2027届高考生物人教版一轮复习同步训练：基因工程的基本工具和基本操作程序

**基本信息** 聚焦基因工程工具与操作程序，以基础概念辨析和综合实验应用为核心，通过典型例题构建从工具特性到操作逻辑的知识体系，体现科学思维与探究实践素养。 **综合设计** |模块|题量/典例|题型特征|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基础强化练|7题（含限制酶、DNA提取等）|基础概念辨析与操作细节判断|从限制酶识别切割、DNA连接酶功能到载体构建基本要求，形成工具特性认知链| |综合提升练|3题（含高考题）|综合实验设计与方案分析|结合单/双酶切、基因表达载体筛选等，构建“工具选择-操作程序-结果分析”的应用逻辑链|

2027届高考生物人教版一轮复习同步训练：基因工程的基本工具和基本操作程序 姓名： 学号： 班级： 一、基础强化练 1.（2026·河南联考）下列是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（　　） 限制酶 识别序列及切割位点 HindⅡ 5′－GTY↓RAC－3′ AluⅠ 5′－AG↓CT－3′ BamHⅠ 5′－G↓GATCC－3′ Sau3AⅠ 5′－↓GATC－3′ A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团 B.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割 C.AluⅠ切割后的DNA片段可选用E.coliDNA连接酶连接 D.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割 2.（2026·四川内江一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A.可以选择新鲜洋葱、香蕉、菠菜或猪肝等作为实验材料 B.可利用DNA和蛋白质在酒精中溶解度差异初步分离DNA C.本实验需要设置对照组来排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 D.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别 3.（2026·山东青岛模拟）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（　　） A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B.若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C.如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D.表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 4.（2026·广东佛山模拟）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（　　） A.提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤 B.可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA C.琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀 D.若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧 5.（2026·湖北武汉模拟）油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是（　　） A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物 B.应在PCR扩增体系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶 C.可适当降低复性的温度，以减少电泳中非特异性条带的产生 D.用限制酶B处理目的基因后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子 6.（2026·福建泉州期中）科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入番茄细胞中，成功培育出抗冻番茄。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T－DNA的加工和转移，下列叙述正确的是（　　） A.构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒 B.利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列 C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上 D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的番茄细胞 7.（2026·江西南昌联考）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶（切割位点相同或不同均可）。几种基因工程中常用的限制酶如下表所示。下列叙述错误的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5′G↓CGC3′ GlaⅠ 5′GC↓GC3′ HhaⅠ 5′GCG↓C3′ HpaⅡ 5′C↓CGG3′ NarⅠ 5′GG↓CGCC3′ A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶，切出的黏性末端不同 B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后，其序列不能被GlaⅠ切割 C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割 D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16 二、综合提升练 8.（2026·江西萍乡月考）水杨酸加氧酶可催化石油污染物降解，该酶由bphA2cA1c基因编码。从鞘氨醇单胞菌属的B1菌株中获取bphA2cA1c基因后，与大肠杆菌质粒结合可构建基因表达载体，在该过程中使用限制酶切割DNA时存在“单酶切法”和“双酶切法”（如图）。在只考虑产物两两结合的情况下，下列相关叙述正确的是（　　） A.bphA2cA1c基因自连可能是“单酶切法”对应的最小产物 B.只有“双酶切法”才会使bphA2cA1c基因与质粒正确连接 C.“单酶切法”对应的产物种类少于“双酶切法”对应的产物种类 D.“双酶切法”后，bphA2cA1c基因就可表达出水杨酸加氧酶 9.（2026·山东聊城联考）酵母菌转录激活因子GAL4的BD部分负责与基因上游的激活序列（UAS）结合，GAL4的AD部分负责激活UAS下游基因的转录过程。只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能，其机制如图1。报告基因LacZ在酵母菌细胞内编码的酶可对无色底物Xgal进行切割并产生蓝色物质，使酵母菌菌落呈蓝色。将M基因与BD基因连接、N基因与AD基因连接，分别构建融合基因的表达载体（如图2）并导入酵母菌，可用于研究蛋白M和N的相互作用。下列分析正确的是（　　） A.融合蛋白BDM或融合蛋白ADN可单独激活报告基因表达 B.受体酵母菌是BD基因缺陷型或AD基因缺陷型酵母菌 C.需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内 D.若转基因酵母菌的菌落呈白色，则说明蛋白M和N相互结合 10.（2025·山东卷，25）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的TDNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　bp，则一定为正向重组质粒。  （2）为证明这两个突变体是TDNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有TDNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　 　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且TDNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。  （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。  答案：（1）复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550 （2）4　环化　测序和序列比对 （3）不能 2027届高考生物人教版一轮复习同步训练：基因工程的基本工具和基本操作程序 姓名： 学号： 班级： 一、基础强化练 1.（2026·河南联考）下列是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（　　） 限制酶 识别序列及切割位点 HindⅡ 5′－GTY↓RAC－3′ AluⅠ 5′－AG↓CT－3′ BamHⅠ 5′－G↓GATCC－3′ Sau3AⅠ 5′－↓GATC－3′ A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团 B.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割 C.AluⅠ切割后的DNA片段可选用E.coliDNA连接酶连接 D.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割 答案：A 解析：限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团；一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ；用AluⅠ切割得到的是平末端，E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远低于T4 DNA连接酶，因此应用T4 DNA连接酶连接AluⅠ切割后的DNA片段；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ仍可识别并切割重组片段。 2.（2026·四川内江一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A.可以选择新鲜洋葱、香蕉、菠菜或猪肝等作为实验材料 B.可利用DNA和蛋白质在酒精中溶解度差异初步分离DNA C.本实验需要设置对照组来排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 D.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别 答案：D 解析：可使用二苯胺试剂鉴定DNA的存在，但不能用于测定不同提取液中DNA的纯度差别。 3.（2026·山东青岛模拟）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（　　） A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B.若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C.如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D.表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 答案：B 解析：同尾酶识别的核苷酸序列不同，但是产生的黏性末端相同，因此用同尾酶切割载体和目的基因，可以产生相同的黏性末端而进行互补再次连接；要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中，转录形成的mRNA可与原基因转录的mRNA碱基互补配对，抑制该基因的翻译过程，从而使该基因表达量下降；由于DNA子链延伸时总是从5′端到3′端，如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物5′端末尾设计加入酶切位点；表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达。 4.（2026·广东佛山模拟）某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是（　　） A.提取DNA时，研磨后需用滤纸进行过滤 B.可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA C.琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀 D.若DNA带负电，则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧 答案：D 解析：研磨液需用纱布进行过滤，而不是用滤纸，以保证提取到更多的DNA；蛋白质可溶于酒精，而DNA不溶于酒精，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出；在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀；靠近加样孔的一端为负极，接通电源，带负电的DNA分子向正极移动而使DNA逐渐分离。 5.（2026·湖北武汉模拟）油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是（　　） A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物 B.应在PCR扩增体系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶 C.可适当降低复性的温度，以减少电泳中非特异性条带的产生 D.用限制酶B处理目的基因后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子 答案：B 解析：PCR引物一般是单链DNA；DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋；复性温度过低会导致引物与模板链非特异性结合，会增加电泳中非特异性条带；若该绿叶油菜为杂合子，则其含绿叶基因和黄化叶基因，绿叶基因不能被限制酶B切割，黄化叶基因被限制酶B酶切后产生2个片段，故应出现3条电泳条带。 6.（2026·福建泉州期中）科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入番茄细胞中，成功培育出抗冻番茄。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T－DNA的加工和转移，下列叙述正确的是（　　） A.构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒 B.利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列 C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上 D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的番茄细胞 答案：C 解析：Vir区的基因活化能促进T－DNA的加工和转移，使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，不能选限制酶Ⅱ；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列，并据此设计引物；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T－DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区基因活化可促进插入T－DNA中的抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上；卡那霉素抗性基因不在T－DNA序列中，为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞，最好在培养基中添加四环素，可以筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞。 7.（2026·江西南昌联考）同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶（切割位点相同或不同均可）。几种基因工程中常用的限制酶如下表所示。