2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和基本操作程序

该高中生物学高考复习导学案系统覆盖基因工程的基本工具（限制酶、DNA连接酶、载体）、基本操作程序（目的基因获取等四步）及DNA提取鉴定、PCR扩增电泳等核心考点，按考点分层次梳理知识，通过细读教材、判断正误等问题导向设计，引导学生自主构建逻辑清晰的知识网络。 亮点在于自主诊断与科学思维、探究实践素养培养，如设置判断正误自测、核心考向真题演练（2025年广东卷等题目），实验活动指导DNA提取与PCR操作。每个模块配有归纳总结和课堂训练，助力学生自主诊断提升，教师可依学情精准指导，支持因材施教。

2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和基本操作程序 姓名： 学号： 班级： 课标 要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 3.活动：DNA的提取和鉴定。 4.活动：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 考情 分析 1.重组DNA技术的基本工具 2025·江苏卷，19；2024·江西卷，12；2023·新课标卷，6 2.基因工程的基本操作程序 2025·广东卷，7；2025·安徽卷，15、20；2025·陕晋青宁卷，21；2025·山东卷，25；2025·浙江1月选考，24；2025·甘肃卷，21；2024·广东卷，21；2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，21；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·山东卷，25；2024·黑吉辽卷，25；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，20 3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽卷，14；2024·河北卷，13；2024·山东卷，13；2023·广东卷，11 4.DNA片段的扩增及电泳鉴定 2025·江苏卷，23；2025·全国卷，6；2024·浙江6月选考，20；2024·江西卷，19；2024·黑吉辽卷，7；2023·江苏卷，22 考点一　基因工程的基本工具 1.基因工程的概念 2.基因工程的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（也称“限制酶”）。 细读教材 1.（选择性必修3 P71正文拓展）将一个基因从DNA分子上切割下来需要切割两处，同时产生四个黏性末端或平末端。 2.（选择性必修3 P71正文拓展）限制酶主要来源于原核生物，不能切割自身的DNA分子的原因可能是限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列，或其识别序列已被修饰。 （2）DNA连接酶。 细读教材 3.（选择性必修3 P72正文拓展）DNA连接酶和DNA聚合酶功能的区别是DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上；DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 （3）载体。 【判断正误】 （1）（2024·贵州卷，13）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。（　　） 答案：√ （2）（2021·辽宁卷，3）基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。（　　） 答案：× 提示：基因工程中常用农杆菌转化植物细胞，农杆菌的特点是其细胞内的Ti质粒上的T－DNA片段能够转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，噬菌体一般用于细菌的转化。 （3）（经典高考题）一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。（　　） 答案：√ （4）（经典高考题）限制性内切核酸酶能识别和切割RNA。（　　） 答案：× 提示：限制性内切核酸酶只能识别和切割DNA，不能识别和切割RNA。 （5）（经典高考题）限制性内切核酸酶可从原核生物中提取。（　　） 答案：√ 核心考向 考向1　分析基因工程的基本工具，考查科学思维 1.（2024·湖南卷，5）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案：B 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶；酶切条件不合适可能使酶失活，无法发挥作用，应调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。 2.（2026·湖北名校调研）如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶，且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是（　　） A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0和1个游离的磷酸基团 B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞 C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和含bar基因的DNA片段，确保目的基因正确插入 D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白 答案：C 解析：质粒为环状DNA，切割前没有游离的磷酸基团，切割后形成线性DNA，含2个游离的磷酸基团；基因工程的核心是构建基因表达载体；用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化及与目的基因反向连接；应用抗原—抗体杂交法来检测bar基因是否翻译出相应蛋白质。 考点二　基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）筛选合适的目的基因。 ①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。 ②筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 （2）利用PCR获取和扩增目的基因。 ①原理：DNA半保留复制。 ②条件。 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外 用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧 核苷酸 合成DNA子链的原料 耐高温的 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 ③过程。 ④结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着循环次数的增多，DNA分子以指数形式增加。 细读教材 1.（选择性必修3 P78～79图3－5拓展）PCR反应过程中，引物非常关键。PCR技术需要引物是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从DNA链的3′端延伸DNA链；利用PCR技术扩增目的基因时，需要两种引物的原因是目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 （1）构建基因表达载体的目的。 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成。 提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较 项目 启动子 终止子 起始 密码子 终止 密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因 上游 目的基因 下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（正常情况下，不编码氨基酸） （3）基因表达载体的构建过程。 2.（选择性必修3 P80图3－6拓展）重组DNA分子中标记基因的作用是将含目的基因的细胞筛选出来。 3.（选择性必修3 P80图3－6拓展）在构建基因表达载体时，目的基因的序列中不能含有用到的限制酶的识别序列，原因是防止目的基因被限制酶破坏。 3.将目的基因导入受体细胞 提醒　农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 细读教材 4.（选择性必修3 P81资料卡拓展）在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是Ti质粒上的T－DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。 4.目的基因的检测与鉴定 【判断正误】 （1）（2025·河北卷，2）PCR过程中DNA双链的解旋需要酶的催化。（　　） 答案：× 提示：PCR过程中DNA双链的解旋是通过高温实现的，不需要酶来解旋。 （2）（经典高考题）载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达。（　　） 答案：× 提示：载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞，但不能促进目的基因的表达。 （3）（经典高考题）设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。（　　） 答案：× 提示：设计扩增目的基因的引物时要考虑表达载体相关序列，从而保证目的基因能与表达载体相连接及正常表达。 （4）（经典高考题）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。（　　） 答案：× 提示：载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。 （5）（经典高考题）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。（　　） 答案：√ 【情境·思维·深析】 胰岛素促进因子（PDX－1）能诱导干细胞分化为胰岛B细胞，为糖尿病的治疗提供了新的思路。科研人员欲构建PDX－1基因的克隆载体用于诱导干细胞分化。回答下列问题。 （1）cDNA的合成：从基因文库中检索小鼠PDX－1基因的mRNA序列，设计上下游引物并在引物的5′端分别添加HindⅢ和BamHⅠ限制酶切割序列。以提取的RNA为模板进行逆转录，为防止RNA被水解，需要在逆转录体系中加入RNA酶抑制剂。然后进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳。 （2）克隆载体的构建：回收凝胶中目的基因片段，并进行纯化。选用的克隆载体结构如图所示，其中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X－gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。用限制酶HindⅢ和BamHⅠ、DNA连接（或限制酶、DNA连接）酶将cDNA纯化物与该克隆载体连接形成重组DNA分子。重组的效率除了与温度、pH等外界环境因素有关，还与酶的浓度、载体和目的基因的浓度及比例（答出1点即可）等有关。将重组DNA分子导入用氯化钙处理过的感受态大肠杆菌中进行转化，将转化后的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素和X－gal的固体培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，其中白色菌落为阳性克隆。 （3）科研人员将含有PDX－1基因的腺病毒载体转染人的干细胞，使其分化为胰岛B细胞，该过程中胰岛素基因得到了表达。该细胞可用于治疗由胰岛素缺乏引起的糖尿病。 核心考向 考向2　通过分析具体情境中PCR的条件及过程，考查科学思维 3.（2025·广东卷，7）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（　　） A.1′－碱基 B.2′－氢 C.3′－羟基 D.5′－磷酸基团 答案：C 解析：DNA复制时，子链延伸的方向是从5′端到3′端，即下一个脱氧核糖核苷酸的 5′－磷酸基团与上一个脱氧核糖核苷酸的3′－羟基进行连接，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3′－羟基。 4.（2026·江苏如皋调研）如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（　　） A.DNA体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP B.PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2＋可用于激活DNA聚合酶 C.②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 D.引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 答案：B 解析：体内DNA复制过程中解旋由ATP提供能量，体外DNA复制（PCR）过程中解旋加热提供能量；PCR过程中需要添加缓冲液，缓冲液中的Mg2＋可用于激活耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）；根据DNA两条链反向平行的特点，结合图中引物的方向可知，②链从L到R的方向为5′→3′；引物③的5′端添加了某序列，经过第1次循环，得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列，经过第2次循环，得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列，所以至少需经2次循环可获得该序列的双链产物。 归纳总结 PCR技术和体内DNA复制的比较 考向3　通过分析基因工程的基本操作，考查科学思维 5.（2025·福建卷，10）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（　　） A.农杆菌转化前应先使用Ca2＋处理烟草细胞 B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 答案：A 解析：利用含重组Ti质粒的农杆菌转化烟草细胞前，不需要使用Ca2＋处理烟草细胞；利用农杆菌转化植物细胞时，农杆菌中重组Ti质粒上的含紫杉醇合成相关基因的T－DNA能转移到烟草细胞中，并将相关基因整合到烟草细胞的染色体DNA上；由题干可知，紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，从而影响肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤细胞增殖，起到抗癌作用；生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，会破坏红豆杉植物资源，而利用转基因烟草合成紫杉醇的前体物质用于生产紫杉醇，有利于红豆杉天然资源的保护。 6.（2025·陕晋青宁卷，21）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与 其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ NdeⅠ XhoⅠ EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ XbaⅠ （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。  （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的　　　　（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－　　　　　　　　 －3′，切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　，抗性基因 　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  答案：（1）4种脱氧核苷酸　延伸 （2）5′端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ （3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上　2　再分化 解析：（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 （2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列，而 S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列，要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体，又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知，需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用能与BamHⅠ产生相同黏性末端的BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′－AGATCT－3′。 （3）T－DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上，抗性基因1位于T－DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T－DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 归纳总结 1.根据质粒的特点确定限制酶的种类 2.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取（设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ），分析如下： 考点三　活动：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定 （1）基本原理。 （2）操作流程。 细读教材 1.（选择性必修3 P74～75探究·实践拓展）过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是DNA会吸附在滤纸上，影响提取DNA的量。 提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 ②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）实验基础。 ①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 （2）PCR实验操作步骤。 （3）DNA的电泳鉴定。 细读教材 2.（选择性必修3 P84～85探究·实践拓展）如果电泳鉴定结果未出现扩增条带，可能的原因有模板DNA含有蛋白质杂质或Taq DNA聚合酶的抑制剂；Taq DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2＋浓度过低；变性温度低，变性时间短等。 【判断正误】 （1）（2025·四川卷，5）土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色。（　　） 答案：× 提示：DNA不溶于酒精，在沸水加热条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈蓝色。 （2）（2025·湖南卷，2）DNA的粗提取与鉴定实验中，可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。（　　） 答案：× 提示：猪是哺乳动物，猪成熟红细胞没有细胞核，几乎不含DNA，因此不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验。 （3）（2024·河北卷，13）配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。（　　） 答案：× 提示：PCR过程中，应加入4种脱氧核糖核苷酸作为PCR扩增原料。 （4）（2022·山东卷，13）粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。（　　） 答案：√ 核心考向 考向4　围绕实验基本操作及注意事项，考查科学探究 7.（2024·安徽卷，14）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案：D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可初步分离DNA；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，该原理可用于纯化DNA粗提物；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA。 8.（2025·全国卷，6）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（　　） A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 答案：D 解析：配制琼脂糖凝胶时需选用适当缓冲溶液，以维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常移动；电泳时，甲、乙均向“＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷；电泳中，DNA分子的迁移速率与其分子大小、构象等有关，甲、乙电泳条带位置虽然相同，但碱基对的数量可能不同；甲只有限制酶R的一个酶切位点，已知样品3和4中有一个是甲的酶切产物，说明甲被酶R完全酶切后得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基对比甲要少，电泳时移动速度更快，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物。 9.（2025·江苏卷，23节选）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题。 （1）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①　　　　，加入乙醇  ②　　　　　  在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2＋缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR  （2）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如下图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有　　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用　　　　　　　　　　　　　的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。  注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基，“……”表示省略200个碱基。 答案：（1）上清液　溶解DNA　4种脱氧核苷酸（或dNTP）、耐高温的DNA聚合酶 （2）互补配对　植物丁　丙、丁　叶绿体基因组中其他DNA片段 解析：（1）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程为释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取上清液，再加入乙醇（DNA不溶于酒精）→溶解DNA：在沉淀物中加入纯水→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2＋缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 （2）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如题图所示，因此能检出的样本是植物丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有3种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体基因组中其他DNA片段的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。 