3.2.3PCR和电泳课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程中PCR技术，系统阐述其概念、原理、操作程序及电泳鉴定，通过复习DNA复制引入，对比体内复制与PCR，结合引物设计、反应条件等学习支架，构建知识脉络。 其亮点是融合科学思维与探究实践，用对比表格深化结构与功能观，实验步骤及误差分析培养证据分析能力，如电泳鉴定指导实践操作，助力学生掌握技能，教师可高效开展探究教学。

第三章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序（3） 第一步：目的基因的筛选与获取 利用PCR获取和扩增目的基因 ① PCR的概念： PCR是____________________的缩写，它是一项根据___________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_____________________ _________进行大量复制的技术。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 参与DNA复制 酸序列 目的基因的核苷 ② 原理： ③ 操作环境： ④ 目的： ⑤ 优点： DNA半保留复制。 体外复制（PCR扩增仪/PCR仪）。 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。 可以在短时间内大量扩增目的基因。 目的基因的筛选与获取——引物 一 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 什么是引物 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键。 -5 ′ 3 ′ - 引物1 5 ′ - -3 ′ 5 ′ - -3 ′ 引物2 3 ′ - -5 ′ DNA复制的过程 参与的组分 在DNA复制中的作用 ___________酶（体外用______代替） 打开氢键，解开DNA双链 DNA母链 提供DNA的复制的________ 4种____________ 合成子链的的原料 ______________酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物_______端开始连接脱氧核苷酸 解旋 高温 模板 脱氧核苷酸 DNA聚合 3’ 1.由于DNA两条链反向平行，但子链的合成方向必须从________到________，因此在DNA向某个方向解旋时，DNA两条链中只有一条链合成方向与解旋方向一致，能连续合成（称为前导链），另一条链合成方向与解旋方向不一致，不能连续合成（称为后随链）。 5’端 3’端 2.后随链上每一个片段称____________，合成结束后以____________酶相连。 3.不论前导链还是后随链，每个片段都需要____________，体内复制引物化学本质是____________，复制完成后会被切除并以DNA聚合酶填补空缺。 冈崎片段 DNA连接 引物 单链RNA 拓展：引物 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 子链延伸方向5’ 3’ PCR扩增的前提是： 根据一段已知目的基因两端的核苷酸序列合成引物（不需要知道整个目的基因的碱基序列） DNA两条链反向平行，碱基序列不同，需要两种引物分别与单链DNA模板结合 引物的作用：定位目的基因的位置，与模板连结合，并为子链的延伸提供起点。 为什么需要两种不同的引物？ 请为下列目的基因选择引物序列，并说出子链延伸的方向。 例题： 引物2：← 引物3：→ 9 【注意】 1.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要_________激活，因此，PCR反应___________中一般要添加。 2.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的______________。用于PCR的引物长度通常为___________个核苷酸。 3.DNA的两条链是_________平行的，为了明确地表示 DNA的方向，通常将DNA的羟基端（-OH）称为________端，而磷酸基团的末端称为_______端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从________端延伸DNA链，因此，DNA复制需要________。 4.当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的_________________延伸。 Mg2+ 缓冲溶液 短单链核酸 20~30 反向 3’ 5’ 3’ 引物 5’端向3’端 第1步：变性 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 当温度超过90℃时， 双链DNA解旋为单链。 95℃ PCR反应的过程 第一步：目的基因的筛选与获取 （1）变性的目的：_________________________________________。 DNA变性指DNA中___________________的过程， 解旋酶、高温均会引起DNA变性。 变性在一定温度范围内进行， 温度范围中点称为变性温度（Tm）， 不同DNA分子，Tm不同。 使双链DNA解旋为单链 氢键断裂，双螺旋打开 一 5 ′- 3 ′- -3 ′ -5 ′ 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第2步：复性 温度下降到50℃左右 50℃ 长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高 PCR反应的过程 第一步：目的基因的筛选与获取 （2）复性的目的：________________________________。 退火温度与引物Tm值有关（即与引物__________和__________有关）。 使引物通过碱基互补配对与模板链相结合 长度 GC含量 一 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 第3步：延伸 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 5 ′- -3 ′ -5 ′ 3 ′- 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 72℃ PCR反应的过程 第一步：目的基因的筛选与获取 一 第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。 5′- -3′ 3′- 5’ 3′- -5′ 5′- -3′ 5′- -3′ 3′- -5′ 5′- -3′ 3′- -5′ 5′- -3′ 3′- -5′ 5′- -3′ 3′- -5′ PCR反应的过程 第一步：目的基因的筛选与获取 一 第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 第一步：目的基因的筛选与获取 项目 数值以及调整 误差分析 变性温度 一般90~95℃，远超一般DNA的____________，保证DNA完全变性 变性温度过高或时间过长会影响________活性；温度过低变性不完全，都会降低产量 变性时间 20~30秒，不宜过长，防止影响_____活性 退火温度 一般是引物 变性温度 以下5~10℃，保证引物和模板充分结合，大多在50~60℃之间 退火温度过高，_____与_____不能结合，PCR无法继续，导致产物过_____；温度过低，会导致引物与模板的_______________，非目的基因增多。（电泳产物出现杂带）可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。 退火时间 一般30~60秒 延伸温度 一般72℃左右，Taq酶的____________ 延伸温度过高或过低，会导致Taq酶活性_______，降低效率；时间过短延伸不完全，出现非目标产物或产物减少 延伸时间 模板越长延伸时间越长，一般1kb模板需要1分钟 变性温度 Taq酶 Taq酶 引物 模板 少 非特异性结合 最适温度 下降 2.利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ 3次 1.变性、复性（退火）、延伸三个步骤为一个循环，一般PCR进行30~35个循环，当进行n个循环后，1个DNA分子扩增为________个。 2n 20 比较项目 体内DNA复制 PCR 不同点 解旋 利用_________酶 边解旋边复制 利用__________ 先解旋后复制 参与的酶 主要是___________和________ 还有DNA连接酶、引物酶等 ____________ 引物 单链________，由引物酶合成 不保留在复制的子链中 单链________，人工合成添加 保留在复制的子链中 温度 （人体）37℃ 不同步骤温度不同 连续性 __________________ 前导链连续，后随链不连续 均为连续复制 相同点 规律 都是半保留复制，遵循____________原则 原料和能量 dATP、________、________、________（统称dNTPs） 金属离子 需要________，作为DNA聚合酶的激活剂 模板 亲代DNA的____________ 子链合成方向 从5’端到3’端 解旋 高温 DNA聚合酶 解旋酶 Taq酶 RNA DNA 半不连续复制 碱基互补配对 dTTP dCTP dGTP Mg2+ 两条链 目的基因的筛选与获取 一 dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP 腺苷（A) 腺嘌呤 脱氧核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 【思考】用PCR可以扩增mRNA吗？ 不可以直接扩增mRNA， 需要将它逆转录成cDNA（complementary DNA）再进行扩增。 目的基因的筛选与获取 一 上述扩增可以在_________________中自动完成，实际上就是一台能够自动___________的仪器。完成以后，常采用_____________________来鉴定PCR产物。 PCR扩增仪（PCR仪） 调控温度 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增(PCR仪) DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向看与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 24 PCR实验操作过程 方法步骤 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 移液 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 PCR技术 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul 20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul 20umol/l 的引物I 2.5ul 20umol/l 的引物II 2.5ul H2O 28-33ul 1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U 模板DNA 5-10ul 总体积 50ul 注：模板DNA的用量为1pg-1ug DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 实际上是进行PCR反应的场所 PCR技术 目的基因的筛选与获取——体外PCR所需的基本条件 一 耐高温的DNA聚合酶 DNA模板 引物（2种） 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 dATP dGTP dCTP dTTP 配制反应体系时，需要用什么工具量取少量液体？ 微量移液器（移液枪） 为什么需要缓冲液？ 为DNA聚合酶提供合适的pH 三、方法步骤 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使______________ 。 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 940C，5min 30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min 最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，10min 移液 离心 扩增 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 PCR技术 反应液集中在离心管的底部 预变性和72℃左右总延伸的目的？ 增加模板DNA彻底变性的概率； 有利于充分延伸（防止延伸不完全） 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 电泳的原理： （1）许多生物大分子，都具有可解离的基团，在一定的___下，这些基团都会带上特定电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_______的电极移动，称为电泳。 （2）带负电的分子，电泳时向___________移动；带正电的分子，电泳时向___________移动。 （3）由于不同分子本身大小、形状、带电性质的差异，不同分子在电泳时迁移率（移动速率）不同，以此实现不同分子的分离。 （4）DNA电泳以琼脂糖作为支持介质，DNA在pH=8时带负电荷，所以在电泳中的移动方向是________________。DNA均为双螺旋结构，所以在DNA形状相同（如都是线形、或都是环形）的情况下，迁移率仅与分子大小__________（选填“正相关”或“负相关”）。 pH 相反 正极（阳极） 负极（阴极） 从负极到正极 负相关 根据待分离DNA片段的大小，用_____ 配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的____ 混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成_____ 。 方法步骤： 配制 琼脂糖溶液 制备 琼脂糖凝胶 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 电泳 核酸染料 加样孔 电泳缓冲液 根据待分离DNA片段的大小，用_____ 配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的____ 混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成_____ 。 方法步骤： 将扩增得到的PCR产物与_____________ 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的_____ 内。留一个加样孔加入指示分子大小的_________ 。 配制 琼脂糖溶液 制备 琼脂糖凝胶 加样 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 电泳 核酸染料 加样孔 电泳槽 电泳缓冲液 凝胶载样缓冲液（内含指示剂） 加样孔 标准参照物（Marker） 填充电泳槽 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入____ 内。将______ 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 电泳缓冲液 电泳 观察 接通电源，根据电泳槽____________ 来设定电压，一般为1～5V/cm。待_____ 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于_____ 观察和照相。 阳极至阴极之间的距离 紫外灯下 指示剂 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践·探究 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果） 一条条带 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 3.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 结果分析与评价 结果分析与评价 DNA片段的扩增及电泳鉴定 实践探究 漏加了PCR反应成分; 耐高温的DNA聚合酶失活; PCR程序设置不合理等 ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性； ②复性温度过低； ③模板DNA污染。 4.如果未出现条带，可能原因是什么？ 5.如果出现不止一条条带，可能原因是什么？ 拓展应用——PCR相关计算 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 第一次扩增 引物A 引物B 不等长的DNA____个 2 DNA总数____个 2 拓展应用——PCR相关计算 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 不等长的DNA____个 4 DNA总数____个 4 拓展应用——PCR相关计算 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链（等长）DNA______个 2 不等长的DNA____个 6 DNA总数____个 8 拓展应用——PCR相关计算 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 15 15 短链-短链（等长）DNA____个 8 DNA总数____个 16 不等长的DNA____个 8 拓展应用——PCR扩增DNA规律 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 不等长的DNA 短链-短链 （等长）DNA 含引物A(或B) 的DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 2 4 6 8 2n 聚合酶链式反应——过程归纳 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①子代DNA分子数为：___个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代含有的目的基因数目：_____个 ④子代DNA分子中含引物的DNA分子数为____个; 含引物A（或B）的DNA分子数为：____个, 同时含两种引物的DNA分子数______个; 共消耗引物的对数______个 ⑤复制过程中共需引物_______个 ⑥第n次复制需要引物______个 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n PCR扩增DNA规律 2n－2 2n－1 2n 拓展应用——PCR相关计算 Their application——PCR correlation calculation 图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为________。 15/16 2.利用PCR技术扩增目的基本因， 其原理与细胞内DNA复制类似。 【概念检测】 1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 (1) afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ） (2) 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ） (3) 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ） 练习与应用 教材P83 第四步：目的基因的检测与鉴定 √ × × 2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D 第四步：目的基因的检测与鉴定 【拓展应用】1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 练习与应用 教材P83 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 Lavf57.83.100 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $