选择性必修3 第三章 基因工程(按章分类）-高中生物·2026年高考真题分类

**基本信息** 2026年高考生物基因工程专题真题汇编，含12单+2多+21非选择，聚焦工具酶操作、转基因技术等核心考点，以荧光斑马鱼培育、癌症免疫治疗等真实情境命题。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|12|限制酶选择、蛋白质工程（如MT酶改造）|结合科研案例（如GloFish研发）考查基础原理| |多选题|2|基因工程菌培养、微生物分离|涉及实验误差分析（如菌落计数偏差）| |非选择题|21|转基因操作（如甜醅α-淀粉酶基因克隆）、合成生物学（如痛风治疗尿酸响应体系）|综合性强，如第32题融合基因工程与动物细胞工程，体现高考命题跨模块趋势|

【 高中生物 】 2026年高考真题-按章分类 选择性必修3 生物技术与工程 第三章 基因工程 12个单选题 + 2个多选题 + 21个非选择题 ---- 教 师 版 ---- 一、单选题 1.(2026高考·甘肃)科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish。为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是( ) A.步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B.处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C.步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D.新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 1.B 该流程属于蛋白质工程范畴，设计荧光蛋白结构后，步骤①应是推测氨基酸序列以及对应的脱氧核苷酸序列(基因序列)，不需要推测转运RNA类型，A错误。将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，可通过显微操作将改造后的荧光蛋白基因导入斑马鱼受精卵，B正确。斑马鱼是卵生生物，受精卵可在体外适宜环境中发育，不需要移植到斑马鱼体内发育，C错误。转基因生物存在潜在的安全风险，新型荧光斑马鱼上市前必须进行安全性评价，D错误。 2.(2026高考·全国卷)为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B.若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C.重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D.重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 2.A 用限制酶X切割质粒时，存在部分质粒未被切割，或切割后自身环化的情况，这类质粒仍为2.4kb的环状结构，抗性基因完整，可在抗性平板上生长，因此能挑选到含2.4kb质粒的大肠杆菌菌落，A错误。原质粒长度为2.4kb，目的基因长度为1.5kb，二者连接后得到的重组质粒总长度为2.4+1.5=3.9kb，因此提取到3.9kb的质粒提示其中可能含有目的基因，B正确。目的基因两端均为X酶的黏性末端，插入时存在两种方向：若目的基因上0.4kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+0.4=0.7kb，2.1+1.1=3.2kb，C正确。若目的基因反向插入，即1.1kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+1.1=1.4kb，2.1+0.4=2.5kb，D正确。 3.(2026高考·北京)MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是( ) A.温度和pH会影响MT的催化活性 B.第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C.为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D.对MT结构的改造属于蛋白质工程 3.B 酶的活性受温度、pH等因素的影响，MT本质是酶，因此温度和pH会影响其催化活性，A正确。根据题干信息，将第216位的丙氨酸变为苏氨酸后，MT的热稳定性提高，并未改变其催化功能(仍可催化海藻糖合成)，说明该位点的丙氨酸与MT的热稳定性有关，未体现对其专一性的作用，B错误。热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高活性，因此筛选热稳定性高的MT时，应在较高温度下测定酶活性，C正确。通过改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，以获得功能符合需求的蛋白质，该技术属于蛋白质工程，D正确。 4.(2026高考·湖北)将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是( ) A.选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B.为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C.工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 4.C 益生菌是对人体有益的微生物，对人体无毒性，具备天然安全性，适合作为表达新抗原的工程菌受体，A正确。不同患者的肿瘤细胞特有的新抗原存在差异，个性化免疫治疗需要针对患者筛选其特有的肿瘤新抗原，才能精准激活针对该患者肿瘤的特异性免疫，B正确。工程菌属于外来异物，进入人体后会被免疫系统识别并清除，无法在体内长期存活；且免疫监视是人体免疫系统的功能，并非工程菌的功能，C错误。树突状细胞属于抗原呈递细胞，可将肿瘤新抗原摄取、加工后呈递给辅助性T细胞，进而激活体液免疫和细胞免疫，即激活特异性免疫过程，D正确。 5.(2026高考·湖北)为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是( ) A.F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B.F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C.F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D.F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 5.B XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误。F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确。F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误。PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 6.(2026高考·湖南)关于表中生物学实验的相关叙述，错误的是( ) 选项 实验名称 相关叙述 A 低温诱导植物细胞染色体数目的变化 低温能抑制洋葱根尖分生区细胞中纺锤体的形成，引起细胞内染色体数目加倍 B 绿叶中色素的提取和DNA的粗提取 绿叶中的色素不溶于无水乙醇，DNA易溶于无水乙醇 C 探究酵母菌细胞呼吸的方式 细胞呼吸产物的产生情况是因变量，温度是无关变量 D 模拟生物体维持pH的稳定 可设置HCO3-/H2CO3缓冲液或HPO42-/H2PO4-缓冲液作为对照组 A.A B.B C.C D.D 6.B 低温诱导植物细胞染色体数目加倍的原理是低温可抑制有丝分裂前期纺锤体的形成，洋葱根尖分生区细胞可进行有丝分裂，纺锤体形成受抑制后，着丝粒分裂产生的子染色体无法移向细胞两极，会引起细胞内染色体数目加倍，A正确。绿叶中的色素属于脂溶性有机物，易溶于无水乙醇等有机溶剂，因此无水乙醇可作为该实验的提取液；DNA不溶于无水乙醇，因此DNA粗提取实验中常用体积分数为95%的冷酒精使DNA析出，B错误。探究酵母菌细胞呼吸的方式实验中，自变量是氧气的有无，因变量是细胞呼吸产物的产生情况，温度、培养液用量、酵母菌初始数量等均为无关变量，需保持相同且适宜，C正确。模拟生物体维持pH的稳定实验中，清水组、HCO3-/H2CO3或HPO42-/H2PO4-缓冲液组均为对照组，生物材料组为实验组，D正确。 7.(2026高考·江西)植物生物反应器是一种新兴的重组蛋白表达系统，研究人员按图示流程制备抗蛋白F的抗体。下列叙述错误的是(　　) A.制备杂交瘤细胞需将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 B.利用F免疫的小鼠能制备出多种抗F的单克隆抗体 C.单克隆抗体阳性克隆培养液中通常需要添加血清 D.可用PCR检测植物叶片中是否含有抗F的抗体 7.D 制备杂交瘤细胞的核心操作就是将免疫小鼠的B淋巴细胞(可分泌特异性抗体)与骨髓瘤细胞(可无限增殖)融合，符合单克隆抗体制备的流程，A正确。抗原蛋白F上存在多个不同的抗原决定簇，可刺激小鼠产生多种分泌抗F抗体的B淋巴细胞，因此可制备多种抗F的单克隆抗体，B正确。单克隆抗体阳性克隆的培养属于动物细胞培养，目前人类未完全掌握动物细胞所需的全部营养物质，因此培养液中通常需要添加血清等天然成分补充未知营养，C正确。PCR是扩增和检测核酸的技术，抗F抗体的本质是蛋白质，无法用PCR检测，检测抗体需要使用抗原-抗体杂交技术，D错误。 8.(2026高考·江西)蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是(　　) A.第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B.将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C.判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D.甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 8.D 酶的活性依赖其特定的空间结构，第n位甲硫氨酸氧化会改变蛋白酶E的局部结构，进而改变E的空间结构，导致酶活性下降，A正确。蛋白质的氨基酸序列由编码它的基因的碱基序列决定，替换特定位置的氨基酸可通过蛋白质工程(即第二代基因工程)改造对应基因的碱基序列，再经表达获得改造后的蛋白酶，B正确。本次改造的目的是提高E对S的耐受性，因此判断改造效果的指标是经S处理后酶的活性保留情况，需用S处理一段时间后测定酶活性进行对比，C正确。酶的专一性由酶活性位点的结构决定，替换甲硫氨酸提高了E对S的耐受性，没有信息表明该替换改变了酶的活性位点结构，无法得出E的专一性降低的结论，D错误。 9.(2026高考·湖南)将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是( ) A.来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B.不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C.外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D.调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 9.B 所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确。重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误。外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确。启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 10.(2026高考·河南)胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸(脯氨酸除外)之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是(　　) A.甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B.胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C.第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D.由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 10.D 蛋白质工程从预期蛋白质功能出发，经结构设计、氨基酸序列推导最终改造对应基因，再通过基因表达获得改造蛋白，整个过程遵循中心法则即遗传信息传递的一般规律，A正确。酶的专一性指酶只能催化一种或一类化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后的甲无其可作用的位点因此不能被水解，体现了酶的专一性，B正确。改造后甲仍保持抗体活性，第96位精氨酸未被替换，推测该位点可能与抗体的功能密切相关，替换后可能导致抗体活性丧失，C正确。密码子简并性是指同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发生改变，D错误。 11.(2026高考·云南)内含肽(Int)可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是(　　) A.构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B.内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C.不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D.为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 11.C 题干中X+Y融合蛋白由两个独立基因表达后经自我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合基因，构建X+Y融合蛋白基因，不一定存在碱基序列相互影响问题，A错误。从图中可以看到，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内，而是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋白功能结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误。从图中过程可以看出，内含肽的IntAN与IntAᶜ、IntBᶜ与IntBᴺ通过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切除和连接作用，C正确。由图可知，内含肽在反应后被完全切除，得到的X+Y融合蛋白不含内含肽结合部位，所以再为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，也不能实现自我切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X+Y融合蛋白新的结构，D错误。 12.(2026高考·浙江)利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是(　　) A.将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B.不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C.转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D.转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 12.D 水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化(不需要再次脱分化)。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误。转基因过程中，外源基因(P1基因)插入水稻染色体的位置是随机的(位置效应)，不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误。水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误。题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 二、多选题 13.(2026高考·江西)研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是(　　) A.需在72℃条件下培养基因工程菌 B.添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C.可根据电泳结果初步评价T的纯度 D.可根据PCR产物的多少计算T的活性 13.AB 该基因工程菌为大肠杆菌，培养大肠杆菌的适宜温度为37℃左右；72℃是该DNA聚合酶T催化PCR反应延伸时的适宜温度，不是培养工程菌的温度，72℃条件下大肠杆菌无法存活，A错误。诱导物浓度并非越高越好，高浓度诱导物通常会对工程菌的生长产生毒害，反而会抑制目的蛋白的表达，降低T酶的产量，B错误。蛋白质电泳可根据条带数目初步判断蛋白质的纯度：若仅出现目的条带说明纯度高，出现多条杂带说明杂质多，C正确。T酶的活性是其催化PCR合成DNA的能力，相同反应条件下，T酶活性越高，单位时间内扩增得到的PCR产物量越多，因此可以根据PCR产物的多少计算T酶的活性，D正确。 14.(2026高考·河北)窖泥中的微生物是影响白酒风味的因素之一。现从某酒厂窖泥中分离筛选与白酒风味物质形成相关的己酸菌，下列分析错误的是( ) A.分离培养己酸菌时，需对培养基、培养皿和窖泥进行灭菌 B.通过稀释涂布平板法统计的菌落数一般比活菌的实际数偏多 C.依据己酸菌的特异基因序列设计引物，可通过PCR对目的菌株进行鉴定 D.获得的己酸菌优良菌种需扩大培养后再用于白酒的规模化生产 14.AB 分离培养己酸菌时，为避免杂菌污染，需对培养基、培养皿进行灭菌，但窖泥是分离目标菌的原材料，若对窖泥灭菌会杀死其中的己酸菌，无法完成目标菌的分离筛选，A错误。使用稀释涂布平板法统计活菌数时，若两个或多个活菌聚集在一起，平板上只会形成一个菌落，因此统计得到的菌落数一般比活菌的实际数偏少，B错误。不同物种的基因序列具有特异性，依据己酸菌的特异基因序列设计引物进行PCR，可根据是否扩增出目标产物完成对目的菌株的鉴定，C正确。筛选获得的己酸菌优良菌种初始数量较少，需先进行扩大培养，获得足够多的菌种后才能用于白酒的规模化生产，D正确。 三、解答题 15.(2026高考·甘肃)甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲(含酵母菌等微生物)发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 (1)燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供__________。 (2)甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的__________；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致__________ (3)发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为__________；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的__________，使乙醇含量__________。 (4)为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入__________酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切__________(填“可以”或“不可以”)切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是__________。 15.【答案】(1)碳源/碳源和能源物质 (2)消毒；酒曲中的微生物失活 (3)28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量；无氧呼吸/酒精发酵；升高 (4)MfeⅠ；不可以；α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂 【解析】(1)淀粉属于多糖，水解产生的还原糖含有碳元素，既可作为碳源为酵母菌的生命活动提供碳元素；又可通过细胞呼吸分解，释放能量，为酵母菌提供能源物质。 (2)消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。蒸煮原料通过高温杀灭一部分杂菌，属于传统发酵中的消毒操作。微生物的活性受温度影响，高温会使酵母菌等微生物的蛋白质变性失活，造成菌种死亡，因此摊凉降温可以避免高温杀死接种的发酵菌种，保护酒曲内酵母菌等微生物的活性。 (3)酵母菌的最适生长温度约为28℃，此条件下酵母菌代谢旺盛、增殖速度快，可扩大菌种数量，为后续发酵提供足够的菌种；发酵后期，密封容器内氧气含量快速下降，会抑制酵母菌的有氧呼吸，促进酵母菌进行无氧呼吸(酒精发酵)产生乙醇，使发酵体系内乙醇含量逐渐升高。 (4)①构建基因表达载体时，目的基因应当插入到启动子和终止子之间，且限制酶不能破坏目的基因和载体上的启动子、终止子和标记基因等，由图可知，EcoRⅠ会破坏目的基因；MfeⅠ会破坏载体上的启动子；Hind Ⅲ会破坏载体上的抗性基因(卡那霉素抗性基因)，结合限制酶识别序列可知，EcoRⅠ和MfeⅠ属于同尾酶，可产生相同的黏性末端，因此构建基因表达载体时，可用BamHⅠ和EcoRⅠ切割质粒，在目的基因的两端分别添加上BamHⅠ和MfeⅠ的识别序列。为了保证目的基因能够正常表达，结合目的基因的转录方向，在表达载体上，目的基因的转录方向为从启动子到终止子，因此引物1的5′端引入BamHⅠ的识别序列，引物2的5′端需要引入Mfe Ⅰ的识别序列。 ②由图可知，α-淀粉酶基因的序列内部存在一个EcoRⅠ的酶切位点，用EcoRⅠ切割重组质粒时，EcoRⅠ会从目的基因的内部将其切断，造成目的基因断裂，因此无法获得完整的α-淀粉酶基因。 16.(2026高考·北京)学习以下材料，回答(1)~(4)题。 合成生物学助力尿酸代谢平衡 尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。 为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体(见下图)，右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加(如下图)。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 (1)表达载体中__________的功能是驱动目的基因的转录。 (2)由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者__________结合蛋白。 (3)为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码__________的U酶。 (4)对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是__________。 (5)利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找__________。 16.【答案】(1)启动子 (2)竞争性 (3)分泌型 (4)减少 cH 的数目 (5)能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列 【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，功能就是驱动下游目的基因的转录，表达载体中启动子的功能是驱动目的基因的转录。 (2)R蛋白既可以和尿酸可逆结合，也可以和cH序列可逆结合，尿酸浓度低时R更多结合cH，尿酸浓度高时R更多结合尿酸、从cH上脱离，说明尿酸和cH序列会竞争结合R蛋白。 (3)实验目的是降解血液中的尿酸而非细胞内的尿酸，因此改造后的sU基因编码的U酶需要被分泌到细胞外，才能进入血液发挥降解尿酸的作用。 (4)“相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少”，现在要进一步降低小鼠血液尿酸浓度，就需要让sU(U酶)的表达量更高，因此可以减少sU表达载体上串联的cH序列的数量，降低R蛋白对sU转录的抑制作用，提升U酶的合成量，增强尿酸降解效果。 (5)该尿酸调控系统的核心是“能响应目标代谢物(尿酸)、同时可结合对应调控DNA序列的双功能R蛋白+R蛋白的结合靶序列cH”，要复助力血糖稳态的维持，关键是寻找能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列。 17.(2026高考·贵州)高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： (1)科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 (2)将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C (3)科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐(能使未甲基化的碱基C转变为U)处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙(只显示含有32P的条带)。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 17.【答案】(1)Bcl I和Xba I (2)3+6；2500 (3)X；4；3和9 【解析】(1)若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 (2)在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 (3)启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 18.(2026高考·湖北)蛋白激酶CaMKIIδ过度活化可导致某些心血管疾病。该酶过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸(Met)有关。可通过向导RNA引导，将腺嘌呤碱基编辑器(ABE)精确定位至基因的待编辑位置，使基因相关位点①和②(如图1)的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，从而抑制CaMKIIδ的过度活化。科研人员设计两种向导RNA—sgRNA1和sgRNA6，以此构建了两种ABE，两者在机体心肌细胞中编辑CaMKIIδ基因的效率如图2。 回答下列问题： (1)CaMKIIδ的化学本质是________。 (2)实验中使用心肌特异性启动子来驱动ABE发挥作用，目的是______________。 (3)图1中sgRNA1序列为________(填标号)。 A.5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3' B.5'-GTCTGTGCATCATGGAAGC-3' C.5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3' D.5'-CGAAGGUACUACGUGUCUG-3' (4)由图2可知，以________为向导RNA的ABE编辑效果更好，理由是______________。 (5)镰状细胞贫血是一种遗传病，导致该病的根本原因是_________________；理论上，若用上述技术，需将碱基编辑器导入________(填细胞名称)，从而实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 18.【答案】(1)蛋白质 (2)使ABE基因仅在心肌细胞中表达，避免影响其他细胞的正常生理功能 (3)C (4)sgRNA6；只有基因位点①和②的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，才能抑制CaMKⅡδ的过度活化，以sgRNA6为向导的ABE对位点①和②均有较高的编辑效率，而以sgRNA1为向导的ABE仅对位点①有较高编辑效率，对位点②编辑效率极低 (5)控制血红蛋白合成的基因发生了基因突变；造血干细胞 【解析】(1)CaMKIIδ是一种蛋白激酶，由题干信息可知，蛋白激酶CaMKIIδ过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸有关，因此该酶的化学本质为蛋白质。 (2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质，因此为了驱动ABE仅在心肌细胞中表达，需要在编码ABE的基因的上游添加心肌特异性启动子，避免对其他组织细胞造成不必要的编辑，降低副作用。 (3)基因的转录是以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，从模板链的3'端结合RNA聚合酶转录而来，由图示可知与sgRNA结合的向导DNA序列的编码链为5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3'，根据碱基互补配对原则，且RNA中含U不含T，sgRNA1的碱基序列为5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3'，C符合题意，ABD不符合题意。 (4)由图2可知：含SgRNA1的ABE仅在位点①A→G转换效率高，位点②几乎无编辑效果；含sgRNA6的ABE在位点①和②的A-G转换效率均较高，可同时编辑第281和282位甲硫氨酸，更有效地抑制CaMKII8过度活化。 (5)镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由血红蛋白基因中一个碱基对的替换(A/T→T/A)导致谷氨酸被缬氨酸替换，进而引起血红蛋白结构异常。血红蛋白只在红细胞中被选择性表达合成，红细胞由造血干细胞分化而来，因此将碱基编辑器导入造血干细胞，可使其分化产生正常的红细胞，实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 19.(2026高考·湖北)L基因编码一种水解酶，对人体消化营养物质非常重要。为研究L基因在染色体上的定位，科研人员进行了如下实验。 实验一：通过PCR技术从人—鼠融合细胞A～F(每个细胞保留了部分人染色体)中检测L基因，结果如图1。通过染色体分析确定了融合细胞中所含人染色体信息，结果如图2。 实验二：用荧光探针(特异性检测L基因的模板链)检测人细胞中L基因在染色体上的定位，结果如图3。 回答下列问题： (1)可用化学试剂________诱导人细胞和鼠细胞融合。 (2)据图1可知，L基因存在于_______(填A～F标号)融合细胞中。 (3)据图1、图2推测L基因定位在人________号染色体上。 (4)实验二中，应选择有丝分裂________期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点的原因是________________。 (5)随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种遗传现象属于________。 19.【答案】(1)聚乙二醇/PEG (2)A、C、F (3)2 (4)中；有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体 (5)表观遗传 【解析】(1)诱导动物细胞融合的化学试剂是聚乙二醇(PEG)，所以可用化学试剂聚乙二醇(PEG)诱导人细胞和鼠细胞融合。 (2)观察图1，其中显示了人细胞、鼠细胞以及人-鼠融合细胞A-F中L基因的检测结果，根据图1可知，人-鼠融合细胞的A、C、F中含有对应的条带，所以L基因存在于A、C、F融合细胞中。 (3)结合图1中L基因存在的融合细胞以及图2中融合细胞含有人染色体情况，通过对两者信息的分析推测，L基因定位在人2号染色体上，原因是含L基因的A、C、F融合细胞均含有人2号染色体，不含L基因的B、D、E融合细胞均不含人2号染色体。 (4)实验二中，因为有丝分裂中期染色体形态固定、数目清晰，便于观察，所以应选择有丝分裂中期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点，是由于DNA进行了复制，形成了姐妹染色单体，使得每条染色体上有两个DNA分子，即有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体，从而与荧光探针结合出现两个信号点。 (5)随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种仅由基因甲基化修饰等引起的性状改变，遗传物质未发生改变的遗传现象属于表观遗传。 20.(2026高考·湖南)株高是影响水稻产量的重要性状，探究株高相关基因的遗传机制对水稻育种有重要意义。回答下列问题： (1)为阐明纯合品系甲(株高100 cm)株高由几对基因控制和显隐性等遗传机制，将其与纯合野生品系(株高140 cm)杂交后，株高均为140 cm，F2中株高140 cm和100 cm的数量比约为3∶1，推测品系甲株高的遗传机制为________________________________________________________________________________。 (2)品系甲是野生型的某株高基因发生突变所致，其转录产物编码序列的第796位突变，野生型及突变型基因转录模板链的部分碱基序列如图所示。 野生型： 突变型： ①该突变体第_____位氨基酸突变为_____(部分密码子及对应氨基酸：GCU丙氨酸，CUU亮氨酸，UUC苯丙氨酸，UCG丝氨酸)。 ②拟设计PCR引物扩增该株高基因片段，以检测其他水稻是否发生该突变，应选择引物_____(填序号)。 Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. Ⅳ. (3)某纯合品系乙(株高75 cm)与纯合品系甲(株高100 cm)杂交后，株高均为100 cm，中株高100 cm的347株，株高75 cm的114株，用(2)中的引物和方法检测品系乙的该株高基因： ①若发现与品系甲有相同突变，推测乙的基因型为_____(用A、a；B、b；C、c……表示基因)。将品系乙与纯合野生品系(株高140 cm)杂交，其表现为株高140 cm，中株高140 cm、100 cm和75 cm三种表型的数量比约为9∶6∶1，推测所涉及基因的位置关系是_____________________________________。 ②若发现与品系甲无相同突变，则品系乙形成的原因是__________________________________________。 20.【答案】(1)由一对等位基因控制，株高140 cm为显性性状，100cm隐性性状 (2)266；苯丙氨酸；Ⅱ和Ⅲ (3)aabb；两对等位基因位于两对同源染色体上；甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 【解析】(1)根据题意，纯合品系甲(株高100cm)和纯合野生品系(株高140cm)杂交后，F1株高全为140cm，说明株高140 cm为显性性状，株高100 cm为隐性性状;F2两种表型比约为3:1，符合一对等位基因的分离定律， 因此推测品系甲株高的遗传机制由一对等位基因控制，株高140cm为显性性状，100cm为隐 性性状。 (2)根据题干信息可知，品系甲是野生型的转录产物编码序列第796位突变导致的，对比野生型和突变型甲的转录模板链部分序列可知，是模板链对应的位点碱基发生了"G→A"的替换，由突变基因模板链转录形成的mRNA方向是5'→3'，对应模板链方向是3'→5'，由于mRNA上每3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基叫作1个密码子，转录产物编码序列第796位突变，796÷3=265……1，则266号的模板链序列是796G、797A、798G，对应密码子为5'-CUC-3'，突变后对应密码子为5'-U UC-3'，编码苯丙氨酸。PCR 扩增需要一对引物，引物的作用是使 DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此引物序列应与DNA 两条链3'端互补，为检测其他水稻是否发生该突变，引物序列中应包含突变位点，根据突变型基因转录模板链部分碱基序列的两端可知，有一个引物为5′−⋯GCTTCG−3′，符合此条件的是引物II， 另一引物的序列为5′−⋯GGTGTC−3′，符合此条件的是引物Ⅲ，故选引物II和III。 (3)假设品系甲的突变基因为a，若甲、乙有同一基因突变(a 基因)，纯合甲与纯合乙杂交，F2出现3:1的表型比，两者有一对基因是相同的(aa)，说明两者表型差异必然涉及另一对等位基因，推测乙的基因型为aabb，品系乙(aabb)x野生型(AABB) ， F1全为140 cm(AaBb)，F2出现了9:6:1的分离比，推测表型和基因型对应如下： A-B-140cm 、A-bb和aaB-100cm 、aabb75m，满足两对等位基因独立遗传的特点，说明两对等位基因位于两对同源染色体，遵循基因的自由合定律。若发现品系乙与品系甲无相同突变，纯合品系乙与纯合品系甲杂交后，F2出现出现3:1的表型比，说明甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 21.(2026高考·广东)玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异(图a)，且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： (1)将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为__________性状。 (2)根据这对基因的序列设计了3种引物(图a)，便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶(延伸速度约为1000 bp/min)、缓冲液(含Mg2+)、水、4种脱氧核苷酸和__________，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤(图c)中泳道_______________的带型。 (3)基于品系W构建了针对VW基因的RNAi(可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达)转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株_______________进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果(胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同)： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为_________________； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为____________________________。 (4)已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：_____________________________________是产生品系A粉质胚乳的原因。 21.【答案】(1)显性 (2)模板DNA/玉米基因组DNA；① (3)(胚乳的)RNA；粉质；粉质：硬质=3：1 (4)VA基因表达量低，编码的催化酶合成不足，无法有效催化非极性胡萝卜素转化为下游产物；非极性胡萝卜素积累，导致形成粉质胚乳 【解析】(1)粉质品系 A、硬质品系 W 为纯合品系，正反交F1籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉质，硬质为显性性状。 (2)PCR反应体系除引物、Taq酶、缓冲液、脱氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。品系W是纯合VWVW，Taq DNA聚合酶延伸速度约为1000 bp/min，引物1与引物2可扩增出100+196=296bp(约300bp)的片段，引物3延伸的子链至多延伸500bp，不能再作为引物1结合的模板，因此扩增产物对应图c的泳道①。 (3)要检测VW的表达是否受影响，需要检测转录产物，因此提取胚乳的RNA，通过逆转录PCR检测。 已知VW高表达对应硬质，低表达对应粉质。 ①纯合转基因植株的VW表达被RNAi显著降低，因此胚乳性状为粉质。 ②杂合转基因植株(V+V−，V+为正常VW，V−为表达被敲低的VW)自交，胚乳由两个基因型相同的极核+一个精子发育而来，仅纯合的VWVW表现为硬质，杂合转基因植株中VW表达被敲低，因此性状比例为粉质：硬质=3：1。 (4)据题干信息可知，VW编码的酶催化非极性胡萝卜素转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足，因此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚乳的原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突变，非极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为硬质。 22.(2026高考·河北)根据开花的特点，辣椒植株的花型可分为单花、中花和多花3种类型。为探究该性状的遗传规律，研究者利用甲、乙和丙3种单花纯合体进行了杂交实验，结果见表。 实验编号 杂交组合 F1表型 F2表型及比例 ① 甲×乙 多花 多花∶单花=9∶7 ② 甲×丙 多花 多花∶单花=9∶7 ③ 乙×丙 中花 中花∶单花=9∶7 回答下列问题： (1)根据实验①结果推断，控制花型的基因遗传遵循______________定律。实验②的F2单花个体中，纯合体占比为_________。利用甲和实验②的F1进行杂交，子代中多花占比为_________。 (2)根据3个杂交实验结果判断，控制花型的基因至少涉及_________对。因此推测，上述实验中表现出多花的辣椒植株，必须具有甲中参与控制多花的_________(填“显性”或“隐性”)基因，该等位基因用A/a表示。 (3)现将实验①的F1和丙杂交，对其子代单株和甲、丙的A/a基因进行PCR扩增，产物经酶切后电泳结果的带型如图所示。若(2)中的推测正确，在图中将多花和中花植株检测结果对应位置的条带涂黑，杂交子代中，电泳结果与亲本丙相同的个体理论上占比为_________。 (4)现有多株基因型相同的中花辣椒植株，从亲本甲、乙和丙中选择_________与该类植株杂交，根据子一代表型及比例即可确定其基因型。 22.【答案】(1)基因的自由组合(分离定律和自由组合)；3/7；1/2/50% (2)3/三 (3)显性 1/2/50% (4)乙和丙 【解析】(1) 实验①F2表型比为多花:单花=9:7，是9:3:3:1的变形，说明控制该性状的两对基因遵循基因自由组合定律； 设相关基因型是A/a、B/b、C/c，实验②F₁为双杂合(可设为AabbCc)，则F₂中A_C_为多花占9份，其余所有单花占7份，单花中纯合体为aabbCC、AAbbcc、aabbcc共3份，因此纯合体占比为 3/7；甲、乙和丙3种单花纯合体，可设甲为单花纯合(AAbbcc)，实验②F₁为双杂合AabbCc，子代要得到多花(A_C_)，甲提供Abc，F₁产生AC配子的概率为1/2，因此子代多花占比为 1/2。 (2)三个杂交实验的F2都出现9:7，说明任意两个亲本杂交，F1都为两对基因杂合，而三个亲本都是单花纯合，甲×乙、甲×丙、乙×丙分别在不同的两对基因间杂合，因此至少3对； 所有多花个体都出现在含甲的杂交后代中，说明多花必须携带甲的显性基因(题目设定为A)。 (3)结合(2)可推得基因型：甲AAbbcc、乙aaBBcc、丙aabbCC，表型规则：同时含A和另一对显性基因→多花，不含A但同时含B和C→中花，其余单花，实验①F1基因型为AaBbcc，丙为aabbCC，根据电泳图：甲(AA)只有上方1条A的条带，丙(aa)只有下方2条a的条带，多花植株必须携带A(来自甲)和a(来自丙)，因此既有A条带也有a条带，三个条带都涂黑；中花植株基因型为aa，只有a的条带，因此只涂黑下方两个条带；实验①F₁基因型为AaBbcc，和丙(aabbCC)杂交，电泳只检测A/a，A/a基因型后代分离为Aa:aa=1:1，电泳结果和丙(aa)相同的个体占比为 1/2。 (4)中花基因型为aaB_C_，共有4种可能：aaBBCC、aaBBCc、aaBbCC、aaBbCc，选择纯合亲本乙(aaBBcc)和丙(aabbCC)分别杂交：不同基因型的中花，后代表型比例不同：可以通过乙杂交后代是否出现单花判断C是否杂合，通过丙杂交后代是否出现单花判断B是否杂合，四种基因型的结果互不相同，因此选择乙和丙即可确定其基因型。 23.(2026高考·四川)肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌(E.coli)，构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 (1)DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成________键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是____________________________________。 (2)PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果_______________________________________________________。 (3)色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是__________。 (4)有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是__________(填“E.coli”或“E.coli-fp”)；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 23.【答案】(1)磷酸二酯； His标签可被抗体识别，便于FP蛋白的筛选 (2)FP蛋白、PD-1抗体单独使用 时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著 (3)ATP (4)E.coli-fp；大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖；基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果 【解析】(1)DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选。 (2)结合图2曲线分析：和对照组相比，PD-1抗体组、FP蛋白组的肿瘤体积都更小，说明FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著。 (3)分析图3：加入FP蛋白后，ATP的峰值消失，只产生AMP的峰值，说明FP可以催化ATP分解；而GTP加入FP后无变化，因此FP的反应底物是ATP。 (4)只有工程菌E.coli−fp含有His标签序列，能被His标签抗体检测到，因此出现阳性杂交信号的组1是E.coli−fp。 肿瘤因快速增殖内部形成缺氧环境，大肠杆菌为兼性厌氧菌，可适应缺氧的肿瘤微环境完成生长增殖；能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖。 结合前文结论，基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果。 24.(2026高考·河北)黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： (1)黑曲霉菌种的分离纯化应选用_________(填“固体”或“液体”)培养基。 (2)细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照_________原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的_________端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是_________。 (3)构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有_________基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用_________培养基筛选出转基因成功的菌株。 (4)构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果(图2)表明_________________________________________________________。(答出两点) (5)传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是________________________________________________。(答出两点) 24.【答案】(1)固体 (2)碱基互补配对；5′；Sac Ⅰ (3)标记；选择 (4)①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长(生物量)无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力 (5)①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高 【解析】(1)微生物的分离纯化需要获得单菌落，只有固体培养基上才能形成单菌落，因此选用固体培养基。 (2)核酸折叠形成双链遵循碱基互补配对原则；PCR扩增时，引物与模板3'端互补，引物延伸的方向是5'端→3'端，额外的限制酶识别序列需要添加在引物的5′端；根据图1载体的酶切位点顺序：启动子-KpnⅠ-A-SpeⅠ-B-NcoⅠ-C-SacⅠ-终止子可知，A位点两侧是KpnⅠ和SpeⅠ，C位点两侧是Nco Ⅰ和Sac Ⅰ，结合题意可知，该过程需要使含片段A和C的转录产物自身折叠形成双链，图1可知，PCR扩增CreA基因D片段时，分别在5'端添加了A片段和C片段对应的限制酶，要使A片段和C片段插入的D片段转录产物互补，则需要将C位点插入的D片段与A位点插入的D片段反向，结合图中载体上的限制酶对应关系可知，限制酶①应为Sac Ⅰ。 (3)基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因，还需具有标记基因，标记基因的作用是筛选成功转入载体的受体细胞；在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基是选择培养基，可利用选择培养基筛选出转基因菌株。 (4)分析图2曲线，G(原菌株)和G1(抑制CreA表达的菌株)的生物量曲线几乎重合，说明CreA表达抑制对黑曲霉生长无显著影响；G1的淀粉酶活力远高于G，说明抑制CreA表达可以显著提高淀粉酶活力。 (5)传统工艺需要高温处理淀粉，而淀粉酶R可直接降解生淀粉，因此优势为：①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和。副产物少，产物纯度更高 25.(2026高考·山东)小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是_______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________(填“需要”或“不需要”)添加引物，原因是___________________________________________________________________________________。 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。 25.【答案】(1)启动子；复制原点 (2)PstⅠ、XhoⅠ (3)DNA聚合酶、DNA连接酶；不需要；同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 (4)抗原-抗体杂交 【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 (2)要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用PstⅠ和KpnⅠ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，PstⅠ切割载体后要加同聚物G尾，KpnⅠ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用XhoⅠ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择PstⅠ、 XhoⅠ。 (3)由于用XhoⅠ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶(补全单链区)和DNA连接酶(连接缺口)。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 (4)检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 26.(2026高考·黑吉辽蒙卷)我国科学家在半矮秆水稻性状改良研究领域中取得了突破性进展。 (1)已知水稻高秆和半矮秆性状受一对等位基因SD1/sd1控制。SD1基因编码有功能的赤霉素20-氧化酶，催化底物产生赤霉素，控制高秆性状；sd1基因不能产生有功能的酶，控制半矮秆性状。杂交结果说明高秆对半矮秆为显性，从基因型和基因产物功能的角度，对此结论的解释是________。 (2)半矮秆稻抗倒伏，但高氮肥下才能高产。为使其在低氮肥下高产，科学家找到一种名为“千粒稻”的高秆水稻，该水稻具有低氮肥下高产的相关基因。为寻找该基因，将千粒稻与半矮秆稻杂交，筛选________性状的半矮秆子代，再与________杂交。重复以上操作，得到一系列只包含一小段千粒稻染色质但低氮肥高产的杂交品系(C系)。上述过程是为了尽可能避免________流入C系，以缩小筛选范围。 (3)从C系中筛选到一段DNA序列，命名为qINCA2.qINCA2与半矮秆稻的同源序列INCA2只有一个核苷酸差异，均不编码蛋白质。在低氮肥条件下，INCA2导致局部染色质成为稳定的环，把RCN2基因“锁”在其中(下图b)，而qINCA2没有使染色质成环能力(下图c)。 qINCA2控制低氮肥高产性状的分子水平解释为________。 (4)基于以上机制欲用基因组编辑技术(可以精准快速改变DNA序列)改造另一种氮肥依赖型半矮秆稻品种，培育低氮肥高产型纯合子。合理的方案是先编辑该半矮秆稻的________，筛选得到低氮肥高产型第一代基因组编辑水稻。由于该水稻可能是________，需再让其进行________，然后从中筛选获得目标水稻。 26.【答案】(1)杂合子基因型为SD1sd1，其中SD1可编码产生有功能的赤霉素20-氧化酶，合成赤霉素，表现为高秆，因此高秆对半矮秆为显性 (2)低氮肥高产；半矮秆稻；千粒稻其余染色质(DNA) (3)qINCA2没有使染色质成环的能力，无法将RCN2基因锁定，RCN2基因可以正常转录、翻译(正常表达)，合成RCN2蛋白，因此水稻在低氮肥条件下表现高产 (4)INCA2基因；杂合子；自交 【解析】(1)显性性状的定义是：杂合子所表现出的性状为显性性状。结合题干信息，只要携带SD1基因就能合成有功能的酶，产生赤霉素，表现高秆，因此高秆对半矮秆为显性。 (2)该过程是通过回交逐步定位目的基因：首先需要筛选获得符合要求的低氮肥高产性状的半矮秆子代，之后与亲本半矮秆稻回交，重复操作后，可淘汰千粒稻中除目的基因所在片段外的其余染色质/DNA，仅保留带目的基因的小段千粒稻染色质，缩小筛选范围。 (3)从题图可知：半矮秆稻的INCA2使染色质成环，抑制RCN2表达，导致低氮肥低产；而千粒稻的qINCA2不能成环，RCN2可正常表达，因此实现低氮肥高产。 (4)待改造的半矮秆稻含INCA2，因此需要编辑其INCA2基因，使其突变为qINCA2类型；水稻是二倍体，一次编辑通常仅改变一对同源染色体中的一个INCA2基因，因此第一代编辑水稻一般为杂合子；杂合子自交后会发生性状分离，可从后代中筛选得到纯合的低氮肥高产目标植株。 27.(2026高考·河南)4-α糖基转移酶(4αGT)在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体(仅用于目的基因的复制和保存)中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端(图1)，判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________(填“a”或“b”)对应目的基因片段，理由是________。 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________(答出一点即可)。 27.【答案】(1)复制原点；终止子；终止目的基因的转录 (2)XhoⅠ；NcoⅠ (3)b；重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 【解析】(1)载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点(DNA复制的起始位点)。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 (2)结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 (3)根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 (4)工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 28.(2026高考·陕晋青宁卷)研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的___________性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是___________(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于___________型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的___________酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是___________。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是___________或___________两种组合，原因是___________。 (4)为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是___________。可利用___________法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，___________(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 28.【答案】(1)简并性；③ (2)诱导；RNA聚合；引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育 (3)EcoR I和Kpn I；EcoR I和SaI I；从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译(即发生移码突变) (4)增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触；农杆菌转化法；抑制 【解析】(1)由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)，这样能避免转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符，需要对其进行测序并序列比对，所以选③。 (2)因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗虫棉，所以在该载体中，启动子P属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达。之后检测到J*蛋白在细胞外积累，说明S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是EcoR I和Kpn I或EcoR I和SaI I两种组合，原因是根据图中信号肽序列的核苷酸数量，从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译(即发生移码突变)。 (4)为获得足够的重组质粒，对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触。将融合基因导入棉花茎尖细胞，可利用农杆菌转化法。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，使组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 29.(2026高考·云南)UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体(ACCR)的羧基端。回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒(图a)，复制原点(ori)不能在UW4菌株中启动复制(质粒不复制策略)。 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和________三步。 (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是________(答出2点)。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2(图b)。 (3)我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是________。 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加_________，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是________；在第二次筛选培养基中添加________。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是________(填图c中序号)；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并________。 29.【答案】(1)延伸 (2)防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌(或重组质粒)扩散到环境中，造成基因污染 (4)庆大霉素；pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长；蔗糖；②；电泳检测 【解析】(1)PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接。 (3)在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此类设计的主要目的是防止工程菌(或重组质粒)扩散到环境中，造成基因污染。 (4)据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活；筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是②，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并电泳检测来鉴定。 30.(2026高考·安徽)肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液______异常；乳腺癌细胞培养时______(填“会”或“不会”)出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是______。 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示(实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点)。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为______(填图2中序号)。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是______。 (3)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因______S基因的转录，______(填“促进”或“抑制”)肿瘤耐药。 30.【答案】(1)pH；不会；胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞 (2)①④或③④；将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 (3)抑制；促进 【解析】(1)动物细胞培养中，CO₂的作用是维持培养液正常的pH，若CO₂不足会导致培养液pH异常；乳腺癌细胞是癌细胞，细胞膜上糖蛋白减少，失去了接触抑制特性，因此培养时不会出现接触抑制；胰蛋白酶处理贴壁细胞分散细胞时，处理时间过长会过度分解细胞蛋白、损伤细胞，因此需要控制处理时间。 (2)构建重组质粒时，需要保证目的基因插入方向正确：质粒启动子在插入位点左侧，转录方向从左到右，而P基因自身转录方向向左，因此需要将P基因的右端(转录起点侧)连接靠近启动子的Bgl II位点，左端连接靠近终止子的Hind III位点，但因质粒的复制原点有Hind III的酶切位点，在启动子和复制原点之间还有BamH I的酶切位点，故只能选择Bgl II作为靠近启动子的酶切位点、Spe I作为靠近终止子的酶切位点。根据碱基互补配对，Bgl II识别序列为AGATCT，P基因右端序列匹配引物③(5'-AGATCTAGGCAT-3')；Spe I识别序列为ACTAGT，P基因左端序列匹配引物④(5'-ACTAGTCCGTGT-3')，因此选引物③④。BglⅡ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，扩增P基因时，也可以在上游引物的5'端添加BamHⅠ识别序列，选择引物①和④。 本实验探究P基因的作用，实验组导入含P基因的重组质粒，对照组需要排除质粒本身的影响，因此对照组为转入不含P基因的空质粒的乳腺癌细胞，其余条件与实验组一致。 (3)启动子甲基化会阻碍RNA聚合酶与启动子结合，因此P蛋白诱导S基因启动子甲基化，会抑制S基因的转录；S基因的作用是抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖，S基因表达被抑制后，DNA损伤修复可以正常进行，因此会促进肿瘤耐药。 31.(2026高考·浙江)农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因(Gpd)构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 31.【答案】(1)感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌；EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ (2)超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台；(平板)划线法/稀释涂布平板法；单菌落；腐草霉素 (3)提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间；T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 【解析】(1)用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞(可导入外源DNA分子的农杆菌)。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 (2)为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台(或无菌实验室或灭菌的操作台)的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因(Zeoᴿ)。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 (3)从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 四、实验题 32.(2026高考·全国卷)研究人员利用基因工程和动物细胞工程技术对某品种奶牛进行改良，以使奶牛的乳腺表达并分泌蛋白B，技术路线如图所示。回答下列问题。 (1)在获取目的基因的过程中，步骤①和步骤②所用的酶分别是___________。 (2)完成基因导入后，需要鉴定牛胚胎成纤维细胞染色体DNA上是否成功插入B基因，可使用的检测技术有___________(答出1点即可)等。 (3)牛卵母细胞去核时，所使用的卵母细胞应处于_______(填“减数分裂Ⅰ中期”“减数分裂Ⅱ中期”或“有丝分裂中期”)。 (4)步骤③将2种细胞融合常用的方法有_______(答出1点即可)等。步骤④胚胎移植前，需要对重构胚进行_________________处理，以使重构胚完成细胞分裂和发育进程。 (5)设计实验，鉴定成年转基因母牛的乳腺是否分泌了蛋白B，简要写出实验思路。 32.【答案】(1)逆转录酶、DNA聚合酶 (2)PCR (3)减数分裂Ⅱ中期 (4)电融合法；激活 (5)取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验 【解析】(1)步骤①是以mRNA为模板合成互补DNA的逆转录过程，需要逆转录酶；步骤②是通过PCR技术扩增目的基因，需要用到耐高温的DNA聚合酶。 (2)检测细胞染色体DNA上是否插入目的基因，属于分子水平的核酸检测，可通过特异性PCR技术扩增出目的基因片段来验证插入是否成功，也可以用DNA分子杂交技术。 (3)动物体细胞核移植的去核操作，需要选用发育到减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，该时期的卵母细胞细胞质具备促进细胞核全能性表达的条件。 (4)动物细胞融合的常用方法有电融合法、聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法；重构胚需要通过激活处理(如电刺激、化学刺激)，才能启动细胞分裂，完成后续的发育进程。 (5)检测目的基因是否成功表达出蛋白质，采用抗原-抗体特异性结合的原理，可取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验，即可鉴定乳腺是否分泌了蛋白B。 33.(2026高考·湖北)玉米是重要粮食作物之一，对低温极为敏感。低温不仅限制玉米的生长，还抑制其对磷的吸收。研究发现，一种泛素连接酶UbL是协调玉米低温响应与磷吸收的核心调控因子，UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，UbL的靶蛋白包括低温信号通路关键蛋白J和磷转运蛋白T。为阐明UbL基因调控玉米低温响应与磷吸收的分子机制，科研人员对野生型玉米(WT)进行UbL基因敲除和定向改造，分别获得功能缺失突变体ubl与定向改造的突变体，并进行了相关实验研究，结果如图所示。 回答下列问题： (1)与野生型玉米相比，低温条件下突变体玉米植株中磷的含量________，原因是____________________。 (2)推测蛋白J含量与玉米耐寒性之间呈________相关性，请设计实验证明上述推论________________(写出实验思路)。 (3)UbL作为枢纽蛋白，体现了基因与性状之间的关系是____________。 (4)培育耐低温玉米，对农业种植的积极意义是____________________(回答一点即可)。 33.【答案】(1)升高；突变体ubl中UbL基因功能缺失，不能催化磷转运蛋白T降解，磷转运蛋白T含量高，促进玉米对磷的吸收 (2)负；将生理状态相同的野生型玉米均分为三组，第一组导入蛋白J基因使其过表达(增加蛋白J含量)，第二组敲除蛋白J基因(减少蛋白J含量)，第三组不做处理(作为对照)，将三组玉米置于4℃低温环境中培养，一段时间后统计并比较三组玉米的存活率 (3)一个基因可以影响多个性状 (4)扩大玉米的种植区域，可在气温偏低的北方或高海拔地区种植玉米；降低低温冻害造成的玉米减产，提高玉米在低温地区的产量 【解析】(1)由图D可知，与野生型玉米相比，低温条件下突变体玉米植株中磷的含量升高，因为UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，UbL的靶蛋白包括磷转运蛋白T，突变体ubl中UbL基因功能缺失，不能催化磷转运蛋白T降解，磷转运蛋白T含量高，促进玉米对磷的吸收，所以低温条件下突变体玉米植株中磷的含量升高。 (2)UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，ubl中UbL基因功能缺失，蛋白J不能被降解，含量高，4℃低温处理下，与野生型玉米相比，突变体ubl玉米植株相对存活率低，所以推测蛋白J含量与玉米耐寒性之间呈负相关性，为了验证上述推论，实验思路为将生理状态相同的野生型玉米均分为三组，第一组导入蛋白J基因使其过表达(增加蛋白J含量)，第二组敲除蛋白J基因(减少蛋白J含量)，第三组不做处理(作为对照)，将三组玉米置于4℃低温环境中培养，一段时间后统计并比较三组玉米的存活率。若玉米植株存活率表现为过表达蛋白J组存活率＜对照组存活率＜敲除蛋白J组存活率，则证明蛋白J含量与玉米耐寒性呈负相关性。 (3)UbL是一种泛素连接酶，其作为枢纽蛋白，靶蛋白包括低温信号通路关键蛋白J和磷转运蛋白T，一个基因(UbL基因)影响两种性状(耐寒性、磷的吸收)，体现了基因与性状之间可以是“一个基因可以影响多个性状”的关系。 (4)培育耐低温玉米，对农业种植的积极意义是在低温环境下仍能正常生长，扩大玉米的种植区域，可在气温偏低的北方或高海拔地区种植玉米；降低低温冻害造成的玉米减产，提高玉米在低温地区的产量。 34.(2026高考·湖南)阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体(CAR)基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： (1)CAR基因和病毒载体的部分结构(含限制酶切割位点)分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的________(填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是________________________________________。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是__________。 (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________(单选)的Aβ聚集体含量。 A.24 h检测细胞内 B.24 h检测细胞外 C.0 h和24 h检测细胞内 D.0 h和24 h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射_____________；该实验结论是_____________________________________________________________________________________。 34.【答案】(1)抗体；使其在星形胶质细胞中特异性表达；KpnⅠ和BamHⅠ (2)C (3)携带空载体(或不携带CAR基因或仅携带GFP基因)的等量病毒；在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因(CAR-A疗法)能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 【解析】(1)实验目的是形成CAR-A细胞(嵌合抗原受体基因)，并鉴定这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力，所以表达产物需要与Aβ聚集体特异性结合，所以胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列。 要使其在星形胶质细胞中特异性表达，所以需要选择特异性启动子。 为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细胞，需要将CAR基因编码序列和特异性启动子导入病毒载体中，分析目的基因和载体，可以选择KpnⅠ和BamHⅠ切割目的基因和病毒载体，可以保证目的基因插入病毒载体中，依次形成特异性启动子、CAR表达载体、GFP基因和终止子的表达载体。 (2)要证明细胞具有“吞噬”和“降解”Aβ聚集体的能力，必须检测Aβ是否进入了细胞内部以及其含量的变化。在0 h(更换培养基前)和24 h(更换培养基继续培养后)分别检测细胞内的Aβ聚集体含量，如果24 h时细胞内Aβ含量显著低于0 h，则能确凿地证明CAR-A细胞不仅吞噬了Aβ，还在细胞内将其降解了，C正确，ABD错误。 (3)为检测效果，实验组6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，对照组选择6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带空载体(或不携带CAR基因或仅携带GFP基因)的等量病毒，由于3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降，说明了在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因(CAR-A疗法)能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 35.(2026高考·广东)疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因(MM-CP)按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： (1)构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于______________。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的____________与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 (2)研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为_____________。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是________________________________________________________________________。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。___________________________________________________________________________________________。 (3)基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊(如图)。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后______________________________________，使更多配子携带MM-CP。 (4)若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。_______________________________________________。 35.【答案】(1)基因重组；反密码子 (2)诱导型启动子；使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代；从预期改造后抗菌肽的功能(仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽 (3)以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复 (4)基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险 【解析】(1)构建转基因按蚊属于基因工程，属于基因重组；翻译过程中，tRNA上的反密码子和mRNA上的密码子配对。 (2)抗菌肽基因仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，所以推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为诱导型启动子。该启动子使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代。 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，所以设计思路：从预期改造后抗菌肽的功能(仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽。 (3)结合图示可知，Cas9切割野生型染色体后，会以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复，让原本的野生型染色体也变成携带MM-CP的染色体，最终体细胞两条同源染色体均带MM-CP，减数分裂产生的配子几乎都携带该基因，因此后代携带MM-CP的比例显著升高。 (4)从生物进化角度，基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险。 20 / 31 学科网（北京）股份有限公司 $ 【 高中生物 】 2026年高考真题-按章分类 选择性必修3 生物技术与工程 第三章 基因工程 12个单选题 + 2个多选题 + 21个非选择题 ---- 学 生 版 ---- 一、单选题 1.(2026高考·甘肃)科研人员将水母、珊瑚等生物的荧光蛋白基因导入普通斑马鱼，使其在特定光照下呈现鲜艳荧光，开发出了全球首例商业化转基因观赏鱼GloFish。为了获得亮度更高、颜色更丰富的新型荧光斑马鱼，科学家们进行了相关操作，流程如图。下列叙述正确的是( ) A.步骤①：推测氨基酸序列以及对应的转运RNA类型 B.处理②：通过显微操作法将改造后的基因导入受精卵 C.步骤③：将转基因受精卵移植到斑马鱼体内发育成熟 D.新型荧光斑马鱼在上市之前不再需要进行安全性评价 2.(2026高考·全国卷)为构建含目的基因的重组质粒，某同学用限制酶X分别切割质粒P和含有目的基因的DNA片段，用连接酶连接后导入大肠杆菌，挑选在抗性平板上长出的菌落，提取质粒进行分析。目的基因(1.5 kb，1 kb=103 bp)及质粒P(2.4 kb)中的限制酶(X、Y、Z)切割位点、各片段长度等信息如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.在抗性平板上挑选不到含2.4 kb质粒的大肠杆菌菌落 B.若提取的质粒为3.9 kb，提示其中可能含有目的基因 C.重组质粒用Y和Z双酶切可得3.2 kb和0.7 kb的片段 D.重组质粒用Y和Z双酶切可得2.5 kb和1.4 kb的片段 3.(2026高考·北京)MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是( ) A.温度和pH会影响MT的催化活性 B.第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C.为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D.对MT结构的改造属于蛋白质工程 4.(2026高考·湖北)将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是( ) A.选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B.为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C.工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 5.(2026高考·湖北)为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是( ) A.F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B.F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C.F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D.F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 6.(2026高考·湖南)关于表中生物学实验的相关叙述，错误的是( ) 选项 实验名称 相关叙述 A 低温诱导植物细胞染色体数目的变化 低温能抑制洋葱根尖分生区细胞中纺锤体的形成，引起细胞内染色体数目加倍 B 绿叶中色素的提取和DNA的粗提取 绿叶中的色素不溶于无水乙醇，DNA易溶于无水乙醇 C 探究酵母菌细胞呼吸的方式 细胞呼吸产物的产生情况是因变量，温度是无关变量 D 模拟生物体维持pH的稳定 可设置HCO3-/H2CO3缓冲液或HPO42-/H2PO4-缓冲液作为对照组 A.A B.B C.C D.D 7.(2026高考·江西)植物生物反应器是一种新兴的重组蛋白表达系统，研究人员按图示流程制备抗蛋白F的抗体。下列叙述错误的是(　　) A.制备杂交瘤细胞需将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 B.利用F免疫的小鼠能制备出多种抗F的单克隆抗体 C.单克隆抗体阳性克隆培养液中通常需要添加血清 D.可用PCR检测植物叶片中是否含有抗F的抗体 8.(2026高考·江西)蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是(　　) A.第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B.将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C.判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D.甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 9.(2026高考·湖南)将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是( ) A.来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B.不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C.外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D.调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 10.(2026高考·河南)胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸(脯氨酸除外)之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是(　　) A.甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B.胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C.第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D.由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 11.(2026高考·云南)内含肽(Int)可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是(　　) A.构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B.内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C.不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D.为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 12.(2026高考·浙江)利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是(　　) A.将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B.不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C.转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D.转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 二、多选题 13.(2026高考·江西)研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是(　　) A.需在72℃条件下培养基因工程菌 B.添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C.可根据电泳结果初步评价T的纯度 D.可根据PCR产物的多少计算T的活性 14.(2026高考·河北)窖泥中的微生物是影响白酒风味的因素之一。现从某酒厂窖泥中分离筛选与白酒风味物质形成相关的己酸菌，下列分析错误的是( ) A.分离培养己酸菌时，需对培养基、培养皿和窖泥进行灭菌 B.通过稀释涂布平板法统计的菌落数一般比活菌的实际数偏多 C.依据己酸菌的特异基因序列设计引物，可通过PCR对目的菌株进行鉴定 D.获得的己酸菌优良菌种需扩大培养后再用于白酒的规模化生产 三、解答题 15.(2026高考·甘肃)甜醅是西北地区的传统小吃，可由燕麦发酵而成。燕麦经清洗、浸泡、蒸煮、摊凉后，加入酒曲(含酵母菌等微生物)发酵，即可制成甜醅。回答下列问题。 (1)燕麦中的淀粉被淀粉酶水解成还原糖，为酵母菌提供__________。 (2)甜醅制作时，蒸煮原料的操作属于无菌技术中的__________；加入酒曲前摊凉是为了避免原料温度过高导致__________ (3)发酵初期，需要将温度控制在28℃左右是因为__________；发酵后期，密封发酵容器可促进酵母菌的__________，使乙醇含量__________。 (4)为了推动甜醅的工业化生产，研发人员利用基因工程技术从甜醅中克隆了α-淀粉酶基因，构建了表达载体。实验所用载体结构、引物设计图和限制酶识别序列及酶切位点如下。 ①在设计α-淀粉酶引物序列时，为了将目的基因正确插入表达载体，引物1的5′端引入了BamH Ⅰ识别序列，引物2的5′端需引入__________酶的识别序列。 ②构建成功的重组质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切__________(填“可以”或“不可以”)切割出完整的α-淀粉酶基因。理由是__________。 16.(2026高考·北京)学习以下材料，回答(1)~(4)题。 合成生物学助力尿酸代谢平衡 尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。 为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体(见下图)，右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加(如下图)。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 (1)表达载体中__________的功能是驱动目的基因的转录。 (2)由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者__________结合蛋白。 (3)为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码__________的U酶。 (4)对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是__________。 (5)利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找__________。 17.(2026高考·贵州)高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： (1)科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的_____对质粒进行酶切。 (2)将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为_________的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为_____bp。                W试剂：识别G；X试剂：识别G、A；                Y试剂：识别C、T；Z试剂：识别C (3)科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐(能使未甲基化的碱基C转变为U)处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙(只显示含有32P的条带)。③中加入的是__________试剂；a和b两片段长度相差_____个核苷酸；启动子的该序列从端到端第_____位核苷酸发生了甲基化。 18.(2026高考·湖北)蛋白激酶CaMKIIδ过度活化可导致某些心血管疾病。该酶过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸(Met)有关。可通过向导RNA引导，将腺嘌呤碱基编辑器(ABE)精确定位至基因的待编辑位置，使基因相关位点①和②(如图1)的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，从而抑制CaMKIIδ的过度活化。科研人员设计两种向导RNA—sgRNA1和sgRNA6，以此构建了两种ABE，两者在机体心肌细胞中编辑CaMKIIδ基因的效率如图2。 回答下列问题： (1)CaMKIIδ的化学本质是________。 (2)实验中使用心肌特异性启动子来驱动ABE发挥作用，目的是______________。 (3)图1中sgRNA1序列为________(填标号)。 A.5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3' B.5'-GTCTGTGCATCATGGAAGC-3' C.5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3' D.5'-CGAAGGUACUACGUGUCUG-3' (4)由图2可知，以________为向导RNA的ABE编辑效果更好，理由是______________。 (5)镰状细胞贫血是一种遗传病，导致该病的根本原因是_________________；理论上，若用上述技术，需将碱基编辑器导入________(填细胞名称)，从而实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 19.(2026高考·湖北)L基因编码一种水解酶，对人体消化营养物质非常重要。为研究L基因在染色体上的定位，科研人员进行了如下实验。 实验一：通过PCR技术从人—鼠融合细胞A～F(每个细胞保留了部分人染色体)中检测L基因，结果如图1。通过染色体分析确定了融合细胞中所含人染色体信息，结果如图2。 实验二：用荧光探针(特异性检测L基因的模板链)检测人细胞中L基因在染色体上的定位，结果如图3。 回答下列问题： (1)可用化学试剂________诱导人细胞和鼠细胞融合。 (2)据图1可知，L基因存在于_______(填A～F标号)融合细胞中。 (3)据图1、图2推测L基因定位在人________号染色体上。 (4)实验二中，应选择有丝分裂________期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点的原因是________________。 (5)随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种遗传现象属于________。 20.(2026高考·湖南)株高是影响水稻产量的重要性状，探究株高相关基因的遗传机制对水稻育种有重要意义。回答下列问题： (1)为阐明纯合品系甲(株高100 cm)株高由几对基因控制和显隐性等遗传机制，将其与纯合野生品系(株高140 cm)杂交后，株高均为140 cm，F2中株高140 cm和100 cm的数量比约为3∶1，推测品系甲株高的遗传机制为________________________________________________________________________________。 (2)品系甲是野生型的某株高基因发生突变所致，其转录产物编码序列的第796位突变，野生型及突变型基因转录模板链的部分碱基序列如图所示。 野生型： 突变型： ①该突变体第_____位氨基酸突变为_____(部分密码子及对应氨基酸：GCU丙氨酸，CUU亮氨酸，UUC苯丙氨酸，UCG丝氨酸)。 ②拟设计PCR引物扩增该株高基因片段，以检测其他水稻是否发生该突变，应选择引物_____(填序号)。 Ⅰ. Ⅱ. Ⅲ. Ⅳ. (3)某纯合品系乙(株高75 cm)与纯合品系甲(株高100 cm)杂交后，株高均为100 cm，中株高100 cm的347株，株高75 cm的114株，用(2)中的引物和方法检测品系乙的该株高基因： ①若发现与品系甲有相同突变，推测乙的基因型为_____(用A、a；B、b；C、c……表示基因)。将品系乙与纯合野生品系(株高140 cm)杂交，其表现为株高140 cm，中株高140 cm、100 cm和75 cm三种表型的数量比约为9∶6∶1，推测所涉及基因的位置关系是_____________________________________。 ②若发现与品系甲无相同突变，则品系乙形成的原因是__________________________________________。 21.(2026高考·广东)玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因VA和VW可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异(图a)，且在胚乳发育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如下研究。 回答下列问题： (1)将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为__________性状。 (2)根据这对基因的序列设计了3种引物(图a)，便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶(延伸速度约为1000 bp/min)、缓冲液(含Mg2+)、水、4种脱氧核苷酸和__________，反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①～⑤(图c)中泳道_______________的带型。 (3)基于品系W构建了针对VW基因的RNAi(可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达)转基因植株。鉴定转基因植株中VW基因表达是否受到影响，应提取植株_______________进行PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果(胚乳由极核和精子结合后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同)： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为_________________； ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为____________________________。 (4)已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推测研究人员提出的假设。最合理的是：_____________________________________是产生品系A粉质胚乳的原因。 22.(2026高考·河北)根据开花的特点，辣椒植株的花型可分为单花、中花和多花3种类型。为探究该性状的遗传规律，研究者利用甲、乙和丙3种单花纯合体进行了杂交实验，结果见表。 实验编号 杂交组合 F1表型 F2表型及比例 ① 甲×乙 多花 多花∶单花=9∶7 ② 甲×丙 多花 多花∶单花=9∶7 ③ 乙×丙 中花 中花∶单花=9∶7 回答下列问题： (1)根据实验①结果推断，控制花型的基因遗传遵循______________定律。实验②的F2单花个体中，纯合体占比为_________。利用甲和实验②的F1进行杂交，子代中多花占比为_________。 (2)根据3个杂交实验结果判断，控制花型的基因至少涉及_________对。因此推测，上述实验中表现出多花的辣椒植株，必须具有甲中参与控制多花的_________(填“显性”或“隐性”)基因，该等位基因用A/a表示。 (3)现将实验①的F1和丙杂交，对其子代单株和甲、丙的A/a基因进行PCR扩增，产物经酶切后电泳结果的带型如图所示。若(2)中的推测正确，在图中将多花和中花植株检测结果对应位置的条带涂黑，杂交子代中，电泳结果与亲本丙相同的个体理论上占比为_________。 (4)现有多株基因型相同的中花辣椒植株，从亲本甲、乙和丙中选择_________与该类植株杂交，根据子一代表型及比例即可确定其基因型。 23.(2026高考·四川)肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌(E.coli)，构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 (1)DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成________键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是____________________________________。 (2)PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果_______________________________________________________。 (3)色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是__________。 (4)有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是__________(填“E.coli”或“E.coli-fp”)；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 24.(2026高考·河北)黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： (1)黑曲霉菌种的分离纯化应选用_________(填“固体”或“液体”)培养基。 (2)细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照_________原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的_________端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是_________。 (3)构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有_________基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用_________培养基筛选出转基因成功的菌株。 (4)构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果(图2)表明_________________________________________________________。(答出两点) (5)传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是________________________________________________。(答出两点) 25.(2026高考·山东)小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是_______，载体上与其能自我复制相关的结构是_______。 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为___________。 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是_______________________________，该过程中___________(填“需要”或“不需要”)添加引物，原因是___________________________________________________________________________________。 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是__________________。 26.(2026高考·黑吉辽蒙卷)我国科学家在半矮秆水稻性状改良研究领域中取得了突破性进展。 (1)已知水稻高秆和半矮秆性状受一对等位基因SD1/sd1控制。SD1基因编码有功能的赤霉素20-氧化酶，催化底物产生赤霉素，控制高秆性状；sd1基因不能产生有功能的酶，控制半矮秆性状。杂交结果说明高秆对半矮秆为显性，从基因型和基因产物功能的角度，对此结论的解释是________。 (2)半矮秆稻抗倒伏，但高氮肥下才能高产。为使其在低氮肥下高产，科学家找到一种名为“千粒稻”的高秆水稻，该水稻具有低氮肥下高产的相关基因。为寻找该基因，将千粒稻与半矮秆稻杂交，筛选________性状的半矮秆子代，再与________杂交。重复以上操作，得到一系列只包含一小段千粒稻染色质但低氮肥高产的杂交品系(C系)。上述过程是为了尽可能避免________流入C系，以缩小筛选范围。 (3)从C系中筛选到一段DNA序列，命名为qINCA2.qINCA2与半矮秆稻的同源序列INCA2只有一个核苷酸差异，均不编码蛋白质。在低氮肥条件下，INCA2导致局部染色质成为稳定的环，把RCN2基因“锁”在其中(下图b)，而qINCA2没有使染色质成环能力(下图c)。 qINCA2控制低氮肥高产性状的分子水平解释为________。 (4)基于以上机制欲用基因组编辑技术(可以精准快速改变DNA序列)改造另一种氮肥依赖型半矮秆稻品种，培育低氮肥高产型纯合子。合理的方案是先编辑该半矮秆稻的________，筛选得到低氮肥高产型第一代基因组编辑水稻。由于该水稻可能是________，需再让其进行________，然后从中筛选获得目标水稻。 27.(2026高考·河南)4-α糖基转移酶(4αGT)在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体(仅用于目的基因的复制和保存)中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端(图1)，判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________(填“a”或“b”)对应目的基因片段，理由是________。 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________(答出一点即可)。 28.(2026高考·陕晋青宁卷)研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的___________性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是___________(选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对)。 (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于___________型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的___________酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是___________。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是___________或___________两种组合，原因是___________。 (4)为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是___________。可利用___________法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，___________(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 29.(2026高考·云南)UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体(ACCR)的羧基端。回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒(图a)，复制原点(ori)不能在UW4菌株中启动复制(质粒不复制策略)。 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和________三步。 (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是________(答出2点)。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2(图b)。 (3)我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是________。 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加_________，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是________；在第二次筛选培养基中添加________。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是________(填图c中序号)；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并________。 30.(2026高考·安徽)肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液______异常；乳腺癌细胞培养时______(填“会”或“不会”)出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是______。 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示(实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点)。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为______(填图2中序号)。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是______。 (3)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因______S基因的转录，______(填“促进”或“抑制”)肿瘤耐药。 31.(2026高考·浙江)农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因(Gpd)构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备________，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经________限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在________中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用________方法接种在固体培养基上培养，适时挑选________再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有________的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是________。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或________，导致甘油合成代谢受阻。 四、实验题 32.(2026高考·全国卷)研究人员利用基因工程和动物细胞工程技术对某品种奶牛进行改良，以使奶牛的乳腺表达并分泌蛋白B，技术路线如图所示。回答下列问题。 (1)在获取目的基因的过程中，步骤①和步骤②所用的酶分别是___________。 (2)完成基因导入后，需要鉴定牛胚胎成纤维细胞染色体DNA上是否成功插入B基因，可使用的检测技术有___________(答出1点即可)等。 (3)牛卵母细胞去核时，所使用的卵母细胞应处于_______(填“减数分裂Ⅰ中期”“减数分裂Ⅱ中期”或“有丝分裂中期”)。 (4)步骤③将2种细胞融合常用的方法有_______(答出1点即可)等。步骤④胚胎移植前，需要对重构胚进行_________________处理，以使重构胚完成细胞分裂和发育进程。 (5)设计实验，鉴定成年转基因母牛的乳腺是否分泌了蛋白B，简要写出实验思路。 33.(2026高考·湖北)玉米是重要粮食作物之一，对低温极为敏感。低温不仅限制玉米的生长，还抑制其对磷的吸收。研究发现，一种泛素连接酶UbL是协调玉米低温响应与磷吸收的核心调控因子，UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，UbL的靶蛋白包括低温信号通路关键蛋白J和磷转运蛋白T。为阐明UbL基因调控玉米低温响应与磷吸收的分子机制，科研人员对野生型玉米(WT)进行UbL基因敲除和定向改造，分别获得功能缺失突变体ubl与定向改造的突变体，并进行了相关实验研究，结果如图所示。 回答下列问题： (1)与野生型玉米相比，低温条件下突变体玉米植株中磷的含量________，原因是____________________。 (2)推测蛋白J含量与玉米耐寒性之间呈________相关性，请设计实验证明上述推论________________(写出实验思路)。 (3)UbL作为枢纽蛋白，体现了基因与性状之间的关系是____________。 (4)培育耐低温玉米，对农业种植的积极意义是____________________(回答一点即可)。 34.(2026高考·湖南)阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体(CAR)基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： (1)CAR基因和病毒载体的部分结构(含限制酶切割位点)分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的________(填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是________________________________________。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是__________。 (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，__________(单选)的Aβ聚集体含量。 A.24 h检测细胞内 B.24 h检测细胞外 C.0 h和24 h检测细胞内 D.0 h和24 h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射_____________；该实验结论是_____________________________________________________________________________________。 35.(2026高考·广东)疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因(MM-CP)按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： (1)构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于______________。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的____________与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 (2)研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为_____________。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是________________________________________________________________________。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。___________________________________________________________________________________________。 (3)基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊(如图)。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后______________________________________，使更多配子携带MM-CP。 (4)若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。_______________________________________________。 第三章 基因工程 ---- 参考答案及解析 ---- 一、单选题 1.B 该流程属于蛋白质工程范畴，设计荧光蛋白结构后，步骤①应是推测氨基酸序列以及对应的脱氧核苷酸序列(基因序列)，不需要推测转运RNA类型，A错误。将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，可通过显微操作将改造后的荧光蛋白基因导入斑马鱼受精卵，B正确。斑马鱼是卵生生物，受精卵可在体外适宜环境中发育，不需要移植到斑马鱼体内发育，C错误。转基因生物存在潜在的安全风险，新型荧光斑马鱼上市前必须进行安全性评价，D错误。 2.A 用限制酶X切割质粒时，存在部分质粒未被切割，或切割后自身环化的情况，这类质粒仍为2.4kb的环状结构，抗性基因完整，可在抗性平板上生长，因此能挑选到含2.4kb质粒的大肠杆菌菌落，A错误。原质粒长度为2.4kb，目的基因长度为1.5kb，二者连接后得到的重组质粒总长度为2.4+1.5=3.9kb，因此提取到3.9kb的质粒提示其中可能含有目的基因，B正确。目的基因两端均为X酶的黏性末端，插入时存在两种方向：若目的基因上0.4kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+0.4=0.7kb，2.1+1.1=3.2kb，C正确。若目的基因反向插入，即1.1kb的片段靠近质粒的Z位点，用Y和Z双酶切后，得到的片段长度为0.3+1.1=1.4kb，2.1+0.4=2.5kb，D正确。 3.B 酶的活性受温度、pH等因素的影响，MT本质是酶，因此温度和pH会影响其催化活性，A正确。根据题干信息，将第216位的丙氨酸变为苏氨酸后，MT的热稳定性提高，并未改变其催化功能(仍可催化海藻糖合成)，说明该位点的丙氨酸与MT的热稳定性有关，未体现对其专一性的作用，B错误。热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高活性，因此筛选热稳定性高的MT时，应在较高温度下测定酶活性，C正确。通过改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，以获得功能符合需求的蛋白质，该技术属于蛋白质工程，D正确。 4.C 益生菌是对人体有益的微生物，对人体无毒性，具备天然安全性，适合作为表达新抗原的工程菌受体，A正确。不同患者的肿瘤细胞特有的新抗原存在差异，个性化免疫治疗需要针对患者筛选其特有的肿瘤新抗原，才能精准激活针对该患者肿瘤的特异性免疫，B正确。工程菌属于外来异物，进入人体后会被免疫系统识别并清除，无法在体内长期存活；且免疫监视是人体免疫系统的功能，并非工程菌的功能，C错误。树突状细胞属于抗原呈递细胞，可将肿瘤新抗原摄取、加工后呈递给辅助性T细胞，进而激活体液免疫和细胞免疫，即激活特异性免疫过程，D正确。 5.B XhoⅠ的酶切位点在基因A内部，不能选择，否则会破坏基因A，A错误。F1位于基因A的下游，要让基因A正向插入质粒，F1的5'端需要带有HindⅢ的酶切位点，对应质粒上靠近β-半乳糖苷酶基因的酶切位点； F2位于基因A的上游，其5'端需要带有XbaⅠ的酶切位点，对应质粒上靠近启动子的酶切位点。 这样切割后，基因A的两端就能和质粒切割后的黏性末端互补连接，且保证基因A的转录方向和质粒上的启动子方向一致，B正确。F1位于基因A的下游， F2位于基因A的上游，若F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点，会导致基因与质粒反接，C错误。PvuⅠ、ScaⅠ的酶切位点位于Ampr抗性基因内部，切割会破坏抗性标记基因，无法后续筛选重组质粒，D错误。 6.B 低温诱导植物细胞染色体数目加倍的原理是低温可抑制有丝分裂前期纺锤体的形成，洋葱根尖分生区细胞可进行有丝分裂，纺锤体形成受抑制后，着丝粒分裂产生的子染色体无法移向细胞两极，会引起细胞内染色体数目加倍，A正确。绿叶中的色素属于脂溶性有机物，易溶于无水乙醇等有机溶剂，因此无水乙醇可作为该实验的提取液；DNA不溶于无水乙醇，因此DNA粗提取实验中常用体积分数为95%的冷酒精使DNA析出，B错误。探究酵母菌细胞呼吸的方式实验中，自变量是氧气的有无，因变量是细胞呼吸产物的产生情况，温度、培养液用量、酵母菌初始数量等均为无关变量，需保持相同且适宜，C正确。模拟生物体维持pH的稳定实验中，清水组、HCO3-/H2CO3或HPO42-/H2PO4-缓冲液组均为对照组，生物材料组为实验组，D正确。 7.D 制备杂交瘤细胞的核心操作就是将免疫小鼠的B淋巴细胞(可分泌特异性抗体)与骨髓瘤细胞(可无限增殖)融合，符合单克隆抗体制备的流程，A正确。抗原蛋白F上存在多个不同的抗原决定簇，可刺激小鼠产生多种分泌抗F抗体的B淋巴细胞，因此可制备多种抗F的单克隆抗体，B正确。单克隆抗体阳性克隆的培养属于动物细胞培养，目前人类未完全掌握动物细胞所需的全部营养物质，因此培养液中通常需要添加血清等天然成分补充未知营养，C正确。PCR是扩增和检测核酸的技术，抗F抗体的本质是蛋白质，无法用PCR检测，检测抗体需要使用抗原-抗体杂交技术，D错误。 8.D 酶的活性依赖其特定的空间结构，第n位甲硫氨酸氧化会改变蛋白酶E的局部结构，进而改变E的空间结构，导致酶活性下降，A正确。蛋白质的氨基酸序列由编码它的基因的碱基序列决定，替换特定位置的氨基酸可通过蛋白质工程(即第二代基因工程)改造对应基因的碱基序列，再经表达获得改造后的蛋白酶，B正确。本次改造的目的是提高E对S的耐受性，因此判断改造效果的指标是经S处理后酶的活性保留情况，需用S处理一段时间后测定酶活性进行对比，C正确。酶的专一性由酶活性位点的结构决定，替换甲硫氨酸提高了E对S的耐受性，没有信息表明该替换改变了酶的活性位点结构，无法得出E的专一性降低的结论，D错误。 9.B 所有生物的DNA均为双螺旋结构且共用一套遗传密码，因此来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合，题干中转基因鱼生长速率加快也证明重组序列可成功表达，A正确。重组基因导入受精卵时，整合到受体染色体上的位置、拷贝数存在差异，且基因表达还受其他调控因素影响，因此不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平不一定相同，B错误。外源基因仅存在于细胞质中时，细胞分裂过程中易丢失，整合到染色体DNA上才能随染色体复制稳定传递给子代细胞，是其在受体细胞中稳定遗传的关键，C正确。启动子是RNA聚合酶识别结合启动转录的序列，调控启动子活性可改变生长激素基因的表达水平，通过观察对应转基因鱼的生长速率，可验证二者的关系，D正确。 10.D 蛋白质工程从预期蛋白质功能出发，经结构设计、氨基酸序列推导最终改造对应基因，再通过基因表达获得改造蛋白，整个过程遵循中心法则即遗传信息传递的一般规律，A正确。酶的专一性指酶只能催化一种或一类化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后的甲无其可作用的位点因此不能被水解，体现了酶的专一性，B正确。改造后甲仍保持抗体活性，第96位精氨酸未被替换，推测该位点可能与抗体的功能密切相关，替换后可能导致抗体活性丧失，C正确。密码子简并性是指同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发生改变，D错误。 11.C 题干中X+Y融合蛋白由两个独立基因表达后经自我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合基因，构建X+Y融合蛋白基因，不一定存在碱基序列相互影响问题，A错误。从图中可以看到，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内，而是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋白功能结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误。从图中过程可以看出，内含肽的IntAN与IntAᶜ、IntBᶜ与IntBᴺ通过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切除和连接作用，C正确。由图可知，内含肽在反应后被完全切除，得到的X+Y融合蛋白不含内含肽结合部位，所以再为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，也不能实现自我切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X+Y融合蛋白新的结构，D错误。 12.D 水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化(不需要再次脱分化)。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误。转基因过程中，外源基因(P1基因)插入水稻染色体的位置是随机的(位置效应)，不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误。水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误。题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 二、多选题 13.AB 该基因工程菌为大肠杆菌，培养大肠杆菌的适宜温度为37℃左右；72℃是该DNA聚合酶T催化PCR反应延伸时的适宜温度，不是培养工程菌的温度，72℃条件下大肠杆菌无法存活，A错误。诱导物浓度并非越高越好，高浓度诱导物通常会对工程菌的生长产生毒害，反而会抑制目的蛋白的表达，降低T酶的产量，B错误。蛋白质电泳可根据条带数目初步判断蛋白质的纯度：若仅出现目的条带说明纯度高，出现多条杂带说明杂质多，C正确。T酶的活性是其催化PCR合成DNA的能力，相同反应条件下，T酶活性越高，单位时间内扩增得到的PCR产物量越多，因此可以根据PCR产物的多少计算T酶的活性，D正确。 14.AB 分离培养己酸菌时，为避免杂菌污染，需对培养基、培养皿进行灭菌，但窖泥是分离目标菌的原材料，若对窖泥灭菌会杀死其中的己酸菌，无法完成目标菌的分离筛选，A错误。使用稀释涂布平板法统计活菌数时，若两个或多个活菌聚集在一起，平板上只会形成一个菌落，因此统计得到的菌落数一般比活菌的实际数偏少，B错误。不同物种的基因序列具有特异性，依据己酸菌的特异基因序列设计引物进行PCR，可根据是否扩增出目标产物完成对目的菌株的鉴定，C正确。筛选获得的己酸菌优良菌种初始数量较少，需先进行扩大培养，获得足够多的菌种后才能用于白酒的规模化生产，D正确。 三、解答题 15.【答案】(1)碳源/碳源和能源物质 (2)消毒；酒曲中的微生物失活 (3)28℃是酵母菌的最适生长温度，有利于酵母菌快速增殖，扩大菌种数量；无氧呼吸/酒精发酵；升高 (4)MfeⅠ；不可以；α-淀粉酶基因的序列内部存在EcoR Ⅰ的酶切位点，用EcoR Ⅰ酶切后目的基因会断裂 【解析】(1)淀粉属于多糖，水解产生的还原糖含有碳元素，既可作为碳源为酵母菌的生命活动提供碳元素；又可通过细胞呼吸分解，释放能量，为酵母菌提供能源物质。 (2)消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。蒸煮原料通过高温杀灭一部分杂菌，属于传统发酵中的消毒操作。微生物的活性受温度影响，高温会使酵母菌等微生物的蛋白质变性失活，造成菌种死亡，因此摊凉降温可以避免高温杀死接种的发酵菌种，保护酒曲内酵母菌等微生物的活性。 (3)酵母菌的最适生长温度约为28℃，此条件下酵母菌代谢旺盛、增殖速度快，可扩大菌种数量，为后续发酵提供足够的菌种；发酵后期，密封容器内氧气含量快速下降，会抑制酵母菌的有氧呼吸，促进酵母菌进行无氧呼吸(酒精发酵)产生乙醇，使发酵体系内乙醇含量逐渐升高。 (4)①构建基因表达载体时，目的基因应当插入到启动子和终止子之间，且限制酶不能破坏目的基因和载体上的启动子、终止子和标记基因等，由图可知，EcoRⅠ会破坏目的基因；MfeⅠ会破坏载体上的启动子；Hind Ⅲ会破坏载体上的抗性基因(卡那霉素抗性基因)，结合限制酶识别序列可知，EcoRⅠ和MfeⅠ属于同尾酶，可产生相同的黏性末端，因此构建基因表达载体时，可用BamHⅠ和EcoRⅠ切割质粒，在目的基因的两端分别添加上BamHⅠ和MfeⅠ的识别序列。为了保证目的基因能够正常表达，结合目的基因的转录方向，在表达载体上，目的基因的转录方向为从启动子到终止子，因此引物1的5′端引入BamHⅠ的识别序列，引物2的5′端需要引入Mfe Ⅰ的识别序列。 ②由图可知，α-淀粉酶基因的序列内部存在一个EcoRⅠ的酶切位点，用EcoRⅠ切割重组质粒时，EcoRⅠ会从目的基因的内部将其切断，造成目的基因断裂，因此无法获得完整的α-淀粉酶基因。 16.【答案】(1)启动子 (2)竞争性 (3)分泌型 (4)减少 cH 的数目 (5)能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列 【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，功能就是驱动下游目的基因的转录，表达载体中启动子的功能是驱动目的基因的转录。 (2)R蛋白既可以和尿酸可逆结合，也可以和cH序列可逆结合，尿酸浓度低时R更多结合cH，尿酸浓度高时R更多结合尿酸、从cH上脱离，说明尿酸和cH序列会竞争结合R蛋白。 (3)实验目的是降解血液中的尿酸而非细胞内的尿酸，因此改造后的sU基因编码的U酶需要被分泌到细胞外，才能进入血液发挥降解尿酸的作用。 (4)“相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少”，现在要进一步降低小鼠血液尿酸浓度，就需要让sU(U酶)的表达量更高，因此可以减少sU表达载体上串联的cH序列的数量，降低R蛋白对sU转录的抑制作用，提升U酶的合成量，增强尿酸降解效果。 (5)该尿酸调控系统的核心是“能响应目标代谢物(尿酸)、同时可结合对应调控DNA序列的双功能R蛋白+R蛋白的结合靶序列cH”，要复助力血糖稳态的维持，关键是寻找能与葡萄糖可逆结合的蛋白，以及能与该蛋白可逆结合的特定DNA序列。 17.【答案】(1)Bcl I和Xba I (2)3+6；2500 (3)X；4；3和9 【解析】(1)若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamH I与Bst I识别相同序列(5'-GGATCC-3')，切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且Bst I酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用 BamH I酶与Bst I酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有Bcl I酶和Xba I酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 (2)在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。结合各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 (3)启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'(共10个核苷酸，5'→3'编号为1~10)，互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键。电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断(即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断)。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组:条带位置对应 C/T位点一Y试剂(识别C、T)；2组:条带位置仅对应C位点一Z试剂(识别C)；3组:条带位置对应A/G位点X试剂(识别G、A)；4组:条带位置仅对应G位点一W试剂(识别G)。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1(Y)和2(Z)的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 18.【答案】(1)蛋白质 (2)使ABE基因仅在心肌细胞中表达，避免影响其他细胞的正常生理功能 (3)C (4)sgRNA6；只有基因位点①和②的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，才能抑制CaMKⅡδ的过度活化，以sgRNA6为向导的ABE对位点①和②均有较高的编辑效率，而以sgRNA1为向导的ABE仅对位点①有较高编辑效率，对位点②编辑效率极低 (5)控制血红蛋白合成的基因发生了基因突变；造血干细胞 【解析】(1)CaMKIIδ是一种蛋白激酶，由题干信息可知，蛋白激酶CaMKIIδ过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸有关，因此该酶的化学本质为蛋白质。 (2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质，因此为了驱动ABE仅在心肌细胞中表达，需要在编码ABE的基因的上游添加心肌特异性启动子，避免对其他组织细胞造成不必要的编辑，降低副作用。 (3)基因的转录是以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，从模板链的3'端结合RNA聚合酶转录而来，由图示可知与sgRNA结合的向导DNA序列的编码链为5'-GCTTCCATGATGCACAGAC-3'，根据碱基互补配对原则，且RNA中含U不含T，sgRNA1的碱基序列为5'-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3'，C符合题意，ABD不符合题意。 (4)由图2可知：含SgRNA1的ABE仅在位点①A→G转换效率高，位点②几乎无编辑效果；含sgRNA6的ABE在位点①和②的A-G转换效率均较高，可同时编辑第281和282位甲硫氨酸，更有效地抑制CaMKII8过度活化。 (5)镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，由血红蛋白基因中一个碱基对的替换(A/T→T/A)导致谷氨酸被缬氨酸替换，进而引起血红蛋白结构异常。血红蛋白只在红细胞中被选择性表达合成，红细胞由造血干细胞分化而来，因此将碱基编辑器导入造血干细胞，可使其分化产生正常的红细胞，实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 19.【答案】(1)聚乙二醇/PEG (2)A、C、F (3)2 (4)中；有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体 (5)表观遗传 【解析】(1)诱导动物细胞融合的化学试剂是聚乙二醇(PEG)，所以可用化学试剂聚乙二醇(PEG)诱导人细胞和鼠细胞融合。 (2)观察图1，其中显示了人细胞、鼠细胞以及人-鼠融合细胞A-F中L基因的检测结果，根据图1可知，人-鼠融合细胞的A、C、F中含有对应的条带，所以L基因存在于A、C、F融合细胞中。 (3)结合图1中L基因存在的融合细胞以及图2中融合细胞含有人染色体情况，通过对两者信息的分析推测，L基因定位在人2号染色体上，原因是含L基因的A、C、F融合细胞均含有人2号染色体，不含L基因的B、D、E融合细胞均不含人2号染色体。 (4)实验二中，因为有丝分裂中期染色体形态固定、数目清晰，便于观察，所以应选择有丝分裂中期的细胞进行观察；图3中每条染色体上出现两个信号点，是由于DNA进行了复制，形成了姐妹染色单体，使得每条染色体上有两个DNA分子，即有丝分裂中期每条染色体含有两条染色单体，从而与荧光探针结合出现两个信号点。 (5)随着年龄的增长，大多数人的基因甲基化修饰程度增加，基因表达水平降低，这种仅由基因甲基化修饰等引起的性状改变，遗传物质未发生改变的遗传现象属于表观遗传。 20.【答案】(1)由一对等位基因控制，株高140 cm为显性性状，100cm隐性性状 (2)266；苯丙氨酸；Ⅱ和Ⅲ (3)aabb；两对等位基因位于两对同源染色体上；甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 【解析】(1)根据题意，纯合品系甲(株高100cm)和纯合野生品系(株高140cm)杂交后，F1株高全为140cm，说明株高140 cm为显性性状，株高100 cm为隐性性状;F2两种表型比约为3:1，符合一对等位基因的分离定律， 因此推测品系甲株高的遗传机制由一对等位基因控制，株高140cm为显性性状，100cm为隐 性性状。 (2)根据题干信息可知，品系甲是野生型的转录产物编码序列第796位突变导致的，对比野生型和突变型甲的转录模板链部分序列可知，是模板链对应的位点碱基发生了"G→A"的替换，由突变基因模板链转录形成的mRNA方向是5'→3'，对应模板链方向是3'→5'，由于mRNA上每3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基叫作1个密码子，转录产物编码序列第796位突变，796÷3=265……1，则266号的模板链序列是796G、797A、798G，对应密码子为5'-CUC-3'，突变后对应密码子为5'-U UC-3'，编码苯丙氨酸。PCR 扩增需要一对引物，引物的作用是使 DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此引物序列应与DNA 两条链3'端互补，为检测其他水稻是否发生该突变，引物序列中应包含突变位点，根据突变型基因转录模板链部分碱基序列的两端可知，有一个引物为5′−⋯GCTTCG−3′，符合此条件的是引物II， 另一引物的序列为5′−⋯GGTGTC−3′，符合此条件的是引物Ⅲ，故选引物II和III。 (3)假设品系甲的突变基因为a，若甲、乙有同一基因突变(a 基因)，纯合甲与纯合乙杂交，F2出现3:1的表型比，两者有一对基因是相同的(aa)，说明两者表型差异必然涉及另一对等位基因，推测乙的基因型为aabb，品系乙(aabb)x野生型(AABB) ， F1全为140 cm(AaBb)，F2出现了9:6:1的分离比，推测表型和基因型对应如下： A-B-140cm 、A-bb和aaB-100cm 、aabb75m，满足两对等位基因独立遗传的特点，说明两对等位基因位于两对同源染色体，遵循基因的自由合定律。若发现品系乙与品系甲无相同突变，纯合品系乙与纯合品系甲杂交后，F2出现出现3:1的表型比，说明甲乙突变可能是同一基因不同位点的突变，形成复等位基因，且甲突变的结果对乙的是显性 21.【答案】(1)显性 (2)模板DNA/玉米基因组DNA；① (3)(胚乳的)RNA；粉质；粉质：硬质=3：1 (4)VA基因表达量低，编码的催化酶合成不足，无法有效催化非极性胡萝卜素转化为下游产物；非极性胡萝卜素积累，导致形成粉质胚乳 【解析】(1)粉质品系 A、硬质品系 W 为纯合品系，正反交F1籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉质，硬质为显性性状。 (2)PCR反应体系除引物、Taq酶、缓冲液、脱氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。品系W是纯合VWVW，Taq DNA聚合酶延伸速度约为1000 bp/min，引物1与引物2可扩增出100+196=296bp(约300bp)的片段，引物3延伸的子链至多延伸500bp，不能再作为引物1结合的模板，因此扩增产物对应图c的泳道①。 (3)要检测VW的表达是否受影响，需要检测转录产物，因此提取胚乳的RNA，通过逆转录PCR检测。 已知VW高表达对应硬质，低表达对应粉质。 ①纯合转基因植株的VW表达被RNAi显著降低，因此胚乳性状为粉质。 ②杂合转基因植株(V+V−，V+为正常VW，V−为表达被敲低的VW)自交，胚乳由两个基因型相同的极核+一个精子发育而来，仅纯合的VWVW表现为硬质，杂合转基因植株中VW表达被敲低，因此性状比例为粉质：硬质=3：1。 (4)据题干信息可知，VW编码的酶催化非极性胡萝卜素转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足，因此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚乳的原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突变，非极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为硬质。 22.【答案】(1)基因的自由组合(分离定律和自由组合)；3/7；1/2/50% (2)3/三 (3)显性 1/2/50% (4)乙和丙 【解析】(1) 实验①F2表型比为多花:单花=9:7，是9:3:3:1的变形，说明控制该性状的两对基因遵循基因自由组合定律； 设相关基因型是A/a、B/b、C/c，实验②F₁为双杂合(可设为AabbCc)，则F₂中A_C_为多花占9份，其余所有单花占7份，单花中纯合体为aabbCC、AAbbcc、aabbcc共3份，因此纯合体占比为 3/7；甲、乙和丙3种单花纯合体，可设甲为单花纯合(AAbbcc)，实验②F₁为双杂合AabbCc，子代要得到多花(A_C_)，甲提供Abc，F₁产生AC配子的概率为1/2，因此子代多花占比为 1/2。 (2)三个杂交实验的F2都出现9:7，说明任意两个亲本杂交，F1都为两对基因杂合，而三个亲本都是单花纯合，甲×乙、甲×丙、乙×丙分别在不同的两对基因间杂合，因此至少3对； 所有多花个体都出现在含甲的杂交后代中，说明多花必须携带甲的显性基因(题目设定为A)。 (3)结合(2)可推得基因型：甲AAbbcc、乙aaBBcc、丙aabbCC，表型规则：同时含A和另一对显性基因→多花，不含A但同时含B和C→中花，其余单花，实验①F1基因型为AaBbcc，丙为aabbCC，根据电泳图：甲(AA)只有上方1条A的条带，丙(aa)只有下方2条a的条带，多花植株必须携带A(来自甲)和a(来自丙)，因此既有A条带也有a条带，三个条带都涂黑；中花植株基因型为aa，只有a的条带，因此只涂黑下方两个条带；实验①F₁基因型为AaBbcc，和丙(aabbCC)杂交，电泳只检测A/a，A/a基因型后代分离为Aa:aa=1:1，电泳结果和丙(aa)相同的个体占比为 1/2。 (4)中花基因型为aaB_C_，共有4种可能：aaBBCC、aaBBCc、aaBbCC、aaBbCc，选择纯合亲本乙(aaBBcc)和丙(aabbCC)分别杂交：不同基因型的中花，后代表型比例不同：可以通过乙杂交后代是否出现单花判断C是否杂合，通过丙杂交后代是否出现单花判断B是否杂合，四种基因型的结果互不相同，因此选择乙和丙即可确定其基因型。 23.【答案】(1)磷酸二酯； His标签可被抗体识别，便于FP蛋白的筛选 (2)FP蛋白、PD-1抗体单独使用 时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著 (3)ATP (4)E.coli-fp；大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖；基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果 【解析】(1)DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选。 (2)结合图2曲线分析：和对照组相比，PD-1抗体组、FP蛋白组的肿瘤体积都更小，说明FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著。 (3)分析图3：加入FP蛋白后，ATP的峰值消失，只产生AMP的峰值，说明FP可以催化ATP分解；而GTP加入FP后无变化，因此FP的反应底物是ATP。 (4)只有工程菌E.coli−fp含有His标签序列，能被His标签抗体检测到，因此出现阳性杂交信号的组1是E.coli−fp。 肿瘤因快速增殖内部形成缺氧环境，大肠杆菌为兼性厌氧菌，可适应缺氧的肿瘤微环境完成生长增殖；能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖。 结合前文结论，基因工程改造的E.coli-fp可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果。 24.【答案】(1)固体 (2)碱基互补配对；5′；Sac Ⅰ (3)标记；选择 (4)①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长(生物量)无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力 (5)①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高 【解析】(1)微生物的分离纯化需要获得单菌落，只有固体培养基上才能形成单菌落，因此选用固体培养基。 (2)核酸折叠形成双链遵循碱基互补配对原则；PCR扩增时，引物与模板3'端互补，引物延伸的方向是5'端→3'端，额外的限制酶识别序列需要添加在引物的5′端；根据图1载体的酶切位点顺序：启动子-KpnⅠ-A-SpeⅠ-B-NcoⅠ-C-SacⅠ-终止子可知，A位点两侧是KpnⅠ和SpeⅠ，C位点两侧是Nco Ⅰ和Sac Ⅰ，结合题意可知，该过程需要使含片段A和C的转录产物自身折叠形成双链，图1可知，PCR扩增CreA基因D片段时，分别在5'端添加了A片段和C片段对应的限制酶，要使A片段和C片段插入的D片段转录产物互补，则需要将C位点插入的D片段与A位点插入的D片段反向，结合图中载体上的限制酶对应关系可知，限制酶①应为Sac Ⅰ。 (3)基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因，还需具有标记基因，标记基因的作用是筛选成功转入载体的受体细胞；在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基是选择培养基，可利用选择培养基筛选出转基因菌株。 (4)分析图2曲线，G(原菌株)和G1(抑制CreA表达的菌株)的生物量曲线几乎重合，说明CreA表达抑制对黑曲霉生长无显著影响；G1的淀粉酶活力远高于G，说明抑制CreA表达可以显著提高淀粉酶活力。 (5)传统工艺需要高温处理淀粉，而淀粉酶R可直接降解生淀粉，因此优势为：①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和。副产物少，产物纯度更高 25.【答案】(1)启动子；复制原点 (2)PstⅠ、XhoⅠ (3)DNA聚合酶、DNA连接酶；不需要；同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 (4)抗原-抗体杂交 【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 (2)要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用PstⅠ和KpnⅠ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，PstⅠ切割载体后要加同聚物G尾，KpnⅠ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用XhoⅠ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。载体在加尾时，只能加入一种脱氧核苷酸，否则会随机连接，这样载体两端只能加G尾。同理，目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择PstⅠ、 XhoⅠ。 (3)由于用XhoⅠ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶(补全单链区)和DNA连接酶(连接缺口)。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 (4)检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 26.【答案】(1)杂合子基因型为SD1sd1，其中SD1可编码产生有功能的赤霉素20-氧化酶，合成赤霉素，表现为高秆，因此高秆对半矮秆为显性 (2)低氮肥高产；半矮秆稻；千粒稻其余染色质(DNA) (3)qINCA2没有使染色质成环的能力，无法将RCN2基因锁定，RCN2基因可以正常转录、翻译(正常表达)，合成RCN2蛋白，因此水稻在低氮肥条件下表现高产 (4)INCA2基因；杂合子；自交 【解析】(1)显性性状的定义是：杂合子所表现出的性状为显性性状。结合题干信息，只要携带SD1基因就能合成有功能的酶，产生赤霉素，表现高秆，因此高秆对半矮秆为显性。 (2)该过程是通过回交逐步定位目的基因：首先需要筛选获得符合要求的低氮肥高产性状的半矮秆子代，之后与亲本半矮秆稻回交，重复操作后，可淘汰千粒稻中除目的基因所在片段外的其余染色质/DNA，仅保留带目的基因的小段千粒稻染色质，缩小筛选范围。 (3)从题图可知：半矮秆稻的INCA2使染色质成环，抑制RCN2表达，导致低氮肥低产；而千粒稻的qINCA2不能成环，RCN2可正常表达，因此实现低氮肥高产。 (4)待改造的半矮秆稻含INCA2，因此需要编辑其INCA2基因，使其突变为qINCA2类型；水稻是二倍体，一次编辑通常仅改变一对同源染色体中的一个INCA2基因，因此第一代编辑水稻一般为杂合子；杂合子自交后会发生性状分离，可从后代中筛选得到纯合的低氮肥高产目标植株。 27.【答案】(1)复制原点；终止子；终止目的基因的转录 (2)XhoⅠ；NcoⅠ (3)b；重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 【解析】(1)载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点(DNA复制的起始位点)。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 (2)结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 (3)根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 (4)工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 28.【答案】(1)简并性；③ (2)诱导；RNA聚合；引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育 (3)EcoR I和Kpn I；EcoR I和SaI I；从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译(即发生移码突变) (4)增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触；农杆菌转化法；抑制 【解析】(1)由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)，这样能避免转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符，需要对其进行测序并序列比对，所以选③。 (2)因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗虫棉，所以在该载体中，启动子P属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达。之后检测到J*蛋白在细胞外积累，说明S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育。 (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是EcoR I和Kpn I或EcoR I和SaI I两种组合，原因是根据图中信号肽序列的核苷酸数量，从EcoR I位点插入才能保证翻译正常进行，其余位点均会抑制翻译(即发生移码突变)。 (4)为获得足够的重组质粒，对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触。将融合基因导入棉花茎尖细胞，可利用农杆菌转化法。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，使组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 29.【答案】(1)延伸 (2)防止目的基因自身环化、防止质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌(或重组质粒)扩散到环境中，造成基因污染 (4)庆大霉素；pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长；蔗糖；②；电泳检测 【解析】(1)PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接。 (3)在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此类设计的主要目的是防止工程菌(或重组质粒)扩散到环境中，造成基因污染。 (4)据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活；筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是②，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并电泳检测来鉴定。 30.【答案】(1)pH；不会；胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞 (2)①④或③④；将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 (3)抑制；促进 【解析】(1)动物细胞培养中，CO₂的作用是维持培养液正常的pH，若CO₂不足会导致培养液pH异常；乳腺癌细胞是癌细胞，细胞膜上糖蛋白减少，失去了接触抑制特性，因此培养时不会出现接触抑制；胰蛋白酶处理贴壁细胞分散细胞时，处理时间过长会过度分解细胞蛋白、损伤细胞，因此需要控制处理时间。 (2)构建重组质粒时，需要保证目的基因插入方向正确：质粒启动子在插入位点左侧，转录方向从左到右，而P基因自身转录方向向左，因此需要将P基因的右端(转录起点侧)连接靠近启动子的Bgl II位点，左端连接靠近终止子的Hind III位点，但因质粒的复制原点有Hind III的酶切位点，在启动子和复制原点之间还有BamH I的酶切位点，故只能选择Bgl II作为靠近启动子的酶切位点、Spe I作为靠近终止子的酶切位点。根据碱基互补配对，Bgl II识别序列为AGATCT，P基因右端序列匹配引物③(5'-AGATCTAGGCAT-3')；Spe I识别序列为ACTAGT，P基因左端序列匹配引物④(5'-ACTAGTCCGTGT-3')，因此选引物③④。BglⅡ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，扩增P基因时，也可以在上游引物的5'端添加BamHⅠ识别序列，选择引物①和④。 本实验探究P基因的作用，实验组导入含P基因的重组质粒，对照组需要排除质粒本身的影响，因此对照组为转入不含P基因的空质粒的乳腺癌细胞，其余条件与实验组一致。 (3)启动子甲基化会阻碍RNA聚合酶与启动子结合，因此P蛋白诱导S基因启动子甲基化，会抑制S基因的转录；S基因的作用是抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖，S基因表达被抑制后，DNA损伤修复可以正常进行，因此会促进肿瘤耐药。 31.【答案】(1)感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌；EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ (2)超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台；(平板)划线法/稀释涂布平板法；单菌落；腐草霉素 (3)提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间；T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 【解析】(1)用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞(可导入外源DNA分子的农杆菌)。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。 从图1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。 用这两种酶同时酶切，会将质粒切成4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 (2)为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台(或无菌实验室或灭菌的操作台)的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因(Zeoᴿ)。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 (3)从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 四、实验题 32.【答案】(1)逆转录酶、DNA聚合酶 (2)PCR (3)减数分裂Ⅱ中期 (4)电融合法；激活 (5)取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验 【解析】(1)步骤①是以mRNA为模板合成互补DNA的逆转录过程，需要逆转录酶；步骤②是通过PCR技术扩增目的基因，需要用到耐高温的DNA聚合酶。 (2)检测细胞染色体DNA上是否插入目的基因，属于分子水平的核酸检测，可通过特异性PCR技术扩增出目的基因片段来验证插入是否成功，也可以用DNA分子杂交技术。 (3)动物体细胞核移植的去核操作，需要选用发育到减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，该时期的卵母细胞细胞质具备促进细胞核全能性表达的条件。 (4)动物细胞融合的常用方法有电融合法、聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法；重构胚需要通过激活处理(如电刺激、化学刺激)，才能启动细胞分裂，完成后续的发育进程。 (5)检测目的基因是否成功表达出蛋白质，采用抗原-抗体特异性结合的原理，可取母牛的乳汁，进行抗原-抗体杂交实验，即可鉴定乳腺是否分泌了蛋白B。 33.【答案】(1)升高；突变体ubl中UbL基因功能缺失，不能催化磷转运蛋白T降解，磷转运蛋白T含量高，促进玉米对磷的吸收 (2)负；将生理状态相同的野生型玉米均分为三组，第一组导入蛋白J基因使其过表达(增加蛋白J含量)，第二组敲除蛋白J基因(减少蛋白J含量)，第三组不做处理(作为对照)，将三组玉米置于4℃低温环境中培养，一段时间后统计并比较三组玉米的存活率 (3)一个基因可以影响多个性状 (4)扩大玉米的种植区域，可在气温偏低的北方或高海拔地区种植玉米；降低低温冻害造成的玉米减产，提高玉米在低温地区的产量 【解析】(1)由图D可知，与野生型玉米相比，低温条件下突变体玉米植株中磷的含量升高，因为UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，UbL的靶蛋白包括磷转运蛋白T，突变体ubl中UbL基因功能缺失，不能催化磷转运蛋白T降解，磷转运蛋白T含量高，促进玉米对磷的吸收，所以低温条件下突变体玉米植株中磷的含量升高。 (2)UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，ubl中UbL基因功能缺失，蛋白J不能被降解，含量高，4℃低温处理下，与野生型玉米相比，突变体ubl玉米植株相对存活率低，所以推测蛋白J含量与玉米耐寒性之间呈负相关性，为了验证上述推论，实验思路为将生理状态相同的野生型玉米均分为三组，第一组导入蛋白J基因使其过表达(增加蛋白J含量)，第二组敲除蛋白J基因(减少蛋白J含量)，第三组不做处理(作为对照)，将三组玉米置于4℃低温环境中培养，一段时间后统计并比较三组玉米的存活率。若玉米植株存活率表现为过表达蛋白J组存活率＜对照组存活率＜敲除蛋白J组存活率，则证明蛋白J含量与玉米耐寒性呈负相关性。 (3)UbL是一种泛素连接酶，其作为枢纽蛋白，靶蛋白包括低温信号通路关键蛋白J和磷转运蛋白T，一个基因(UbL基因)影响两种性状(耐寒性、磷的吸收)，体现了基因与性状之间可以是“一个基因可以影响多个性状”的关系。 (4)培育耐低温玉米，对农业种植的积极意义是在低温环境下仍能正常生长，扩大玉米的种植区域，可在气温偏低的北方或高海拔地区种植玉米；降低低温冻害造成的玉米减产，提高玉米在低温地区的产量。 34.【答案】(1)抗体；使其在星形胶质细胞中特异性表达；KpnⅠ和BamHⅠ (2)C (3)携带空载体(或不携带CAR基因或仅携带GFP基因)的等量病毒；在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因(CAR-A疗法)能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 【解析】(1)实验目的是形成CAR-A细胞(嵌合抗原受体基因)，并鉴定这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力，所以表达产物需要与Aβ聚集体特异性结合，所以胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列。 要使其在星形胶质细胞中特异性表达，所以需要选择特异性启动子。 为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细胞，需要将CAR基因编码序列和特异性启动子导入病毒载体中，分析目的基因和载体，可以选择KpnⅠ和BamHⅠ切割目的基因和病毒载体，可以保证目的基因插入病毒载体中，依次形成特异性启动子、CAR表达载体、GFP基因和终止子的表达载体。 (2)要证明细胞具有“吞噬”和“降解”Aβ聚集体的能力，必须检测Aβ是否进入了细胞内部以及其含量的变化。在0 h(更换培养基前)和24 h(更换培养基继续培养后)分别检测细胞内的Aβ聚集体含量，如果24 h时细胞内Aβ含量显著低于0 h，则能确凿地证明CAR-A细胞不仅吞噬了Aβ，还在细胞内将其降解了，C正确，ABD错误。 (3)为检测效果，实验组6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，对照组选择6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带空载体(或不携带CAR基因或仅携带GFP基因)的等量病毒，由于3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降，说明了在星形胶质细胞中特异性表达CAR基因(CAR-A疗法)能够有效清除阿尔茨海默病模型小鼠大脑中的Aβ聚集体，并显著减轻相关的神经元损伤。 35.【答案】(1)基因重组；反密码子 (2)诱导型启动子；使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代；从预期改造后抗菌肽的功能(仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽 (3)以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复 (4)基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险 【解析】(1)构建转基因按蚊属于基因工程，属于基因重组；翻译过程中，tRNA上的反密码子和mRNA上的密码子配对。 (2)抗菌肽基因仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，所以推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为诱导型启动子。该启动子使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代。 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，所以设计思路：从预期改造后抗菌肽的功能(仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽。 (3)结合图示可知，Cas9切割野生型染色体后，会以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复，让原本的野生型染色体也变成携带MM-CP的染色体，最终体细胞两条同源染色体均带MM-CP，减数分裂产生的配子几乎都携带该基因，因此后代携带MM-CP的比例显著升高。 (4)从生物进化角度，基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险。 20 / 31 学科网（北京）股份有限公司 $