3.2.1 基因工程的基本操作程序-2025-2026学年高二生物优质备课课件（人教版选择性必修3）

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，涵盖目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建等核心内容。课堂以转基因抗虫棉培育情境导入，结合复习回顾（重组DNA技术工具）和预习自测，搭建“复习-情境-预习”的学习支架，衔接前后知识脉络。 其亮点在于通过对比表格（如原核与真核基因结构）、典例分析（引物设计、酶切方案）和思考讨论（PCR循环产物分析），培养科学思维与探究实践能力，情境导入联系实际体现态度责任。帮助学生构建知识体系，提升分析问题能力，为教师提供结构化教学资源，提高教学效率。

复习回顾： 1.重组DNA技术的基本工具有哪些？ 2.限制酶切割产生的末端有？ 3.限制酶为什么不切割自身DNA？ 4.连接平末端一般用？ 5.做载体的条件？ 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体 黏性末端或平末端 无限制酶的识别切割序列，或者将DNA识别序列甲基化使限制酶不能将其切开。 T4 DNA连接酶 能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，有一个至多个限制酶切割位点，有标记基因，无毒害作用 情境导入 培育转基因抗虫棉的简要过程 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 提取 抗虫棉 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取（前提） 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 4.目的基因的检测与鉴定（保证） 抗虫基因 苏云金杆菌 第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序 学习目标： 1.简述PCR的原理、条件及过程。 2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 预习自测 (1)可用PCR技术直接扩增mRNA来获取目的基因(　　) (2)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) (3)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　) (4)TaqDNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶 (　　) (5)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高(　　) (6)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) (7)基因表达载体中含有启动子和终止密码子(　　) (8)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × × mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增 是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。 × 高温 × DNA聚合酶 × 基因表达载体的构建 × 有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。 √ √ 探究一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指___________________。 编码蛋白质的基因 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因——Bt 抗虫蛋白基因（Bt基因 ） 探究一.目的基因的筛选与获取 2.基因的结构 外显子 内含子 启动子 原核生物 真核生物 RNA聚合酶识别结合的部位，驱动基因转录 使转录停止 终止子 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 外显子：能编码蛋白质的序列。内含子：不能编码蛋白质的序列 编码蛋白质 探究一.目的基因的筛选与获取 【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较 【思考】编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 不能编码蛋白质的序列 = 非编码区 原核生物的基因： 不能编码蛋白质的序列 真核生物的基因： = 非编码区+内含子 不同点 相同点 原核细胞 编码区是 的 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用的 区组成 真核细胞 编码区是间隔的、 的 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用的 区组成 连续 不连续 编码区 非编码 不一样，真核细胞更长，因为有内含子 探究一.目的基因的筛选与获取 3.筛选合适的目的基因 (1)较为有效的方法之一 从相关的___________和___________的基因中进行筛选。 已知结构 功能清晰 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 对Bt基因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关 掌握了Bt 基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 功能清晰 已知结构 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程 探究一.目的基因的筛选与获取 (2)认识基因结构和功能的技术方法 利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具(如BLAST)等，找到合适的目的基因。 测序技术 序列数据库 序列比对工具 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 基因测序仪 探究一.目的基因的筛选与获取 3.获取目的基因的方法 ①从生物组织中直接获取 ②人工合成 ③从基因文库中获取 ④利用PCR获取和扩增目的基因 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 基因组文库（某生物全部基因） 部分基因文库（主要是cDNA文库） 前提： 方法： DNA合成仪 探究一.目的基因的筛选与获取 基因组DNA限制酶切 基因组文库 mRNA 逆转录得cDNA,酶切 cDNA文库 拼接质粒，导入细菌中保存为文库 （3）基因文库的构建 探究一.目的基因的筛选与获取 部分基因文库和基因组文库的比较 文库类型 文库大小 基因中启动子（非编码区） 基因中内含子 基因多少 cDNA文库 基因组文库 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） 探究一.目的基因的筛选与获取 4.利用PCR获取和扩增目的基因 （1）PCR技术：PCR是______________ _的缩写，是一项根据___________ 的原理，在___ _提供参与DNA复制的___ ____与__ _______，对___________________ _进行______ __的技术； 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 原理 操作环境 目的 优点： 探究一.目的基因的筛选与获取 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ①条件 ATP DNA聚合酶（形成磷酸二酯键） 解旋酶（解螺旋，打开氢键） ③复制特点: ①边解旋边复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） ②复制原则: ②半保留复制 ④子链的延伸方向： 5'端→3'端 因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。 