下列叙述错误的是（　　） 限制酶的名称 识别和切割位点 HinPⅡ 5′G↓CGC3′ GlaⅠ 5′GC↓GC3′ HhaⅠ 5′GCG↓C3′ HpaⅡ 5′C↓CGG3′ NarⅠ 5′GG↓CGCC3′ A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶，切出的黏性末端不同 B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后，其序列不能被GlaⅠ切割 C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割 D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16 答案：C 解析：同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶，HinPⅡ识别和切割位点是 5′G↓CGC3′，HhaⅠ识别和切割位点是5′GCG↓C3′，二者识别序列相同，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶，两者的切割位点不同，切出的黏性末端不同；HinPⅡ识别和切割位点是 5′G↓CGC3′，HpaⅡ识别和切割位点是5′C↓CGG3′，二者切割产物连接后的序列为 5′GCGG3′，GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′，说明连接后的5′GCGG3′序列不能被GlaⅠ识别和切割；HinPⅡ识别和切割位点是5′G↓CGC3′，NarⅠ识别和切割位点是 5′GG↓CGCC3′，HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为5′GCGCC3′，GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′，即该序列能被GlaⅠ识别和切割；GlaⅠ识别和切割位点是 5′GC↓GC3′，NarⅠ识别和切割位点是5′GG↓CGCC3′，在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16（因为在GlaⅠ识别位点基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点）。 二、综合提升练 8.（2026·江西萍乡月考）水杨酸加氧酶可催化石油污染物降解，该酶由bphA2cA1c基因编码。从鞘氨醇单胞菌属的B1菌株中获取bphA2cA1c基因后，与大肠杆菌质粒结合可构建基因表达载体，在该过程中使用限制酶切割DNA时存在“单酶切法”和“双酶切法”（如图）。在只考虑产物两两结合的情况下，下列相关叙述正确的是（　　） A.bphA2cA1c基因自连可能是“单酶切法”对应的最小产物 B.只有“双酶切法”才会使bphA2cA1c基因与质粒正确连接 C.“单酶切法”对应的产物种类少于“双酶切法”对应的产物种类 D.“双酶切法”后，bphA2cA1c基因就可表达出水杨酸加氧酶 答案：A 解析：使用“单酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒，获得的DNA片段末端是相同的，因此其两两结合产物有：目的基因自身连接物、质粒自身连接物、目的基因与质粒正向连接物和目的基因与质粒的反向连接物，而使用“双酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒，其两两结合产物通常只有目的基因与质粒的正向连接物。质粒的相对分子质量大于目的基因，因此bphA2cA1c基因自身连接可能是“单酶切法”对应的最小产物；将通过“双酶切法”得到的含bphA2cA1c基因的重组质粒导入受体菌，才可能表达出水杨酸加氧酶。 9.（2026·山东聊城联考）酵母菌转录激活因子GAL4的BD部分负责与基因上游的激活序列（UAS）结合，GAL4的AD部分负责激活UAS下游基因的转录过程。只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能，其机制如图1。报告基因LacZ在酵母菌细胞内编码的酶可对无色底物Xgal进行切割并产生蓝色物质，使酵母菌菌落呈蓝色。将M基因与BD基因连接、N基因与AD基因连接，分别构建融合基因的表达载体（如图2）并导入酵母菌，可用于研究蛋白M和N的相互作用。下列分析正确的是（　　） A.融合蛋白BDM或融合蛋白ADN可单独激活报告基因表达 B.受体酵母菌是BD基因缺陷型或AD基因缺陷型酵母菌 C.需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内 D.若转基因酵母菌的菌落呈白色，则说明蛋白M和N相互结合 答案：C 解析：已知只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能，融合蛋白BDM或融合蛋白ADN不能单独激活报告基因表达；受体酵母菌应是BD基因和AD基因共同缺陷型，若只有一种基因缺陷，则导入外源的BDM或ADN可能会驱动报告基因的表达，不能用于研究蛋白M和蛋白N的相互作用；需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内，若蛋白M和N能够相互结合，则BD蛋白和AD蛋白可以接近，能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈蓝色，若蛋白M和N不能相互结合，则BD蛋白和AD蛋白无法接近，不能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈白色。 10.（2025·山东卷，25）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的TDNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　bp，则一定为正向重组质粒。  （2）为证明这两个突变体是TDNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有TDNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　 　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且TDNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。  （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。  答案：（1）复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550 （2）4　环化　测序和序列比对 （3）不能 解析：（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向连接也可以反向连接，且无法区分，为了确定是否为正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂基因需要插入启动子和终止子之间，因此不能选择BamHⅠ，因为该限制酶会破坏终止子，若选PstⅠ则无法补齐酶切后的黏性末端，因此只能选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切，XbaⅠ酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的TDNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板的3′端→5′端，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后电泳结果呈现一长一短2条带，若正向连接，较短的条带长度近似为550 bp，若反向连接，较短的条带长度近似为200 bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基对的限制酶，原因是识别序列越短，其特异性越低，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否属于同一个基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此需测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 高三生物学同步训练 第1页（共1页） 学科网（北京）股份有限公司 $