3.2.1基因工程的基本操作程序课件-2026-2027学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，以转基因抗虫棉案例导入，通过问题探讨衔接目的基因筛选与获取、表达载体构建等核心内容，结合基因结构、PCR技术等知识拓展搭建学习支架。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，通过对比原核与真核基因结构、设计PCR引物等活动培养结构与功能观，融入Bt蛋白安全性讨论体现态度责任。实例丰富，助力学生提升探究能力，教师可高效开展教学。

第2节 基因工程的基本操作程序 【本节聚焦】 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 第1课时 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 1 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 转基因抗虫棉与普通棉花 从社会中来 2 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 问题探讨 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 3 基因工程的基本操作程序： 获：目的基因的筛选与获取（前提） 构：基因表达载体的构建 导：将目的基因导入受体细胞（关键） 检：目的基因的检测和鉴定（保证） （核心） 知识拓展：基因的结构 基因1 基因2 基因3 DNA片段 放大 基因通常是有遗传效应的DNA片段； 能编码特定的蛋白质 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 5 探究一.目的基因的筛选与获取 2.基因的结构 外显子 内含子 启动子 原核生物 真核生物 RNA聚合酶识别结合的部位，驱动基因转录 使转录停止 终止子 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 外显子：能编码蛋白质的序列。内含子：不能编码蛋白质的序列 编码蛋白质 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶识别结合位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因上游； 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因下游； 终止转录 本质： 位置： 作用： 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 原核细胞的基因结构 7 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 编码区 非编码区： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 能转录相应的mRNA，然后在翻译前就被剪切掉，不能编码蛋白质的DNA序列 不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列，包括启动子、终止子等。 外显子： 内含子： 8 【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较 不能编码蛋白质的序列 = 非编码区 原核生物的基因： 不能编码蛋白质的序列 真核生物的基因： = 非编码区+内含子 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 典型的原核细胞基因的结构示意图 典型的真核细胞基因的结构示意图 9 真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图 （连续的） （不连续） 知识拓展： 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 成熟mRNA 相应酶切除内含子对应的片段 转录 翻译 真核基因：编码区（外显子+内含子） 多肽链 前体RNA 蛋白质 加工 思考1：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 提示：一般不能产生原来的蛋白质 原因： ①原核细胞里没有相应的酶去除内含子对应的片段； ②原核细胞没有真核细胞的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 编码区（转录区） 非编码区 非编码区 启动子 终止子 基因 转录 前体RNA mRNA 转录后加工 外显子 内含子 逆转录 mRNA—DNA cDNA 不含非编码序列 即不含非编码区和内含子 cDNA的形成： 思考2：如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质吗？ 提示：把真核生物的cDNA导入到原核细胞中表达。 13 　 非编码区 非编码区 编码区 mRNA 对应基因的一条链 Ａ Ｂ 原核生物基因 思考3：下图代表某种生物的基因，解离成两条单链后，与其对应的成熟mRNA杂交的结果，请问那个图代表的是真核生物的基因？ mRNA 对应基因的一条链 非编码区 非编码区 科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。 一、目的基因的筛选与获取 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)实例： 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 1.目的基因 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将 “杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因 那么，如何筛选目的基因呢？ 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。 一、目的基因的筛选与获取 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 【思考2】抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 【思考1】Bt基因的杀虫机理是怎样的？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 在基因工程操作前应充分考虑目的基因的安全性等问题！ 一、目的基因的筛选与获取 2.筛选合适的目的基因 (1)较为有效的方法之一 从相关的___________和___________的基因中进行筛选。 已知结构 功能清晰 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关 掌握了Bt 基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 功能清晰 已知结构 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程 一、目的基因的筛选与获取 (2)认识基因结构和功能的技术方法 测序技术 序列数据库 序列比对工具 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 基因测序仪 一、目的基因的筛选与获取 3.获取目的基因的方法 ①从生物组织中直接获取 ②人工合成 ③从基因文库中获取 ④利用PCR获取和扩增目的基因 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 基因组文库（某生物全部基因） 部分基因文库（主要是cDNA文库） 前提： 方法： DNA合成仪 一、目的基因的筛选与获取 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 反转录法： 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 ②人工合成 一、目的基因的筛选与获取 ③基因文库的构建 （1）建立基因组文库 某生物所有DNA 特定的限制酶 基因组所有基因 每个基因和载体结合重组DNA分子 导入受体菌 基因组文库 一、目的基因的筛选与获取 ③基因文库的构建 （2）建立cDNA基因文库 某种生物的成熟mRNA 单链DNA 双链DNA片段（cDNA） 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子 cDNA文库中的基因不含以上结构 一、目的基因的筛选与获取 部分基因文库”和基因组文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子、终止子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 可以 部分基因可以 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子 cDNA文库中的基因不含以上结构 某种生物的全部基因 探究一.目的基因的筛选与获取 PCR是_______________的缩写，是一项根据___________ ________的原理，在____提供参与DNA复制的 与_________，对 进行 的技术； 聚合酶链式反应 DNA半保 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 留复制 ①全称： ②原理： ③操作环境： ④目的： ⑤优点： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR仪 ④利用PCR获取和扩增目的基因 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ①条件 ATP DNA聚合酶（形成磷酸二酯键） 解旋酶（解螺旋，打开氢键） ③复制特点: ①边解旋边复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） ②复制原则: ②半保留复制 ④子链的延伸方向： 5'端→3'端 因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。 回顾:体内DNA复制 一、目的基因的筛选与获取 （1）PCR条件: 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（2种） （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶 (TaqDNA聚合酶） dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增。 反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 【拓展】DNA的复制的原料--dNTP 脱氧核苷三磷酸（dNTP），包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP） 用作DNA复制的原料 为DNA复制提供能量 一、目的基因的筛选与获取 （1）PCR条件: 耐高温的DNA聚合酶 DNA模板 引物 缓冲溶液 四种脱氧核苷酸 PCR扩增仪（PCR仪） 微量离心管 ——控制温度 （dNTP） （2种） 一般添加Mg2+ （激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶） 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 体内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除） 体外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除） 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸 引物只能结合在模板链的3’端 引物： ③两种引物都结合在DNA模板链的___端；脱氧核苷酸连接在引物的___端进行延伸，子链的延伸方向 。 已知目的基因两端的核苷酸序列 关于引物 ①两种引物的序列相同吗？ 3’ 3’ 目的基因两端具有不同的核苷酸序列 *复制两种引物之间的序列 引物1和引物2不同 5’→3’ ②设计引物的依据是： 故引物的碱基序列与模板链5’端的一段核苷酸链碱基序列相同。 PCR扩增目的基因前提：要有一段已知目的基因两端的部分核苷酸序列，以便根据它合成引物。 练习∙反馈 1.若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是 (从引物①②③④中选) DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 ①5′AACTATGCGCTCATGA3′ ②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′ ③5′AGAGGCTACGCATTGC3′ ④5′TCATGAGCGCATAGTT3′ ①③ 2.利用PCR技术扩增目的基因设计引物时需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？ 只需要根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物（无需知道全部序列） 一、目的基因的筛选与获取 （2）PCR反应过程 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 一、目的基因的筛选与获取 （2）PCR反应过程 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链 DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。G、C含量越高，破坏氢键温度越高 一、目的基因的筛选与获取 （2）PCR反应过程 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ (2)复性： 50℃ 两 思考：引物结合在模板链的什么位置？ 引物只结合DNA模板链 3'端位置， 引导子链从 5'端→3'端方向复制。 一、目的基因的筛选与获取 问题1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ ①引物与DNA模板结合 ②解开的两条模板链重新结合③引物与引物结合 加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 在设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补 问题2：怎样提高复性时引物与模板配对结合率，而不是模板链之间配对结合呢？ 问题3：如何避免引物与引物结合？ （2）PCR反应过程 一、目的基因的筛选与获取 （2）PCR反应过程 当温度上升到______左右时，溶液中的4种___________在耐高温的______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 3’端 一、目的基因的筛选与获取 （2）PCR反应过程 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 一、目的基因的筛选与获取 一、目的基因的筛选与获取 【思考】利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 第一轮循环 第二轮循环 第三轮循环 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 非目的基因序列 目的基因序列 引物 ①DNA分子有_____个 ②总链数___ 条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：___ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 ①子代DNA分子数：___个②含模板链DNA分子数为：__个 ③含引物的DNA分子数为：___个 ④同时含两条引物的DNA分子数：______个 ⑤含引物A（或B）的DNA分子数为： 个 ⑥只含引物A（或B） 的DNA分子数为： 个 ⑦第3次出现两条等长的DNA片段 等长链DNA分子数为： 个 ⑧复制过程中共需引物________个 ⑨第n次复制需要引物____个 2n 2n - 2 2n-1 2 2n 2n-2n 2n＋1 -2 2n 前提：模板DNA的起始数量为1，且引物与DNA分子的中间部位结合时 1 例.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是 A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引 　物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 　补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 　至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变 　产物AD D 补充：基因的定点突变技术------重叠PCR技术 ①该过程需要______种引物； ②PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果； ③PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果； ④产物AD的形成需要引物吗？___________________________________ ⑤需要改变的碱基位于引物___和引物___上 ⑥引物b和引物c之间有什么关系？__________________________________ ⑦PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___ 和引物___ 4 a b c d b c 引物b和引物c应有部分碱基互补的关系 a d 不需要，但需要耐高温的DNA聚合酶 引物A 引物B 引物C 引物D PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 ①这是一种定点 技术。 ②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若选用该引物划“×”） 基因突变 √ √ × × × × √ √ × × × × √ × × √ 补充：基因的定点突变技术----重叠PCR技术 PCR不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。 （逆转录PCR，简称RT-PCR ） [P79旁栏思考]用PCR可以扩增mRNA吗？ DNA聚合酶不能识别RNA序列 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之成单链DNA ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 一、目的基因的筛选与获取 (3)PCR产物鉴定 PCR过程可以在 中自动完成，完成以后， 常采用 来鉴定PCR的产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 【当堂训练】 1.关于PCR技术的说法不正确的是(　　) A.PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B.PCR过程中共需要两个引物分子 C.PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D.PCR过程中DNA合成方向是5′到3′ E．PCR扩增中不需要解旋酶也能解开双链DNA B 解析　PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中DNA合成方向是5′到3′，D正确。 48 2.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　) D A.①过程所需的原料是核糖核苷酸 B.②过程所需的酶必须耐高温 C.③过程需要解旋酶破坏氢键 D.④过程的引物对之间不能互补配对 解析　①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。 49 7/8 3.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是 A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 √ 50 思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？ ①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。 ②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 核心工作——基因表达载体构建 苏云金芽孢杆菌 Bt基因 转基因棉花 × 51 二、基因表达载体的构建 核心 1.目的： 2.基因表达载体的组成： （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选。 注意：目的基因必须插入到启动子与终止子之间。 抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。 二、基因表达载体的构建 核心 知识拓展： 启动子的类型 (1) 组成型启动子: (2)组织特异性启动子: (3)诱导型启动子: 这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。 当诱导物存在时，可以激活或抑制 目的基因的表达。 课堂练习 √ 1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是 A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 54 二、基因表达载体的构建 3.构建过程: DNA分子 （含目的基因） （同尾酶）处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同种限制酶 载体 （质粒） 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 二、基因表达载体的构建 [思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？ 载体 目的基因 自身环化 片段间 随意 连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 1’ 1 2’ 正向连接 单酶切法缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接 二、基因表达载体的构建 双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因的DNA片段和载体切割。 限制酶a切割 a b DNA连接酶 连接 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 B.防止质粒与目的基因反向连接 二、基因表达载体的构建 (3)确保出现相同黏性末端原则： 通常所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，如图中 ； 为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割；如图也可选择 和 两种限制酶。 (1)不破坏目的基因：如图甲中可选择 ，而不选择 。 (2)保留标记基因（至少1个）、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。 PstⅠ SmaⅠ SmaⅠ PstⅠ PstⅠ EcoRⅠ 图甲　　 　　　　图乙 限制酶的选择原则 (4)切割位点位于启动子和终止子之间：以保证目的基因可以转录 二、基因表达载体的构建 归纳梳理： 基因表达载体的构建方法（重点在于限制酶的选择） (1)不破坏目的基因原则。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，提高筛选成功率。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。 (4)切割位点位于启动子和终止子之间：以保证目的基因可以转录 思考讨论：应该选择什么限制酶对上图所示的质粒和目的基因进行切割，形成重组载体？ 方案：Hind III 和 BamH I 使用“双酶切”时，要注意方向性，通过题目信息判断目的基因的转录方向。 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 引物1 引物2 引入限制酶识别序列 引入限制酶识别序列 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 思考‧讨论： 若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？ 使用引物设计引入限制酶识别序列，通过PCR扩增实现突变。 目的基因 外源 DNA 5’ 3’ 3’ 5’ 拓展：PCR引物设计 DNA复制为何需要引物？ 不能从头合成：DNA聚合酶无法在没有游离羟基（3'-OH）的情况下从头开始合成新链。它只能将核苷酸添加到已有的核酸链的3'-OH末端上。 引物的作用: 使DNA聚合酶能够从引物的3’ 端开始连接脱氧核苷酸 合成引物的前提: 要有一段已知目的基因的核苷酸序列。 5’- -3’ -5’ 3’- 引物 子链延伸 5’ -3’ 引物 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键。 3’- -5’ 62 【典例1】对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物，应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______（填字母）作为引物。 B、C 1、引物需位于目的基因的两侧、且能顺利扩增出目的基因 2、引物只能与模板链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸 拓展： PCR引物设计 1、引物的选择 总结： 只需要根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物（无需知道全部序列） 【典例2】(2017·江苏)设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（见图），请分别说明理由。 (1)第1组： 。 (2)第2组： 。 引物Ⅰ′自身折叠后互补配对而失效 引物Ⅰ与引物Ⅱ局部互补配对而失效 5' 3' 5' 3' 3' 5' 2、引物的设计 64 【典例3】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图：若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(填编号) ②和④ 总结: 1. 若待扩增序列的两端已知，则所用两条引物的方向_____（相对或相反） 2.若DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，则所选引物应朝向已知序列的_______（外侧或内侧）（即反向PCR技术） 相对 外侧 3、引物的修饰 为了使PCR产物能连接到载体上，可以在扩增过程中添加限制酶识别位点。可在引物的 端添加限制酶识别位点. 5′ 目的基因两侧无限制酶切位点？ 【典例4】研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，成为生产胰岛素的“活工厂”。已知胰岛素基因的α链为转录模板，据图分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物 进行特殊处理，处理方式为 。 3′ 5′ mRNA 3′ 5′ 3′ 5′ 强启 动子 BamHⅠ SalⅠ ②和③ 在引物③的5’端添加BamHⅠ识别序列和强启动子在引物②的5’端添加SalⅠ识别序列 66 (1)据图分析，应选用         酶切割质粒，以保证质粒与目的基因高效重组。 【典例5】 镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中P1、P2、P3表示引物。 Mun I 和Xho I  (2)已知 EGFP 基因转录得到的 RNA 中缺乏起始密码子 AUG。利用 PCR 技术获取 EGFP 基因时，为保证 EGFP 基因能正确插入载体且可以正常表达，除选择引物 P1 外，还需要选择引物        ,并在其 5'端增加碱基序列 5'                 3'。 P2 GAATTCATG  67 归纳总结：PCR引物设计原则 扩增 特异性 扩增 高效性 引物 拓展： PCR引物设计 ①引物与一段已知目的基因的核苷酸序列互补配对 ②引物__________________不应存在互补序列 ③引物_______可以修饰，______不可修饰 ④引物_______要适宜 ⑤引物__________要适宜 长度 GC含量 3'端 5'端 自身及引物之间 通常20-30bp 45-55% 课堂练习 1.HindⅢ、BamHI、XhoI表示3种限制酶且切割DNA产生的黏性末端不同。据此回答下列问题： 若瘦素基因两端没有合适的限制酶酶切位点，为使瘦素基因能正确插入P载体中，应在图中引物1和2的     （填“3'”或“5'”）端分别添加        （填“HindⅢ”或“BamHⅠ”或“XhoⅠ”）的识别序列。  5' HindⅢ、BamHI（ 顺序不能换） 2.如图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是 A.若通过PCR技术提取该目的 基因应该选用引物甲和引物丙 B.图1中的质粒用BclⅠ切割后， 含有2个游离的磷酸基团 C.构建基因表达载体时为了防止目的 　基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切 D.在导入目的基因的受体细胞中，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达 √ 构建基因表达载体时至少保留一个标记基因的完整，便于目的基因的检测和筛选；图1中BamHⅠ同时切割两种标记基因，不能选用BamHⅠ剪切，图2中目的基因左侧只能选BclⅠ，而质粒上没有目的基因右侧Sau3AⅠ的切点，两者都有Hind Ⅲ的切点，为了防止目的基因与质粒自身环化，在构建基因表达载体时应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切，C错误。 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 √ 被PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏 72 3.某一质粒载体如图所示，有人将此质粒用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： (1)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________ ；并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。 二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有目的基因的重组质粒 二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示： 标记基因的筛选原理 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 利用2种标记基因的筛选 ①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落； ②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4.科学家将大麦的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的转基因啤酒酵母菌种可表达出LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒。其基本的操作过程如下图所示: (1)这种技术 地改变了啤酒酵母菌的性状,在可遗传变异的来源中，它属于________。  (2)将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所利用到的载体是________。  (3)题图中C 进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是 。 基因重组 质粒 在含有青霉素的培养基上能存活, 在含有四环素的培养基上不能存活 定向 重组质粒 4.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的 产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素) 培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的 培养基中能形成菌落 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D 【典例3】某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ） A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A 课堂总结 基因表达 载体的构建 基因表达载体的结构 基因表达载体的构建过程及方法 限制酶的选择原则 启动子 目的基因 终止子 标记基因 复制原点 构建基因表达载体的目的 基础检测 (1)可用PCR技术直接扩增mRNA来获取目的基因(　　) (2)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) (3)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　) (4)TaqDNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶 (　　) (5)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　) (6)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) (7)基因表达载体中含有启动子和终止密码子(　　) (8)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × × mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增 是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。 × 高温 × DNA聚合酶 × 基因表达载体的构建 × 有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。 √ √ Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v1.0.8 $