓中的造血干细胞。 （2）M蛋白的作用是特异性识别乳腺癌细胞膜上的膜蛋白，该膜蛋白需要仅在乳腺癌细胞高表达，在上皮细胞、成纤维细胞等正常细胞不表达，才能保证药物精准靶向乳腺癌细胞，避免损伤正常细胞。由表格可知，H蛋白仅在乳腺癌细胞高表达，正常细胞不表达；T蛋白在乳腺癌细胞和成纤维细胞中均有高表达，R蛋白、E蛋白仅在上皮细胞高表达，F蛋白仅在成纤维细胞高表达，因此最适合被M蛋白识别的膜蛋白是H蛋白。 （3）分析酶切后的M基因序列两端的黏性末端可知，M基因模板链右端（即3'端）需要与载体启动子部位连接，M基因模板链右端的黏性末端为5'-GATC-3'，故切割载体的限制酶需选Bcl Ⅰ。M基因模板链左端需要与载体终止子部位连接，M基因模板链左端的黏性末端为5'-AGCT-3'，非模板链5'端突出的黏性末端为5'-GATC-3'，故切割载体的限制酶需选Hind Ⅲ。载体与M基因片段连接时，需要用DNA连接酶催化两个DNA片段的黏性末端之间形成磷酸二酯键，完成连接。 （4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，原载体上的启动子无法被巨噬细胞内的RNA聚合酶识别结合，导致M基因不能转录，无法合成M蛋白，更换为巨噬细胞可以识别的启动子后，RNA聚合酶可结合到新的启动子上，启动M基因的转录，进而翻译产生M蛋白。 （5）A、细胞膜包裹药物可以起到保护药物不被降解的作用，不是含M蛋白的巨噬细胞膜的优点，A错误； B、M蛋白可以特异性识别乳腺癌细胞，实现药物的靶向运输，B正确； C、药物靶向作用于乳腺癌细胞，可减少药物对正常健康细胞的作用，降低药物对健康细胞的毒性，C正确； D、吞噬功能是完整活的巨噬细胞才具备的功能，本实验仅使用巨噬细胞膜包裹药物，无论是否改造膜结构都不具备吞噬乳腺癌细胞的能力，D错误。 2．（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。 （1）研究发现，树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异，可设计开展如下实验： ①________； ②将_______分别进行酶切并连接； ③将重组DNA分子导入大肠杆菌； ④分离表达的TR1蛋白质测定_______，明确蛋白之间的差异。 （2）树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是________。 （3）树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是________。 【答案】（1）克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因 目的基因与载体 氨基酸序列 （2）利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高。 （3）树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择 【解析】基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白基因。②为将树鼩、其他哺乳动物TR1蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由（2）中展示的蛋白质之间的差异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TRI蛋白质的氨基酸序列。 （2）树鼩TRI蛋白第579位氨基酸为M，人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因，使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高，则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI蛋白第579位氨基酸序列差异造成的。 （3）适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。 3．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 （1）基因S启动子的基本组成单位是____________。 （2）通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是____________。 （3）为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有______________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是______________。 （4）用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________。 【答案】（1）脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） （2）EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体正向链接（可能会反向链接） （3）酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR （4）品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【解析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA （2）逻辑推理与论证 【解析】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 4．（2022·重庆·高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。 步骤I： 步骤II： （1）花药培养能缩短育种年限，原因是________。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含________的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是________。 （2）步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是________；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有________。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加________。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的________，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是________，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。 【答案】（1）单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 （2）cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术 【解析】1、单倍体育种的原理是染色体变异，方法是用花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩短育种年限。2、cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库，基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合，它包含了该生物的所有基因。 （1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。 （2）cDNA文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA文库。在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti质粒中含有抗生素抗性基因，故应在培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，即用含eu基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui基因，可采取DNA分子杂交技术的方法。 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产 【答案】A 【解析】基因工程只能生产已有的蛋白质，人工长胰岛素A链有氨基酸的替换，B链增加了两个氨基酸，需要通过蛋白质工程生产。 A、胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误； B、人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确； C、人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确； D、人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。 故选A。 1．（2026·重庆好教育·二诊）纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、可溶性、低生产成本且能结合多种表位等优势，在疾病的预防、诊断和治疗方面有着广阔的应用前景。利用噬菌体展示技术制备纳米抗体（抗体展示在噬菌体表面）的流程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．同一个体不同细胞中的遗传物质相同，因此过程①可分离B或T淋巴细胞提取总RNA B．过程②逆转录PCR中，利用逆转录酶即可获得编码纳米抗体的基因双链片段 C．过程②纳米抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因融合插入载体中，利用抗原一抗体特异性结合筛选噬菌体 D．过程③可选择转化骨髓瘤细胞，利用骨髓瘤细胞无限增殖的特点生产足够数量的纳米抗体 【答案】C 【解析】A、T淋巴细胞并不产生抗体，只有B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞才产生抗体（B淋巴细胞能编码产生抗体的mRNA），因此仅需要分离B淋巴细胞提取其总的mRNA即可，A错误； B、过程2是逆转录PCR，包括逆转和PCR扩增两个步骤，首先需要以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA（单链）；然后需要DNA聚合酶（如Taq酶）作用下进行PCR扩增，才能获得双链DNA片段，B错误； C、过程②是将编码纳米抗体的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使得目的蛋白展示在噬菌体表面，随后通过抗原-抗体特异性结合，筛选出能够展示纳米抗体的阳性噬菌体，C正确； D、噬菌体是专门寄生在大肠杆菌内部的，因此过程③选择转化大肠杆菌，D错误。 故选C。 2．（2026·重庆一中·模拟预测）重组DNA技术在为人们提供需要的生物新品种或新产品方面发挥了重要作用，下图为该技术在其中一些方面应用实例的流程图，下列说法正确的是（　　）    A．①过程常采用的技术是Ca²⁺处理法，原理是Ca²⁺可以让细胞处于易吸收外界DNA的状态 B．细胞Ⅰ主要从动物脾脏中获取，一种病原体能激活机体形成多种细胞Ⅰ C．细胞Ⅱ还可通过动物细胞融合技术获得，检测筛选细胞Ⅱ时需要使用特异性抗体 D．为保证植物叶绿素的正常合成和植物组织的正常发育，④整个过程必须要在光照下完成 【答案】B 【解析】A、①过程是将重组载体导入动物受精卵，常用技术为显微注射法；Ca²⁺处理法是将目的基因导入原核细胞的方法，通过使细胞处于感受态来吸收外源DNA，不适用于动物细胞，A错误； B、细胞Ⅰ是可产生特异性抗体的浆细胞，主要从免疫动物的脾脏中获取；一种病原体表面存在多种抗原决定簇，可激活机体中多种B细胞增殖分化，形成多种浆细胞，B正确； C、细胞Ⅱ可通过浆细胞与骨髓瘤细胞的动物细胞融合技术获得，但筛选能产生目标抗体的细胞Ⅱ时，需使用特异性抗原进行抗原-抗体杂交检测，不需要使用特异性抗体，C错误； D、④为植物组织培养过程，其中脱分化阶段需要避光处理，仅再分化阶段需要光照以合成叶绿素，并非整个过程都需要光照，D错误。 3．（2026·重庆第二外国语学校·模拟预测）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左往右。为使乳酸杆菌产生该酶，以图中质粒为载体进行转基因，下列说法不正确的是（    ） 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT A．家禽肠道内乳酸杆菌细胞呼吸产生的物质可抑制某些微生物生长 B．限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来，种类繁多且具有专一性 C．在受体细胞中，W基因转录时以乙链为模板，可以边转录边翻译 D．为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒 【答案】D 【解析】基因工程是按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品、基因工程过程包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定，基因工程操作中用到的工具有限制酶、DNA连接酶、运载体。 A、家禽肠道内的乳酸菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，A正确； B、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，种类繁多，且能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，具有专一性，B正确； C、枯草芽孢杆菌为原核生物，其中的W基因可以边转录边翻译，且根据转录时子链的延伸方向为5'端往3'端方向可知，W基因转录时以乙链为模板，C正确； D、EcoRI在质粒上有两个酶切位点，会将终止子切掉，故均不能选择，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，故为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和MfeⅠ切割质粒，D错误。 