课堂训练 1.（2024·山东卷，13）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案：A 解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变；仅设置一个对照组即可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰。 2.（2024·黑吉辽卷，7）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（　　） A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案：A 解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的； 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，其不会与DNA结合，不能用于指示DNA分子的具体位置；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移，同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢；琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 3.（2025·福建卷，15）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（　　） A.DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B.可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C.泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D.泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 答案：C 解析：DNA分子因含磷酸基团在电泳缓冲液中带负电荷，在电场作用下DNA分子由电源负极向电源正极移动；P质粒有2个EcoRⅠ限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知泳道③条带是EcoRⅠ限制酶单酶切产物，而泳道③只有一条条带，由此可以推出EcoRⅠ的两个酶切位点大致平分质粒P，泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物；泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物，BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，结合泳道③条带可推出，泳道⑦条带是EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切产物，泳道⑤条带是EcoRⅠ和SacⅠ的双酶切产物，泳道⑥条带为SacⅠ和BamHⅠ的双酶切产物；限制酶只水解磷酸二酯键，酶切后的质粒碱基数不会改变。 4.用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中生长的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 答案：D 解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，目的基因有正向连接和反向连接两种连接形式，因此转录的产物可能不同；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中生长的菌落，不一定含有目的基因；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落。 5.（2025·广东卷，21）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题。 （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C－末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及　　　　检测，筛选获得重组菌株W1。  （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有　　　　　 　　　　　 　　（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是　 　　　　　　　　　　 　 　。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是   　。  （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为  　。  （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：    　。  答案： （1）荧光 （2）稀释涂布平板法、显微镜直接计数法　排除培养基本身荧光对实验结果的干扰　PGeo在生长稳定期停止基因转录，且C－末端带有SsrA短肽的mKate2被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解 （3）快速生长期荧光强度较弱，生长稳定期快速增加后保持稳定 （4）将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换成酶A基因，并将上述两种质粒导入敲除酶B基因的野生型大肠杆菌中 解析：（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用PCR检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录，由于目的基因能表达出红色荧光蛋白，故还可对菌落进行荧光检测以判断目的基因是否表达出相应的蛋白质。 （2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰。进入生长稳定期后，由于PGeo在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，且C－末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解，导致荧光强度快速下降。 （3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期，细胞处于快速生长阶段，阻遏蛋白X的量相对充足，PX启动子受到较高程度的抑制，合成的mKate2较少，使荧光强度上升不明显；随着培养的进行，阻遏蛋白X的合成减少降解增多，对PX启动子的阻遏作用减弱，mKate2转录，荧光强度快速增加，并趋于稳定。 （4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，需满足以下条件。条件1：为了保证细胞正常生长，必须保证酶A和酶B在快速生长期都正常。条件2：为了在生长稳定期有大量莽草酸，需要使酶A增加、酶B减少。为满足条件2，野生型大肠杆菌应无法产生酶B，故敲除野生型大肠杆菌的酶B基因。为保证细胞生长，可以将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因，保障快速生长期酶B的供应，也能满足稳定生长期酶B减少的要求。将质粒②中的mKate2基因替换成酶A基因，使酶A基因在稳定生长期大量表达，这样能在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。 高三生物学导学案 第2页（共2页） 学科网（北京）股份有限公司 $