2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和操作程序

该高中生物学高考复习导学案系统梳理了基因工程的基本工具（限制酶、DNA连接酶、载体）和操作程序（目的基因获取、表达载体构建、导入受体细胞、检测鉴定），按工具特性与操作逻辑构建知识网络，通过抗虫植物培育示意图分析、限制酶表格与质粒图结合等问题导向设计，引导学生自主推导步骤关联与工具作用，形成系统认知框架。 亮点在于自主诊断与科学思维培养，如“亮考帮”模块让学生总结核心知识点、自主出题自测并记录疑惑，活动方案中双酶切优点分析、重组质粒构建情境问题等任务，培养基于证据的逻辑推理能力。课堂训练含真题演练（如2025南京月考、2026南通开学考），帮助学生精准定位薄弱点，教师可通过学生疑惑记录实现因材施教，提升备考实效。

2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和操作程序 学习目标 1.概述基因工程的基本原理。2.概述基因工程的一般步骤。 核心体系 活动方案 活动一 概述基因工程操作过程 下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，请回答下列问题。 （1）请写出基因工程操作的基本步骤。 （2）获取目的基因的一般方法有哪些？ （3）②的构建需要哪些酶的参与？限制酶主要来源于原核生物，但限制酶不能切割自身所在原核生物的DNA分子，为什么？DNA连接酶和DNA聚合酶作用有什么不同？从④→⑤采用的是什么技术？ （4）将目的基因导入受体细胞通常有哪些方法？图示农杆菌转化法，目的基因（抗虫基因）需要插入Ti质粒的什么部位？原因是什么？ （5）检测抗虫基因是否转移到植物细胞中以及检测抗虫基因是否能转录的方法是什么？检测抗虫基因是否能翻译的方法是什么？检测植物能否表现出抗虫性状的方法是什么？ 活动二 回顾基因工程中工具酶的使用 下表是四种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。 限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ Hind Ⅲ 识别序列及 切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GATC CTAG↑ A↓AGCTT TTCGA↑A 图1 图2 （1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有哪些？作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有哪些条件？ （2）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用哪两种限制酶切割？ （3）与单酶切相比，双酶切的优点是什么？ （4）质粒中四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？ （5）酶切后的载体和目的基因片段，通过什么酶作用后获得重组质粒？此酶作用于什么化学键？此酶通常有哪两类，区别是什么？ （6）将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用Sau3A Ⅰ（BamHⅠ与Sau3AⅠ酶来源不同，识别序列也不同，但是切割后可以产生相同的游离单链黏性末端）酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化，被转化的大肠杆菌有哪三种？ （7）平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中的哪两个？ （8）若用Sau3AⅠ切图1质粒，最多可能获得几种大小不同的DNA片段？ 活动三 认同基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题。 （1）构建基因表达载体的目的是？如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是什么？ （2）含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也不能区分的原因是什么？ （3）在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需在固体培养基中添加什么物质？ （4）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自哪里？ （5）若受体细胞是原核生物，来自真核生物的目的基因通常来源于PCR技术还是RT-PCR技术？ 课堂训练 1. 下列与生物工程中有关酶的说法，正确的是（　　） A.胰蛋白酶和胃蛋白酶都能用于制备细胞悬液 B.DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成 C.逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板 D.限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键 2. [2025南京月考]下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是（　　） A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开 B.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小 C.序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同 D.T4 DNA连接酶不能催化黏性末端的连接 3. [2025盐城五校联考]基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是（　　） A.载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞 B.载体能协助目的基因在受体细胞中稳定存在 C.载体含有启动子和终止子协助目的基因表达 D.载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割” 4. [2026南通如皋开学考]图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的是（　　） A.基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性 B.两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coli DNA连接酶连接 C.Hind Ⅲ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂 D.产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定 5. [2026苏州中学月考]一种新型DNA聚合酶可耐受92 ℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是（　　） A.这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸 B.当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应 C.为维持较高的催化活性，适宜在70 ℃～75 ℃下保存 D.对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性 6. 用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段（限制酶在对应切点一定能切开），酶切位点及酶切产物分离结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） 图1　酶切位点图 图2　电泳结果示意图 A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B.图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键 C.图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物 D.用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到7种产物 7. [2025徐州期末]下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是（　　） A.若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列 B.扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成 C.利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞 D.为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组 8. （多选）[2024连云港赣榆高中检测]图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中TetR是四环素抗性基因、AmpR是氨苄青霉素抗性基因。图2为重组质粒，甲、乙、丙为3种引物所在的相应位置。下列有关叙述错误的有（　　） 图1 图2 A.质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接 B.质粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA连接酶的作用下形成重组质粒 C.若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3 D.用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒，选择引物甲和丙最合适 9. [2026四川绵阳南山中学开学考]卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。请回答下列问题。 （1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是________________ _____________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 （2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是________________________________。 注：限制酶的识别序列和切割位点如下： 图1 （3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是________________________________________________________________， 随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 （4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2 所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_______________________。 图2 亮考帮 一、亮闪闪 本节课我掌握了 核心知识点，理清了 的解题逻辑；通过课堂小组讨论，学会了用 思路分析题型，纠正了之前混淆的概念，整体搭建起本节知识框架，这是我本节课最大的收获。 二、考考你 我出一道思考题： 解答： 出题后自测发现，这类题型的 步骤容易粗心出错，后续做题要重点留意。 三、帮帮我 我存在的疑惑： 1. 知识点的原理没有完全理解； 2.遇到 类题目不知道怎么切入解题； 3. 概念容易和之前学的内容弄混，希望课堂互助环节可以和同学探讨。 参考答案 活动方案 活动一 （1） 获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （2） 从基因文库中获取、人工合成法。 （3） 限制性内切核酸酶、DNA连接酶。 自身所在原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶催化游离的单个脱氧核苷酸连接到子链3′端。植物组织培养。 （4） 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法；导入动物细胞：显微注射法；导入微生物：感受态转化法（Ca2+处理法）。T-DNA内部。只有T-DNA能转移并整合到植物细胞染色体组中。 （5） PCR等技术。抗原—抗体杂交。抗虫接种试验。 活动二　 （1） 能够自我复制、具有标记基因、具有一个或多个限制酶切割位点。启动子和终止子。 （2） BclⅠ和Hind Ⅲ。 （3） 可保证插入外源片段的方向，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。 （4） 作为标记基因，用于阳性筛选。 （5） DNA连接酶。磷酸二酯键。E.coli DNA连接酶，只能催化黏性末端连接；T4 DNA连接酶，可催化黏性末端或平末端的连接。 （6） 分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 （7）引物甲和引物丙。 （8）7种。 活动三 （1） 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且目的基因能够表达和发挥作用。二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长。 （2） 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。 （3） 四环素。 （4） 受体细胞。 （5） RT-PCR技术。 归纳： 与DNA有关的酶 酶 作用 作用相关“键” 限制酶 切割DNA片段，产生两个（具有相同黏性末端或平末端）DNA片段 破坏磷酸二酯键 DNA 连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链 破坏氢键（非化学键） DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键 DNA（水解）酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键 课堂训练 1 B 2 C　限制酶切割DNA双链时，每个切口会断开2个磷酸二酯键（双链各1个），若获得一个外源基因需切两次产生两个切口，则共断开4个磷酸二酯键，A错误；限制酶识别序列越短，可能的组合数越少，因此短序列在DNA中出现的概率更大，B错误；序列—C↓ATG—被切割后，黏性末端为2个碱基，而—G↓GATCC—被切割后，黏性末端为4个碱基，两者碱基数不同，C正确；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，D错误。 3 D　载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，A正确；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，D错误。 4 D　突变是不定向的，具有可逆性，A错误；E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低于T4 DNA连接酶，而AluⅠ限制酶切割DNA形成的是平末端，应该用T4 DNA连接酶，B错误；HindⅢ切割基因A时，破坏的是磷酸二酯键，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 5 D　DNA聚合酶的本质是蛋白质，其基本单位为氨基酸，A错误；DNA聚合酶催化反应需模板DNA、引物及脱氧核苷酸，仅模板和底物无法启动反应，B错误；酶保存通常需低温（如4 ℃）以维持活性，高温保存会破坏酶结构，即使耐高温酶长期保存仍需低温，C错误；通过突变特定氨基酸位点可优化酶结构域稳定性，如糖基化修饰以提升耐热性，进一步突变可能增强特性，D正确。 6 D 7 C　成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，A正确；在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成，B正确；导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞通常是受精卵，C错误；要使目的基因在乳腺细胞中表达，需要在目的基因的上游加上乳腺蛋白基因的启动子，D正确。 8 BCD　质粒P1经“酶处理”后由平末端转变成黏性末端，黏性末端游离，易与互补末端碰撞，因此能提高目的基因片段和质粒的连接效率，A正确；质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，不需要DNA聚合酶，B错误；图示的质粒均含有抗氨苄青霉素的基因，因此，若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能说明成功导入了重组质粒P3，C错误；用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，选择引物乙和丙即可，因为PCR扩增的DNA片段是引物之间的序列，扩增乙和丙之间的序列就包含了目的基因，D错误。 9 （1） 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释 （2） BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 （3） 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 （4） 44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 解析：（2） E．coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连，甚至目的基因倒接的情况，因此切割质粒时，SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，但由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。（3） 由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。（4） 据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 2027届高考生物人教版一轮复习导学案 第1页（共1页） 学科网（北京）股份有限公司 $