回顾:体内DNA复制 探究一.目的基因的筛选与获取 子链合成需要引物： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 引物可以是DNA单链， 也可以为RNA单链， 体内的DNA复制通常以RNA单链为引物（不切除） 体外（PCR）一般以DNA单链为引物（后续被酶切除） 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 引物结合在模板链的3’端 DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。 探究一.目的基因的筛选与获取 （2）PCR条件: 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。 DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增。 探究一.目的基因的筛选与获取 【拓展】 DNA的复制的原料--dNTP dNTP 是脱氧核苷三磷酸的缩写，N 是指 A、T、G、C 四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简图如下： P P P ～ ～ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 dNTP 为子链合成供能。 dATP dGTP dCTP dTTP 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ (2)复性： 50℃ 两 思考：引物结合在模板链的什么位置？ 引物结合在DNA模板链 3'端位置， 引导子链从 5'端→3'端方向复制。 设计引物的要求： ①同种引物之间不能发生碱基互补配对，防止引物自身折叠； ②两种引物之间不能互补配对，防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合。③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 探究一.目的基因的筛选与获取 探究一.目的基因的筛选与获取 （3）PCR反应过程 ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ 探究一.目的基因的筛选与获取 【思考讨论】1.利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 探究一.目的基因的筛选与获取 【思考讨论】 2.PCR扩增的 (填“是”或“不是”)完整的模板DNA分子，理由是 。 3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是？设计引物时需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？ 4．要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别添加上 。 5.用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） 只需要根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物（无需知道全部序列） 不是 PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物 5′端 限制酶的识别序列 PCR不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。 探究一.目的基因的筛选与获取 (4)PCR产物鉴定 PCR过程可以在 中自动完成，完成以后， 常采用 来鉴定PCR的产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 (2)若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 (3)若用PCR技术扩增图示目的基因，应选 用的引物是 。 【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 5 (2n+1-2)=62 引物甲、引物丙 BC 3′端 至少3个循环 【典例2】(不定项)运用PCR技术从DNA中扩增目的基因的过程中，引物是所需要的基本条件，引物的3′端碱基为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制。下列叙述正确的是(　　) A．引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸 B．通过设计引物的3′端能选择需要扩增的DNA片段 C．引物的5′端可用于添加限制酶切割位点等序列 D．用图中引物扩增一个循环后即可获得目的基因 探究二.基因表达载体的构建 核心 1.目的： 2.基因表达载体的组成： （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选。 注意：目的基因必须插入到启动子与终止子之间。 抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。 探究二.基因表达载体的构建 本质 位置 功能 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 探究二.基因表达载体的构建 3.构建过程: DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同种 载体 （质粒） 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 探究二.基因表达载体的构建 [思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？ 载体 目的基因 自身环化 片段间 随意 连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 1’ 1 2’ 正向连接 单酶切法缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接 探究二.基因表达载体的构建 双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因的DNA片段和载体切割。 限制酶a切割 a b DNA连接酶 连接 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 B.防止质粒与目的基因随意连接 探究二.基因表达载体的构建 (3)确保出现相同黏性末端原则： 通常所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，如图中 ； 为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割；如图也可选择 和 两种限制酶。 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶 尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。 PstⅠ SmaⅠ SmaⅠ PstⅠ PstⅠ EcoRⅠ 图甲　　 　　　　图乙 限制酶的选择原则 【典例3】某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 【典例4】用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落， 不一定含有目的基因 C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的 培养基中能形成菌落 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素) 和Tet的培养基中能形成菌落 D 网络构建