故选D。 4．（2026·重庆八中·一模）近年来,里氏木霉（常作为纤维素酶工业生产菌株）被改造为高效生产药用蛋白的“细胞工厂”。操作流程如图所示,下列有关叙述正确的是（    ） A．敲除内源纤维素酶基因的核心目的是避免发酵产物被降解 B．转入人源溶酶体酶基因后,可通过PCR等技术检测其是否整合到里氏木霉的基因组中 C．配制图中培养基时可以以蛋白胨为氮源、纤维素为碳源 D．相比该工程菌,大肠杆菌合成的药用蛋白更接近于人体细胞产物 【答案】B 【解析】A、敲除内源纤维素酶基因的核心目的是减少无关蛋白的表达，让工程菌更多资源用于生产目标药用蛋白，或便于后续分离纯化（纤维素酶不会降解药用蛋白，因此 “避免发酵产物被降解” 的表述不准确），A错误； B、转入人源溶酶体酶基因后，可通过PCR技术设计特异性引物，检测目的基因是否整合到里氏木霉的基因组中（若能扩增出目的基因片段，说明整合成功），B正确； C、工程菌已敲除内源纤维素酶基因，无法合成纤维素酶，因此不能利用纤维素作为碳源（培养基不能以纤维素为碳源），C错误； D、里氏木霉是真核微生物，具备内质网、高尔基体，可对蛋白质进行翻译后修饰（如糖基化），其合成的药用蛋白更接近人体细胞产物；而大肠杆菌是原核生物，无这些细胞器，无法进行复杂修饰，D错误。 故选B。 5．（2026·重庆八中·模拟预测）研究表明80%的结直肠癌患者的A基因（肿瘤抑制基因）突变产生A-基因，A-表达的错误蛋白不行使正常功能且会干扰正常A蛋白发挥作用。Cre-loxP系统可通过删除DNA特定位点的Stop序列，调控目标基因的表达，原理如下图。科研人员利用该系统构建A基因杂合突变的结直肠癌模型鼠，且只允许突变基因A-在该鼠肠上皮细胞表达。具体操作中，研究人员需对两只野生型鼠分别转基因，然后从它们的杂交后代中筛选目标个体。下列相关叙述错误的是（　　）    A．启动子和目标基因间插入loxP-Stop-IoxP序列后，目标基因不表达 B．Cre酶可通过识别loxP位点敲除Stop序列，实现目标基因的表达 C．导入一只野生型鼠的基因及调控序列为   D．导入另一只野生型鼠的基因及调控序列为   【答案】D 【解析】在启动子和目标基因间插入loxP-Stop-loxP序列，目标基因不转录，敲除Stop（和一个loxP）序列，目标基因转录，利用Cre-lexP系统构建易患结直肠癌的A基因杂合突变模型鼠，且只允许突变基因A-在该鼠的肠上皮细胞表达，需要在使基因只在肠上皮细胞表达的启动子和A-基因之间加上loxP-Stop-loxP，这样A-基因不能表达，当Cre酶基因表达出Cre酶时，即A/A-基因启动子与Cre酶基因结合，能切除Stop（和一个loxP）序列，这样A-基因转录。 A、由题意可知，Cre-loxP系统可通过删除DNA特定位点的Stop序列，调控目标基因的表达，说明在启动子和目标基因间插入loxP-Stop-loxP序列后，目标基因不表达，A正确； B、由图可知，Cre酶可通过识别loxP位点敲除Stop序列，实现目标基因的表达，B正确； CD、由题意可知，欲从两只鼠杂交后代中选出A基因杂合突变的结直肠癌模型鼠，且只允许突变基因A-在该鼠肠上皮细胞表达，可导入一只野生型鼠的基因及调控序列为A/A-基因的启动子-loxP-Stop-loxP-A-基因，此时A-不能表达， 导入另一只野生型鼠的基因及调控序列为使基因只在肠上皮细胞表达的启动子-Cre酶基因，Cre酶基因可正常表达，杂交后代中，当Cre酶基因表达出Cre酶时，即A/A-基因启动子与Cre酶基因结合，能切除Stop（和一个loxP）序列，这样A-基因转录，符合该条件的小鼠为目标小鼠，C正确，D错误。 故选D。 6．（2026·重庆九龙坡·二调）如图，  pBI121是人工构建的双元表达载体，由大肠杆菌质粒、农杆菌 Ti质粒 T-DNA转移元件及植物表达调控元件组合而成。我国科学家将 Bt抗虫基因插入 pBI121后，通过花粉管注射或农杆菌介导法转化，成功培育出可稳定遗传的抗虫棉。下列相关说法错误的是（    ） A．在植物细胞中含有抗虫基因的pBI121 重组质粒能正常复制和增殖 B．抗虫基因需重组到棉花细胞的染色体上才能传代抗虫性状 C．通过GUS 水解X-Gluc产生蓝色可以检测抗虫基因的表达 D．棉铃虫对抗虫棉产生的显性抗性比隐性抗性的基因频率增加更快 【答案】A 【解析】A、pBI121 重组质粒中只有T-DNA片段才能转移并插入到受体细胞染色体中，才能随受体细胞染色体复制而复制，A错误； B、只有抗虫基因整合到棉花细胞的染色体DNA上，才能随染色体复制和细胞分裂稳定传递给子代，维持稳定的抗虫性状，B正确； C、GUS基因与抗虫基因受同一个真核启动子调控，若抗虫基因成功插入并表达，说明载体结构完整，GUS基因也可正常表达，其编码的GUS水解X-Gluc产生蓝色，可间接检测抗虫基因的表达，C正确； D、显性抗性基因只要存在就会表现出抗性，所有携带显性抗性基因的棉铃虫都能在抗虫棉上存活，因此基因频率增加更快，而隐性抗性只有纯合时才表现抗性，杂合子仍会被淘汰，基因频率增加更慢，D正确。 7．（2026·重庆巴蜀中学·一模）科研人员发现BbCUC蛋白与野生型球孢白僵菌（WT）分生孢子的形成有关，利用基因工程获得了BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC和超量表达菌株BbCUCOE，并将BbCUC基因导入△BbCUC获得回补菌株BbCUCCOM。将等量菌株分别接种在相同且适宜的培养基上，统计相关数据，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．构建BbCUCOE菌株时可将BbCUC基因的启动子替换为活性更强的启动子 B．BbCUC基因通过促进球孢白僵菌产孢结构的发生促进分生孢子的形成 C．可以利用抗原-抗体杂交技术检验目的菌株是否构建成功 D．BbCUCCOM表型并未完全与WT一致，说明导入后可能影响其他基因表达 【答案】B 【解析】A、超量表达菌株构建常采用强启动子（如组成型或诱导型高效启动子）替代原启动子，以增强目的基因转录水平，A正确； B、根据柱状图，BbCUC蛋白编码基因敲除菌株△BbCUC的分生孢子数量和产孢结构平均数量都高于野生型，说明BbCUC基因通过抑制球孢白僵菌产孢结构的发生抑制分生孢子的形成，B错误； C、Western-blot（抗原-抗体杂交）可检测BbCUC蛋白有无及表达量差异，是验证基因敲除、超表达及回补效果的可靠手段，C正确； D、回补菌株表型未完全恢复，可能因随机插入导致邻近基因表达受影响、拷贝数变异或表观遗传修饰，该解释合理，D正确。 故选B。 8．（2026·重庆八中·模拟预测）为探究猪流行性腹泻病毒蛋白Nsp15是否与宿主蛋白SLC25a3结合，研究人员构建两种重组质粒分别表达融合蛋白Flag-Nsp15和Myc-SLC25a3，转化后获得三组细胞（①、②、③）。利用抗Flag抗体分别收集各组中能与之结合的蛋白，再分别用抗Flag、抗Myc的单克隆抗体检测，同时取各组细胞总蛋白进行相同检测，结果如图所示。下列分析正确的是（    ） A．制备抗Flag单克隆抗体时需在已免疫动物体内分离得到记忆B细胞作为材料 B．若使用抗Myc抗体收集蛋白，则①组中同样会出现Flag条带 C．②组IP产物中无Myc条带，说明细胞内不表达SLC25a3蛋白 D．③组IP产物中有Myc条带，表明Nsp15能与SLC25a3结合 【答案】D 【解析】A、制备单克隆抗体时，需要从已免疫动物体内分离得到能产生抗体的浆细胞（效应B细胞），不是记忆B细胞，A错误； B、①组仅表达Flag-Nsp15，不表达Myc-SLC25a3，若用抗Myc抗体收集蛋白，无法捕获到Flag-Nsp15，不会出现Flag条带，B错误； C、从Input（总蛋白）结果可以看出，②组总蛋白有Myc条带，说明细胞内正常表达SLC25a3蛋白；IP产物无Myc条带是因为②组本身不表达Flag-Nsp15，无法被抗Flag抗体捕获，C错误； D、③组用抗Flag抗体收集蛋白时，沉淀中检测到Myc条带，说明Flag-Nsp15被捕获时，Myc-SLC25a3也一同被拉下来，证明Nsp15能与SLC25a3结合，D正确。 9．（2026·重庆彭水第一中学校·模拟预测）口服α—干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。请回答下列问题： （1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______。由于DNA复制时，子链只能由5'向3’方向延伸，故可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______作为引物。 （2）步骤②用到的农杆菌Ti质粒的功能是：______。图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和______，后者利用了细胞______的原理。 （3）如果将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，早期胚胎培养至______阶段，然后进行胚胎移植，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为______。 （4）干扰素体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70℃条件下保存半年，给广大患者带来福音。对蛋白质进行改造，应该直接对基因进行操作来实现对蛋白质的改造。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过______或______，对______进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产或生活需要。 【答案】（1）干扰素基因两端的部分核苷酸序列 B、C （2）将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上 植物细胞工程 增殖 （3）桑椹胚或囊胚 乳房生物反应器（或乳腺生物反应器） （4）基因修饰 基因合成 现有蛋白质 【解析】分析图解：图中过程①表示利用PCR技术扩增目的基因，过程②表示基因表达载体的构建，过程③表示将重组质粒导入根瘤农杆菌，过程④表示目的基因的检测和鉴定。 （1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列；因DNA复制时，子链总是从5'向3'方向延伸，子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。 （2）迄今约80%的转基因植物都是利用农杆菌转化法，因为农杆菌的Ti质粒上的T-DNA，可将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上；分析题图可知，图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了细胞增殖的原理。 （3）通过基因工程得到的受精卵要在体外进行早期胚胎培养，一般培养至桑椹胚或囊胚阶段进行胚胎移植；转基因动物发育成熟后，可从转基因动物分泌的乳汁中获干扰素，人们把这种转基因生物称为乳房生物反应器，也叫乳腺生物反应器。 （4）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产或生活需要。 10．（2026·重庆南开中学·模拟预测）科学家研究发现，小麦的抗旱性跟 TaPPR13 基因的表达水平呈正相关，科研人员欲将强启动子SV40插入 TaPPR13 基因上游，构建重组表达载体以提高其表达量。下图为载体结构及目标基因编辑区域示意图（注: SalⅠ、EcoRⅠ、 BsaⅠ、 Xho Ⅰ、 NocⅠ、 MonⅠ为限制酶, NocⅠ、 MonⅠ为非回文序列的稀有限制酶；LacZ基因表达的酶可催化X-gal物质转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则呈白色；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题： （1）首先需要将TaPPR13 基因插入到质粒上,需要用限制酶 XhoⅠ与 SalⅠ分别对TaPPR13 基因和质粒分别酶切。连接时基因与质粒以相同限制酶切割位点进行连接为正向连接，以不相同限制酶切割位点进行连接为反向连接。为获得反向连接的重组质粒，可用______酶对连接产物进行鉴定，不能酶切的即是。 （2）科研人员需通过PCR 技术扩增强启动子SV40片段，设计PCR 引物时，需确保两端的引物序列分别与SV40片段的______（填“5'端”或“3'端”）序列互补,若b链为 TaPPR13 基因的模板链,要使扩增的SV40片段能定向插入TaPPR13 基因上游的特定区域，还需分别在两种引物的5'端添加______酶和 EcoR I酶的识别序列。 （3）需将导入重组表达载体的大肠杆菌接种到含______的选择培养基上培养，培养后筛选出______（填“蓝色”或“白色”）菌落。 （4）将构建成功的重组表达载体成功导入小麦细胞后，需检测TaPPR13基因的表达水平，检测结果若为______，则说明强启动子SV40发挥作用，TaPPR13 基因表达量比非转基因小麦高。 【答案】（1）XhoⅠ和SalⅠ （2）3'端 MonⅠ （3）X-gal和氨苄青霉素 白色 （4）转基因小麦中TaPPR13蛋白含量高于非转基因小麦 【解析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶为同尾酶，会切出相同的黏性末端，在连接时，若是正向连接则连接处会恢复原有的酶切位点，若是反向连接则会形成新的酶切位点，原来的XhoⅠ酶切位点处形成NocⅠ酶切位点，SalⅠ酶切位点处形成MonⅠ酶切位点。故用XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶对连接产物进行鉴定。 （2）由于配对的两条链反向平行，所以引物会结合到目的基因的3'端，因为TaPPR13基因的模板链为b链，所以启动子要插入在目的基因的左右，要使启动子能够定向连接到目的基因的右侧，需要采用双酶切，目的基因连接上后在其上游有MonⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点，所以SV40两端要加上相同的酶切位点。 （3）质粒上有氨苄青霉素抗性基因，要筛选出导入重组表达载体的大肠杆菌，则需要在培养基中加入氨苄青霉素，目的基因的插入破坏了LacZ基因，不能产生催化X-gal物质转化为蓝色物质的酶，所以要筛选白色菌落。 （4）基因表达的产物是蛋白质，若强启动子SV40发挥作用，则同未转基因的小麦相比，会产生更多的TaPPR13蛋白。 11．（2026·重庆八中·模拟预测）科学家通过 PCR 技术可诱导干扰素基因的中间位点发生突变，即定点突变PCR 技术（重叠延伸 PCR），是通过带突变位点的引物扩增出两段含突变重叠区的片段，再通过片段杂交、延伸获得完整突变基因，过程如图。根据信息回答下列问题： （1）利用此方法获得突变基因，设计引物2和引物3的序列的要求是_____。（答两点） （2）PCR1和PCR2_____（填“能”或“不能”）在同一个反应体系里面进行，主要原因是_____。 （3）④混合、变性后，杂交会产生_____种新的产物，画出不可以扩增出目标突变基因的杂交产物_____。 （4）过程⑤是否需要加入引物和模板，原因是_____。 【答案】（1）都带有突变位点的突变序列；二者碱基序列可以互补配对 （2）不能 引物2和引物3可以互补配对，会相互结合，无法和模板DNA结合发挥引物作用 （3）2 （4）不需要，杂交后的重叠单链可以互为引物和模板，直接完成延伸 【解析】（1）该方法需要两段扩增片段都含突变位点，因此两个引物都需要引入突变；同时引物2和3需要互补，才能让两段片段在后续杂交时形成重叠配对。 （2）若将两个PCR放在同一体系，互补的引物2和3会优先结合失活，无法和模板DNA结合发挥引物作用，无法完成正常的PCR扩增。 （3）PCR1和PCR2共得到4条单链，除去原来的自身配对产物，新杂交产物共2种；不可以扩增出目标突变基因，因为没有给DNA聚合酶提供可用于延伸的3'端 。 （4）杂交后，单链的3'端已经和互补链的重叠区配对，杂交后的重叠单链可以互为引物和模板，直接完成延伸，因此不需要额外加入引物和模板。 12．（2026·重庆第二外国语学校·模拟预测）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白相互作用的研究 蛋白相互作用是指蛋白质之间相互结合并发挥特定的生物学功能的现象，是生物分子之间交互作用的重要形式。IKK 复合体由IKKα、IKKβ和 NEMO 三个亚基组成，细胞周期调控激酶 PLK1是一种催化蛋白质磷酸化的酶。PLK1 可通过磷酸化 IKKβ抑制IKK复合体的活化，为研究 PLK1 与 IKK 的互作，进而确定IKK 的作用机制，进行了如下实验。 研究人员通过免疫共沉淀技术进行研究。该技术的原理是，在细胞内如果 A蛋白能够与B蛋白结合，若用预先固定在琼脂糖珠子上的蛋白A 的抗体去沉淀 A蛋白，则B也会一起沉淀下来。通过检测沉淀中是否存在B蛋白，即可确定 A和B蛋白是否存在相互作用。研究人员向人胚肾 H细胞中转入分别含有Flag—PLK1融合基因和Myc-NEMO融合基因的表达载体，将细胞裂解后，用含有抗 Flag 抗体的琼脂糖珠子进行沉淀。检测细胞裂解液和沉淀中蛋白情况，结果如图 1。用同样方法研究了 PLK1 与 IKKα、IKKβ相互作用的情况，结果如图2。      Pull-down实验也是研究蛋白质相互作用的方法。将细胞裂解，获得含有待测蛋白的细胞裂解液。在体外，利用一种带有特定蛋白标签（如GST）的纯化融合蛋白作为钓饵，与细胞裂解液温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，利用抗体检测并鉴定沉淀中的蛋白。研究人员利用该技术验证了PLK1与NEMO的相互作用情况，结果见图3。 利用上述两种技术，研究人员初步确定了PLK1发挥作用的分子机制。 （1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个_____和终止子，翻译时所用起始密码子和终止密码子_____。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，研究人员通过_____技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是_____。免疫共沉淀实验结果表明_____。 （3）根据 Pull--down 实验结果推测 PLK1 不能与 NEMO 直接结合。请补充Pull-down实验的操作步骤（从下列选项中选择）：纯化_____蛋白→将含有_____基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定。 A.GST-PLK1   B.His-PLK1   C.GST-NEMO   D.His-NEMO   E.GST （4）依据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果，请尝试解释PLK1蛋白作用于IKK复合体的机制_____。 【答案】（1）启动子 相同 （2）抗原抗体杂交 检测并鉴定导入的Flag-PLK1和Myc-NEMO基因是否正常表达 PLK1 与 NEMO 存在相互作用， PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用 （3）EA D （4）PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化 【解析】1、基因工程的基本操作程序有四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞，（4）目的基因的检测与鉴定。 1、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （1）Flag-PLK1融合基因在转录时，Flag基因和PLK1基因共用同一个启动子和终止子，进而保证融合基因在受体细胞中正常转录。基因的表达包括转录和翻译两个步骤，但由于两个基因融合成为一个基因，同时进行转录和翻译，因此在翻译时所用起始密码子和终止密码子相同。 （2）分析免疫共沉淀结果可知，由于蛋白质和抗体的结合具有特异性，因而研究人员通过抗原-抗体杂交技术检测相关蛋白互作情况，对细胞裂解液进行检测的目的是保证细胞裂解液中存在待检测蛋白质。根据沉淀蛋白与抗体结合情况显示沉淀蛋白中能同时检测到PLK1 与 NEMO，但不能同时检测到PLK1和IKKα、IKKβ，据此可推测PLK1 与 NEMO 存在相互作用， PLK1与IKKα、IKKβ不存在相互作用。 （3）根据 题意，His、GST是作为标签蛋白使用的，探究PLK1与NEMO的相互作用情况，His应与NEMO结合，用抗His抗体检测，细胞裂解液中可检测到His-NEMO融合蛋白，GST钓饵沉淀和GST-PLK1钓饵沉淀中未出现杂交带，说明 PLK1 不能与 NEMO 直接结合。据此推测其检测步骤为：纯化GST.、GST-PLK1钓饵蛋白→ →将含有His-NEMO基因的表达载体导入大肠杆菌中→将纯化的蛋白与大肠杆菌裂解液混合温育→用相应的琼脂糖凝胶沉淀→对裂解液和沉淀进行抗体检测和鉴定，支持上述结论的实验结果是GST-PLK1钓饵沉淀中检测不到His-NEMO融合蛋白。 （4）题意显示，PLK1 可通过磷酸化 IKKβ抑制IKK复合体的活化，根据免疫共沉淀和Pull-down实验的结果可推测PLK1通过与IKK复合体之外的其他蛋白结合，间接与NEMO蛋白相互作用，从而催化IKKβ蛋白磷酸化，抑制IKK复合体活化。 13．（2026·重庆·模拟预测）微藻中的SqME基因在烟草（双子叶植物）中异源表达后，可增强光合效率并促进脂质积累。而在SqME基因下游插入DNA片段N（转录后会被剪接）可显著提升SqME的表达量，进而提高脂质产量。某研究单位构建了SqME超表达载体，将其导入烟草用于生产生物柴油，流程如图所示。 （1）运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是______。若该引物较长且G-C碱基对比例高，在PCR扩增过程中可适当______复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 （2）为了使DNA片段N正确插入Ti-SqME的表达载体上，需要在扩增N时所用的两种引物的5′端加上______（填限制酶）的识别序列。 （3）若采用农杆菌转化法将Ti-SqME-N表达载体导入烟草，需先将Ti-SqME-N表达载体导入农杆菌，在培养农杆菌的培养基加入______和______分别有利于提高转化效率和筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。为将农杆菌中Ti-SqME-N表达载体导入烟草，具体的转化方法可以是__________（填一种即可）。另外还可以采用我国科学家独创的方法：______________，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 【答案】（1）S-F和S-R 提高 （2）EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ （3）Ca2+ 卡那霉素 方案1：将农杆菌与烟草组织共同培养，利用植物组织培养技术获得烟草植株，再进行筛选、鉴定。方案2：将烟草花直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。（填一种即可） 花粉管通道法 【解析】基因工程基本操作步骤包括：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定等。 （1）据图可知运用PCR技术从微藻中获取SqME基因，可选择的一对引物是S-F和S-R，引物需要与扩增DNA片段的上下游碱基互补配对，将引物之间的DNA片段扩增出来。若该引物较长且G-C碱基对比例高，G-C之间三个氢键，破坏氢键耗能多，因此在PCR扩增过程中可适当提高复性温度，从而提高SqME基因扩增准确性。 （2）据图可知，DNA片段N正确插入SqME的下游，且需要在启动子和终止子之间，因此在扩增N时所用的两种引物的5′端加上EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的识别序列。 （3）将目的基因导入农杆菌细胞中，需要用钙离子处理，使其处于能够吸收周围质粒的生理状态，提高转化效率。重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，因此可以在培养基中加入卡那霉素来筛选导入了Ti-SqME-N表达载体的农杆菌。将目的基因导入植物细胞中常用农杆菌转化法，具体操作：方案1：将农杆菌与烟草组织共同培养，利用植物组织培养技术获得烟草植株，再进行筛选、鉴定。方案2：将烟草花直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。另外还可以采用我国科学家独创的方法：花粉管通道法，将Ti-SqME-N表达载体导入烟草中。 14．（2026·重庆八中·模拟预测）人乳铁蛋白（hLF）是一种具有抗菌、抗病毒功能的珍贵药用蛋白，天然存在于人乳汁中，但提取困难且成本高昂。科学家计划利用乳腺生物反应器技术，将人乳铁蛋白基因导入山羊基因组中，使其在乳腺细胞中高效表达，从而通过收集羊奶来工业化生产该蛋白。已知只有将过程①获得的hLF基因置于 BLG 基因调控区下游，才能使其在动物乳腺组织中特异性表达。下图是科研人员构建基因表达载体及培育转基因山羊的部分流程示意图。 请回答下列问题。 （1）图1中，为确保过程①获取的hLF 基因能正确插入BLG 基因调控区下游，还需要在 hLF基因上、下游引物的5'端分别插入__________酶的识别序列。图2中C的发育阶段通常为___________。 （2）为了检测转基因山羊是否培育成功，科研人员进行了多层面的检测： ①分子水平检测：提取转基因山羊乳腺细胞的DNA，除PCR 外，还可利用______________技术检测 hLF基因是否整合到染色体DNA 上；提取___________，利用抗原—抗体杂交技术检测是否产生了人乳铁蛋白。 ②个体水平鉴定：若检测到乳汁中含有活性的人乳铁蛋白，说明转基因动物制备成功。与传统的大肠杆菌发酵工程生产相比，利用乳腺生物反应器生产的优势在于____________（答两点）。 （3）在实际操作中，科研人员发现部分转基因克隆羊虽然基因组中整合了hLF基因，但其乳汁中并未检测到目标蛋白，或者蛋白产量极低。请结合表观遗传学或基因表达调控的知识，分析造成这种现象的可能原因有___________（答两点）。 【答案】（1）NheⅠ和SalⅠ（或BamHⅠ） 桑葚胚或囊胚期 （2）DNA分子杂交 山羊乳腺细胞中的蛋白质 产物具有生物活性、提取方便 （3）乳腺特异性启动子被甲基化修饰，无法启动转录，表达受阻；hLF 基因发生甲基化修饰，转录被抑制；mRNA稳定性差、翻译效率低；或蛋白无法正常分泌，导致乳汁中检测不到 【解析】（1）图1中，为确保过程①获取的hLF 基因能正确插入BLG 基因调控区下游，需要让 PCR 扩增出的 hLF 基因两端带有与质粒上 BLG 调控区下游相同的限制酶识别序列。从图 1 看，BLG 基因下游的酶切位点是Nhe I和Sal I（或 BamH I，以保证定向插入），因此，引物 5' 端应插入 Nhe I 和 Sal I（或 BamH I） 限制酶的识别序列；图2中，C 是核移植后体外培养的重组胚胎，胚胎移植时通常选择桑葚胚或囊胚阶段。 （2）①分子水平检测：提取转基因山羊乳腺细胞的DNA，除PCR 外，还可利用DNA分子杂交技术检测 hLF基因是否整合到染色体DNA 上，该方法的原理是核酸单链之间的碱基互补配对原则；提取山羊乳腺细胞中的蛋白质，利用抗原—抗体杂交技术检测是否产生了人乳铁蛋白。 ②个体水平鉴定：若检测到乳汁中含有活性的人乳铁蛋白，说明转基因动物制备成功。与传统的大肠杆菌发酵工程生产相比，利用乳腺生物反应器生产的优势在于获得的产物具有生物活性（乳腺细胞可对表达的蛋白质进行正确的折叠、糖基化等加工，保证蛋白质有天然活性），通过收集乳汁即可获得大量目的蛋白，成本低，大肠杆菌细胞中没有内质网和高尔基体，不能对人乳铁蛋白进行加工。 （3）根据题意，转基因细胞中已经整合了hLF基因，但未检测出目标蛋白，或产量极低，根据表观遗传的概念，分析可能的原因如下：乳腺特异性启动子被甲基化修饰，无法启动转录，表达受阻；hLF 基因发生甲基化修饰，转录被抑制；mRNA稳定性差、翻译效率低；或蛋白无法正常分泌，导致乳汁中检测不到。 15．（2026·重庆西南大学附属中学·模拟预测）研究者将红球菌中两种合成类胡萝卜素的关键酶基因B及基因C导入衣藻，使其成为生产类胡萝卜素的“细胞工厂”，图1为基因表达载体的构建过程和相应限制酶的识别序列。 （1）选用限制酶分别对质粒1和质粒2进行酶切，并将基因B插入具有高表达启动子的质粒2中构建重组质粒。质粒2中高表达启动子位于_______（填“Ⅰ”或“Ⅱ”）处，理由是____________。 （2）用EcoR Ⅴ处理质粒3产生________末端；用EcoR Ⅰ处理重组质粒获得具有黏性末端且含基因B的DNA片段；为使含基因B的DNA片段与质粒3相连，可利用_______酶处理黏性末端，再利用____________酶使两者高效连接构建基因表达载体。 （3）将载体导入衣藻后，初步在含________的培养基上培养，得到衣藻转化体1、2，研究者依据目的基因B和C的序列设计引物，利用PCR技术分别确定基因表达载体上目的基因B和C的导入情况，电泳结果如下图所示： 通过电泳结果可得知成功导入基因表达载体的是衣藻转化体______（填“1”或“2”）。为检测两种基因的表达情况，后续可进行的操作是______________。 【答案】（1）Ⅱ 基因B的转录方向为从PamC Ⅰ到Xba Ⅰ，高表达启动子必须位于质粒2的PamC Ⅰ处（即Ⅱ处），才能驱动基因B的转录；若位于Ⅰ处（Xba Ⅰ处），则无法启动转录。 （2）平 DNA聚合酶 T4DNA连接酶 （3）链霉素 1 提取转化体总RNA进行核酸分子杂交检测mRNA（或提取蛋白质用抗原抗体杂交技术检测目的蛋白） 【解析】（1）由图1可知，基因B的转录方向为从PamC Ⅰ位点指向Xba Ⅰ位点（即从右至左），启动子必须位于目的基因的上游（首端），才能启动转录。因此质粒2中高表达启动子位于Ⅱ处，因为基因B的转录方向为从PamC Ⅰ到Xba Ⅰ，高表达启动子必须位于质粒2的PamC Ⅰ处（即Ⅱ处），才能驱动基因B的转录；若位于Ⅰ处（Xba Ⅰ处），则无法启动转录。 （2）EcoR Ⅴ识别序列为5'-GAT↓ATC-3'，切割后得到的是平末端；DNA连接酶不能直接连平末端和黏性末端，因此为使含基因B的DNA片段与质粒3相连，先用DNA聚合酶处理黏性末端，变成平末端，再利用T4 DNA 连接酶使两者高效连接构建基因表达载体。 （3）由于质粒上有链霉素抗性基因aadA，所以将载体导入衣藻后，初步在含链霉素的培养基上培养，能存活的是导入载体的衣藻转化体。由图2的电泳结果可知，衣藻转化体1含有的条带与含有基因表达载体的相同，而衣藻转化体2没有相应的条带，说明成功导入基因表达载体的是衣藻转化体1。为检测两种基因的表达情况，后续可进行的操作是提取转化体总RNA进行核酸分子杂交检测mRNA（或提取蛋白质用抗原抗体杂交技术检测目的蛋白）。 16．（2026·重庆大足中学&名校联盟·模拟预测）药物A是从某植物体叶肉细胞中提取的一种蛋白质，对治疗糖尿病具有良好的疗效。某研究团队运用生物工程相关技术，利用大肠杆菌来生产这种药物。下图表示制备工程菌时所使用的质粒、目的基因的结构及其相关限制酶识别位点（限制酶的识别序列和切割位点如表所示），其中LacZ基因表达的产物可将无色物质X-gal催化为蓝色物质，从而使菌落呈现蓝色，否则为白色。回答下列问题。 限制酶 BamH I EcoR I Sau3A I Sma I Xma I 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -G↓AATTC- ↓GATC- -CCC↓GGG- -C↓CCGGG- （1）科学家根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段，由于__________，该方法得到的DNA片段有多种可能。 （2）利用PCR技术获取和扩增目的基因，已知待扩增的目的基因两侧相关序列如下，扩增时选用的两种引物碱基序列为（注明序列的5′和3′端）________。 （3）为将目的基因准确插入质粒中，最好选用__________酶切割目的基因，酶切处理后的目的基因和质粒需使用__________（填“T4”、“E.coli”或“T4或E.coli”）DNA连接酶处理，才能得到重组质粒。 （4）为了筛选获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入________，培养一段时间挑选出呈__________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量的目的菌。 【答案】（1）一种氨基酸可能有多种密码子编码 （2）5′-TCTGTT-3′和5′-CTTGGA-3′ （3）BamH Ⅰ和Xma Ⅰ T4或E.coli （4）卡那霉素和X-gal 白色 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有多种密码子编码，因此，根据药物A的氨基酸序列人工合成DNA片段的方法得到的DNA片段有多种可能。 （2）由于DNA复制时子链的延伸是从5′端向3′端延伸，含磷酸基团的一端为5′端，含羟基的一端为3′端，因此两个引物的设计需要分别根据模板DNA两条链的3′端进行设计，因此，依据图中目的基因两侧相关序列，扩增时选用的引物碱基序列为5′-TCTGTT-3′和5′-CTTGGA-3′。 （3）目的基因与质粒形成重组分子要有相同的末端，且目的基因应插入启动子和终止子之间才能在受体细胞中表达。终止子与启动子之间有三种限制酶识别序列：EcoR I、Xma I和BamH I。据图可知，EcoR I会破坏目的基因，故为将目的基因准确插入质粒中，最好选用Xma I和BamH I切割目的基因。Xma I和BamH I切割得到的是黏性末端，用T4或E.coli DNA连接酶处理均可，都可以得到重组质粒。 （4）由图可知，质粒中含有LacZ基因和卡那霉素抗性基因，在构建基因表达载体时目的基因插入使LacZ基因被破坏，无法表达产生相应的产物将无色物质X-gal催化为蓝色物质，菌落应呈白色。因此，在培养基中应加入的物质有卡那霉素和X-gal，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌才能不被卡那霉素杀死，同时表现为白色菌落。 17．（2026·重庆康德·模拟预测）苏云金芽孢杆菌中含有一种抗虫基因 Bt基因，通过产生 Bt抗虫蛋白，杀死鳞翅目昆虫。科学家将从苏云金芽孢杆菌细胞内获取的 Bt基因与质粒1结合构建重组质粒2，然后导入普通棉花中，获得T₀代植株。 （1）已知 Bt基因两端的酶切位点如图1所示，P为启动子。研究者采用引物P₁（含 EcoRI识别序列）和P₂（含 BamHI识别序列） 对质粒1进行扩增,使质粒1线性化，再经酶切、连接，使Bt基因与质粒1重组为质粒2。请在图1质粒1处标出引物P₁和P₂的位置及方向。 （2）对不同T₀代植株进行PCR 检测，结果如下图。 代4号植株表现为非抗虫，但PCR 检测结果为____（填“阳性”或“阴性”），可能的原因是____。 a. Bt基因未导入 b. Bt基因所在染色体片段缺失 c. Bt基因突变 d. Bt基因表达效率太低 （3）将T₀代2号植株与普通棉花杂交获得T₁代，对T₁代进行抗虫鉴定，结果发现抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3：1，推测导入的 Bt基因位于_____上（填“同源染色体”或“非同源染色体”）。T₀代2号棉花自交，子代的性状分离比为____。 （4）长期单一种植抗虫棉可能会导致棉铃虫数量增加甚至爆发。科研人员借鉴传统农业中“间作”的方法，在转基因棉田中混种棉铃虫的寄主作物，作为棉田的“庇护所”，请用现代生物进化理论解释其原理____。 【答案】（1）/ （2）阳性 cd （3）非同源染色体 抗虫︰非抗虫（普通）＝15︰1 （4）“庇护所”能为敏感型棉铃虫提供生存条件，使得种群中保留一定数量的敏感型个体，敏感型个体随机交配，可将敏感基因传给后代，可以防止种群抗性基因频率增长过快，避免抗性个体的数量快速增加，进而避免棉铃虫爆发。 【解析】（1）要使质粒1线性化，且能与Bt基因经酶切、连接重组为质粒2，引物P1和P2应分别位于质粒1的两端，且方向相反，这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列，并且EcoR Ⅰ应与启动子连接在一侧，保证Bt基因转录方向正确。位置及方向如图（P1逆时针）。 或 （2）T0代4号植株表现为非抗虫，但PCR检测结果为阳性，可能的原因是Bt基因突变或Bt基因表达效率太低，导致表现为非抗虫。 （3）普通棉花相当于隐性纯合子，将T0代2号植株与普通棉花杂交获得T1代，对T1代进行抗虫鉴定，结果发现抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3︰1，应为1︰1︰1︰1的变型，推测导入的Bt基因位于非同源染色体上，且遵循自由组合定律，T0代2号棉花自交，子代的性状及分离比为抗虫︰非抗虫=15︰1。 （4）据题干信息可知，“庇护所”能为敏感型棉铃虫提供生存条件，使得种群中保留一定数量的敏感型个体，敏感型个体通过随机交配，可将敏感基因传给后代，这样可防止种群抗性基因频率增长过快，以避免抗性个体的数量快速增加，进而避免在转基因棉田中发生棉铃虫爆发。 18．（2026·重庆九龙坡·二调）利用PET 降解酶（PETase）分解废弃PET塑料应用前景广阔。实验室拟分离纯化高效降解PET的微生物并提取相关酶，流程如图1所示。研究人员通过卷积神经网络机器学习辅助的蛋白质工程技术对其改造，获得性能更优的突变型 PET 降解酶，改造思路如图2所示。请回答下列问题： （1）图1 中样品可采集自 。 A．未被塑料污染的土壤 B．废旧塑料填埋场的土壤 C．能消化塑料的黄粉虫肠道内容物 D．生长于塑料填埋场的植物根组织 （2）关于图1中培养基及培养过程的说法，下列叙述正确的是 。 A．在培养基灭菌前制备平板 B．①号培养基的作用是使微生物富集 C．②③培养基应以PET为唯一碳源 D．③中PET 量最低的微生物为目标菌 （3）据图2，为获得性能更优 PET 降解酶，其技术路线依次为 （用字母和箭头表示） A．重组DNA分子导入大肠杆菌 B．改变的PET 酶基因与质粒重组 C．分析最优突变体的氨基酸序列 D．改变PET 酶基因的特定序列 E．利用工程菌发酵生产突变蛋白 （4）人工构建突变体时需要大量的目的基因和载体（质粒），其中扩增质粒常用的方法是______，构建好的重组表达载体导入大肠杆菌时常用的方法是______。 （5）科学家获得了 PET 酶突变体（PETaseS121E/D186H/R224/N233K）, 经测定在50°C, 酶活性提升了数十倍。请结合以上信息，推测突变体酶活性大幅提升的原因_________。 【答案】（1）BC （2）BCD （3）C→D→B→A→E （4）在宿主细菌中增殖 感受态细胞法 （5）4个氨基酸位点的替换，导致酶的空间结构发生改变，增强了酶的热稳定性和催化速率 【解析】（1）分离降解PET的微生物，需从该微生物富集的环境取样：废旧PET填埋场土壤富含PET，存在大量目标降解菌；可消化塑料的黄粉虫肠道内也存在这类微生物，因此选BC。未被塑料污染的环境、植物根组织几乎不含目标降解菌，AD错误。 （2）A、制备固体平板时，需要先对培养基灭菌，再倒平板制备，因此制备平板在灭菌之后，A错误； B、①培养基为富集培养基，作用是扩大目标降解菌的数量，对微生物进行富集，B正确； C、筛选降解PET的微生物时，②③为选择培养基，需要以PET为唯一碳源，仅允许能利用PET的微生物生长，C正确； D、目标菌降解PET能力最强，培养后体系中剩余PET量最低，因此PET量最低的菌落就是目标菌，D正确。 （3）该过程符合蛋白质工程的技术流程：筛选得到最优突变体后，先分析最优突变体的氨基酸序列（C），再根据氨基酸序列推测改造基因，改变PET酶基因的特定序列（D），之后将改造后的目的基因与质粒重组得到重组DNA（B），再将重组DNA导入大肠杆菌（A），最后利用工程菌发酵生产突变蛋白（E）。即顺序为C→D→B→A→E。 （4）质粒通常是独立于细菌拟核以外的小型、环状双链DNA分子，扩增质粒常用的方法是在宿主细菌中增殖；将重组表达载体导入大肠杆菌时，常用Ca2+处理细胞，使细胞处于能吸收外源DNA的感受态，该方法称为感受态细胞法。 （5）氨基酸序列改变会导致蛋白质空间结构改变，4个氨基酸位点的替换，导致酶的空间结构发生改变，增强了酶的热稳定和催化速率，因此酶活性大幅提高。 19．（2026·重庆八中·模拟预测）植物对盐胁迫形成了一系列适应机制，其中SOS信号途径是植物耐盐性的重要信号通路。禾本科植物谷子是一种抗逆耐贫瘠作物，探究其体内的SOS2蛋白和SOS3蛋白是否存在相互作用，能为培育抗逆作物新品种奠定基础。部分研究过程如下。 （1）首先从GenBank数据库中查询SOS2基因和SOS3基因的碱基序列，设计并合成特异性_____________，用于PCR扩增获得目的基因。若PCR产物符合预期结果，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的________________。 （2）研究者利用荧光性酶互补技术研究SOS2蛋白和SOS3蛋白是否存在相互作用，该技术中使用的荧光素酶被切割为无活性的氨基端片段（N端）和羧基端片段（C端），它们不能自发重组发挥作用，只有当它们分别融合能够相互作用的蛋白时，才能引发重组并能激发荧光素酶活性，从而产生荧光（其机理见图甲）。 ①研究者用Kpn Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切获得的SOS2基因和SOS3基因，分别插入p1载体、p2载体。SOS2基因两端的黏性末端分别为5′-GTAC-3′和5′-_______-3′，SOS3基因应插入p2载体的_____（填“Ⅰ”或“Ⅱ”）位点。 ②将载体导入叶片细胞（见图丙），荧光信号的检测结果见图丁。 图丙中ⅰ、ⅱ分别对应的基因是______、_____（填“cLUC”“nLUC”“cLUC-SOS2”或“nLUC-SOS3”）。图丁中_____可作为证据说明该区域叶肉细胞能合成SOS2-C端融合蛋白和SOS3-N端融合蛋白。 综上所述，谷子体内的SOS2蛋白和SOS3蛋白存在相互作用。 （3）研究表明Na+逆向转运蛋白SOS1对于植物耐盐性非常重要，它是抗盐胁迫的关键蛋白。根据图戊所示机制，解释盐胁迫下植物能实现Na+外排的原因是_______________。 【答案】（1）引物 碱基序列（脱氧核苷酸序列） （2）TCGA Ⅱ nLUC-SOS3 nLUC 只有区域2出现荧光 （3）盐胁迫下，SOS2与SOS3结合后到达细胞膜，与细胞膜上的Na+逆向转运蛋白SOS1相互作用，使SOS1磷酸化，实现Na+外排 【解析】（1）PCR是一种体外扩增DNA的技术，原理是DNA分子复制，PCR技术扩增目的基因时，需要根据目的基因的序列设计合成特异性引物；琼脂糖凝胶电泳只能分离不同大小的DNA，无法判断DNA的碱基序列（脱氧核苷酸序列），因此PCR产物大小符合预期后仍需测序确认序列正确性。 （2）① 目的基因用Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，Kpn Ⅰ酶切产生黏性末端5′−GTAC−3′，根据Sal Ⅰ的识别序列G↓TCGAC，酶切后产生的黏性末端为5′−TCGA−3′；本实验需要表达LUC片段-目的蛋白的融合蛋白，才能在目的蛋白互作时让荧光素酶的N/C端重组产生荧光，p2载体携带cLUC（C端编码基因），结构为启动子---位点Ⅰ---cLUC---位点Ⅱ---终止子，要得到cLUC-目的蛋白的融合蛋白，需要将目的基因插入cLUC下游的Ⅱ位点保证融合表达，因此选Ⅱ。 ② 本实验的对照设计为：仅含单个融合蛋白/空载体，实验组为同时含cLUC−SOS2和nLUC−SOS3，因此区域3为cLUC+nLUC−SOS3，区域4为nLUC+cLUC−SOS2，即ⅰ为nLUC−SOS3，ⅱ为nLUC；只有两个融合蛋白都正常合成且相互作用，才会产生强荧光，因此只有区域2出现荧光，可以证明两种融合蛋白都成功合成。 （3）结合图戊的机制，SOS2与SOS3结合后到达细胞膜，盐胁迫解除了SOS3对SOS2的抑制，SOS2与SOS3形成复合物后，与细胞膜上的Na+逆向转运蛋白SOS1相互作用，使SOS1磷酸化，将细胞内多余的Na+转运出细胞，实现Na+外排。 20．（2026·重庆好教育·二诊）RNA沉默技术利用hpRNA（如图1所示）的双链部分（与靶基因的序列相同）特异性结合靶基因的mRNA，将其降解而抑制靶基因的表达。ZmHAK1基因在玉米的钾离子吸收、离子平衡、胁迫响应及生长发育中起关键作用。研究人员欲利用RNA沉默技术研究ZmHAK1基因的功能，进行了相关实验。回答下列问题： （1）研究人员需构建玉米ZmHAK1基因的hpRNA干扰载体，干扰载体中需含有如图2所示的目的片段。构建干扰载体的过程中需要使用的植物表达载体结构及其上的限制酶切割位点如图3所示，限制酶的识别序列和切割位点如表1所示。载体结构中，除了图3所示结构元件外，还未标明的结构元件有________。启动子的功能是________。 注：潮霉素抑制蛋白质合成后，叶绿素合成相关酶的含量不足，导致叶绿素无法正常合成，叶片就会逐渐变黄。 图3植物表达载体 限制酶 识别序列和切割位点 SmaI 5'-CCC↓GGG-3' ApaI 5'-GGGCC↓C-3' SpeI 5'-A↓CTAGT-3' XbaI 5'-T↓CTAGA-3' HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3' 表1 （2）研究人员获取ZmHAK1基因后，设计了如表2所示的引物F1和F2，利用PCR技术获取反向片段后，将获取的反向片段与酶切后的植物表达载体连接成重组载体1.为使正向片段与重组载体1正确连接形成重组载体2，用于PCR扩增正向片段的引物R1和R2的5′端应该分别增加限制酶________的识别序列。据题中信息分析，下列能正确表示引物R1序列的是________（填序号）。 A．5'-ACTAGTACCACTTGCGTCTGAGTCA-3′ B．5'-TCTAGAGCATCATCTACGGCGACAT-3' C．5'-TCTAGAACCACTTGCGTCTGAGTCA-3' D．5'-AAGCTTGCATCATCTACGGCGACAT-3' 引物名称 引物序列 F1 5'-GGGCCCGCATCATCTACGGCGACAT-3' F2 5'-ACTAGTACCACTTGCGTCTGAGTCA-3' 表2 （3）研究人员利用________法将目的基因导入玉米细胞中，经过脱分化形成________，经过再分化形成转基因玉米植株。 （4）在个体生物学水平上筛选转基因玉米植株，根据载体结构信息，设计一种可行的筛选方案：________。 【答案】（1）复制原点 作为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA （2）XbaI、HindⅢ C （3）农杆菌转化 愈伤组织 （4）取适量一定浓度的潮霉素溶液均匀涂抹在待检测玉米植株的叶片上，一段时间后观察玉米植株叶片的颜色变化，叶片颜色无明显变化的是转基因玉米植株 【解析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。 （1）载体结构中，除了图3所示结构元件（启动子、终止子、标记基因、限制酶识别位点）外，还未标明的结构元件有复制原点。启动子的功能是作为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 （2）研究人员获取ZmHAK1基因后，设计了如表2所示的引物F1和F2，利用PCR技术获取反向片段后，将获取的反向片段与酶切后的植物表达载体连接成重组载体1，为使正向片段与重组载体1正确连接形成重组载体2，用于PCR扩增正向片段的引物R1和R2的5′端应该分别增加限制酶XbaI、HindⅢ的识别序列。据题中信息分析，下列能正确表示引物R1序列的是5'-TCTAGAACCACTTGCGTCTGAGTCA-3'，因为该引物序列的5’端添加了XbaI的识别序列，进而可以通过限制酶的添加实现反向链接。 （3）研究人员利用农杆菌转化法将目的基因导入玉米细胞中，进而获得转化成功的受体细胞，该细胞经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化形成转基因玉米植株，该过程的原理是植物细胞的全能性。 （4）为了在个体生物学水平上筛选转基因玉米植株，结合基因表达载体的信息可知，其中带有的标记基因是潮霉素抗性基因，据此可取适量一定浓度的潮霉素溶液均匀涂抹在待检测玉米植株的叶片上，一段时间后观察玉米植株叶片的颜色变化，叶片颜色无明显变化的是对潮霉素有抗性的目标植株，即为转基因玉米植株。 21．（2026·重庆·二模）韧皮部杆菌（CLas）可引起柑橘黄龙病并导致柑橘植株死亡。西南大学柑橘研究所的科研人员发现，CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。为培育抗黄龙病柑橘，研究人员进行了相关实验。 （1）据图1分析，应选限制酶________切割质粒，为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因A端引物的________（填“5′”或“3′”）端添加________（填“SphI”“Sau3AI”或“MunI”）的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）将Ti质粒转入农杆菌，在含氨苄青霉素的培养基上培养得到多个单菌落。欲鉴定某单菌落是否为重组农杆菌从而用于柑橘外植体的感染，有两种鉴定方案。方案①：挑取该单菌落提取质粒，对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。方案②：挑取该单菌落转入3mL培养液，振荡培养12小时后取1mL提取质粒，再对目的基因进行PCR扩增与电泳鉴定。你建议选择方案________（填“①”或“②”），理由是________。 （3）为鉴定获得的转基因柑橘植株是否抗病，研究人员对甲、乙、丙三组植株进行CLas菌接种实验，一段时间后检测剩余细菌相对数量。结果如图2所示。丙组抗病效果最好，结合题干信息分析机理为________。 【答案】（1）EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ 5′ Mun Ⅰ （2）② 方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验 （3）茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果 【解析】（1）据图分析要保证正确插入，应选择双酶切，不能使用BamH I和Sau3A I，二者会破坏复制原点。可使用EcoR I和Sph I双酶切。为了后续能将目的基因正确连接到Ti质粒上，应在APP3-14基因靠近启动子的A端引物的5端添加EcoR I的同尾酶Mun I识别序列，B端的5端添加Sph I的识别序列，扩增后通过DNA连接酶将APP3-14基因与Ti质粒进行连接。 （2）后续转基因植株培育需要大量的重组菌，方案②保留了含重组质粒的农杆菌用于后续实验，故建议选择方案②。 （3）CLas会诱导柑橘植株产生PUB21蛋白而降解抗黄龙病关键蛋白MYC2，从而抑制植株的“茉莉酸防御反 应”（植物受到病原菌等侵染后，激活茉莉酸途径，产生多种物质增强防御能力）。APP3-14蛋白可防止MYC2被降解，并破坏CLas细胞膜。结合图示结果：茉莉酸激活（参与）防御途径；APP3-14保护MYC2并破坏CLas细胞膜，两者协同增强抗病效果。 22．（2026·渝西中学·模拟预测）科研人员将耐低磷基因（Pho基因）与抗虫基因（Bt基因）拼接成 Pho-Bt 融合基因，构建了含 Pho-Bt融合基因的表达载体，培育出耐低磷且抗豆荚螟的大豆新品种（如图）。 （1）与细胞内 DNA复制相比，融合PCR 构建融合基因时无需解旋酶参与，其特殊的解旋机制是_______；反应体系中dNTP 除作为DNA 合成原料外，还能_______。 （2）引物 2和引物 3的重叠区碱基序列必须_______，才能实现两基因的搭桥连接；搭桥杂交后的延伸过程，不需要额外添加引物，原因是_______；PCR1中，至少经过_______轮循环才能获得两端均含引物 1和引物 2的目标DNA 片段①。 （3）据载体图谱，为避免融合基因与质粒连接时发生自身环化和反向连接，需在引物 1和引物 4的 5'端分别添加_______、_______的识别序列。 【答案】（1）通过高温变性破坏氢键实现双链解旋 为DNA子链的延伸提供能量 （2）互补配对 搭桥杂交形成的互补单链3´端可直接作为DNA合成的引物启动延伸 2 （3）EcoRI BclI 【解析】（1）PCR与体内DNA复制不同，不需要解旋酶，通过高温变性破坏氢键实现双链解旋；dNTP（脱氧核苷三磷酸）除作为DNA合成的原料外，水解特殊化学键还能为DNA子链的延伸提供能量。 （2）引物2和引物3需要通过碱基互补配对结合，才能实现两个基因的搭桥连接，因此重叠区碱基序列必须互补配对；搭桥变性杂交后，重叠区互补结合，搭桥杂交形成的互补单链3´端可直接作为DNA合成的引物启动延伸，因此不需要额外添加引物；PCR第一轮循环仅能得到只带一个引物的片段，第二轮循环即可得到两端同时含引物1和引物2的目标片段，因此至少需要2轮循环。 （3）要避免连接时融合基因自身环化、反向连接，需要选择两种不同的限制酶切割，产生不同的黏性末端；融合基因转录方向是从Pho（引物1端）到Bt（引物4端），需要插入到质粒的启动子和终止子之间，根据载体上限制酶识别序列的位置，需要在引物1（融合基因左端，靠近启动子）5'端添加EcoRI识别序列，引物4（融合基因右端，靠近终止子）5'端添加BclI识别序列。 23．（2026·重庆第十一中学校教育集团·模拟预测）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3' 3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3' 3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3' 3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3' 3' CAGCT↑G5' （1）可从______中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。基因表达载体含有多个重要元件，其中启动子的作用是______。 （2）为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5'端和3'端分别添加限制酶______的酶切序列。若基因E11转录模板链的3'端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是______。 （3）使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有______的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。若1号菌落含有重组质粒，则其他菌落的条带出现的原因可能是______。 （4）将纯化得到的蛋白E11添加到含有______（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 【答案】（1）序列数据库 RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA （2）NsiⅠ，SalⅠ 选择SalⅠ和PstⅠ对质粒进行完全酶切，利用DNA聚合酶将SalⅠ产生的黏性末端补平 （3）四环素 2号、3号导入的重组载体是两个pET质粒环化形成，4号导入的是空白pET质粒 （4）U-DPG和RA 【解析】（1）获取已知目的基因的序列信息，可从核酸序列数据库中查询；启动子是基因表达载体的核心元件，功能是作为RNA聚合酶识别和结合的位点，启动下游目的基因的转录。 （2）质粒的转录方向为从启动子到终止子，目的基因E11需与质粒转录方向一致，才能正常表达；质粒上可用于插入目的基因的酶切位点需位于启动子和终止子之间，且不破坏氯霉素/四环素抗性基因、复制原点等关键元件，可选位点为PstⅠ、SalⅠ（ApaⅠ识别序列和PspOMⅠ识别序列相同会破坏两个标记基因）。由于基因E11中含有PstⅠ酶切位点，所以不能在转录模板链的5'端对应编码链的3'端，需添加PstⅠ酶切序列，由限制酶识别序列可知：NsiⅠ的切割位点为5'ATGCA↓T3'，PstⅠ的切割位点为5'CTGCA↓G3'，二者切割后可产生互补的黏性末端（均含-TGCA-序列），能实现连接；因此基因E11转录模板链的5'端对应编码链的3'端（靠近终止子），需添加NsiⅠ酶切序列，3'端（靠近启动子）添加SalⅠ酶切序列，使目的基因与酶切后的质粒定向连接，避免反向连接。若基因E11转录模板链的3'端不添加酶切序列，需通过改造质粒实现定向连接，避免目的基因随机连接或质粒自连：先用SalⅠ和PstⅠ对质粒完全酶切，产生两个不同的末端（SalⅠ黏性末端、PstⅠ黏性末端）；用DNA聚合酶将SalⅠ切割产生的黏性末端补平，使质粒形成一个平末端（SalⅠ处）+一个黏性末端（PstⅠ处）；目的基因仅转录模板链的5'端有与PstⅠ互补的黏性末端（限制酶NsiⅠ切割形成），3'端为天然平末端，只能与质粒的黏性末端、平末端分别配对，从而实现定向连接。 （3）质粒上含氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，目的基因插入位点位于氯霉素抗性基因内部：当目的基因与质粒连接形成重组质粒时，氯霉素抗性基因被破坏，失去抗性；而四环素抗性基因保持完整，仍具有抗性。因此需将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的培养基中培养，筛选出成功导入质粒（空白质粒或重组质粒）的大肠杆菌。结合电泳结果和质粒/目的基因长度分析：若1号菌落含有重组质粒。2号、3号：条带位置比1号更靠近点样孔（分子量更大），原因可能是两个空白pET质粒经酶切后自身环化形成二聚体质粒，分子量远大于重组质粒，电泳迁移速率更慢；4号：条带位置对应M2的5000bp左右，与空白pET质粒（5369bp）的电泳位置相符，说明导入的是未插入目的基因的空白pET质粒。 （4）题干明确：体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，葡萄糖基转移酶E11是该过程的关键酶。酶的活性验证需在底物存在的条件下进行，因此反应体系中需加入该酶的两种底物（U—DPG和RA），通过检测产物RD的合成速率，即可验证蛋白E11的葡萄糖基转移酶活性。 24．（2026·重庆育才中学·模拟预测）人血清白蛋白（HSA）是一种血浆蛋白，在临床上应用广泛，需求量大。武汉大学开发出水稻胚乳生物反应器生产HSA。 （1）与利用转基因大肠杆菌相比，利用水稻胚乳生物反应器生产HSA的优点是_____________。 （2）为确保HSA基因只在胚乳中表达，筛选出基因Glua1和Sbe1，三种基因在水稻叶、根和胚乳中的表达量如表所示。 基因表达 叶 根 胚乳 Glua1表达量 0.5 3 101978 Sbe1表达量 27 25 1461 Xa1表达量 0.6 8 0 Xa1基因作为__________（阳性/阴性）对照组，构建表达载体时，应将HSA基因插入到_____________基因启动子之后，原因是___________________。 （3）GFP基因表达蛋白能够在紫外线照射下发出绿色荧光，为便于筛选成功导入的细胞，欲将GFP基因插入HSA基因下游形成融合基因，GFP及HSA基因的部分序列如下图所示： HSA GFP 5’ATG AAG TGG GTA……TTT CAT GAC AAT3’ 5’ATGAGTAAAAGA……TTGTCTCAAGAT3’ 3’TAC TTC ACC CAT……AAA GTA CTG TTA5’ 3’TACTCATTTCCT……AACAGAGTTCTA5’ 应选用的引物组合为_____________。 3’CTG TTA GAA GTA 5’ 3’GAA GTA TAC TTC 5’ 5’CTT CAT ATG AGT 3’ 5’CAA GAT CTT CAT 3’ 甲 乙 5’ATGAAG 3’ 3’TACTTC 5’ 3’GTTCTA 5’ 3’CAAGAT 5’ 丙 丁 注：所有引物只写出部分序列 （4）将融合后的目的基因导入到农杆菌，再侵染水稻的愈伤组织，培育出水稻胚乳生物反应器，紫外线照射后，_____________表示HSA基因在水稻胚乳中特异性表达。 （5）由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，科学家将α-淀粉酶基因与HAS基因一起转入水稻，目的是_____________。 【答案】（1）水稻胚乳为真核细胞，可对 HSA 进行翻译后加工，使其具有生物活性；产量高、成本低、易规模化生产（大肠杆菌为原核细胞，无内质网、高尔基体等细胞器，无法对HSA进行正常加工） （2）阴性 Glua1 Sbe1基因与Glua1基因在胚乳中的表达水平均高于叶和根，但Glua1基因在胚乳中的表达量显著高于Sbe1基因 （3）甲和丙 （4）水稻植物中胚乳发出绿色荧光 （5）防止转基因花粉的传播（防止基因污染） 【解析】（1）大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，无法对真核来源的蛋白质（如 HSA）进行糖基化等翻译后加工，表达的蛋白可能无活性；而水稻胚乳细胞是真核细胞，有内质网、高尔基体等细胞器，可对 HSA 进行加工修饰，使其具有生物活性；同时水稻种植成本低、产量高，适合大规模生产。 （2）Xa1基因在胚乳中表达量为0，符合“不表达”的阴性对照的作用，用于验证胚乳特异性表达的特点；根据表格数据，Sbe1基因与Glua1基因在胚乳中的表达水平均高于叶和根，但Glua1基因在胚乳中的表达量显著高于Sbe1基因，因此 Glua1 启动子能驱动 HSA 基因仅在水稻胚乳中高效特异性表达，在构建表达载体时，应将HSA基因插入到Glua1基因启动子之后。 （3）要将 GFP 基因插入 HSA 基因下游形成融合基因，PCR 扩增需满足：上游引物：与 HSA 基因的 3' 端互补；下游引物：与 GFP 基因的 5' 端互补，且扩增方向正确。HSA 的 3' 端序列为：5'...TTT CAT GAC AAT3'，其互补链为3'...AAA GTA CTG TTA5'，因此上游引物需与 HSA 的 3' 端模板链互补，对应引物甲（3'CTG TTA GAA GTA 5'）。GFP 的 5' 端序列为：5'ATGAGTAAAAGA...3'，因此下游引物需与 GFP 的 5' 端模板链（3'TACT CATTTCCT...5'）互补，对应引物丙（5'ATGAAG 3'）。 （4）GFP 基因表达的蛋白在紫外线下会发出绿色荧光，且 HSA 基因由胚乳特异性启动子驱动，因此：紫外射线照射后，水稻胚乳部位发出绿色荧光，表示 HSA 基因在水稻胚乳中特异性表达。 （5）α- 淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因此将其与 HSA 基因一起转入水稻，目的是：防止转基因水稻的花粉扩散，避免目的基因通过花粉传播到其他植株，造成基因污染。 25．（2026·重庆八中·模拟预测）苏云金芽孢杆菌中含有一种抗虫基因 Bt基因，通过产生 Bt抗虫蛋白，杀死鳞翅目昆虫。科学家将 Bt基因与质粒1结合构建重组质粒2，然后导入普通棉花中，获得T0代植株。 （1）由于Bt基因序列已知，可以从___________中快速检索获取其完整序列。 （2）已知 Bt基因两端的酶切位点如图1所示，P为启动子。 研究者采用引物P1（含 EcoRI 识别序列）和P2（含 BamHI 识别序列）对质粒1进行扩增，使质粒1线性化，再经酶切、连接，使Bt基因与质粒1重组为质粒2。请从下列选项中选出正确的引物P1和P2的位置及方向___________（单选）。 a.   b. c.  d. （3）对不同 T₀代植株进行 PCR 检测，结果如图2。T₀代4号植株表现为非抗虫，但 PCR 检测结果为___________（填“阳性”或“阴性”），可能的原因是___________（多选）。 a． Bt基因未导入 b． Bt 基因所在染色体片段缺失 c． Bt基因突变 d．Bt基因表达效率太低 （4）已知向 T0代2号植株中成功导入两个 Bt 基因，现将其与普通棉花杂交获得T1代，T1代中抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3：1，据此推测导入的 Bt基因位于___________上填（“同源染色体”或“非同源染色体”）。T0代2号植株自交，子代的性状分离比为___________。 【答案】（1）序列数据库 （2）a （3）阳性 cd （4）非同源染色体 抗虫︰非抗虫（普通）＝15︰1 【解析】（1）目的基因序列已知时，可从序列数据库中检索筛选获得完整的目的基因序列。 （2）要使质粒1线性化，且能与Bt基因经酶切、连接重组为质粒2，引物P1（含 EcoRI 识别序列）和P2（含 BamHI 识别序列）应分别位于质粒1的两端，且方向相反（P1指向启动子，P2指向另一端），这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoRⅠ和BamHⅠ识别序列，并且EcoRⅠ应与启动子连接在一侧，保证Bt基因转录方向正确，所以a符合要求。 （3）T0代4号植株表现为非抗虫，但PCR检测结果为阳性，可能的原因是c、Bt基因突变或d、Bt基因表达效率太低，导致表现为非抗虫（Bt基因未导入和Bt 基因所在染色体片段缺失不会出现阳性条带）。 （4）普通棉花相当于隐性纯合子，将T0代2号植株与普通棉花杂交获得T1代，对T1代进行抗虫鉴定，结果发现抗虫棉花与非抗虫棉花的比值约为3︰1，应为1︰1︰1︰1的变型，推测导入的Bt基因位于非同源染色体上，且遵循自由组合定律，T0代2号棉花自交，含有Bt基因就为抗虫，所以子代的性状分离比为抗虫︰非抗虫=15︰1。 26．（2026·重庆巴蜀中学校·二模）司美格鲁肽被当作“减肥神药”在社会上遭到热议，其有效成分为胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物。某团队将相关基因连入载体后导入人源HEK-293细胞，再将导入成功的细胞移植至小鼠体内，成功构建出光照下可合成GLP-1的糖尿病治疗模型小鼠，机制如图所示。请回答下列问题： （1）哺乳动物肠道L细胞会分泌GLP-1，可通过提取哺乳动物肠道L细胞RNA，逆转录生成DNA，再利用_____（填写中文全称）扩增GLP-1基因。 （2）GLP-1基因及选择质粒的结构如图甲、乙所示，为保证GLP-1基因能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2．GLP-1基因的转录方向为_____（填“从左往右”或“从右往左”）；引物1序列为5′—_____—3′（写10个碱基即可）。 （3）构建载体时选用组成型启动子（核心特点是驱动基因持续表达，不受外界条件、细胞类型及发育阶段影响）和诱导型启动子（基础状态下驱动基因低表达或不表达，仅受特定外界信号诱导后才启动或增强转录）。启动子1、2、3依次是_____（填“组成型”或“诱导型”）启动子。 （4）从免疫角度推测，用水凝胶囊包裹人源HEK-293细胞的目的是_____。 【答案】（1）聚合酶链式反应 （2）从右往左 5'-TCTAGACCTA-3' 。 （3）组成型、组成型、诱导型 （4）避免小鼠免疫系统识别、攻击、排斥移植的人源 HEK-293 细胞（降低免疫排斥反应） 【解析】（1）提取 RNA 逆转录得到 cDNA（互补 DNA）后，体外扩增目的基因 GLP-1 的技术是PCR（聚合酶链式反应），这是基因工程中目的基因扩增的标准技术。 （2）转录的方向是从基因的启动子端→终止子端，RNA 聚合酶沿着模板链（非模板链题目已标注）的3'→5' 方向移动，合成 RNA 沿 5'→3' 方向延伸。 从图甲碱基链方向：基因下方链为 5'→3'（左→右），上方非模板链为 3'→5'（左→右）；引物 2 结合在基因右侧 3' 端，引物 1 结合在基因左侧 5' 端，转录时以非模板链的互补链为模板，因此转录方向为从右向左。 同时结合质粒双酶切定向插入要求：目的基因需要 KpnⅠ、XbaⅠ 双酶切，转录必须和质粒启动子方向匹配，进一步确定转录方向从右往左。 题目说明：图甲已知序列为非模板链（编码链），编码链与 mRNA 序列（T 换 U）一致，模板链与编码链反向互补。 引物 1 结合在目的基因左侧模板链的 3' 端，序列与非模板链（编码链）5' 端起始序列完全相同，同时需要引入XbaⅠ酶切位点，所以引物 1的5'-TCTAGACCTA-3' 。 （3）启动子 1：驱动光敏色素基因表达，光敏色素是光照信号的感应蛋白，因此是组成型。 启动子 2：驱动 p65、vp64 转录激活因子持续表达，不需要光照诱导、持续稳定存在，符合组成型启动子定义（持续表达，不受外界条件影响）。 启动子 3：直接驱动 GLP-1 目的基因，只有光照信号传导过来才会启动 GLP-1 转录，黑暗下不表达，完全符合诱导型启动子定义。 （4）人源 HEK-293 细胞对于小鼠来说属于异体外来细胞，会被小鼠免疫系统识别为抗原，引发强烈的细胞免疫排斥，导致移植细胞被清除死亡。 水凝胶囊包裹细胞，可以形成物理屏障，隔离细胞与小鼠免疫系统的直接接触，降低、避免免疫排斥反应，让移植细胞在小鼠体内长期存活、稳定表达 GLP-1。 27．（2026·重庆南开中学·模拟预测）白桦是我国重要的绿化树种，BpMYB5基因是调控白桦耐盐性的关键基因，为验证该基因的耐盐功能，研究人员利用无缝克隆技术，将BpMYB5基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP过表达载体，开展相关实验研究。回答下列问题： 注：KanR为卡那霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。 （1）过程①是利用PCR技术将质粒线性化，传统方法是利用限制酶在对应酶切位点进行切割，与限制酶切方法相比，过程①的优点是______，该过程中引物应选择______。 （2）为确保BpMYB5基因与eGFP基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物设计时，应去除BpMYB5基因中编码终止密码子的序列。已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA链）的部分序列如下表（AUG为起始密码子，UAG、UAA、UGA为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1的碱基序列应为5'-_______-3'（写出15个碱基）。融合基因必须插入到T-DNA内部的原因是______。 BpMYB5基因序列 5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3' eGFP基因序列 5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3' （3）实验人员对农杆菌感染后的白桦愈伤组织进行筛选，应该在培养基中添加的抗生素为______，将筛选得到的转基因愈伤组织经培养可获得转基因白桦植株，通过观察______以了解BpMYB5基因的表达水平和表达部位。 【答案】（1）不受酶切位点序列的限制，可以在质粒任意位点进行开环；避免限制酶破坏质粒上功能区域；在对质粒线性化的同时可以进行大量扩增 引物2和引物3 （2）GCTGGACATAAACAC T-DNA可携带融合基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上 （3）卡那霉素 绿色荧光强度和分布 【解析】（1）传统限制酶切割质粒只能在限制酶特定的识别序列（酶切位点）处切开，而PCR技术线性化质粒不受酶切位点序列的限制，可以在质粒任意位点进行开环；避免限制酶破坏质粒上功能区域；在对质粒线性化的同时可以进行大量扩增。 PCR扩增的延伸方向为5'→3'，过程①需要将环状质粒从目标断开位点打开，得到全长的线性化质粒，因此需要选择分别结合在断开位点两侧、延伸方向覆盖整个质粒的引物2和引物3，才能扩增得到符合要求的线性化载体。 （2） BpMYB5编码链末端为5'-…GTGTTTTAGCAT-3'，其中TAG（对应终止密码子UAG）及其后CAT需去除；R1是BpMYB5的反向引物，延伸方向为5'→3'，需要与BpMYB5去除TAGCAT后的末端、eGFP的开头序列互补，实现两基因无缝连接，所以引物R1的15个碱基序列为GCTGGACATAAACAC。 农杆菌转化植物的原理是：农杆菌Ti质粒上T-DNA可携带融合基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，因此融合基因必须插入T-DNA内部才能稳定转化和表达。 （3）重组质粒的T-DNA区域携带卡那霉素抗性基因（KanR），只有成功转入重组质粒的愈伤细胞能在含卡那霉素的培养基上存活，因此培养基中添加卡那霉素进行筛选。 BpMYB5与绿色荧光蛋白基因（eGFP）融合表达，绿色荧光的强度反映BpMYB5的表达水平，绿色荧光的分布反映BpMYB5的表达部位，因此可通过观察绿色荧光强度和分布了解目的基因的表达情况。 28．（2026·重庆巴蜀中学·模拟预测）天仙子植株产生的托品烷类生物碱是临床上广泛应用的抗胆碱药物，其生物合成可能与天仙子植株的根中大量表达的T3 基因有关。为鉴定T3 基因的功能，可通过病毒诱导法改变T3基因的表达，并测定托品烷类生物碱的含量。结果如图所示。 （1）根据上述研究结果，说明病毒诱导法__________（填“促进”或“抑制”）T3基因表达，进而影响托品烷类生物碱的合成量。 （2）基因表达量的检测方法是对天仙子根的RNA 进行处理从而得到的_________作为荧光定量PCR 检测模板，在PCR 反应体系中加入一种 Taqman 探针，该探针5'端标记荧光基团 （R），3'端标记淬灭剂 （Q）。当探针保持完整时，荧光基团与淬灭剂距离较近，荧光被淬灭，检测不到荧光信号；当PCR 进行延伸反应时，TaqDNA聚合酶将探针进行酶切，使荧光基团与淬灭剂分离，荧光不再被淬灭。荧光信号可被仪器检测，过程如图所示。荧光定量PCR 仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与核酸浓度有关，核酸浓度越高，Ct值越______，进而根据Ct值检测各基因的相对表达量。 （3）科学家获得一株托品烷类高表达的天仙子（突变株甲），其性状改变与5号染色体DNA 的880kb~903kb区间相关。根据野生型天仙子的该区间设计连续的重叠引物，提取突变株天仙子和野生型的基因组 DNA 进行PCR，产物扩增结果如图所示。 据图推测5号染色体上第________对引物对应的区间内碱基对的_________是突变体甲出现的根本原因。为后续高效构建高表达目的基因的表达载体，扩增目的基因设计引物时，可在引物的_______端添加不同的限制酶的识别序列，以适合不同的质粒。 【答案】（1）抑制 （2）cDNA 小 （3）4 缺失 5' 【解析】（1）从柱状图可以看出：对照组的T3基因表达量和托品烷类生物碱含量都显著高于病毒诱导组。这说明病毒诱导法抑制T3基因表达，进而影响托品烷类生物碱的合成量。 （2）荧光定量PCR检测基因表达量时，需要先将提取的RNA通过反转录得到cDNA（互补DNA），以此作为PCR的检测模板。荧光定量PCR中，核酸浓度越高，荧光信号达到预设阈值的循环数（Ct值）越小。 （3）从电泳结果看，野生型在引物对4对应的区间有扩增产物，而突变体甲没有，说明该区间的碱基对发生了改变，导致PCR无法正常扩增，因此突变体甲的根本原因出在第4对引物对应的区间。突变体甲的性状改变与该区间相关，且PCR产物消失，说明该区间内碱基对发生了缺失，导致引物无法结合或扩增失败。PCR扩增时，Taq酶从引物的3'端开始延伸，因此在引物的5'端添加限制酶识别序列，不会影响扩增过程，且该序列会保留在扩增产物两端，方便后续酶切连接到质粒上。 29．（2026·重庆一中·一模）科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因（位于小鼠5号染色体）融合,形成Gata3-GFP融合基因,构建并筛选只含一个融合基因的基因表达载体。载体注射到小鼠受精卵后,会替代原Gata3基因整合到染色体上。科研人员最后筛选获得能正常表达融合蛋白的雌､雄小鼠各一只。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图1注所示,A､B､C､F､R为不同引物,回答相关问题: （1）为了使GFP基因能正确插入载体,在PCR扩增GFP编码序列前,需要设计引物F和R,其序列分别为________和________（填序号）。 ①5′-CCCCTCGAGAAAAACACTTTTTGATATTCG-3′ ②5′-CCCGAATTCTTCTAGATGACCACAAGATAG-3′ ③5′-CCCCAATTGTTCATGCTTGATATGCCAATC-3′ ④5′-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3′ （2）若要确定小鼠细胞中是否只导入了一个融合基因,可选择引物________（从“A”､“B”､“C”中选择）用于PCR扩增并电泳（如图2）,结果________（填“甲”､“乙”或“丙”）可说明小鼠细胞中只导入了一个融合基因,原因是_____________。 （3）已知上述两只小鼠细胞中都只导入了一个融合基因,杂交后获得F1若干,将体细胞中都含有两个融合基因的雌雄个体杂交,不考虑变异,则F2中荧光小鼠理论上约占________。 （4）不对称PCR技术可获得特定序列的单链DNA（ss-DNA）作为分子探针来检测特定基因,其基本原理是采用不等量的一对引物P1和P2,经若干次循环后,低浓度的引物P1被耗尽,以后的循环只产生含高浓度引物P2的延伸产物。若反应体系中原有m个模板DNA,最初8次循环后P1耗尽,此时消耗了________个引物P1,再进行10次循环后一共消耗了________个引物P2。 【答案】（1）④ ② （2）AC 甲 只导入了一个融合基因的细胞中一条染色体有融合基因，其同源染色体只有Gata3基因，因此使用引物A、C可以同时扩增融合基因的大部分（大片段）和几乎全部Gata3基因（小片段） （3）100% （4）255m 2815m 【解析】选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。DNA重组技术的基本工具包括 “分子手术刀”--限制酶、“分子缝合针”--DNA连接酶、“分子运输车”--基因进入受体细胞的载体。 （1）目的是将 GFP 基因插入载体，需要两端带有与载体匹配的酶切位点（Nhe I 和 EcoR I）。 引物 F（上游）：需要 Nhe I 识别序列 GCTAGC，对应序列④：5′-CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC-3′。引物 R（下游）：需要 EcoR I 识别序列 GAATTC，且为反向互补序列，对应序列②：5′-CCCGAATTCTTCTAGATGACCACAAGATAG-3′。 （2）选择引物 A、C。A 位于融合基因上游，C 位于 Gata3 基因下游，可同时扩增融合基因大片段和正常 Gata3 基因小片段。若只导入一个融合基因，细胞中一条染色体有融合基因，同源染色体只有正常 Gata3 基因，PCR 产物会出现 “一大一小” 两条带，对应图中的甲。只导入一个融合基因时，细胞中一条染色体有融合基因，同源染色体只有 Gata3 基因。使用引物 A、C 可同时扩增融合基因（大片段）和正常 Gata3 基因（小片段），因此出现两条带。 （3）已知两只小鼠都导入了一个融合基因，且融合基因替代了一条 5 号染色体上的 Gata3 基因，因此这两只小鼠的基因型可记为 Gata3-融合基因。 杂交后 F₁ 中体细胞含两个融合基因的个体，基因型为 融合基因-融合基因。 该个体产生的配子均含融合基因，因此自交后 F₂ 所有个体都含融合基因，荧光小鼠理论上占 100%。 （4）① 初始模板 DNA 为 m 个，PCR 每次循环引物 P1 的消耗量是上一轮的 2 倍。8 次循环后 P1 耗尽，总消耗量为：m×（20+21+22+⋯+27）=m×（28−1）=255m 。前 8 次循环中，引物 P2 的总消耗量为 255m；第 9~18 次循环（共 10 次）只产生含 P2 的链，每次循环消耗 28m 个 P2，10 次共消耗 10×28m=2560m。 总消耗量：255m+2560m=2815m。 30．（2026·重庆巴蜀中学·一模）某家系中有个体患甲病（由A/a控制）和乙病（由B/b控制），图1是该家系的系谱图，图2是该家系中部分成员的基因检测结果（条带①②代表一对等位基因，③④代表另一对等位基因）。同一对等位基因的常规引物可通用。已知Ⅱ-4只患乙病。请回答下列问题： （1）乙病为____遗传病，Ⅲ2和Ⅲ3患病情况分别是____。 （2）现欲通过PCR检测IV1的基因组成情况，利用孕妇外周血中胎儿游离DNA（cfDNA）进行筛查。但cfDNA只占母体血液总DNA的5%~10%，且高度降解，完好模板数量极微，普通PCR难以扩增出目的条带。因此选择巢式PCR进行扩增（如图3），在PCR常规引物的基础上设计补充内引物，利用两对引物进行两次PCR扩增，极大提升了检验的灵敏度。 ①第一次PCR利用____（填“常规”或“补充内”）引物进行扩增；第一次PCR扩增产物作为模板加入第二次PCR扩增体系，请从引物的角度分析，在第二次扩增前稀释第一次扩增产物的原因是____。 ②巢式PCR能在初始模板浓度很低的情况下仍能获得明显的目的条带，检验灵敏度高、特异性强的原因是____。 ③由PCR检验及其他产前筛查结果得知，IV1为健康男性，PCR检验结果出现三个条带，请在图1lii中画出这三个条带的位置__________。 【答案】（1）伴X染色体隐性 患甲病、患甲病和乙病（两病都患） （2）常规 降低第一次PCR 中残留常规引物的浓度，避免与补充内引物共同扩增出非目标片段 两轮扩增实现信号二次放大，内引物特异性靶向第一轮产物内部，错误扩增的产物内部拥有内引物互补序列的概率极低，抑制了非特异性扩增从而检出极微量模板 【解析】PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 （1）因Ⅱ4只患乙病，根据“无中生有”判断乙病为隐性遗传病。电泳结果表示I1为纯合子，不能提供致病基因给子代，因此判断乙病为伴X染色体隐性遗传病。进一步结合Ⅱ4电泳结果推断其基因型为AaXbY，再结合I1纯合子电泳结果判断条带①为A，条带②为a，条带③为XB，条带④为Xb，因此Ⅲ2和Ⅲ3的基因型分别是aaXBXb、aaXbY，故Ⅲ2患甲病，Ⅲ3患甲病和乙病。 （2）①第一次 PCR使用常规外引物，对cfDNA 中极低浓度的目标片段进行初步捕获和富集。稀释第一轮产物的核心目的：降低干扰物浓度：稀释103~105倍可充分去除残留外引物、dNTPs及 PCR抑制剂；优化扩增体系：调整模板与内引物的摩尔比例，避免模板过量导致第二轮扩增效率下降；减少非特异性：防止第一轮的非特异性产物作为第二轮模板引发链式非特异性扩增。 ②巢式PCR通过双重引物验证实现高特异性：外引物和内引物必须分别与目标序列的上下游不同区段完全匹配，非特异性片段无法同时满足两轮配对而被有效排除。灵敏度源于指数级级联放大：第一轮使模板从微量提升至可检测水平，第二轮在此基础上再实现10倍扩增，总放大效应达10l2倍以上，可检测单拷贝模板。 ③Ⅳ1为健康男性，PCR检验结果出现三个条带，其基因型一定为AaXBY。这里需要注意，该结果是使用巢式 PCR扩增得出的，因此最后一次 PCR是用内引物进行的，所以对应的三个条带都该比题干电泳图的对应条带小一些，所以都应该画得靠下一些：。 31．（2026·重庆一中·模拟预测）球孢白僵菌是一种应用广泛的昆虫病原真菌，科研人员欲利用同源重组技术敲除球孢白僵菌中M基因（利用同源臂之间的序列会发生交换的特性，用抗氯嘧磺隆基因sur置换M基因以实现基因敲除）。回答下列问题： （1）通过PCR技术大量获得sur基因，该过程中使用的酶为________，为了激活该酶，需要在PCR反应缓冲液中添加________。为将sur基因正确连接进质粒1，在引物设计时应分别往引物1与引物2的5'端添加________的识别序列（图甲）。 （2）将成功插入sur的重组质粒1导入球孢白僵菌，在含有________的固体培养基上进行培养。为了排除宿主基因组外的sur表达对抗性筛选的影响，对球孢白僵菌的培养应在________（填“大于”或“小于”）23℃的温度条件下进行。结果发现部分长出菌落的菌株中M基因仍存在，经过分析发现，sur基因整合到球孢白僵菌基因组中时，除了同源重组的方式外，还能发生T-DNA随机插入，导致目的基因未被敲除但菌株能通过抗性筛选进而出现假阳性（图乙）。 （3）为避免假阳性对实验结果的干扰，现将OpS3基因插入质粒2（图丙），再利用质粒2通过同源重组的方式将“启动子-OpS3-终止子”片段插入重组质粒1中（OpS3基因可使球孢白僵菌合成红色卵孢素）。若质粒2上的LB₂片段的序列设计成与质粒1中的RB₁片段相同，那么RB₂的序列应与质粒1中________（从“A~D”中选填）之间的部分片段相同。 A．复制原点与左边界 B．左边界与LB₁。 C．LB₁与RB₁ D．RB₁与右边界 （4）将改造后的重组质粒1导入野生型球孢白僵菌中，在适宜温度条件下于抗性筛选平板上进行稀释涂布培养，在培养基上呈现________（填“红色”或“白色”）的菌株为M基因成功敲除菌株。 【答案】（1）耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ KpnI、EcoRI （2）氯嘧磺隆 大于 （3）B （4）红色 【解析】（1）PCR需要耐高温的DNA聚合酶（Taq酶），该酶依赖Mg2+激活，因此反应缓冲液中需添加镁离子。为保证sur基因正向插入质粒的启动子与终止子之间（方向正确），需选择两种产生不同黏性末端的限制酶（避免自身环化）。质粒上启动子与终止子之间有EcoRI、KpnI、HindⅢ和MfeⅠ位点，HindIII会破坏质粒上的启动子，EcoRI在LB1处也会进行切割，故在切割质粒时可选择MfeI和KpnI，其中EcoRI和MfeⅠ切割后会产生相同的黏性末端，sur基因上有MfeI的识别序列，根据sur基因的转录方向为从右向左，引物2侧应连接到启动子这边，故引物2的5'端添加EcoRI的识别序列，引物1的5'端添加KpnI的识别序列。 （2）标记基因为抗氯嘧磺隆基因 sur ，因此需在含氯嘧磺隆的培养基上筛选转化子；质粒携带温度敏感型复制原点，23℃以下质粒可自主复制，大于23℃时质粒无法复制并逐渐丢失。大于23℃培养可排除游离质粒上 sur 基因表达的干扰，仅保留整合到基因组中的 sur 基因表达的菌株。 （3）同源重组的核心是两个同源序列之间发生交换。题目明确质粒2的 LB₂与质粒1的 RB₁序列相同，为实现“启动子 - OpS3 - 终止子”片段的定向插入，质粒2的 RB₂需与质粒1中左边界与 LB₁之间的序列同源，这样两个同源臂（左边界- LB₁、RB₁）可发生配对交换，将目的片段准确插入重组质粒1的 T-DNA 区。 （4）OpS3 基因可使球孢白僵菌合成红色卵孢素。当 M 基因成功敲除时，说明同源重组顺利完成，OpS3 基因随 T-DNA 整合到宿主基因组中并稳定表达，因此菌落呈现红色；若为假阳性（T-DNA 随机插入、M 基因未敲除），则无 OpS3 基因表达，菌落为白色。 32．（2026·重庆大足中学&七校联盟·模拟预测）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 （1）基因工程的核心步骤是________。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5’端分别引入________限制酶识别序列。本实验中，从基因N扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。 （2）构建完成的重组质粒大小约9.5 kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。为进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳检测结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是________。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA、GCC、GCU、GCG。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，_______是诱变第243位苯丙氨酸的引物。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ c：5′-…GCT/CCC/GAG/CGT/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ d：5′-…GAG/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ 【答案】（1）基因表达载体的构建 XhoⅠ和XbaⅠ 5 （2）外源DNA 1 只有1号菌株的PCR产物条带大小（约2.3kb）与目的基因N的大小一致 （3）b 【解析】（1）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤；为了保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho I酶切，由于目的基因N含有SpeI识别序列，故N基因不能使用SpeI酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端 ，基因N酶切时可以用Xba I替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列，N基因a链为转录模板链，转录从模板链的3'端→5'端，引物与模板链的3'端结合，因此a链的右边为3'端，将基因与载体正向连接，则引物1的5'端应添加Xho Ⅰ序列，引物2的5'端应添加Xba Ⅰ序列；本实验中，基因N进行PCR扩增需要1种DNA聚合酶，构建载体需要用3种限制酶SpeⅠ、XhoI、Xba Ⅰ和1种DNA连接酶，整个过程共需要5种酶。 （2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，只有1号菌株的PCR产物条带大小（约2.3kb）与目的基因N的大小一致，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N，在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。 （3）b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知b是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且b引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'端首位GCA为240位，则b引物5'端GCC为243位，其后面的序列与a引物a的第243位后面的序列相同。 33．（2026·重庆一中·二模）辣椒遗传转化的成功率低，筛选难度大｡研究人员以甜菜红素合成基因RUBY为核心构建了可视化载体pKSE-RUBY，使重组细胞在愈伤组织阶段即可表现出肉眼可见的红色，大幅提高了辣椒转化､筛选的效率｡载体构建过程如下图所示： 根据图中信息回答以下问题： （1）扩增基因：基因扩增时需要引物，原因是____；扩增RUBY时，上游引物应选择引物____（填序号）｡ （2）处理载体：线性化的载体能提高同源重组的效率，图中以EcoRI切开质粒pKSE，再用DNA聚合酶将黏性末端补平，获得线性化载体｡另外，用____的方法也能获得线性化载体｡ （3）同源重组：由于目的基因与线性化载体的同源区段可发生交换，因此在RUBY两侧需引入同源臂｡ ①同源臂包含限制酶识别序列及15个碱基对组成的特异性序列，为保证EcoRI能在重组质粒上RUBY基因两侧进行切割，下游引物的5'端需添加____个核苷酸，写出下游引物额外添加序列中3'端的10个碱基：5'-____-3'｡ ②常规的基因表达载体构建过程会用到两种不同的限制酶，图中同源重组的过程中只用到EcoRI一种限制酶，但仍能高效地构建重组质粒，且目的基因能正确连接，原因是____｡ （4）鉴定质粒：已知pKSE的全长为16437bp，RUBY基因全长为3951bp，则重组质粒经EcoRI切割后，再将黏性末端补平，会得到长度为____的片段｡ 【答案】（1）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链 ③ （2）PCR扩增 （3）21 TTACGAATTC 目的基因两端的同源臂与线性化载体两端的序列特异性同源，可通过同源交换定向连接目的基因，避免了自身环化和反向连接 （4）16441 bp和3961 bp 【解析】（1）PCR扩增基因时，由于DNA聚合酶的功能特性：不能从头合成DNA链，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此必须添加引物。根据图示转录方向为③→④（从左到右），上游引物需结合在目的基因上游，3′端朝向目的基因内部才能完整扩增RUBY，因此选择引物③。 （2）除了限制酶切割环形质粒获得线性载体外，还可以通过PCR扩增质粒骨架序列，直接得到线性化载体。 （3）① 如图，基因左、右同源臂需将酶切位点补充完整（多1个碱基对），否则在同源重组得到的重组质粒中， RUBY基因两侧没有EcoRI识别序列。因此，上、下游引物均需添加21个核苷酸。 下游引物需与所给序列3'端互补配对，额外添加序列中3'端的10个碱基（5′→3′）为TTACGAATTC。 图示如下： ② 同源重组依赖同源序列的特异性配对：目的基因两端的同源臂分别和线性化载体两端的序列特异性互补，通过同源交换可以定向插入目的基因，因此仅用一种限制酶也能保证目的基因正确连接，不会出现自身环化或反向连接。 （4）重组质粒中RUBY两侧各有一个EcoRI酶切位点，酶切后得到两个片段：原pKSE载体骨架长度为16437 bp，插入的RUBY基因长度为3951 bp，故重组质粒经EcoRI切割后，再将黏性末端补平，会得到长度为16441bp和3961 bp的片段｡图解如下： 34．（2026·重庆育才中学·模拟预测）丙酮酸作为细胞呼吸的中间产物，常作为高价值化合物合成的重要调控靶点，大肠杆菌的PdhR蛋白可作为丙酮酸响应的抑制因子，但其应用局限于原核生物。为在酵母菌中构建基于大肠杆菌PdhR蛋白的丙酮酸响应生物传感器，研究人员进行了系列研究。请回答下列问题： （1）研究人员构建了NLS—PdhR—CLN2融合基因（如图1）。为确保NLS基因连接的准确性，需使用限制酶________切割启动子A和PdhR基因间的序列。改造后的PdhR蛋白既可以调控酵母菌核基因的表达，又能维持PdhR蛋白含量的稳态，已知NLS是核定位信号，那么CLN2基因的作用可能是促进PdhR蛋白________（填“合成”或“降解”）。 （2）图2是丙酮酸响应生物传感器。组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的活性，据图2可知，当丙酮酸浓度升高时，酵母菌会发绿色荧光，原因是________。 （3）启动子B由天然启动子B0改造而来。研究表明，PdhR蛋白不能识别并结合天然启动子B0；科研人员通过在B0下游插入特定序列，获得了图2所示的改造启动子B，并通过实验（如图3）证明PdhR蛋白能特异性识别并结合启动子B，由此推测，实验中P是指无荧光标记的_________（填“启动子B”或“无关启动子”），并在泳道5的方框中补充可能的条带宽度_________。 （4）成功转化丙酮酸响应生物传感器的酵母菌适宜在_________（填“固体”或“液体”）培养基中扩大培养。 【答案】（1）BamHI、SpeⅠ 降解 （2）当丙酮酸浓度升高时，丙酮酸会抑制PdhR蛋白与pdhO识别并结合，解除对启动子B的抑制作用，从而促进gfp基因表达绿色荧光蛋白 （3）启动子B （4）液体 【解析】（1）NLS基因两端有BamHI和XbaI的酶切位点，启动子A和PdhR基因间的序列含SpeⅠ、BamHI和EcoRⅤ的酶切位点，XbaⅠ和SpeⅠ切割所得的黏性末端相同，故应使用BamHI、SpeⅠ切割启动子A和PdhR基因间的序列。据题可知，NLS使PdhR蛋白定位到细胞核中，CLN2蛋白应促进PdhR蛋白及时降解，以维持PdhR蛋白含量的稳态。 （2）当丙酮酸浓度升高时，丙酮酸会抑制PdhR蛋白与pdhO识别并结合，解除对启动子B的抑制作用，从而促进gfp基因表达绿色荧光蛋白。 （3）P 是无荧光标记的竞争探针，用于验证 PdhR 蛋白与启动子 B 的特异性结合。若 P 为启动子 B，会与荧光标记的启动子 B 竞争结合 PdhR 蛋白，导致荧光条带变浅。实验仅检测荧光标记的B启动子，与泳道2相比，泳道5的PdhR与标记B的结合效率完全相同，因此条带1的宽度与泳道2一致，条带2的宽度也与泳道2一致，补充可能的条带宽度如图：。 （4）液体培养基适宜用于扩大培养菌株。 35．（2026·重庆西南大学附中·模拟预测）病毒诱导的基因沉默（VIGS）是将某植物的特定内源基因片段通过重组病毒载体导入该植物，从而抑制体内相应内源基因表达的技术；其原理是载体携带的该目的基因片段在植物体内产生的RNA，会引导细胞内同源的内源mRNA降解。为在外来入侵物种刺萼龙葵中建立VIGS技术体系，研究人员拟利用一种TRV病毒—质粒融合载体（pTRV）（图1），对其八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因进行沉默实验。PDS基因沉默会导致叶片出现光漂白（变白）现象。 回答下列问题： （1）PDS基因片段的克隆。提取刺萼龙葵叶片细胞的总RNA，经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，用引物F1（5′-CGGGATCCGCGATAGGGTGACAGATGA-3′）和R1（5′-CGGAATTCACACACTGACAGCAACG-3′）进行PCR扩增。PCR过程中，将温度加热至90~95℃的目的是_______。 （2）pTRV-PDS重组载体的构建。为将上述PDS基因片段准确插入pTRV载体的相应酶切位点，应选用______对Ti质粒和PDS基因片段进行双酶切，然后连接。 （3）对重组载体进行鉴定。结果如图2，泳道1、2是pTRV-PDS的双酶切产物，泳道5、6是以pTRV-PDS为模板、用PDS基因片段特异性引物进行PCR的产物（外源PDS基因片段长度为498bp）。 ①泳道1、2的500bp条带比泳道5、6的暗，原因是_________。 ②泳道3、4是出于某种目的设置的对照组，根据电泳结果图推测其样本处理方式应为_________（填字母）。 A.空载pTRV质粒的双酶切产物 B.空载pTRV质粒经相同引物的PCR产物 C.重组pTRV-PDS质粒的单酶切产物 D.重组pTRV-PDS质粒的未酶切产物 （4）基因沉默效果的鉴定。将携带介导细胞间转移的运动蛋白基因的pTRV-PDS重组载体导入农杆菌，并通过叶片注射进行侵染。基于该载体的这一特性，使沉默效应系统性扩散_________（填“需要”或“不需要”）经过植物组织培养阶段。植株出现光漂白症状后，为从分子水平证实PDS基因被沉默，可从叶片细胞提取总RNA，经逆转录后，用PCR技术检测。此时，用于PCR的引物应依据______（填“插入载体的PDS基因片段内部区域”或“插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域”）进行设计，理由是_______。 【答案】（1）使模板DNA解聚为单链 （2）BamHⅠ和EcoRⅠ （3）泳道5、6是PCR扩增产物的电泳结果，目标DNA（PDS基因片段）被特异性大量扩增，含量高，故条带亮；泳道1、2是酶切产物的电泳结果，目标DNA（PDS基因片段）含量低，故条带暗 B （4）不需要 插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域 引物依据插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域进行设计，可以确保扩增的模板仅来自植物内源的PDS基因的mRNA，从而真实反映其表达量是否下降。若引物是依据插入载体的PDS基因片段内部区域进行设计，则会同时扩增出病毒载体自身转录的PDSmRNA序列，无法区分信号来源，会干扰对植物内源基因沉默效果的判断 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 （1）题干已明确该步骤是以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应循环的第一步是高温变性，其目的是破坏DNA双链间的氢键，使双链DNA解聚成为单链，暴露出碱基序列，为后续引物的结合提供模板。 （2）引物F1序列中包含的识别位点（5 ' − GGATCC − 3 '），引物R1序列中包含的识别位点（5 ' − GAATTC − 3 '），因此，通过该对引物扩增出的PDS基因片段，其两端已分别引入了BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点。为将基因片段插入载体，必须选用相同的限制酶对PDS基因片段和载体进行切割，以产生相匹配的黏性末端，故应选用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切。 （3）泳道5、6是PCR产物的电泳结果，PCR技术能特异性、指数级地扩增目标片段，使PDS基因片段大量扩增，因此电泳样品中几乎全是PDS基因片段，条带明亮。泳道1、2是酶切产物的电泳结果，pTRV-PDS重组载体被分割成大小差异巨大的两个片段（载体片段和基因片段），其中PDS基因片段含量少，因此对应条带相对较暗。 ②电泳结果显示泳道3、4无条带，据题图和上述分析可知，空载pTRV质粒和pTRV-重组载体中应同时含有BamH Ⅰ  和 EcoR Ⅰ两种酶切位点，因此，未酶切和单酶切的电泳结果应显示有1条电泳条带，双酶切电泳结果应显示有2条电泳条带，ACD选项可排除；若泳道3、4的样品是空载pTRV质粒经相同引物的PCR产物，空载质粒不含基因插入片段，因此PCR不会扩增出相应的DNA片段，电泳结果应为无条带，为泳道5、6的对照组，可排除非特异性扩增的干扰，故选B。 （4）由于病毒载体自身携带运动蛋白基因，其表达产物可使病毒在植物细胞间系统性移动，因此不需要通过组织培养再生植株，直接将其注射入活体叶片即可使沉默效应扩散。若要在分子水平证实PDS基因沉默，检测目的是判断植物内源PDS基因的mRNA是否减少。若引物是依据插入载体的基因片段内部区域进行设计，则PCR会同时扩增出源于植物内源基因和源于病毒载体转录的PDSmRNA序列，导致检测信号失真，无法准确反映植物内源基因的表达变化。因此，引物必须依据插入载体的PDS基因片段外侧的内源基因区域进行设计，这样扩增产物仅来源于植物PDS内源基因转录的mRNA，从而特异性、真实地检测到其表达量的下降，证实基因沉默成功。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $