专题15 基因工程（6年汇编）（湖南专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 基因工程专题高考真题与模拟题汇编，覆盖湖南近6年考情，聚焦工具酶、PCR技术等核心考点，以病毒抗原、疾病治疗等科研情境设计试题，强化实验分析与综合应用能力。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |选择题|5|限制酶识别位点、PCR原理、基因编辑安全性|结合2024-2026湖南真题，考查工具酶应用与PCR结果分析| |非选择题|8|载体构建、单克隆抗体制备、启动子活性检测|以非洲猪瘟病毒、阿尔茨海默病等真实科研为背景，突出实验设计与结果论证|

专题 15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 湖南考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025湖南(1题)、2024湖南(1题) · 情境设置：多围绕病毒抗原、质粒改造、基因敲除等科研场景，考查工具酶原理。 · 考查重点：限制酶识别位点、切割特点、载体构建中的酶切与连接，常与突变或重组分析结合。 · 命题趋势：注重工具酶的选择与应用，强化对酶切产物和连接产物结构的理解，体现综合性。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026湖南(2题)、2024湖南(1题) · 情境设置：常以疾病治疗、育种改良、蛋白质工程等真实科研为背景，结合PCR技术应用。 · 考查重点：侧重PCR原理、引物设计、电泳结果分析及与测序、重组技术的联系。 · 命题趋势：创新题型增多，如双脱氧测序、基因表达载体构建中的PCR环节，强调实验设计能力。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【解析】 酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 【解析】 A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选B。 2.（2021·湖南·高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： （1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是　　　　　　　　　，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的　　　　　　　　　断开。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是　　　　　　　　　。 （3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是　　　　　　　　　。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为　　　　　　　　　（答出两点即可），功能上具有　　　　　　　　　。 （4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的　　　　　　　　　淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路　　　　　　　　　。 【答案】① 限制性核酸内切酶（限制酶）    ② 磷酸二酯键    ③ 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养     ④ 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难    ⑤ 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答）    ⑥ 发育的全能性    ⑦ B    ⑧ 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 【解析】 1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；② 检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、核移植： （1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物； （2）原理：动物细胞核的全能性； （3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。 【解析】 （1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。 （3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。 （4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。 【点睛】 本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。 3.（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　　等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物　　　　　　对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为　　　　　　bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是　　　　　　（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有　　　　　　（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】（1）① 终止子（复制原点）    ② P1 和 P3    ③ 782    ④ 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失     （2）① 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法）    ② 抗体检测      【解析】 1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。 (1) 重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。 将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失。 (2) ① 诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ② 选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（        ） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 【答案】B 【解析】 A、所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确； B、重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误； C、外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 2.（2024·湖南·高考真题）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【解析】 1、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：① 高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③ 中温延伸：合成子链。 2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【解析】 A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确； B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误； C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确； D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 故选AC。 3.（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: （1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是　　　　　　　，物质b是　　　　　　　。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　　　（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 氨基酸序列    ② mRNA     ③ 密码子的简并性     （2）① 从基因文库中获取目的基因    ② 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成     ③ DNA半保留复制     （3）① 种类     ② 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏     （4）设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间      【解析】 1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列； 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 (1) 据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 (2) 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA半保留复制。 (3) 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。 (4) 为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。 4.（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的　　　　　　　　（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　　。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A. 24 h检测细胞内 B. 24 h检测细胞外 C. 0 h和24 h检测细胞内 D. 0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射　　　　　　　　　　　　　；该实验结论是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 抗体    ② 使其在星形胶质细胞中特异性表达    ③ KpnⅠ和BamHⅠ     （2）C     （3）① 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒    ② 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。      【解析】(1) 实验目的是形成CAR-A细胞（嵌合抗原受体基因），并鉴定这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力，所以表达产物需要与Aβ聚集体特异性结合，所以胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列。 要使其在星形胶质细胞中特异性表达，所以需要选择特异性启动子。 为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，需要将CAR基因编码序列和特异性启动子导入病毒载体中，分析目的基因和载体，可以选择KpnⅠ和BamHⅠ切割目的基因和病毒载体，可以保证目的基因插入病毒载体中，依次形成特异性启动子、CAR表达载体、GFP基因和终止子的表达载体。 (2) 要证明细胞具有“吞噬”和“降解”Aβ聚集体的能力，必须检测Aβ是否进入了细胞内部以及其含量的变化。在0 h（更换培养基前）和24 h（更换培养基继续培养后）分别检测细胞内的Aβ聚集体含量，如果24 h时细胞内Aβ含量显著低于0 h，则能确凿地证明CAR-A细胞不仅吞噬了Aβ，还在细胞内将其降解了，C正确，ABD错误。 (3) 为检测效果，实验组6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，对照组选择6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒，由于3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降，说明了在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 5.（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： （1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用　　　　　　　（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 （2）单倍体育种。常用　　　　　　　　的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　。 （3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用　　　　　　　酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中　　　　　　　　的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路　　　　　　　　。 【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶    ② 生长素和细胞分裂素     （2）① 花药离体培养    ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目     （3）① HindⅢ、BamHⅠ    ② 交链格孢    ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL      【解析】 【关键能力】 （1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证： (1) 因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 (2) 获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 (3) 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL，具体思路：设计引物利用PCR扩增野生百合的基因L及其pL；插入Ti质粒构建基因表达载体，利用农杆菌转化 法导入百合B的体细胞，经植物组织培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原体微 生物侵染转基因百合，检测其抗病能力（要体现基因工程的步骤和关键技术，最后要进行个体生 物学水平鉴定） 题干关键信息 所学知识 信息加工 去除细胞壁获得原生质体 植物体细胞杂交的过程 植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程 获得单倍体植株 植物组织培养技术 通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体 鉴定百合单倍体植株 有丝分裂的过程 单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期 1.（2026·湖南张家界·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可对目标基因进行定点编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A. Cas9蛋白的作用是切割DNA分子，属于限制性内切核酸酶 B. 该技术需要根据目标基因的序列设计向导RNA C. 基因编辑过程中，细胞可通过DNA修复机制修复断裂的DNA D. 该技术可用于治疗人类的单基因遗传病，不会产生任何安全风险 【答案】D 【解析】 A、Cas9蛋白可识别切割特定序列的DNA，功能与限制性内切核酸酶一致，A正确； B、向导RNA需要通过碱基互补配对定位目标基因，因此需要根据目标基因的序列设计特异性向导RNA，B正确； C、Cas9切割使DNA断裂后，细胞可通过自身的DNA修复机制修复断裂的DNA，以此完成基因编辑，C正确； D、CRISPR/Cas9技术仍存在脱靶效应等问题，可能引发基因突变、染色体异常等安全风险，并非不会产生任何安全风险，D错误。 2.（2026·湖南怀化·一模）（多选）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，控制该相对性状的基因为A/a。为研究控制该性状的基因，研究人员将一个紧凑株型的植株与纯合松散株型植株杂交，均为松散株型，中松散株型：紧凑株型=3∶1。研究得知，a基因由A基因内部插入一段序列而来（图1），研究人员设计了3条引物（P1～P3），位置如图1（→表示引物5′→3′方向）。以3个单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（图2-B中乙、丙电泳条带未标出）。不考虑PCR结果异常，下列说法正确的是（       ） A. 若a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，原因是插入导致转录提前终止 B. 图2-A中的条带代表a，丙单株无扩增条带的原因是其基因型为AA C. 图2-B使用的引物组合是P1、P2，乙、丙植株对应的条带均有两条 D. 使用图2-A中的引物组合扩增全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型=2∶1 【答案】BD 【解析】 A、在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，应是终止密码子提前出现，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译，A错误； B、根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，即图2-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，B正确； C、图2-B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，Aa（松散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带。所以乙和丙都只有一条带，C错误； D、使用图2-A中的引物组合（P3和P2）扩增全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A为松散株型，而子二代中Aa∶AA=2∶1，所以使用图2-A中的引物组合扩增全部样本，有扩增条带松散株型（Aa）：无扩增条带松散株型（AA）=2∶1，D正确。 故选BD。 3.（2026·湖南岳阳·一模）原花青素在植物的生长发育、抵御紫外线辐射、增强抗逆性以及防御病虫害等方面发挥着重要作用，无色花青素还原酶编码基因SpLAR是多根紫萍合成原花青素的关键基因，为提高原花青素的产量，研究人员构建了pCAMBIA1301-SpLAR植物表达载体，以获得过表达SpLAR基因多根紫萍株系。回答下列问题： （1）原花青素是多根紫萍中重要的类黄酮化合物（次生代谢物），可利用　　　　　　技术对其进行工厂化生产。 （2）提取多根紫萍的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR筛选出SpLAR基因的cDNA序列，该过程中使用的引物1序列是5’-GGTCACCCTAT-3’，则引物2应设计为　　　　　　（写出10个碱基即可）。SpLAR基因转录时的模板链是　　　　　　链。 （3）成功构建pCAMBIA1301-SpLAR表达载体后，将其导入受体细胞常用的方法是　　　　　　。 （4）提取受体细胞DNA，并选择合适引物进行PCR鉴定，电泳结果如下图。 注：M为参照样品；标号1为SpLAR质粒的PCR产物；标号2为野生型株系PCR产物；标号3为SpLAR转基因株系；标号4为阴性对照 分析结果可知SpLAR基因cDNA　　　　　　（填“是”或“否”）成功整合到受体细胞DNA中。为确保获得过表达SpLAR基因多根紫萍株系，还应补充的实验操作是　　　　　　。 【答案】（1）植物细胞培养     （2）① 5’-CCATGGATGG-3’    ② a     （3）农杆菌转化（法）     （4）① 是    ② 检测转基因株系和野生型的由SpLAR基因转录得到的mRNA含量/无色花青素还原酶含量/原花青素含量，对比分析两组数据      【解析】 基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 (1) 原花青素是多根紫萍中重要的类黄酮化合物，可利用植物细胞培养技术对其进行工厂化生产，这是植物组织培养的过程。 (2) 提取多根紫萍的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR筛选出SpLAR基因的cDNA序列，该过程中使用的引物1序列是5’-GGTCACCCTAT-3’，该引物中包含了BstEⅡ的识别序列，且与a链的左侧配对，则引物2需要与b链的右侧配对，且需要加上限制酶NcoⅠ的识别序列，应设计为5’-CCATGGATGG-3’。根据启动子的位置和子链的延伸方向可判断，SpLAR基因转录时的模板链是a链。 (3) 成功构建pCAMBIA1301-SpLAR表达载体后，将其导入受体细胞常用的方法是农杆菌转化（法），因为受体细胞是植物细胞。通过农杆菌转化法可将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。 (4) 根据图示结果可知，SpLAR基因cDNA已经成功整合到受体细胞DNA中，因为转基因植株3中呈现出SpLAR质粒的PCR产物。为确保获得过表达SpLAR基因多根紫萍株系，还应补充的实验操作是检测转基因株系和野生型的由SpLAR基因转录得到的mRNA含量/无色花青素还原酶含量/原花青素含量，对比分析两组数据，上述操作是为了检测目的基因是否进行了正常表达，以及是否表现了相应的性状。 4.（2025·湖南益阳·一模）野生大豆是宝贵的野生植物资源，耐盐碱能力优异。研究人员将野生大豆中的耐盐碱基因OsMYB56导入粳型常规水稻以提高水稻耐盐碱能力。图1是农杆菌 Ti质粒部分结构，OCS 基因是农杆菌 Ti质粒特有的报告基因，能在植物根茎叶中表达，检测时经电泳、染色后在紫外光下观察到荧光。图2是含OsMYB56基因的DNA片段，其中R1、R2、 R3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。相关限制酶的识别序列及切割位点如图3所示。请回答下列问题： （1）基因工程的核心步骤是　　　　　　。已知OsMYB56基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入序列 GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取OsMYB56基因时，为保证OsMYB56基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物R1外，还需要选择引物　　　　　　（填“R2”或“R3”），并在该引物5’端增加碱基序列5’　　　　　　　3’。 （2）将重组质粒导入农杆菌并侵染水稻细胞，可将外源基因导入水稻细胞内并维持稳定，原因是　　　　　　。 （3）对转化是否成功进行检测时，利用OCS 基因检测得到的电泳图谱如下。检测中需用　　　　　　作为阴性对照，为进一步检测OsMYB56基因是否表达出相关蛋白质，常用　　　　　　技术进行检测。 【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② R2    ③ 5′-GAATTCGCCACC-3′     （2）Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。     （3）① 未转化的水稻植株    ② 抗原一抗体杂交      【解析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 (1) 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；已知OsMYB56基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入序列 GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取OsMYB56基因时，为保证OsMYB56基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物R1外，还需要选择引物“R2”，并在该引物5’端增加碱基序列5′-GAATTCGCCACC-3′。因为图中显示，在Ti质粒的T-DNA区域的启动子和终止子之间含有XhoⅠ、MunⅠ、SalⅠ三种限制酶识别位点，抗病基因上含有XhoⅠ、EcoRⅠ、MunⅠ、SalⅠ四种限制酶识别位点，但MunⅠ会破坏目的基因。根据题图给出的限制酶识别序列和切割位点可知，MunⅠ和EcoRⅠ能切出相同的黏性末端，XhoⅠ和SalⅠ能切出相同的黏性末端。如果选了SalⅠ酶切目的基因上游，并且切质粒用的是MunⅠ和XhoⅠ，由于SalⅠ与XhoⅠ是同尾酶，那么目的基因的上游就会跟质粒上XhoⅠ酶切后的黏性末端相连，这会导致目的基因反方向插入质粒， 应该在R2上加EcoRⅠ识别序列，用EcoRⅠ与XhoⅠ切目的基因，用MunⅠ和XhoⅠ切质粒。又知抗病蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子前加入5′-GCCACC-3′序列，会显著提高基因的表达效率。需在上游的引物的5′端增加碱基序列5′-GAATTCGCCACC-3′。 (2) 将重组质粒导入农杆菌并侵染水稻细胞，可将外源基因导入水稻细胞内并维持稳定，这是因为含重组Ti质粒的农杆菌导入水稻细胞后，Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (3) 对转化是否成功进行检测时，利用OCS 基因检测得到的电泳图谱如下。从图中可以看出，加重组质粒组是阳性对照，会产生电泳条带；空白对照（加水组）和阴性对照不会产生条带，故阴性对照是用未转化的水稻植株为材料做的。从图中可知没有条带的是没有转化成功的植株，故植株2、3、6、8是没有转化成功的植株。为进一步检测OsMYB56基因是否表达出相关蛋白质，可以从转基因水稻中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测抗病基因是否翻译出相应的抗性蛋白。 5.（2026·湖南怀化·二模）黄瓜花叶病毒（CMV）是危害黄瓜生产的主要病毒之一，该病毒侵染植株后会导致叶片皱缩、光合作用减弱，严重影响产量和品质。CMV的基因组中的RNA4负责编码病毒的外壳蛋白。为培育抗CMV的黄瓜新品种，科研人员进行了如图所示的基因工程操作。回答下列问题： （1）为获得CMV的RNA4，应从　　　　　　　　中提取总RNA．然后以RNA4为模板，通过逆转录过程来合成其互补DNA（cDNA）。 （2）使用两种不同的限制酶切割T-DNA．同时对合成的cDNA的两端加装接头，该接头的序列的特点应该是　　　　　　　　，其目的是　　　　　　　　。 （3）图中将病毒RNA4-cDNA反向连接到Ti质粒上，这种连接方式的目的是　　　　　　　　，从而达到抗CMV的作用。 （4）检测转基因黄瓜是否成功获得抗性，可采用的个体生物学水平鉴定方法是　　　　　　　　。与传统的农药防治相比，培育抗病毒转基因黄瓜的优点是　　　　　　　　（写出1点）。 【答案】（1）受CMV感染的黄瓜植株（或感染CMV的黄瓜叶片）     （2）① 与两种限制酶切割产生的黏性末端互补    ② 使cDNA定向插入T-DNA（或使cDNA按特定方向连接到T-DNA上）     （3）反向连接的病毒RNA4-cDNA在黄瓜细胞中转录产生的RNA可以与病毒RNA4互补配对，从而阻止病毒外壳蛋白的合成     （4）① 接种CMV，观察转基因黄瓜是否发病    ② 减少农药使用，保护环境      【解析】(1) CMV侵染黄瓜植株后会在感病组织中大量存在，因此应从受CMV感染的黄瓜植株（或感病黄瓜叶片）中提取总RNA以获得病毒RNA4，而后通过逆转录过程来合成其互补DNA（cDNA）。 (2) 为使cDNA定向插入T-DNA，需要在其两端加装与限制酶切割产生的黏性末端互补的序列，这样才能通过碱基互补配对实现定向连接，保证cDNA定向插入T-DNA（或使cDNA按特定方向连接到T-DNA上），进而获取相应的重组DNA。 (3) 反向连接的RNA4-cDNA在转基因黄瓜细胞中转录后会产生与病毒RNA4互补的RNA，两者结合后会形成双链RNA，从而阻止病毒RNA4翻译合成外壳蛋白，进而获得抗性。 (4) 个体生物学水平的鉴定方法是直接观察生物个体是否具有抗性，即接种CMV，观察转基因黄瓜是否发病。与传统农药防治相比，转基因抗病育种可以减少农药的使用，降低环境污染，保护环境。 6.（2026·湖南岳阳·二模）科学家设计出针对肿瘤细胞表面特定抗原的蛋白质scFv，其制备过程：首先制得由VL-Linker-VH构成的融合基因scFv库（图1，其中箭头表示PCR过程中的引物，scFv基因的首尾各含有一个由6个核苷酸组成的限制酶识别序列），然后将scFv库与噬菌粒（图2）连接成表达载体库，再在噬菌粒表达载体库转染大肠杆菌的基础上，筛选出表面展示有scFv的噬菌体库（图3），最后将其转入合适的表达系统中进行表达并再次筛选，获得特定的scFv。 （1）以下是除R之外的引物，其中1R为①，则1F为　　　　　　　　，scFv首端限制酶识别序列为　　　　　　　　　。 ①5′-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC-3′ ②5′-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3′ ③5′-GTATACCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3′ ④5′-CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC-3′ ⑤5′-GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG-3′ （2）噬菌粒表达载体中，质粒复制原点的作用是　　　　　　　　　　　；根据图2分析被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有乳糖的培养基中才能表达scFv的原因是　　　　　　　　　　　。 （3）用抗scFv的抗体筛选出表面展示有scFv的噬菌体库的原理是　　　　　　　　　　　。 （4）为获得功能完善且结构较为复杂的scFv应该选用　　　　　　　　　　　（填“大肠杆菌表达系统”或“哺乳动物细胞表达系统”） 【答案】（1）① ②    ② 5′-GTATAC-3′     （2）① 为质粒的复制提供起始位点，使噬菌粒能在大肠杆菌细胞中进行复制    ② 噬菌粒中控制scFv表达的启动子为乳糖启动子，乳糖为诱导物，只有在含乳糖的培养基中，乳糖启动子才会被激活，驱动scFv基因的转录和翻译     （3）抗原与抗体的特异性结合     （4）哺乳动物细胞表达系统      【解析】(1) 由图1可知，1R与1F有部分序列互补，已知1R的碱基序列为5'-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC-3'，按照碱基互补配对原则可知，② 5'-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3'的5'端部分碱基可以与①3'端部分碱基互补配对，所以推测1F为② 。由图1可知，下面的一条链为模板链，转录的方向是从左向右，而引物F的碱基序列与模板链的部分碱基序列相同，已知scFv的首端含有一个由6个核苷酸组成的限制酶识别序列，结合以上分析，scFv首端限制酶识别序列为5'-GTATAC-3'。 (2) 噬菌粒表达载体中，质粒复制原点的作用是为质粒的复制提供起始位点，使噬菌粒能在大肠杆菌细胞中进行复制。由图2可知，噬菌粒中控制scFv表达的启动子为乳糖启动子，乳糖为诱导物，只有在含乳糖的培养基中，乳糖启动子才会被激活，所以被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有乳糖的培养基中才能表达scFv。 (3) 用抗scFv的抗体筛选出表面展示有scFv的噬菌体库的原理是抗原与抗体的特异性结合。 (4) 为获得功能完善且结构较为复杂的scFv应该选用哺乳动物细胞表达系统，因为相比于哺乳动物细胞表达系统，大肠杆菌表达系统属于原核系统，功能较为简单。 7.（2026·湖南怀化·一模）噬菌体侵染细菌时会发生如图1所示的重组反应。科学家基于此过程开发了新型分子克隆技术，以快速构建基因表达载体，该克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，具体流程如图2所示。请回答下列问题。 （1）为构建基因表达载体，除含有图示的目的基因和标记基因外，还必须有　　　　。（写出至少两个） （2）BP反应中，attB位点与attP位点间的片段会发生交换，反应后的体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，因此需将反应体系转入对ccdB基因的表达产物　　　　（填“敏感”或“不敏感”）的大肠杆菌，并添加卡那霉素以获得质粒2。LR反应中则发生attL位点与attR位点间的片段交换，继续将LR反应混合体系导入大肠杆菌，并接种到添加　　　　的固体培养基上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中所含质粒即为质粒4。 （3）科学家为研究A基因的表达产物蛋白质A在细胞内的定位，拟利用上述技术构建含有A-GFP融合基因的载体（GFP为绿色荧光蛋白基因）。请在图3所示的流程中填入合适的位点：①　　　　；②attL2；③attR3。为了使融合蛋白顺利表达，对A基因的末端可能需要去除其编码　　　　的序列。 （4）获得的质粒2具有广泛的应用价值。若研究人员希望将A基因转入哺乳动物细胞中进行高效表达，只需利用质粒2与含有　　　　（填“大肠杆菌”或“哺乳动物”）启动子（位于attR1位点的上游）的质粒3进行LR反应即可快速完成构建。与传统的限制酶切割、连接酶连接的方法相比，该克隆技术在构建不同表达载体时的主要优势是　　　　。 【答案】（1）启动子、终止子和复制原点     （2）① 敏感    ② 氨苄青霉素（或Amp）     （3）① attL1    ② 终止密码子     （4）① 哺乳动物    ② 无需使用限制酶进行酶切连接      【解析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (1) 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。 (2) 题图中质粒2含有卡那霉素抗性基因且不具有ccdB基因，导入该质粒的大肠杆菌能在含卡那霉素的平板上增殖；而质粒1含有ccdB基因，为了使其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖，导入的大肠杆菌应对ccdB敏感。用Ca2+处理后的大肠杆菌会处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。题图中质粒1和质粒3中均含有ccdB基因，其表达的产物能抑制大肠杆菌的增殖；质粒2只含有卡那霉素抗性基因而不含氨苄青霉素抗性基因，因而含有该质粒的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的平板上生存；质粒4含有氨苄青霉素抗性基因且不含有ccdB基因，因而含有该质粒的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的平板上增殖。 (3) 由图2可知，LR反应中则发生attL位点与attR位点间的片段交换，因此attR1与attL1重组。若A基因转录的mRNA含有内源的终止密码子，可能导致翻译提前终止，无法与GFP构成融合蛋白。 (4) 如果A基因要在哺乳动物细胞表达，载体上必须具备哺乳动物的启动子。质粒2一旦构建成功，就可以作为“通用供体”，通过LR反应将基因A转移到任何具有attR位点的载体上，无需对目的基因进行重复的PCR扩增和酶切连接，只需通过一步LR反应即可将同一个目的基因转移到不同的表达载体中，通用性强，操作简便。 8.（2026·湖南邵阳·二模）石油烃（碳氢化合物）是石油工业和石油提炼过程中产生的复杂废弃物，对环境和人类健康造成严重威胁，已知almA基因表达产物为可以降解石油烃的胞外酶。研究人员利用下图来自大肠杆菌的PET-28a质粒，通过基因工程构建枯草杆菌工程菌来降解石油烃。 （1）培育枯草杆菌工程菌的核心工作是　　　　　，启动子通常具有物种特异性，插入质粒中的almA基因，其上游启动子应选择　　　　　的启动子。 （2）研究人员为使目的基因almA正确连接到载体上，最好选用　　　　　酶对载体进行酶切处理，引物F的序列为5'　　　　　3'（写出9个碱基序列）。 （3）枯草杆菌具有发达的蛋白质分泌功能，研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是　　　　　。 （4）在含有氨苄青霉素的培养基上接种，能正常生长的　　　　　（填“是”或“不一定是”“一定不是”）含重组载体的枯草杆菌，理由是　　　　　。 （5）研究人员为进一步筛选获得能降解石油烃的菌株，配制的培养基除添加石油烃、琼脂外，还需要添加　　　　　。 【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② 枯草杆菌     （2）① EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”）    ② GAATTCCAT     （3）降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解     （4）① 不一定是    ② 枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长     （5）氮源、水、无机盐      【解析】(1) 培育枯草杆菌工程菌的核心工作是基因表达载体的构建，启动子需要被受体细胞（枯草杆菌）的RNA聚合酶识别，因此需要选择枯草杆菌的启动子。 (2) 限制酶SmaⅠ会破坏目的基因，不能选择，限制酶XmaⅠ与限制酶SmaⅠ具有相同的识别序列，也不能选择，由于BamHⅠ与BclⅠ会形成相同的粘性末端，最好选用EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”）对载体进行酶切处理，根据转录分向，a链为转录的模板链，引物F的左侧添加EcoRⅠ的识别序列，引物F的序列为5'GAATTCCAT3'。 (3) 研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解。 (4) 无论质粒是否插入目的基因，都带有氨苄青霉素抗性基因，因此枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长，所以能生长的不一定是含重组载体的枯草杆菌。  (5) 该培养基以石油烃作为唯一碳源筛选目的菌株，琼脂作为凝固剂，还需要补充微生物生长必需的其他基本营养：水、氮源、无机盐。 9.（2026·湖南永州·二模）（多选）缺氧是神经细胞PC12凋亡的有效诱导因素，且能够引起5-HTT蛋白表达的异常升高。5-HTT蛋白由基因指导合成，为探究基因表达的变化对缺氧PC12细胞的影响，科研人员利用RNA干扰技术，设计和合成了具有特定序列的shRNA，诱导基因沉默。shRNA是一种具有环状结构的分子，部分表达载体的构建如图a。回答下列问题： （1）在PCR扩增目的基因时，需要在反应体系中加入多种成分，其中随扩增次数增加而显著减少的成分有　　　　　　　（答出两点即可）。 （2）在设计序列时，要在其两侧添加不同的限制酶识别序列，目的是　　　　　　　　　　（答出两点即可）。若a链为转录时的模板链，则应该在a链的5'端添加的碱基序列是5'—　　　　　　　　　　　　—3'。 （3）表达载体转染PC12细胞后，可通过检测转染细胞中是否出现　　　　　　　　　　进行鉴定。转染成功的PC12细胞通过转录产生shRNA，经过一系列转变后干扰基因表达的　　　　　　　　　　过程，从而使其沉默。 （4）科研人员比较了不同条件下对照组与转染组PC12细胞的凋亡率，结果如图b。据此结果可得出的结论是　　　　　　　　　。 【答案】（1）引物、脱氧核苷酸     （2）① 使目的基因能定向插入表达载体，防止目的基因自身环化和反向连接    ② GAATTC     （3）① 绿色荧光    ② 翻译     （4）SLC 基因沉默能抑制缺氧诱导的 PC12 细胞凋亡（或敲低SLC基因可缓解缺氧导致的细胞凋亡，合理即可）      【解析】 基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 (1) 在 PCR 扩增过程中，引物与模板链结合，随着扩增次数增加，引物会不断被消耗；脱氧核苷酸（dNTP）作为合成新 DNA 链的原料，也会随着 DNA 链的不断合成而显著减少。 (2) 在构建基因表达载体时，给目的基因两侧添加不同的限制酶识别序列，这样用这两种限制酶切割目的基因和载体后，目的基因两端和载体两端会产生不同的黏性末端，能保证目的基因定向插入表达载体，避免目的基因自身环化以及与载体反向连接。转录是从DNA模板链的3'→5'方向读取，合成mRNA为5'→3'，若a链为转录时的模板链，因此在a链的5'端添加的序列，对应基因下游酶切位点，即要添加EcoRI的识别序列，因此，应在a链5'端应添加EcoRI的识别序列：5'—GAATTC—3'。 (3) 表达载体中含有绿色荧光蛋白基因（GFP），所以可通过检测转染细胞中是否出现绿色荧光来鉴定转染是否成功。shRNA 干扰 SLC 基因表达，SLC 基因指导合成 5 - HTT 蛋白，基因表达包括转录和翻译，shRNA 主要干扰的是翻译过程，从而使 SLC 基因沉默。 (4) 从图 b 可以看出，在缺氧 24h 条件下，对照组的细胞凋亡率明显高于转染 shSLC 组的细胞凋亡率，而正常条件下两组凋亡率差异不大，由此可得出 SLC 基因沉默（转染 shSLC）能抑制缺氧诱导的 PC12 细胞凋亡的结论。 10.（2026·湖南株洲·一模）番茄红素的合成场所在植物细胞的有色体中。八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的关键酶，其N端含有一段转运肽，负责引导PSY蛋白进入有色体。科研人员拟利用绿色荧光蛋白（GFP）作为标签，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，以监控PSY蛋白在细胞内的分布及表达量，进而培育高产红果番茄。研究人员选用In-Fusion技术构建载体。（In-Fusion酶具有3′→5′外切活性，能去除双链DNA分子3′末端的15个核苷酸，暴露5′端单链。） 关键密码子对应氨基酸表 密码子 氨基酸 UAG（终止密码子） — AUG（起始密码子） 甲硫氨酸 CAG 谷氨酰胺 （1）设计扩增PSY基因的N端引物5'端碱基序列（部分）为：5′-…CTGCAGATGGCT…-3′。该引物包含　　　　基因的序列，是为保证在外切酶的作用下，两者产生相同黏性末端；还包含　　　　基因的序列，是为保证引物能与模板结合。 （2）用In-Fusion技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光。 ①推测失败的原因是：融合在PSY蛋白N端的GFP蛋白，遮挡了PSY的　　　　　　　　　，导致PSY无法　　　　　　　　　。 ②解决此问题的方案是：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。需要重新扩增PSY基因和GFP基因，对GFP基因重新设计扩增引物的核心部分分别是：5′……CTACTG3′和5′　　　　　　　　　ATGAGT3′（写出6个碱基）。 （3）另外一个小组使用酶切法正确构建重组质粒如图2，需筛选正向插入PSY的阳性克隆。研究人员设计了三条引物（图2），并利用“三引物共扩增”体系对单菌落进行PCR鉴定。 注：在上图中，F0距连接点：100bp，R0距连接点：500bp，R1距连接点：100bp，PSY长度：1680bp。 为区分“正向插入”和“反向插入”菌落，研究人员将上述三种引物（F0、R0、R1）同时加入PCR反应体系。①若对应菌落为正向插入，电泳结果应出现两条条带，其中较短的特异性条带大小约为　　　　　　　　　。②若PSY基因反向插入，则电泳结果为：　　　　　　　　　。（要求写出条带数目及各条带的大小） 【答案】（1）① GFP    ② PSY     （2）① 转运肽    ② 进入有色体    ③ 将GFP的N端与PSY的C端相连    ④ GAATTC     （3）① 200bp    ② 出现600bp和2280bp的两条条带      【解析】 1、根据题干信息，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，即需要将GFP基因和PSY基因连接。在设计扩增PSY基因的N端引物时，要保证在外切酶作用下两者产生相同黏性末端，所以该引物需包含GFP基因的序列，同时，为保证引物能与模板结合，引物还需包含PSY基因的序列。 2、题干中“用In-Fusion技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光”，结合“八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的关键酶，其N端含有一段转运肽，负责引导PSY蛋白进入有色体”内容，推测失败的原因是融合在PSY蛋白N端的GFP蛋白遮挡了PSY的转运肽，所以导致PSY无法进入有色体，解决此问题的方案是将GFP的N端与PSY的C端相连。对GFP基因重新设计扩增引物，其中一个引物需要包括GFP基因的N端和PSY基因的C端两部分，所以该引物的核心部分是5′GAATTCATGAGT3′。 3、正向插入时，F0与R1可扩增出片段，长度为F0到连接点的100bp + R1到连接点的100bp = 200bp；同时F0与R0可扩增出包含PSY的片段，长度为100bp + 1680bp + 500bp = 2280bp。因此较短条带为200bp。反向插入时，R1与R0可扩增出有效片段，长度为R1到连接点的100bp + R0到连接点的500bp=600bp，F0与R0之间可扩增出长度为500+1680+100=2280bp的条带。 (1) 根据题干信息，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，即需要将GFP基因和PSY基因连接。在设计扩增PSY基因的N端引物时，要保证在外切酶作用下两者产生相同黏性末端，所以该引物需包含GFP基因的序列，同时，为保证引物能与模板结合，引物还需包含PSY基因的序列。 (2) 题干中“用In-Fusion技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光”，结合“八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的关键酶，其N端含有一段转运肽，负责引导PSY蛋白进入有色体”内容，推测失败的原因是融合在PSY蛋白N端的GFP蛋白遮挡了PSY的转运肽，所以导致PSY无法进入有色体，解决此问题的方案是将GFP基因的N端与PSY基因的C端相连。对GFP基因重新设计扩增引物，其中一个引物需要包括GFP基因的N端和PSY基因的C端两部分，所以该引物的核心部分是5′GAATTCATGAGT3′。 (3) 正向插入时，F0与R1可扩增出片段，长度为F0到连接点的100bp + R1到连接点的100bp = 200bp；同时F0与R0可扩增出包含PSY的片段，长度为100bp + 1680bp + 500bp = 2280bp。因此较短条带大小约为200bp。反向插入时，R1与R0可扩增出有效片段，长度为R1到连接点的100bp + R0到连接点的500bp=600bp，F0与R0之间可扩增出长度为500+1680+100=2280bp的条带，因此出现600bp和2280bp的两条条带。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 6年汇编1年模拟 考点分类 湖南考情 命题规律 考点1 基因工程的基本工具 2025湖南(1题)、2024湖南(1题) · 情境设置：多围绕病毒抗原、质粒改造、基因敲除等科研场景，考查工具酶原理。 · 考查重点：限制酶识别位点、切割特点、载体构建中的酶切与连接，常与突变或重组分析结合。 · 命题趋势：注重工具酶的选择与应用，强化对酶切产物和连接产物结构的理解，体现综合性。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026湖南(2题)、2024湖南(1题) · 情境设置：常以疾病治疗、育种改良、蛋白质工程等真实科研为背景，结合PCR技术应用。 · 考查重点：侧重PCR原理、引物设计、电泳结果分析及与测序、重组技术的联系。 · 命题趋势：创新题型增多，如双脱氧测序、基因表达载体构建中的PCR环节，强调实验设计能力。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 2.（2021·湖南·高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： （1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是　　　　　　　　　，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的　　　　　　　　　断开。 （2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是　　　　　　　　　。 （3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是　　　　　　　　　。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为　　　　　　　　　（答出两点即可），功能上具有　　　　　　　　　。 （4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的　　　　　　　　　淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路　　　　　　　　　。 3.（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　　等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物　　　　　　对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为　　　　　　bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是　　　　　　（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有　　　　　　（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·湖南·高考真题）将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（        ） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 2.（2024·湖南·高考真题）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 3.（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题: （1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是　　　　　　　，物质b是　　　　　　　。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　　　（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 4.（2026·湖南·高考真题）阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的　　　　　　　　（填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　　。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________（单选）的Aβ聚集体含量。 A. 24 h检测细胞内 B. 24 h检测细胞外 C. 0 h和24 h检测细胞内 D. 0 h和24 h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射　　　　　　　　　　　　　；该实验结论是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 5.（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： （1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用　　　　　　　（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 （2）单倍体育种。常用　　　　　　　　的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　。 （3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用　　　　　　　酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中　　　　　　　　的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路　　　　　　　　。 【解析】 【关键能力】 （1）信息获取与加工 （2）逻辑推理与论证： (1) 因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 (2) 获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 (3) 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL，具体思路：设计引物利用PCR扩增野生百合的基因L及其pL；插入Ti质粒构建基因表达载体，利用农杆菌转化 法导入百合B的体细胞，经植物组织培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原体微 生物侵染转基因百合，检测其抗病能力（要体现基因工程的步骤和关键技术，最后要进行个体生 物学水平鉴定） 题干关键信息 所学知识 信息加工 去除细胞壁获得原生质体 植物体细胞杂交的过程 植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程 获得单倍体植株 植物组织培养技术 通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体 鉴定百合单倍体植株 有丝分裂的过程 单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期 1.（2026·湖南张家界·二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可对目标基因进行定点编辑，下列相关叙述错误的是（　　） A. Cas9蛋白的作用是切割DNA分子，属于限制性内切核酸酶 B. 该技术需要根据目标基因的序列设计向导RNA C. 基因编辑过程中，细胞可通过DNA修复机制修复断裂的DNA D. 该技术可用于治疗人类的单基因遗传病，不会产生任何安全风险 2.（2026·湖南怀化·一模）（多选）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，控制该相对性状的基因为A/a。为研究控制该性状的基因，研究人员将一个紧凑株型的植株与纯合松散株型植株杂交，均为松散株型，中松散株型：紧凑株型=3∶1。研究得知，a基因由A基因内部插入一段序列而来（图1），研究人员设计了3条引物（P1～P3），位置如图1（→表示引物5′→3′方向）。以3个单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B（图2-B中乙、丙电泳条带未标出）。不考虑PCR结果异常，下列说法正确的是（       ） A. 若a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，原因是插入导致转录提前终止 B. 图2-A中的条带代表a，丙单株无扩增条带的原因是其基因型为AA C. 图2-B使用的引物组合是P1、P2，乙、丙植株对应的条带均有两条 D. 使用图2-A中的引物组合扩增全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型=2∶1 【解析】 A、在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因（图1），a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，应是终止密码子提前出现，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译，A错误； B、根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，即图2-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，B正确； C、图2-B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，Aa（松散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带。所以乙和丙都只有一条带，C错误； D、使用图2-A中的引物组合（P3和P2）扩增全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A为松散株型，而子二代中Aa∶AA=2∶1，所以使用图2-A中的引物组合扩增全部样本，有扩增条带松散株型（Aa）：无扩增条带松散株型（AA）=2∶1，D正确。 故选BD。 3.（2026·湖南岳阳·一模）原花青素在植物的生长发育、抵御紫外线辐射、增强抗逆性以及防御病虫害等方面发挥着重要作用，无色花青素还原酶编码基因SpLAR是多根紫萍合成原花青素的关键基因，为提高原花青素的产量，研究人员构建了pCAMBIA1301-SpLAR植物表达载体，以获得过表达SpLAR基因多根紫萍株系。回答下列问题： （1）原花青素是多根紫萍中重要的类黄酮化合物（次生代谢物），可利用　　　　　　技术对其进行工厂化生产。 （2）提取多根紫萍的总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR筛选出SpLAR基因的cDNA序列，该过程中使用的引物1序列是5’-GGTCACCCTAT-3’，则引物2应设计为　　　　　　（写出10个碱基即可）。SpLAR基因转录时的模板链是　　　　　　链。 （3）成功构建pCAMBIA1301-SpLAR表达载体后，将其导入受体细胞常用的方法是　　　　　　。 （4）提取受体细胞DNA，并选择合适引物进行PCR鉴定，电泳结果如下图。 注：M为参照样品；标号1为SpLAR质粒的PCR产物；标号2为野生型株系PCR产物；标号3为SpLAR转基因株系；标号4为阴性对照 分析结果可知SpLAR基因cDNA　　　　　　（填“是”或“否”）成功整合到受体细胞DNA中。为确保获得过表达SpLAR基因多根紫萍株系，还应补充的实验操作是　　　　　　。 4.（2025·湖南益阳·一模）野生大豆是宝贵的野生植物资源，耐盐碱能力优异。研究人员将野生大豆中的耐盐碱基因OsMYB56导入粳型常规水稻以提高水稻耐盐碱能力。图1是农杆菌 Ti质粒部分结构，OCS 基因是农杆菌 Ti质粒特有的报告基因，能在植物根茎叶中表达，检测时经电泳、染色后在紫外光下观察到荧光。图2是含OsMYB56基因的DNA片段，其中R1、R2、 R3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。相关限制酶的识别序列及切割位点如图3所示。请回答下列问题： （1）基因工程的核心步骤是　　　　　　。已知OsMYB56基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入序列 GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取OsMYB56基因时，为保证OsMYB56基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物R1外，还需要选择引物　　　　　　（填“R2”或“R3”），并在该引物5’端增加碱基序列5’　　　　　　　3’。 （2）将重组质粒导入农杆菌并侵染水稻细胞，可将外源基因导入水稻细胞内并维持稳定，原因是　　　　　　。 （3）对转化是否成功进行检测时，利用OCS 基因检测得到的电泳图谱如下。检测中需用　　　　　　作为阴性对照，为进一步检测OsMYB56基因是否表达出相关蛋白质，常用　　　　　　技术进行检测。 5.（2026·湖南怀化·二模）黄瓜花叶病毒（CMV）是危害黄瓜生产的主要病毒之一，该病毒侵染植株后会导致叶片皱缩、光合作用减弱，严重影响产量和品质。CMV的基因组中的RNA4负责编码病毒的外壳蛋白。为培育抗CMV的黄瓜新品种，科研人员进行了如图所示的基因工程操作。回答下列问题： （1）为获得CMV的RNA4，应从　　　　　　　　中提取总RNA．然后以RNA4为模板，通过逆转录过程来合成其互补DNA（cDNA）。 （2）使用两种不同的限制酶切割T-DNA．同时对合成的cDNA的两端加装接头，该接头的序列的特点应该是　　　　　　　　，其目的是　　　　　　　　。 （3）图中将病毒RNA4-cDNA反向连接到Ti质粒上，这种连接方式的目的是　　　　　　　　，从而达到抗CMV的作用。 （4）检测转基因黄瓜是否成功获得抗性，可采用的个体生物学水平鉴定方法是　　　　　　　　。与传统的农药防治相比，培育抗病毒转基因黄瓜的优点是　　　　　　　　（写出1点）。 6.（2026·湖南岳阳·二模）科学家设计出针对肿瘤细胞表面特定抗原的蛋白质scFv，其制备过程：首先制得由VL-Linker-VH构成的融合基因scFv库（图1，其中箭头表示PCR过程中的引物，scFv基因的首尾各含有一个由6个核苷酸组成的限制酶识别序列），然后将scFv库与噬菌粒（图2）连接成表达载体库，再在噬菌粒表达载体库转染大肠杆菌的基础上，筛选出表面展示有scFv的噬菌体库（图3），最后将其转入合适的表达系统中进行表达并再次筛选，获得特定的scFv。 （1）以下是除R之外的引物，其中1R为①，则1F为　　　　　　　　，scFv首端限制酶识别序列为　　　　　　　　　。 ①5′-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC-3′ ②5′-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3′ ③5′-GTATACCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3′ ④5′-CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC-3′ ⑤5′-GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG-3′ （2）噬菌粒表达载体中，质粒复制原点的作用是　　　　　　　　　　　；根据图2分析被噬菌粒表达载体转染的大肠杆菌在含有乳糖的培养基中才能表达scFv的原因是　　　　　　　　　　　。 （3）用抗scFv的抗体筛选出表面展示有scFv的噬菌体库的原理是　　　　　　　　　　　。 （4）为获得功能完善且结构较为复杂的scFv应该选用　　　　　　　　　　　（填“大肠杆菌表达系统”或“哺乳动物细胞表达系统”） 7.（2026·湖南怀化·一模）噬菌体侵染细菌时会发生如图1所示的重组反应。科学家基于此过程开发了新型分子克隆技术，以快速构建基因表达载体，该克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，具体流程如图2所示。请回答下列问题。 （1）为构建基因表达载体，除含有图示的目的基因和标记基因外，还必须有　　　　。（写出至少两个） （2）BP反应中，attB位点与attP位点间的片段会发生交换，反应后的体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，因此需将反应体系转入对ccdB基因的表达产物　　　　（填“敏感”或“不敏感”）的大肠杆菌，并添加卡那霉素以获得质粒2。LR反应中则发生attL位点与attR位点间的片段交换，继续将LR反应混合体系导入大肠杆菌，并接种到添加　　　　的固体培养基上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中所含质粒即为质粒4。 （3）科学家为研究A基因的表达产物蛋白质A在细胞内的定位，拟利用上述技术构建含有A-GFP融合基因的载体（GFP为绿色荧光蛋白基因）。请在图3所示的流程中填入合适的位点：①　　　　；②attL2；③attR3。为了使融合蛋白顺利表达，对A基因的末端可能需要去除其编码　　　　的序列。 （4）获得的质粒2具有广泛的应用价值。若研究人员希望将A基因转入哺乳动物细胞中进行高效表达，只需利用质粒2与含有　　　　（填“大肠杆菌”或“哺乳动物”）启动子（位于attR1位点的上游）的质粒3进行LR反应即可快速完成构建。与传统的限制酶切割、连接酶连接的方法相比，该克隆技术在构建不同表达载体时的主要优势是　　　　。 8.（2026·湖南邵阳·二模）石油烃（碳氢化合物）是石油工业和石油提炼过程中产生的复杂废弃物，对环境和人类健康造成严重威胁，已知almA基因表达产物为可以降解石油烃的胞外酶。研究人员利用下图来自大肠杆菌的PET-28a质粒，通过基因工程构建枯草杆菌工程菌来降解石油烃。 （1）培育枯草杆菌工程菌的核心工作是　　　　　，启动子通常具有物种特异性，插入质粒中的almA基因，其上游启动子应选择　　　　　的启动子。 （2）研究人员为使目的基因almA正确连接到载体上，最好选用　　　　　酶对载体进行酶切处理，引物F的序列为5'　　　　　3'（写出9个碱基序列）。 （3）枯草杆菌具有发达的蛋白质分泌功能，研究人员敲除了其中8个胞外分泌蛋白酶基因，原因是　　　　　。 （4）在含有氨苄青霉素的培养基上接种，能正常生长的　　　　　（填“是”或“不一定是”“一定不是”）含重组载体的枯草杆菌，理由是　　　　　。 （5）研究人员为进一步筛选获得能降解石油烃的菌株，配制的培养基除添加石油烃、琼脂外，还需要添加　　　　　。 9.（2026·湖南永州·二模）（多选）缺氧是神经细胞PC12凋亡的有效诱导因素，且能够引起5-HTT蛋白表达的异常升高。5-HTT蛋白由基因指导合成，为探究基因表达的变化对缺氧PC12细胞的影响，科研人员利用RNA干扰技术，设计和合成了具有特定序列的shRNA，诱导基因沉默。shRNA是一种具有环状结构的分子，部分表达载体的构建如图a。回答下列问题： （1）在PCR扩增目的基因时，需要在反应体系中加入多种成分，其中随扩增次数增加而显著减少的成分有　　　　　　　（答出两点即可）。 （2）在设计序列时，要在其两侧添加不同的限制酶识别序列，目的是　　　　　　　　　　（答出两点即可）。若a链为转录时的模板链，则应该在a链的5'端添加的碱基序列是5'—　　　　　　　　　　　　—3'。 （3）表达载体转染PC12细胞后，可通过检测转染细胞中是否出现　　　　　　　　　　进行鉴定。转染成功的PC12细胞通过转录产生shRNA，经过一系列转变后干扰基因表达的　　　　　　　　　　过程，从而使其沉默。 （4）科研人员比较了不同条件下对照组与转染组PC12细胞的凋亡率，结果如图b。据此结果可得出的结论是　　　　　　　　　。 【解析】 基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 (1) 在 PCR 扩增过程中，引物与模板链结合，随着扩增次数增加，引物会不断被消耗；脱氧核苷酸（dNTP）作为合成新 DNA 链的原料，也会随着 DNA 链的不断合成而显著减少。 (2) 在构建基因表达载体时，给目的基因两侧添加不同的限制酶识别序列，这样用这两种限制酶切割目的基因和载体后，目的基因两端和载体两端会产生不同的黏性末端，能保证目的基因定向插入表达载体，避免目的基因自身环化以及与载体反向连接。转录是从DNA模板链的3'→5'方向读取，合成mRNA为5'→3'，若a链为转录时的模板链，因此在a链的5'端添加的序列，对应基因下游酶切位点，即要添加EcoRI的识别序列，因此，应在a链5'端应添加EcoRI的识别序列：5'—GAATTC—3'。 (3) 表达载体中含有绿色荧光蛋白基因（GFP），所以可通过检测转染细胞中是否出现绿色荧光来鉴定转染是否成功。shRNA 干扰 SLC 基因表达，SLC 基因指导合成 5 - HTT 蛋白，基因表达包括转录和翻译，shRNA 主要干扰的是翻译过程，从而使 SLC 基因沉默。 (4) 从图 b 可以看出，在缺氧 24h 条件下，对照组的细胞凋亡率明显高于转染 shSLC 组的细胞凋亡率，而正常条件下两组凋亡率差异不大，由此可得出 SLC 基因沉默（转染 shSLC）能抑制缺氧诱导的 PC12 细胞凋亡的结论。 10.（2026·湖南株洲·一模）番茄红素的合成场所在植物细胞的有色体中。八氢番茄红素合成酶（PSY）是该代谢途径的关键酶，其N端含有一段转运肽，负责引导PSY蛋白进入有色体。科研人员拟利用绿色荧光蛋白（GFP）作为标签，构建“GFP-PSY”融合蛋白表达载体，以监控PSY蛋白在细胞内的分布及表达量，进而培育高产红果番茄。研究人员选用In-Fusion技术构建载体。（In-Fusion酶具有3′→5′外切活性，能去除双链DNA分子3′末端的15个核苷酸，暴露5′端单链。） 关键密码子对应氨基酸表 密码子 氨基酸 UAG（终止密码子） — AUG（起始密码子） 甲硫氨酸 CAG 谷氨酰胺 （1）设计扩增PSY基因的N端引物5'端碱基序列（部分）为：5′-…CTGCAGATGGCT…-3′。该引物包含　　　　基因的序列，是为保证在外切酶的作用下，两者产生相同黏性末端；还包含　　　　基因的序列，是为保证引物能与模板结合。 （2）用In-Fusion技术构建载体并导入受体细胞后，荧光显微镜观察发现，转基因植株的细胞质基质中充满了绿色荧光，但有色体中几乎无荧光。 ①推测失败的原因是：融合在PSY蛋白N端的GFP蛋白，遮挡了PSY的　　　　　　　　　，导致PSY无法　　　　　　　　　。 ②解决此问题的方案是：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。需要重新扩增PSY基因和GFP基因，对GFP基因重新设计扩增引物的核心部分分别是：5′……CTACTG3′和5′　　　　　　　　　ATGAGT3′（写出6个碱基）。 （3）另外一个小组使用酶切法正确构建重组质粒如图2，需筛选正向插入PSY的阳性克隆。研究人员设计了三条引物（图2），并利用“三引物共扩增”体系对单菌落进行PCR鉴定。 注：在上图中，F0距连接点：100bp，R0距连接点：500bp，R1距连接点：100bp，PSY长度：1680bp。 为区分“正向插入”和“反向插入”菌落，研究人员将上述三种引物（F0、R0、R1）同时加入PCR反应体系。①若对应菌落为正向插入，电泳结果应出现两条条带，其中较短的特异性条带大小约为　　　　　　　　　。②若PSY基因反向插入，则电泳结果为：　　　　　　　　　。（要求写出条带数目及各条带的大小） 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】B 2.【答案】① 限制性核酸内切酶（限制酶）    ② 磷酸二酯键    ③ 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养     ④ 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难    ⑤ 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答）    ⑥ 发育的全能性    ⑦ B    ⑧ 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 3.【答案】（1）① 终止子（复制原点）    ② P1 和 P3    ③ 782    ④ 蛋白A在大肠杆菌细胞内合成，缺失分泌到细胞外的信号，不能分泌到细胞外；基因A未表达；基因A丢失     （2）① 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法）    ② 抗体检测      考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】B 2.【答案】AC 3.【答案】（1）① 氨基酸序列    ② mRNA     ③ 密码子的简并性     （2）① 从基因文库中获取目的基因    ② 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成     ③ DNA半保留复制     （3）① 种类     ② 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏     （4）设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间      4.【答案】（1）① 抗体    ② 使其在星形胶质细胞中特异性表达    ③ KpnⅠ和BamHⅠ     （2）C     （3）① 携带空载体（或不携带CAR基因或仅携带GFP基因）的等量病毒    ② 在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因（CAR-A疗法）能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。      5.【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶    ② 生长素和细胞分裂素     （2）① 花药离体培养    ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目     （3）① HindⅢ、BamHⅠ    ② 交链格孢    ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL      1.【答案】D 2.【答案】BD 3.【答案】（1）植物细胞培养     （2）① 5’-CCATGGATGG-3’    ② a     （3）农杆菌转化（法）     （4）① 是    ② 检测转基因株系和野生型的由SpLAR基因转录得到的mRNA含量/无色花青素还原酶含量/原花青素含量，对比分析两组数据      4.【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② R2    ③ 5′-GAATTCGCCACC-3′     （2）Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。     （3）① 未转化的水稻植株    ② 抗原一抗体杂交      5.【答案】（1）受CMV感染的黄瓜植株（或感染CMV的黄瓜叶片）     （2）① 与两种限制酶切割产生的黏性末端互补    ② 使cDNA定向插入T-DNA（或使cDNA按特定方向连接到T-DNA上）     （3）反向连接的病毒RNA4-cDNA在黄瓜细胞中转录产生的RNA可以与病毒RNA4互补配对，从而阻止病毒外壳蛋白的合成     （4）① 接种CMV，观察转基因黄瓜是否发病    ② 减少农药使用，保护环境      6.【答案】（1）① ②    ② 5′-GTATAC-3′     （2）① 为质粒的复制提供起始位点，使噬菌粒能在大肠杆菌细胞中进行复制    ② 噬菌粒中控制scFv表达的启动子为乳糖启动子，乳糖为诱导物，只有在含乳糖的培养基中，乳糖启动子才会被激活，驱动scFv基因的转录和翻译     （3）抗原与抗体的特异性结合     （4）哺乳动物细胞表达系统      7.【答案】（1）启动子、终止子和复制原点     （2）① 敏感    ② 氨苄青霉素（或Amp）     （3）① attL1    ② 终止密码子     （4）① 哺乳动物    ② 无需使用限制酶进行酶切连接      8.【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② 枯草杆菌     （2）① EcoRⅠ和BamHⅠ（或者“EcoRⅠ和BclⅠ”）    ② GAATTCCAT     （3）降低了蛋白酶对almA基因表达产物的降解，提高了石油烃降解酶的含量，增强了对石油烃的降解     （4）① 不一定是    ② 枯草杆菌导入不含目的基因的PET-28a质粒也能生长     （5）氮源、水、无机盐      9.【答案】（1）引物、脱氧核苷酸     （2）① 使目的基因能定向插入表达载体，防止目的基因自身环化和反向连接    ② GAATTC     （3）① 绿色荧光    ② 翻译     （4）SLC 基因沉默能抑制缺氧诱导的 PC12 细胞凋亡（或敲低SLC基因可缓解缺氧导致的细胞凋亡，合理即可）      10.【答案】（1）① GFP    ② PSY     （2）① 转运肽    ② 进入有色体    ③ 将GFP的N端与PSY的C端相连    ④ GAATTC     （3）① 200bp    ② 出现600bp和2280bp的两条条带      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $