3.1重组DNA技术的基本工具课件-2026-2027学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本工具，涵盖限制酶、DNA连接酶、载体及理论基础。以棉铃虫虫害问题导入，从实际需求引出基因工程定义与本质，通过问题探究、表格对比等支架衔接知识点，构建完整逻辑链条。 其亮点在于融合科学史梳理与实验探究，通过限制酶命名规则、酶作用结果分析等培养科学思维，“DNA粗提取与鉴定”实验强化探究实践，载体条件等内容渗透结构与功能观。学生能提升分析能力，教师可借助系统资料优化教学。

第1节 重组DNA技术的基本工具 第三章 基因工程 基因工程的诞生和发展 1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。 1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。 1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。 1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯等人发明了PCR。 1990年，人类基因组计划启动。2003年完成 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。 2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 从社会中来 我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。 大量施用农药 × 能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？ 抗虫基因 转基因 基因工程 基因工程 基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。(p67) 对基因工程的概念的理解 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 原理 结果 意义 重组DNA技术、转基因技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 基因重组 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 本质：基因在空间上转移并成功表达 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组； 基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 基因工程理论基础 【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ （1）DNA的基本组成单位都是 。 （2）DNA分子都遵循 配对原则。 （3）双链DNA分子的空间结构都是 。 【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ （1） 是控制生物性状的独立遗传单位。 （2）遗传信息的传递和表达都遵循 。 （3）生物界共用一套 。 四种脱氧核苷酸 规则的双螺旋结构 基因 中心法则 遗传密码 碱基互补 相同遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。 基因工程 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 基因工程 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 基因工程 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 基因工程 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 棉-基因1 棉-基因2 棉-基因3 棉-基因4 棉花细胞DNA片段中的部分基因 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 剪下来的抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？大多数生物会排斥外来的基因，若直接导入会被降解。 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 限制酶是细胞的一种防御性工具。当原核细胞遭到外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效。 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 限制性内切核酸酶 （限制酶） 定义： 来源： 思考：限制酶在原核生物中的主要作用是什么？ 主要是从原核生物（细菌等）中分离纯化出来的 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。 10 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 限制酶的命名： EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli 前两个字母 大肠杆菌的R型菌株分离来的 R型菌株中分离出来的第一种限制酶 例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: Hind I Hind II Hind III 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 作用： 能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 苏-基因1 苏-基因2 苏-基因3 苏-基因4 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 思考：为什么限制性内切核酸酶不剪切细菌本身的DNA？ 细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列或该序列被修饰了。 酶的专一性 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 限制酶的识别序列特点： 通常为6个核苷酸，也有为4、8个核苷酸 特点： ①都可以找到一条中心轴线； ②中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，这就是回文序列。 EcoRⅠ 5’…G-A-A-T-T-C…3’ 3’…C-T-T-A-A-G…5’ SmaⅠ 5’…C-C-C-G-G-G…3’ 3’…G-G-G-C-C-C…5’ BamHⅠ 5’…G-G-A-T-C-C…3’ 3’…C-C-T-A-G-G…5’ TaqⅠ 5’……T-C-G-A……3’ 3’……A-G-C-T……5’ 回文序列：在切割部位，一条链从5’往3’读的碱基顺序与另一条链5’往3’读的顺序完全一致。 下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 限制酶的作用结果 ① 产生黏性末端 识别序列为 GAATTC 切割部位为 GA之间 黏性末端 当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。 G C A A T T T A T A C G 5' 3' 3' 5' G C T T A A A A T T C G EcoR I 注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！ 从5’→3’方向 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。 平末端 C G C C G G G C G C G C 5' 3' 3' 5' C G C C G G G C G C G C 限制酶的作用结果 ② 产生平末端 识别序列为 CCCGGG 切割部位为 CG之间 Sma I 从5’→3’方向 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 推断限制酶切一次： 断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性/平末端， 消耗 分子水。 两 2 2 两 限制酶的作用结果 当堂训练 1.若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成 个片段，共断裂 个磷酸二酯键。 练习1. BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ 识别序列及切割位点   2. 请画出BclⅠ切割后产生的末端 。 3 4 不同限制酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端，称为同尾酶 思考：不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 切割位点的选择范围扩大 同种限制酶切割产生的粘性末端相同，因酶具有专一性 17 限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” ①判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割 ②两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两个片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点 -G -CCTAG GATCT- A- GATCC- G- ③两个末端若是由同尾酶切割产生的，一般情况下，两个片段连接后原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别 DNA连接酶 ——“分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 某“分子运输车”DNA序列 5’ 3’ 3’ 5’ 用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段 DNA连接酶 ——“分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 具有相同的黏性末端! DNA连接酶 ——“分子缝合针” 苏-基因2 Bt基因 5’ 3’ 3’ 5’ DNA连接酶 — “分子缝合针” 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 要形成重组DNA分子，必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上 完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。 DNA连接酶 ——“分子缝合针” 类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 功能 缝合__________和___________ 缝合____________和____________ 区别 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 黏性末端 平末端 E.coli DNA连接酶连接平末端效率较T4DNA连接酶低 注意： ①两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。 ②DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA! ③DNA连接酶作用没有特异性! ④不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化） DNA连接酶 ——“分子缝合针” DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA连接酶 ——“分子缝合针” 归纳总结：几种相关酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 图示 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 将DNA切成两个片段,形成黏性末端或平末端 24 当堂训练 练习2. 已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。 （1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割； （2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。 （3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割， _______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。 能 不一定能 能 不一定 —GGATCX— —CCTAGX— —XGATCX— —XCTAGX— —G —CCTAG GATCX— X— —GGATCC— —CCTAGG— 基因进入受体细胞的载体 ----“分子运输车” Bt蛋白基因 5’ 3’ 3’ 5’ 2.怎样才能将Bt蛋白基因送入棉花细胞呢？ 1.能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制 作用： 种类： 质粒，噬菌体、动植物病毒（必须选择DNA病毒） 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 动物病毒 噬菌体 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 基因进入受体细胞的载体 ----“分子运输车” DNA病毒的基因组为‌双链DNA‌，结构稳定，便于使用限制性内切酶、连接酶等常规分子生物学工具进行‌体外重组操作。改造后的DNA病毒载体可‌删除病毒复制必需基因‌，制成复制缺陷型，降低致病风险。‌‌ ‌‌‌ 最常用的载体——质粒 主要存在于细菌、真菌，其基因属细胞质基因 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 DNA复制的起始位点并带着插入的目的基因一起复制 位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 位于基因的下游；终止转录 便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 能控制表达所需要的特殊性状 一至多个限制酶切位点 供外源DNA片段插入 基因进入受体细胞的载体 ----“分子运输车” 质粒作为运载体的优点（运载体具备条件）： ①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点， 便于_________________________________ ； ②质粒含有复制原点，可在受体细胞中进行自我复制， 或整合到受体细胞_______________，能使目的基因稳定存在； ③质粒DNA分子上有特殊的____________，如四环素抗性基因、 氨苄青霉素抗性基因等，供重组DNA的_____________。 ④对受体细胞无害、易分离，不影响受体细胞正常的生命活动 外源DNA片段（目的基因)插入 标记基因 鉴定和筛选 染色体DNA上 基因进入受体细胞的载体 ----“分子运输车” 思考讨论： 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，原因是 。 2.霍乱弧菌中含有质粒， （填“能”、“不能”）用来做载体，原因是 。 噬菌体 噬菌体宿主是细菌，而不是家蚕 霍乱弧菌引起甲类烈性传染病，而载体的选择应该对受体细胞无害 不能 3.（1）质粒 （是/不是）一种细胞器。 （2）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。 基因工程中的载体： 。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是____ ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。 不是 蛋白质 协助细胞膜控制物质进出细胞 目的基因导入受体细胞 基因进入受体细胞的载体 ----“分子运输车” DNA（如质粒）、生物（如动植物病毒） 拓展：标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 注：受体细胞不能具有抵抗该抗生素的能力,否则无法达到筛选目的。 根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。 合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。 拓展：标记基因的筛选原理 如何提高筛选的准确性? 提示：当质粒(载体)上有两个标记基因时， 可将目的基因插入其中一个标记基因中， 也就是重组质粒上含有 标记基因， 普通质粒上含有 标记基因。 则 的受体细胞不具有标记基因控制的性状， 的受体细胞具有两个标记基因控制的性状， 的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状 这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒 的受体细胞。 未导入 导入 导入 一个 两个 没有导入质粒 导入普通质粒 导入重组质粒 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 一、提取的基本思路 二、 实验原理 NaCl浓度 0 DNA溶解度 0.14mol/L 2mol/L DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液 在一定温度下沸水浴冷却后，DNA被二苯胺试剂染成蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 试剂 作用 研磨液 溶解并提取DNA 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺试剂 蒸馏水 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 ②试剂： 三、材料用具 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 注意： ①选材： 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA 研磨液、二苯胺的配制方法（p117） 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 四、方法步骤 称取30g洋葱,切碎,然后放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨 取材研磨 过滤 分离 鉴定 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。(或离心后，取上清液) 研磨的目的： 破碎细胞，使DNA分子从细胞核中释放出来 不可以用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失 上清液中除DNA，可能含核蛋白、多糖等杂质 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 取材研磨 过滤 分离 鉴定 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分(或用离心法取沉淀物) 搅拌时应轻缓、并沿一个方向： 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 酒精预冷的作用： 低温抑制核酸水解酶活性，从而抑制DNA降解； 低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂 四、方法步骤 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 组别 试剂 处理 结果 对照组 实验组 鉴定 实验组 对照组 水浴加热 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关 2mol/L的NaCl溶液5mL 2mol/L的NaCl溶液5mL 4mL的二苯胺试剂 4mL的二苯胺试剂 丝状物或沉淀物 DNA纯度——看提取物颜色（白色丝状物） 取材研磨 过滤 分离 四、方法步骤 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 五、注意事项 1. 利用动物细胞提取DNA时破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，_________。 2. 以血液为实验材料时，需要加入柠檬酸钠，防止__________。 3. 提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：__________更佳。 4. 实验中进行了2次静置或离心，目的是将_____和_________分开，第1次操作后，DNA存在于______中；第2次操作后DNA存在于_________________或_____________中。 5. DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），目的__________________________ 6.有时会反复利用不同浓度的NaCl溶液溶解、析出DNA，该操作的目的是 吸水涨破 提纯效果 DNA 杂质分子 上清液 析出的白色丝状物 离心管沉淀 血液凝固 分解杂质蛋白，将DNA与蛋白质分开。 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 【探究 实践】DNA粗提取与鉴定 总结归纳 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、 噬菌体、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位： 磷酸二酯键 种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $