第42讲 微生物的培养技术和应用（2大核心速记+3层高分专练）（专项训练）（天津专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

**基本信息** 以天津考情为导向，构建“考情-核心-专练”三维体系，系统提炼无菌技术、接种计数等方法，逻辑串联培养基类型-操作流程-应用情境，强化科学思维与探究实践。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |五年考情·精准定向|考情分析+备考策略|考情定位与高频考点突破|新课标要求-考频-命题情境的考向关联| |两大核心·主干速记|2大核心+操作要点|无菌技术逻辑、接种方法差异、计数公式及误差分析|培养基类型-无菌操作-纯培养-选择计数的原理递进| |分层专练·靶向攻关|3类层级+多情境题|实验异常分析、数据计算、跨模块综合应用|基础操作-重难情境-高考真题的能力梯度提升|

第42讲 微生物的培养技术和应用 （天津专用） 第1部分 五年考情·精准定向 第2部分 两大核心·主干速记 核心1 微生物的基本培养技术 核心2 微生物的选择培养和计数 第3部分 分层专练·靶向攻关 天津专练+全国视野 两年模拟·基础通关 & 一年重难·情境应用 & 高考真题·考向感知 五年考情·精准定向 考情概览 新课标要求 1.通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌菌落。 2.分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数。 考情分析： 1．考查频次：2021—2025五年持续高频必考，隶属于发酵工程大模块。常规1道选择题（4分），2022、2024、2025三年嵌入非选择大题填空，分值4–10分；无菌操作、微生物计数为每年固定落点，属于生物技术工程板块核心得分点。 2．考查要点：①基础培养：培养基四大营养成分、固体 / 液体培养基差异，灭菌与消毒的区分及适用对象； ②接种与纯化：平板划线法、稀释涂布平板法操作区别，涂布法活菌计数计算与误差分析； ③筛选应用：选择培养基原理，土壤目的菌分离流程，培养条件控制、菌落观察与菌种保藏； ④关联延伸：对接工业发酵、杂菌污染防控、传统发酵菌种纯化。 3．命题情境： 实验室实操情境：培养基配制、倒平板、接种操作正误判断； 环境科研情境：土壤降解污染物菌株、固氮菌、耐药菌筛选实验； 工业生产情境：抗生素、氨基酸工程菌的扩大培养与菌种纯化； 图表数据情境：菌落统计表格、培养温度 / 氧气梯度曲线图分析。 备考策略 1．抓牢核心点：吃透无菌技术整套逻辑；牢牢掌握两种接种方法功能差异，死记稀释涂布平板计数公式及 30–300 菌落取值范围；理解选择培养基 “唯一碳源/氮源”筛选本质。 2．熟记关键点：汇总易混易错点：灭菌vs消毒、划线法不可计数、培养皿倒置原因、计数结果偏大偏小原因；专项训练流程图拆解、数据计算、实验异常结果分析，规范专业术语答题表述。 3．紧扣命题趋势：顺应天津卷跨模块综合特点，强化微生物培养 + 基因工程改造工程菌的联动题型；侧重陌生科研新情境的知识迁移；加大实验设计、变量控制、条件优化类探究题训练，提升图表信息提取与定量计算能力。 两大核心·主干速记 核心1 微生物的基本培养技术 一、培养基的配制 1、培养基的概念、用途和类型 概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。 用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 培养基的种类（按物理性质分） 培养基种类 培养基特点 作用 固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种 半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定 液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养 2、培养基的配方 主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。 其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。如表： 微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物 特殊需求 添加维生素 一般pH调至酸性 一般pH调至中性或弱碱性 无氧 二、无菌技术 1、目的：获得纯净的微生物培养物。 2、关键：防止杂菌污染。 3、常用方法：灭菌和消毒。 常用方法 消毒 灭菌 所属范畴 无菌技术 无菌技术 处理条件 较为温和的物理、化学或生物等方法 强烈的理化方法 处理结果 杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子） 杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子） 实质（相同点） 消毒和灭菌的实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性 消毒和灭菌的实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性 4、无菌技术的主要方法及适用对象 操作对象 处理措施 主要方法 培养基 灭菌 湿热灭菌 接种环 灭菌 灼烧灭菌 操作者双手 消毒 化学药物消毒 培养皿 灭菌 干热灭菌 无菌室 消毒 紫外线消毒 牛奶 消毒 巴氏消毒 5、注意事项 1）实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；2）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 特别提醒！ 选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。 三、微生物的纯培养概念辨析 概念 定义 培养物 接种于培养基内在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体 纯培养物 由单一个体繁殖获得的微生物群体 菌落 分散微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体 纯培养 获得纯培养物的过程 四、纯培养的过程（以酵母菌为例） 1、制备培养基 1）配制培养基：称取 → 煮沸 → 过滤 → 加葡萄糖、琼脂 → 定容 2）灭菌：湿热灭菌法 3）倒平板： a、培养基冷却至 50 ℃ 左右开始倒平板，温度过高会烫手，过低培养基会凝固 b、防止瓶口上的微生物污染培养基； c、用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免培养基被污染； d、平板倒置既可防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以防止培养基中的水分过快蒸发。 2、接种和分离 平板划线法分离酵母菌的原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 3、培养 未接种平板和接种平板倒置，28 ℃ 恒温培养箱培养 24-48 h。 （未接种平板）可判断培养基是否被污染。 4、结果分析 1）未接种培养基表面是否有菌落生长（可判断是否被污染）； 2）接种的培养基表面是否出现单菌落，菌落颜色、形状和大小是否一致，是否符合微生物特征； 3）若培养基表面出现了其他菌落，可能由哪些原因引起。 五、分析微生物平板划线和培养的具体操作 微生物平板划线和培养的具体操作如图所示： 1、图中①～⑧不正确的操作及其原因分别是什么？②拔出棉塞后完全握住棉塞会造成杂菌污染，应握住棉塞上部；⑥划线时不能将培养皿完全打开，应在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖；⑦划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧平板应倒置培养。 2、在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。 3、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。 高分攻略！ 平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的 ① 第一次划线前灼烧 · 目的：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。 ② 每次划线前灼烧 · 目的：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端。 ③ 最后一次划线结束后灼烧 · 目的：杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者。 核心2 微生物的选择培养和计数 一、区分选择培养基与鉴别培养基 种类 特点 用途 举例 选择 培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 从众多微生物中分离所需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基分离得到尿素分解菌 鉴别 培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 特别提醒！　常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。 二、微生物的选择培养和数量测定 1、稀释涂布平板法步骤 ①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。 操作步骤： ②涂布平板操作步骤 取菌液 操作说明：取 0.1 mL 菌液，滴加到培养基表面。 涂布器消毒 操作说明：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 涂布器灭菌 操作说明：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 涂布平板 操作说明：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 2、微生物的数量测定方法 ①显微镜直接计数法 原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 方法：用细菌计数板或血细胞计数板计数。 缺点：不能区分死菌与活菌而使计数结果偏大。 特别提醒！　 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 ②活菌计数法 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 减小误差： 一般选择菌落数为 30-300 的平板进行计数；在同一稀释度下，应至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值。 统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 1、实验原理 分离原理 ① 土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶； ② 配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌。 2、实验流程 ① 土壤取样：从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样，先铲去表层土，取距地表 3-8 cm 的土壤层。 ② 样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300的平板进行计数。 ③ 微生物的培养与观察： · a. 接种：用稀释涂布平板法接种。 · b. 培养条件：30-37 ℃ 培养 1~2 天。 · c. 观察：根据菌落的特征区分微生物。 · d. 计数：每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 ④ 计算：计算单位体积内的菌体数。 3、实验结果分析与评价－－微生物培养实验评价指标 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 ➔ 未被杂菌污染 对照的培养皿中有菌落生长 ➔ 被杂菌污染 培养基是否具有筛选作用 选择培养基上的菌落数目远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 ➔ 选择培养基具有筛选作用 样品稀释评价 得到 3 个或 3 个以上菌落数目在30-300的平板 ➔ 操作成功 重复组的结果 比较各重复组 ➔ 若选取同一种土样，统计结果应接近 特别提醒！ 　 本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。 四、理解微生物的选择培养和计数的原理 某兴趣小组从富含纤维素的土壤中取样，加入选择培养基中进行振荡培养，之后接种于鉴别培养基上进行培养，筛选出能够高效分解纤维素的微生物。请回答下列相关问题： 1．从富含纤维素的土壤中取样的原因是什么？纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。 2．分离出分解纤维素的微生物，应该配制以纤维素为唯一碳源的培养基，目的是促进纤维素分解菌生长，抑制其他微生物的生长。 3．已知刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物无法形成，平板上会出现以菌落为中心的透明圈（如图），几号真菌降解纤维素的能力最强，理由是什么？④；④形成的透明圈与菌落直径的比值最大。 4．三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为106的稀释液中各取0.1 mL涂平板，得到以下统计结果： 甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248； 乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是209、240和250，取平均值233； 丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163； 在三位同学的统计中，乙同学的统计是正确的，据此计算，每克土壤样品中含细菌2.33×109个。 5、归纳总结 每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数 = (C ÷ V) × M C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）。 M：代表稀释倍数。 分层专练·靶向攻关 两年模拟·基础通关 一、单选题 1．（2026·天津·模拟预测）某种物质A（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0．1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2．4×108个。相关叙述正确的是（　　） A．多次筛选的过程是诱导细菌发生基因突变，产生高效降解A的菌株 B．③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上 C．乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照 D．若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105 2．（2026·天津·模拟预测）科研人员将等量对T1噬菌体敏感的大肠杆菌接种到12个相同固体培养基上，培养后各平板均长出大量微菌落，接着进行如下表所示实验。下列说法正确的是（    ） 分组 实验处理 培养后统计抗T1噬菌体的菌落数 A组（6个平板） 直接喷T1噬菌体 28个 B组（6个平板） 先把平板上的微菌落重新均匀 涂布一遍，再喷等量T1噬菌体 353个 A．该实验用于培养大肠杆菌的培养基属于选择培养基 B．若两组在喷噬菌体前都用适宜紫外线诱变，A、B两组的抗性菌落数差异会消失 C．B组的涂布使发生抗T1噬菌体自发突变的单个大肠杆菌形成一个菌落的概率增加 D．该实验证明重新涂布后再喷T1噬菌体导致了抗性突变的大量发生 3．（2026·天津滨海新区·三模）下列关于不同微生物代谢与应用的叙述，正确的是（    ） A．酵母菌与醋酸菌代谢类型均为异养需氧型，发酵后形成的溶液都呈酸性 B．硝化细菌和蓝细菌都是原核生物，均可利用光能将无机物合成有机物 C．取泡菜汁样品，利用平板划线法对乳酸菌进行分离和计数 D．选育出高产青霉菌，经扩大培养后才可接种到发酵罐中用于发酵工程工业化生产青霉素 4．（2025·天津和平·三模）下图为研究人员对纤维素分解菌的分离操作（A组）和计数操作（B组）过程示意图。下列有关叙述错误的是（　　） A．⑨计数得到的细菌数与用细菌计数板计数法得到的细菌数相比较多 B．④和⑤所用培养基从物理性质分析，区别是④培养基中没有添加琼脂 C．④的培养基应以纤维素为唯一碳源，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质等的需求 D．可以在培养基中加入刚果红来鉴别纤维素分解菌 5．（2026·天津宝坻·三模）以下高中生物学实验中，不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是（    ） A．将菊花外植体接种到培养基上 B．从新鲜菜花中粗提取DNA C．使用PCR仪扩增目的基因 D．DNA片段的扩增及电泳鉴定 6．（2026·天津南开·二模）微生物在生物技术中被广泛应用，下列有关说法正确的是（    ） A．有的微生物灭活后能使细胞膜上的物质重新排布 B．天然微生物能用于传统发酵但不能用于发酵工程 C．灭菌能杀死微生物的芽孢，而消毒不能杀死芽孢 D．微生物能为重组DNA技术提供两种“分子工具” 7．（2025·天津河北·二模）科研人员通过改良发酵工艺“把玉米变成衣服”，即利用大肠杆菌将玉米转化为戊二胺，再将戊二胺转化为尼龙布，流程如图所示。其中，戊二胺不能从大肠杆菌体内排出，且对细胞有毒害作用。同时环境中pH值低于6．5或高于8．0时，大肠杆菌生长会受到不利影响，下列相关分析错误的是（　　） A．该工业生产中要使用淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等酶制剂 B．发酵结束后，可采用提取、分离和纯化措施来获得戊二胺 C．发酵时定期更换培养液，能降低戊二胺对大肠杆菌的毒害 D．发酵过程中，最好将培养液置于有氧、pH中性或接近中性的条件下培养 （2025·天津和平·二模）阅读下列材料，完成下面小题。 活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析。 8．培养基Ⅰ中，除了活性黑5以外，还需添加的成分不包括（    ） A．抗生素 B．葡萄糖 C．水 D．琼脂 9．假单胞杆菌中，BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为（    ） A．拟核 B．细胞质基质 C．溶酶体 D．核糖体 10．浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化不包括（    ） A．假单胞杆菌的菌落数目 B．假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量 C．假单胞杆菌对活性黑5的分解速率 D．假单胞杆菌中BVU5蛋白的空间结构 11．（2025·天津河北·二模）某兴趣小组测定土壤中尿素分解菌的数量，对土样进行稀释的流程如图所示。摇匀C试管，从C试管中取0.1mL菌液进行接种，在适宜条件下培养一段时间，测得平板中的平均菌落数为38。 ①取土样的工具必须灭菌 ②培养用的培养基为选择培养基 ③可用牛肉膏蛋白胨培养基培养 ④接种时采用涂布平板法 ⑤接种时可采用平板划线法 ⑥每克土样中尿素分解菌的数量至少是3.8×106个 ⑦每克土样中尿素分解菌的数量是3.8×106个 关于本实验，以上说法正确的是（    ） A．①②④⑥ B．①③④⑤⑦ C．②③⑤⑦ D．②④⑤⑥ 12．（2026·天津河北·二模）高中生物学实验中，下列实验操作能达成所述目标的是（　　） A．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境 B．用高浓度蔗糖溶液处理成熟植物细胞观察质壁分离 C．对外植体进行灭菌以杜绝接种过程中的微生物污染 D．在目标个体集中分布的区域划定样方调查种群密度 13．（2026·天津·二模）动物细胞培养时操作不当会造成“黑胶虫”细菌的污染，该菌对氯霉素敏感，高温会使氯霉素失活。下列叙述错误的是（    ） A．配制细胞培养基时，湿热灭菌后加血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素 B．在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要同时考虑对细胞和细菌生长的影响 C．考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液等比稀释后涂布在平板上培养计数 D．采用更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养等操作可清除“黑胶虫”污染 二、解答题 14．（2026·天津和平·二模）生物技术在迅猛发展，它与人类的生活关系越来越密切，请回答下列有关生物技术与工程的问题。 I．如图1是谷氨酸发酵装置示意图，工业上常用谷氨酸棒状杆菌在30℃下发酵获得谷氨酸；如图2是谷氨酸生产的机理，谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为底物进行了如下过程： （1）图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，水在发酵罐夹层流动的作用是_____。图1中3为搅拌器，可以加快谷氨酸形成的速率，其原理是_____。 （2）改变菌体细胞膜的通透性，及时排出谷氨酸是提升产量的关键措施之一，原因是_____。 （3）对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养基中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为_____个/mL，计算得到的值比实际值偏小。 Ⅱ．利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇，对缓解全球能源危机有重大意义。科研人员开展选育高产纤维素酶菌株的相关研究，过程如图3。 （4）从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或_____法接种于CMC平板，培养一段时间后，可根据菌落的_____（写出一项）等特征，初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 （5）鉴定高产纤维素酶菌株是否产生，可使用刚果红平板法。其原理是纤维素被分解，刚果红无法与纤维素的分解产物结合，培养基中的菌落周围会形成透明圈，如图4。下列叙述错误的是_____（多选）。 A．采集的黑土壤需经过高压蒸汽灭菌再进行富集培养 B．配制CMC平板培养基需加入纤维素为唯一碳源 C．紫外线和γ射线处理可使产纤维素酶菌株发生基因突变和染色体畸变 D．图2中两个透明圈内的微生物均能将分解纤维素的酶分泌到细胞外 15．（2025·天津·模拟预测）发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展．产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图所示。回答相关问题：    （1）对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了______法，其统计得到的菌落数比实际数量往往偏_____。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH调至______性。 （2）接种之前的过程①、②都属于扩大培养，整个发酵过程的中心环节是______。 （3）研究发现，某些青霉菌属于维生素营养缺陷型菌株，失去合成某种维生素的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的维生素后才能生长。某研究小组筛选出某种维生素营养缺陷型菌株，为了进一步确定该菌株的具体类型，他们把15种维生素按照不同组合分为5个小组，用5个滤纸片分别蘸取不同小组的维生素，然后覆于接种后的琼脂平板上培养一段时间，结果如下： 组别 维生素组合 1 维生素A 维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B12 2 维生素C 维生素B1 维生素D2 维生素E 烟酰胺 3 叶酸 维生素B2 维生素D2 胆碱 泛酸钙 4 对氨基苯甲酸 维生素B6 维生素E 胆碱 肌醇 5 生物素 维生素B12 烟酰胺 泛酸钙 肌醇 进行涂布之前，常需要检验培养基是否成功灭菌，方法是________，实验结果显示1组和2组滤纸片周围产生生长圈（图2），则该营养缺陷型青霉菌不能合成的维生素是________。叶酸和生物素的双营养缺陷型青霉菌，在此培养基上形成菌落的位置是________。 一年重难·情境应用 一、单选题 1．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2025·贵州黔东南·模拟预测）固氮菌能固定空气中的氮气，为豆科植物制作“氮餐”，使其枝繁叶茂。共生固氮菌不仅可大大提高相应农作物的产量，同时可以“肥田”。研究人员常常通过对土壤中固氮微生物的计数来评估土壤的“肥力”，对某地土壤取样并对土壤中固氮菌进行计数，相关流程和结果如图。下列有关分析正确的是（     ） A．图中纯化培养的培养基应以尿素为唯一氮源 B．还可以用平板划线法对土壤中的固氮菌进行计数 C．需要培养未接种的培养基做对照 D．每克土样中大约含有4×107个固氮菌 2．（2026·湖南长沙·模拟预测）下列关于微生物培养与发酵工程的拓展实验分析，正确的是（     ） A．稀释涂布平板法计数的菌落数，与实际活菌数相比数值偏高 B．连续培养时稳定期的微生物种群增长率最大，代谢产物积累量最高 C．发酵罐中通入无菌空气，可促进酵母菌有氧呼吸，提升酒精发酵产量 D．筛选耐高盐菌株时，需在选择培养基中设置高盐压力，抑制普通微生物生长 3．（2026·陕西·模拟预测）耐盐芽孢杆菌具有耐盐、能形成芽孢、产耐高温耐盐淀粉酶（最适温度60-70℃，耐盐8%NaCl）的特性。下列有关筛选耐盐芽孢杆菌的叙述错误的是（     ） A．该菌产生的淀粉酶宜在65℃条件下保存 B．对培养基和接种环进行灭菌的方法不同 C．可以将10g土样加入90mL一定浓度的灭菌NaCl溶液中进行稀释 D．筛选该菌可以从盐碱地或者盐矿附近获取土样 4．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·江苏徐州·模拟预测）泡菜中存在大量的乳酸菌，摄入一定量的乳酸菌利于保持肠道菌群平衡，但要发挥良好的保健作用，则要有足够量的活性菌经过胃到达小肠才可实现。下列叙述正确的是（     ） A．平板倒置培养可为乳酸菌生长创造无氧环境 B．图2中过程Ⅰ采用的接种方法可以纯化计数乳酸菌（平板划线法不能计数） C．图2中富集培养所用培养液的pH可控制在1.5左右 D．经图1过程获得了菌落数分别为80、79、81的三个平板，则10毫升陈泡菜水中的活菌数为8.0×106个 5．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·广西桂林·三模）研究人员采用图1中甲所示流程获得高耐酒精的高产醋酸菌，其中图2是“纯化培养”后的结果图。下列相关叙述错误的是（　　） A．产醋酸能力最强的醋酸菌菌落是B B．葡萄糖可以为醋酸菌提供碳源和能源 C．自然发酵的甘蔗渣经灭菌后再加入培养基中 D．通过增加酒精浓度进一步筛选高耐酒精的高产醋酸菌 6．（2026·陕西西安·模拟预测）下图表示利用指示菌和测试菌从土壤中筛选产生某种抗生素的目的菌的流程。相关叙述正确的是（　　） A．③过程没有产生透明圈的菌株一定不能产生抗生素 B．③过程挑取菌落时，透明圈直径越大，其产生的抗生素抑制指示菌S的效果越好 C．过程⑤的平板中第2、5号测试菌能产生较强的抗生素抗性，因此第2、5号测试菌为目标菌种 D．过程④划线五种测试菌时，若使用同一个接种环，则每次划线前后均需灼烧，共需灼烧灭菌6次 7．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·山东泰安·三模）臭豆腐一般是以含蛋白质高的优质黄豆为原料，经过泡豆、磨浆、滤浆、点卤、前期发酵、腌制、灌汤、后期发酵等多道工序制成的。其加工制作流程如图所示。下列说法不正确的是（    ） A．上图中卤水发酵的菌种可能来源于B，原因是B未采取灭菌措施 B．取样检测时，按上图所示发酵时间并注意取样时摇匀即可 C．在发酵过程中，由于不止有一种微生物，发酵液的pH前期可能会下降 D．若要对样品中某一菌种计数，适宜采取的方法是稀释涂布平板法 8．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·吉林松原·模拟预测）为分离土壤中高效降解石油的微生物，科研团队设计了3组培养基（成分如表所示），并对菌株生长情况进行检测。已知石油中烃类物质为主要污染物，且微生物对石油的降解能力与菌株生物量呈正相关。下列叙述正确的是（　　） 培养基编号 碳源 氮源 无机盐（含微量元素） 凝固剂 菌株生物量（相对值） Ⅰ 葡萄糖 硝酸铵 适量 琼脂 85 Ⅱ 石油 硝酸铵 适量 琼脂 32 Ⅲ 石油+葡萄糖 硝酸铵 适量 琼脂 68 A．培养基Ⅰ为选择培养基，能筛选出高效降解石油的菌株 B．培养基Ⅱ中的菌株生物量较低的原因是培养基无碳源 C．培养基Ⅲ中添加葡萄糖可能导致菌株对石油的降解效率下降 D．三组培养基均需先进行高压蒸汽灭菌处理后再调节pH 9．【新情境·将科研实情境与知识点相结合】（2026·湖南长沙·一模）饮用水卫生标准规定总菌数小于 100个/mL，且不能检测出大肠杆菌。下列关于饮用水中微生物计数的检测方法的说法，不合理的是（　　） A．将水样滴加到血细胞计数板上，在显微镜下计数 B．取一定量水样过滤，将滤膜贴在平板培养基上，培养后计数 C．在一定水样中加入细胞裂解液，通过检测 ATP 含量来估算微生物数量 D．若在伊红—亚甲蓝培养基上观察到1个金属光泽、深紫色的菌落，则水质不合格 10．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·陕西渭南·三模）塑化剂（DEHP，化学式为C24H38O4）被很多国家认定为毒性化学物质。图为某实验小组从土壤中筛选可降解DEHP细菌的过程。下列叙述错误的是（　　） A．图中多次接种，所使用的方法均为稀释涂布平板法 B．可用DEHP作唯一碳源配制选择培养基筛选目的菌 C．扩大培养时需调控温度、pH、溶氧量等培养条件 D．获取目的菌后，还需经无害化处理才能投入使用 11．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·山东聊城·二模）研究者用酸笋开发具有降低胆固醇功能的益生菌。先将酸笋发酵液接种到含有的固体培养基上，筛选出乳酸菌。然后将乳酸菌接种到含有胆固醇的培养液中，筛选出能够降解胆固醇的乳酸菌。下列叙述错误的是（    ） A．胆固醇属于脂质，主要为微生物的生长提供氮源 B．腌制酸笋需要水封，为乳酸菌发酵提供无氧环境 C．将酸笋发酵液用稀释涂布法接种到固体培养基中 D．溶钙圈直径与菌落直径比值大的菌落为目标菌落 12．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·四川宜宾·模拟预测）袋装酸奶的包装上通常都会注明“胀袋勿食”。某同学选择一过期的胀袋密封酸奶，按图中的操作流程，研究其中的某微生物生长情况，下列有关叙述正确的是（　　） A．巴氏消毒法可以杀死牛奶中的所有微生物和芽孢，且基本不破坏牛奶的营养成分 B．酸奶胀袋是由于其中的乳酸菌无氧呼吸产生了CO2 C．利用图示方法向培养基接种前和接种后都要对涂布器进行灼烧灭菌 D．若3个平板的平均菌落数是180个，则1 mL酸奶中该微生物个数为1.8×106个 二、解答题 13．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·甘肃武威·模拟预测）细菌性传染病已成为制约骆驼产业健康发展的关键因素。某机构针对分离自某地区骆驼场发热骆驼血液的菌株开展研究，内容聚焦病原微生物的精准鉴定、耐药特征解析及致病机制研究三大核心问题。回答下列问题： （1）采用无菌技术采集某地区骆驼场发热骆驼血液样本，并将血液样本用___________（填工具名称）均匀涂布于BHⅠ琼脂平板，室温静置干燥后，将平板___________于37℃恒温箱内孵育18～24h，完成初代培养。随后，选取典型单菌落进行纯化培养，经二次分离后，挑取优势菌落转接至血琼脂平板观察形态特征，进一步通过革兰染色、镜检，筛选出1株革兰阳性球菌。在纯化培养时，可采用___________（填两种方法名称）将单个微生物分散在固体培养基上。 （2）通过PCR技术对分离菌株进行12种耐药基因的检测，扩增结果如图所示。由图可知，分离菌株携带___________种耐药基因。扩增过程中，在DNA聚合酶作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的___________端。这些耐药基因的引物序列互不相同，故在每次扩增循环时，___________的温度可能不同。 M．Trans2000  DNA  Marker；N．阴性对照；1~12．分别为mecA、blaTEM-1、blaCMY-2、ermA、ermB、ermC、tetM、aacA-aphD、aadA1、glrA、qnr、sul1。 （3）研究分离菌株致病机制时，将25只健康小鼠随机分为5组：对照组（生理盐水）及4个实验组（菌液浓度梯度为2.2×106~2.2×109CFU/mL，用___________配制）。各组小鼠腹腔注射0.2mL相应浓度菌液或生理盐水，连续观察14d，记录死亡情况并即时剖检死亡个体，开展__________________、病理学观察及组织切片制备等。 14．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·四川宜宾·模拟预测）青霉素可采用深层通气、分批补料、变温发酵等技术以青霉菌（多细胞丝状真菌）为生产菌株进行生产，细胞中青霉素合成流程如图1所示，回答下列问题： （1）由于青霉菌是需氧菌，需要采用深层通气____（填“液体”或“固体”）发酵技术，在发酵过程中，可通过__________措施（写出1点）对青霉菌持续高效供氧。 （2）结合图1，为使青霉菌只生产青霉素可采取的措施是__________；发酵结束后，根据青霉素的性质采取适当的提取、______措施（写出2个）来获得青霉素产品。 （3）在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉，因此发酵过程中所需的_______（写出2个）都必须经过严格的灭菌。在发酵过程中，要随时检测培养基中的____________和______等，以了解发酵的进程。可用_______（填“大肠杆菌”或“酵母菌”）为指示菌检测青霉素的产量。 15．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·河南南阳·模拟预测）酸奶中的益生菌对改善肠道有益菌群的平衡有帮助。某酸奶中标注的参与发酵的乳酸菌类群有：保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等。回答下列问题： （1）酸奶是以新鲜的牛奶为原料，加入一定比例的蔗糖，经密封发酵而成的一种奶制品。发酵过程中，对发酵装置进行密封的目的是________。 （2）为鉴别市售酸奶中的菌种，工作人员采用稀释涂布平板法在固体培养基上进行接种，该方法中用到的接种工具是________。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是________。 （3）图甲采用了________法接种和分离微生物，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是________。 （4）研究小组在培养基灭菌后加入了碳酸钙粉末，乳酸菌产生的乳酸与碳酸钙反应会产生透明圈，从而筛选出了高产的乳酸菌菌株。图乙中降解碳酸钙能力最强的菌株是________，理由是________。 高考真题·考向感知 一、单选题 1．（2026·广东·高考真题）“酵母菌的纯培养”实验中，下列操作不规范的是（     ） A．在火焰旁冷却接种环 B．试管棉塞放超净台上 C．接种前灼烧试管口 D．划线时轻柔而迅速 2．（2026·河南·高考真题）自然界存在着甲、乙两种降解PET塑料（含碳有机物）的细菌。为筛选这两种细菌，并探究两种细菌的协同降解效果，研究人员进行了相关实验。下列叙述错误的是（　　） A．为筛选出目的菌，培养基应以PET塑料为唯一碳源 B．细菌纯培养时，需用涂布器蘸取单个菌落进行涂布 C．利用显微镜直接计数，可估算出菌悬液中细菌的总数 D．探究甲、乙降解效果的协同性，至少需设三个实验组 3．（2026·安徽·高考真题）某种营养缺陷型细菌在完全培养基上能生长，但在基本培养基上需添加组氨酸才能生长。将等量的营养缺陷型菌株涂布到两种培养基上（基本培养基中添加了少量组氨酸供细菌繁殖，但不足以形成菌落），再分别放入含低浓度和高浓度物质M的滤纸片，培养一段时间后菌落的生长情况如图。下列叙述正确的是（　　） A．固体培养基配制后需要采用干热灭菌法进行灭菌 B．牛肉膏蛋白胨培养基能用于培养该营养缺陷型细菌 C．物质M有诱变作用，菌落a中细菌合成蛋白质时不需要组氨酸 D．物质M有抑制作用，抑菌圈边缘的菌落多数能在基本培养基上生长 4．（2025·广西·高考真题）利用微生物分解厨余垃圾可实现资源的再利用。下列说法错误的是（　　） A．厨余垃圾分解过程产生的热量，会影响分解效率 B．对组成复杂的厨余垃圾再分类，可提高利用效率 C．厨余垃圾中的淀粉，可作为微生物的碳源和氮源 D．含盐量高的厨余垃圾，可选用耐高盐的微生物分解 5．（2025·贵州·高考真题）金龟子绿僵菌（Ma）是一种昆虫病原真菌，可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子（单细胞后代）萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素，导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是（　　） A．可利用Ma开发成微生物杀虫剂 B．为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样 C．稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma D．接种培养Ma时使用的器具需消毒 6．（2025·四川·高考真题）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X:Y=1:1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率=剩余量/添加量×100%），结果如下图。下列叙述正确的是（    ） A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数 B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高 C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种 D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料 7．（2025·湖南·高考真题）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（　　） A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数 B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照 C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸 D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质 8．（2025·江苏·高考真题）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（    ） A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌 B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布 C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线 D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存 9．（2025·福建·高考真题）下列高中生物学实验的部分操作，正确的是（    ） 选项 实验名称 实验操作 A 探究抗生素对细菌的选择作用 涂菌前，需将抗生素均匀涂抹在培养基平板上 B 制作果酒和果醋 当葡萄酒制作完成后，需拧紧瓶盖，促进葡萄醋的发酵 C 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 稀释土壤样品时，每个梯度稀释时都需更换移液器枪头 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 接通电源后，看到DNA条带迁移至凝胶边缘时，停止电泳 A．A B．B C．C D．D 10．（2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（    ） A．镍是组成脲酶的重要元素 B．镍能提高尿素水解反应的活化能 C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 11．（2019·江苏·高考真题）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是 A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养 B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌 C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力 D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值 二、解答题 12．（2026·江西·高考真题）检测食品中维生素B12(VB12）的含量具有重要意义。微生物法是一种检测VB12含量的常用方法，其基本原理是测试菌的生长依赖VB12，培养的生物量与培养基提供的VB12量成对应关系，流程如图（培养物OD值是一种能反映菌体浓度的测量指标，与菌体浓度正相关）。 回答下列问题： （1）图中液体培养基（b）与（c）________（选填“相同”或“不相同”）。 （2）制备测试菌液的“洗涤”和“重悬”操作需使用________溶液，以防止杂菌污染、保证菌体活性。 （3）在“检测食品中的VB12含量”过程中需设计空白（阴性）对照实验，其培养管内包括________[选填序号①液体培养基（c）；②测试菌液；③一定浓度的VB12；④待测样品液；⑤用于提取VB12的溶液]；同时还需设计“不接种测试菌液”的培养管作为另一组对照实验，具体目的是___________________________________。 （4）实验中需每隔一段时间检测培养物OD值。当OD值________时才能用于计算食品中VB12浓度，原因是___________________________________。 13．（2025·北京·高考真题）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。 （1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的_______，诱发基因突变。 （2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的_______性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。 （3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。 由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有_______作用。 （4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M产量，统计结果如下表。 组别 I II Ⅲ IV V VI 筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15 所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3 ①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因________________。 ②表中Ⅲ组和V组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有_______（多选）。 A、Ⅲ组中有野生型菌落，而V组中没有野生型菌落 B、V组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有 C、与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在V组中被抑制 D、与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在V组中被抑制 综上所述，用____________粗提液筛选是获得M+株的有效方法。 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第42讲 微生物的培养技术和应用 （天津专用） 第1部分 五年考情·精准定向 第2部分 两大核心·主干速记 核心1 微生物的基本培养技术 核心2 微生物的选择培养和计数 第3部分 分层专练·靶向攻关 天津专练+全国视野 两年模拟·基础通关 & 一年重难·情境应用 & 高考真题·考向感知 五年考情·精准定向 考情概览 新课标要求 1.通过配制培养基、灭菌、接种和培养等实验操作获得纯化的酵母菌菌落。 2.分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数。 考情分析： 1．考查频次：2021—2025五年持续高频必考，隶属于发酵工程大模块。常规1道选择题（4分），2022、2024、2025三年嵌入非选择大题填空，分值4–10分；无菌操作、微生物计数为每年固定落点，属于生物技术工程板块核心得分点。 2．考查要点：①基础培养：培养基四大营养成分、固体 / 液体培养基差异，灭菌与消毒的区分及适用对象； ②接种与纯化：平板划线法、稀释涂布平板法操作区别，涂布法活菌计数计算与误差分析； ③筛选应用：选择培养基原理，土壤目的菌分离流程，培养条件控制、菌落观察与菌种保藏； ④关联延伸：对接工业发酵、杂菌污染防控、传统发酵菌种纯化。 3．命题情境： 实验室实操情境：培养基配制、倒平板、接种操作正误判断； 环境科研情境：土壤降解污染物菌株、固氮菌、耐药菌筛选实验； 工业生产情境：抗生素、氨基酸工程菌的扩大培养与菌种纯化； 图表数据情境：菌落统计表格、培养温度 / 氧气梯度曲线图分析。 备考策略 1．抓牢核心点：吃透无菌技术整套逻辑；牢牢掌握两种接种方法功能差异，死记稀释涂布平板计数公式及 30–300 菌落取值范围；理解选择培养基 “唯一碳源/氮源”筛选本质。 2．熟记关键点：汇总易混易错点：灭菌vs消毒、划线法不可计数、培养皿倒置原因、计数结果偏大偏小原因；专项训练流程图拆解、数据计算、实验异常结果分析，规范专业术语答题表述。 3．紧扣命题趋势：顺应天津卷跨模块综合特点，强化微生物培养 + 基因工程改造工程菌的联动题型；侧重陌生科研新情境的知识迁移；加大实验设计、变量控制、条件优化类探究题训练，提升图表信息提取与定量计算能力。 两大核心·主干速记 核心1 微生物的基本培养技术 一、培养基的配制 1、培养基的概念、用途和类型 概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。 用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 培养基的种类（按物理性质分） 培养基种类 培养基特点 作用 固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种 半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定 液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养 2、培养基的配方 主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。 其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。如表： 微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物 特殊需求 添加维生素 一般pH调至酸性 一般pH调至中性或弱碱性 无氧 二、无菌技术 1、目的：获得纯净的微生物培养物。 2、关键：防止杂菌污染。 3、常用方法：灭菌和消毒。 常用方法 消毒 灭菌 所属范畴 无菌技术 无菌技术 处理条件 较为温和的物理、化学或生物等方法 强烈的理化方法 处理结果 杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子） 杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子） 实质（相同点） 消毒和灭菌的实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性 消毒和灭菌的实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性 4、无菌技术的主要方法及适用对象 操作对象 处理措施 主要方法 培养基 灭菌 湿热灭菌 接种环 灭菌 灼烧灭菌 操作者双手 消毒 化学药物消毒 培养皿 灭菌 干热灭菌 无菌室 消毒 紫外线消毒 牛奶 消毒 巴氏消毒 5、注意事项 1）实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；2）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 特别提醒！ 选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。 三、微生物的纯培养概念辨析 概念 定义 培养物 接种于培养基内在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体 纯培养物 由单一个体繁殖获得的微生物群体 菌落 分散微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体 纯培养 获得纯培养物的过程 四、纯培养的过程（以酵母菌为例） 1、制备培养基 1）配制培养基：称取 → 煮沸 → 过滤 → 加葡萄糖、琼脂 → 定容 2）灭菌：湿热灭菌法 3）倒平板： a、培养基冷却至 50 ℃ 左右开始倒平板，温度过高会烫手，过低培养基会凝固 b、防止瓶口上的微生物污染培养基； c、用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免培养基被污染； d、平板倒置既可防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以防止培养基中的水分过快蒸发。 2、接种和分离 平板划线法分离酵母菌的原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 3、培养 未接种平板和接种平板倒置，28 ℃ 恒温培养箱培养 24-48 h。 （未接种平板）可判断培养基是否被污染。 4、结果分析 1）未接种培养基表面是否有菌落生长（可判断是否被污染）； 2）接种的培养基表面是否出现单菌落，菌落颜色、形状和大小是否一致，是否符合微生物特征； 3）若培养基表面出现了其他菌落，可能由哪些原因引起。 五、分析微生物平板划线和培养的具体操作 微生物平板划线和培养的具体操作如图所示： 1、图中①～⑧不正确的操作及其原因分别是什么？②拔出棉塞后完全握住棉塞会造成杂菌污染，应握住棉塞上部；⑥划线时不能将培养皿完全打开，应在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖；⑦划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧平板应倒置培养。 2、在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端菌种的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。 3、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？需要；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。 高分攻略！ 平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的 ① 第一次划线前灼烧 · 目的：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。 ② 每次划线前灼烧 · 目的：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端。 ③ 最后一次划线结束后灼烧 · 目的：杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者。 核心2 微生物的选择培养和计数 一、区分选择培养基与鉴别培养基 种类 特点 用途 举例 选择 培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 从众多微生物中分离所需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基分离得到尿素分解菌 鉴别 培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 特别提醒！　常见选择培养基举例：(1)缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。(2)含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。(3)无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。 二、微生物的选择培养和数量测定 1、稀释涂布平板法步骤 ①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。 操作步骤： ②涂布平板操作步骤 取菌液 操作说明：取 0.1 mL 菌液，滴加到培养基表面。 涂布器消毒 操作说明：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 涂布器灭菌 操作说明：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 涂布平板 操作说明：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 2、微生物的数量测定方法 ①显微镜直接计数法 原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 方法：用细菌计数板或血细胞计数板计数。 缺点：不能区分死菌与活菌而使计数结果偏大。 特别提醒！　 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 ②活菌计数法 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 减小误差： 一般选择菌落数为 30-300 的平板进行计数；在同一稀释度下，应至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值。 统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 1、实验原理 分离原理 ① 土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶； ② 配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌。 2、实验流程 ① 土壤取样：从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样，先铲去表层土，取距地表 3-8 cm 的土壤层。 ② 样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300的平板进行计数。 ③ 微生物的培养与观察： · a. 接种：用稀释涂布平板法接种。 · b. 培养条件：30-37 ℃ 培养 1~2 天。 · c. 观察：根据菌落的特征区分微生物。 · d. 计数：每隔 24 小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 ④ 计算：计算单位体积内的菌体数。 3、实验结果分析与评价－－微生物培养实验评价指标 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 ➔ 未被杂菌污染 对照的培养皿中有菌落生长 ➔ 被杂菌污染 培养基是否具有筛选作用 选择培养基上的菌落数目远少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 ➔ 选择培养基具有筛选作用 样品稀释评价 得到 3 个或 3 个以上菌落数目在30-300的平板 ➔ 操作成功 重复组的结果 比较各重复组 ➔ 若选取同一种土样，统计结果应接近 特别提醒！ 　 本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。 四、理解微生物的选择培养和计数的原理 某兴趣小组从富含纤维素的土壤中取样，加入选择培养基中进行振荡培养，之后接种于鉴别培养基上进行培养，筛选出能够高效分解纤维素的微生物。请回答下列相关问题： 1．从富含纤维素的土壤中取样的原因是什么？纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。 2．分离出分解纤维素的微生物，应该配制以纤维素为唯一碳源的培养基，目的是促进纤维素分解菌生长，抑制其他微生物的生长。 3．已知刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物无法形成，平板上会出现以菌落为中心的透明圈（如图），几号真菌降解纤维素的能力最强，理由是什么？④；④形成的透明圈与菌落直径的比值最大。 4．三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为106的稀释液中各取0.1 mL涂平板，得到以下统计结果： 甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248； 乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是209、240和250，取平均值233； 丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163； 在三位同学的统计中，乙同学的统计是正确的，据此计算，每克土壤样品中含细菌2.33×109个。 5、归纳总结 每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数 = (C ÷ V) × M C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）。 M：代表稀释倍数。 分层专练·靶向攻关 两年模拟·基础通关 一、单选题 1．（2026·天津·模拟预测）某种物质A（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解A。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解A的细菌菌株。图中③将M中的菌液稀释一定倍数后，取0．1 mL涂布到平板上，初步估测摇瓶M中1 mL菌液中细菌数为2．4×108个。相关叙述正确的是（　　） A．多次筛选的过程是诱导细菌发生基因突变，产生高效降解A的菌株 B．③接种方法为稀释涂布平板法，涂布时用涂布器蘸取菌液均匀涂布于平板上 C．乙中需要加琼脂和物质A等，实验需设平行重复实验，无需另外设置空白对照 D．若乙平板上菌落数平均为240个，则接种的菌液的稀释倍数为105 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】基因突变、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、基因突变具有不定向性，多次筛选的作用是将环境中已存在的、能高效降解A的菌株选择出来，不能诱导细菌产生定向的降解A的突变，A错误； B、③为稀释涂布平板法，涂布时需先将定量菌液滴加到培养基表面，再将灼烧冷却后的涂布器放在培养基表面将菌液均匀涂开，并非用涂布器蘸取菌液涂布，B错误； C、乙是固体选择培养基，需要加琼脂作为凝固剂，加物质A作为唯一碳源（或氮源）进行选择；实验需要设置平行重复提高结果可靠性，同时还需要设置未接种的空白培养基作为对照，检验培养基是否被杂菌污染，C错误； D、微生物计数公式为1mL菌液菌落数=平板平均菌落数÷涂布体积（mL）×稀释倍数，代入数据得2.4×108=240÷0.1×稀释倍数，可计算出稀释倍数为105，D正确。 2．（2026·天津·模拟预测）科研人员将等量对T1噬菌体敏感的大肠杆菌接种到12个相同固体培养基上，培养后各平板均长出大量微菌落，接着进行如下表所示实验。下列说法正确的是（    ） 分组 实验处理 培养后统计抗T1噬菌体的菌落数 A组（6个平板） 直接喷T1噬菌体 28个 B组（6个平板） 先把平板上的微菌落重新均匀 涂布一遍，再喷等量T1噬菌体 353个 A．该实验用于培养大肠杆菌的培养基属于选择培养基 B．若两组在喷噬菌体前都用适宜紫外线诱变，A、B两组的抗性菌落数差异会消失 C．B组的涂布使发生抗T1噬菌体自发突变的单个大肠杆菌形成一个菌落的概率增加 D．该实验证明重新涂布后再喷T1噬菌体导致了抗性突变的大量发生 【答案】C 【难度】0.4 【知识点】基因突变、培养基的类型及其应用、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、初始培养大肠杆菌的培养基未添加选择抑制物质，属于通用的基础培养基，不属于选择培养基（选择培养基需添加特定物质筛选目标微生物），A错误； B、紫外线仅能提高突变频率，不会改变两组的处理差异：A组未涂布，同一微菌落内的多个突变菌仍聚集，最终仅形成1个抗性菌落；B组涂布后突变菌分散可形成多个独立菌落，两组抗性菌落数差异不会消失，B错误； C、抗T1噬菌体的自发突变在喷噬菌体前已经发生，B组重新涂布可将同一微菌落中多个突变的大肠杆菌分散开，每个突变菌都能独立形成一个抗性菌落，使单个突变菌形成单菌落的概率增加，因此统计的菌落数远高于A组，C正确； D、抗性突变是自发产生的，T1噬菌体仅起选择作用，并未诱导抗性突变发生，D错误。 3．（2026·天津滨海新区·三模）下列关于不同微生物代谢与应用的叙述，正确的是（    ） A．酵母菌与醋酸菌代谢类型均为异养需氧型，发酵后形成的溶液都呈酸性 B．硝化细菌和蓝细菌都是原核生物，均可利用光能将无机物合成有机物 C．取泡菜汁样品，利用平板划线法对乳酸菌进行分离和计数 D．选育出高产青霉菌，经扩大培养后才可接种到发酵罐中用于发酵工程工业化生产青霉素 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】真核细胞与原核细胞、其他微生物的分离与计数、果酒和果醋的制作原理、发酵工程的应用 【详解】A、酵母菌的代谢类型为异养兼性厌氧型，并非异养需氧型，仅醋酸菌为异养需氧型，A错误； B、硝化细菌是化能自养型生物，依靠氧化氨释放的化学能将无机物合成有机物，无法利用光能，只有蓝细菌可利用光能合成有机物，B错误； C、平板划线法仅能实现微生物的分离纯化，无法对活菌进行计数，对微生物分离并计数应使用稀释涂布平板法，C错误； D、选育得到的高产青霉菌初始数量较少，需要先经过扩大培养提升菌种数量后，才能接种到发酵罐中进行工业化发酵生产，D正确。 4．（2025·天津和平·三模）下图为研究人员对纤维素分解菌的分离操作（A组）和计数操作（B组）过程示意图。下列有关叙述错误的是（　　） A．⑨计数得到的细菌数与用细菌计数板计数法得到的细菌数相比较多 B．④和⑤所用培养基从物理性质分析，区别是④培养基中没有添加琼脂 C．④的培养基应以纤维素为唯一碳源，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质等的需求 D．可以在培养基中加入刚果红来鉴别纤维素分解菌 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、培养基的类型及其应用、微生物的接种方法 【详解】A、⑨计数方法为稀释涂布平板法，只能统计活菌数，而细菌计数板计数法无论活菌还是死菌都统计在内，因此稀释涂布平板法统计得到的细菌数与用细菌计数板计数法得到的细菌数相比较少，A错误； B、④和⑤所用培养基从物理性质分析，④是液体培养基，没有添加琼脂；⑤是固体培养基，加有琼脂，B正确； C、该实验是为了分离得到纤维素分解菌，④培养液中以纤维素作为唯一碳源时，只有能利用纤维素的微生物才能生长繁殖，从而筛选出纤维素分解菌，此外还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质等的需求，C正确； D、当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来鉴别纤维素分解菌，即可以在培养基中加入刚果红来鉴别纤维素分解菌，D正确。 故选A。 5．（2026·天津宝坻·三模）以下高中生物学实验中，不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是（    ） A．将菊花外植体接种到培养基上 B．从新鲜菜花中粗提取DNA C．使用PCR仪扩增目的基因 D．DNA片段的扩增及电泳鉴定 【答案】A 【难度】0.5 【知识点】无菌技术、植物组织的培养及基本过程、DNA的粗提取及鉴定、PCR扩增的原理与过程 【详解】A、将菊花外植体接种到培养基属于植物组织培养操作，所用培养基营养丰富，适合微生物生长，若未严格无菌操作，杂菌会快速繁殖，与外植体竞争营养，还会分泌有毒代谢物抑制外植体生长甚至导致其死亡，直接造成实验失败，对结果影响极大，A符合题意； B、从新鲜菜花中粗提取DNA的实验目标是获取菜花的大量DNA，即便混入少量杂菌，杂菌的DNA含量极低，对粗提取结果几乎无影响，无需严格无菌操作，B不符合题意； C、PCR扩增目的基因依靠特异性引物识别目的序列进行扩增，杂菌DNA若不含与引物互补的序列就不会被扩增，且PCR的高温循环过程会直接灭活所有活菌，仅活菌污染对实验结果影响很小，C不符合题意； D、DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理与PCR一致，仅杂菌污染若无匹配的引物结合序列，不会出现非特异性扩增条带，对电泳结果几乎无影响，无需严格无菌操作，D不符合题意。 6．（2026·天津南开·二模）微生物在生物技术中被广泛应用，下列有关说法正确的是（    ） A．有的微生物灭活后能使细胞膜上的物质重新排布 B．天然微生物能用于传统发酵但不能用于发酵工程 C．灭菌能杀死微生物的芽孢，而消毒不能杀死芽孢 D．微生物能为重组DNA技术提供两种“分子工具” 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、DNA重组技术的基本工具、发酵工程的应用 【详解】A、有的微生物如病毒，灭活后能通过与细胞膜上的糖蛋白结合，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，A正确； B、传统发酵直接利用原材料中天然存在的微生物或发酵物中的微生物，发酵工程也可以从天然微生物中筛选菌种，B错误； C、灭菌能杀死所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒能杀死部分微生物，煮沸消毒法能杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，C错误； D、重组DNA技术的分子工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、运载体三类，三类工具都可从微生物中获取，不止两种，D错误。 7．（2025·天津河北·二模）科研人员通过改良发酵工艺“把玉米变成衣服”，即利用大肠杆菌将玉米转化为戊二胺，再将戊二胺转化为尼龙布，流程如图所示。其中，戊二胺不能从大肠杆菌体内排出，且对细胞有毒害作用。同时环境中pH值低于6．5或高于8．0时，大肠杆菌生长会受到不利影响，下列相关分析错误的是（　　） A．该工业生产中要使用淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等酶制剂 B．发酵结束后，可采用提取、分离和纯化措施来获得戊二胺 C．发酵时定期更换培养液，能降低戊二胺对大肠杆菌的毒害 D．发酵过程中，最好将培养液置于有氧、pH中性或接近中性的条件下培养 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、发酵工程的应用 【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。 【详解】A、玉米籽粒主要含淀粉，非粮原料（秸秆、玉米芯）主要含纤维素和果胶，淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等酶制剂可以帮助分解玉米原料为葡萄糖，以利于后续发酵过程的进行，A正确； B、根据题意，发酵产品是大肠杆菌的代谢产物，不是大肠杆菌细胞本身，所以需根据戊二胺的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得戊二胺，B正确； C、根据题意，戊二胺因不能排出大肠杆菌而对其有毒害作用，所以可能需要通过基因工程改造大肠杆菌，使其能够耐受或排出戊二胺，仅定期更换培养液不能解决戊二胺对大肠杆菌的毒害作用，C错误； D、发酵过程利用的菌种是大肠杆菌（一种细菌），大肠杆菌适宜在有氧、pH中性或接近中性的条件下培养 ，D正确。 故选C。 （2025·天津和平·二模）阅读下列材料，完成下面小题。 活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析。 8．培养基Ⅰ中，除了活性黑5以外，还需添加的成分不包括（    ） A．抗生素 B．葡萄糖 C．水 D．琼脂 9．假单胞杆菌中，BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为（    ） A．拟核 B．细胞质基质 C．溶酶体 D．核糖体 10．浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化不包括（    ） A．假单胞杆菌的菌落数目 B．假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量 C．假单胞杆菌对活性黑5的分解速率 D．假单胞杆菌中BVU5蛋白的空间结构 【答案】8．A 9．B 10．A 【难度】0.85 【知识点】真核细胞与原核细胞、微生物的培养与应用综合、培养基的成分及其功能 【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，其中碳源和氮源常采用蛋白胨和牛肉膏，因为它们来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对特殊营养物质和氧气的要求。 8．根据题干信息“活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料”可知活性黑在培养基中作为氮源；虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。故培养基中还应该含有的成分有碳源（如葡萄糖）、无机盐和水。且该培养基为固体培养基，需要加入琼脂，因此该培养基的配制过程中不需要的成分是抗生素，A错误，BCD正确。 故选A。 9．假单胞杆菌为原核生物，没有溶酶体，核糖体是合成蛋白质的场所，没有分解蛋白质的功能，细胞质基质中由于存在多种酶，因此最可能为BVU5蛋白分解活性黑5的场所，B正确，ACD错误。 故选B。 10．A、在液体培养基中不能形成菌落，A错误； BCD、浓度梯度驯化的目的是获得高表达的分解活性黑5的氧化还原酶BVU5，所以浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化有假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量、对活性黑5的分解速率、BVU5蛋白的空间结构，BCD正确。 故选A。 11．（2025·天津河北·二模）某兴趣小组测定土壤中尿素分解菌的数量，对土样进行稀释的流程如图所示。摇匀C试管，从C试管中取0.1mL菌液进行接种，在适宜条件下培养一段时间，测得平板中的平均菌落数为38。 ①取土样的工具必须灭菌 ②培养用的培养基为选择培养基 ③可用牛肉膏蛋白胨培养基培养 ④接种时采用涂布平板法 ⑤接种时可采用平板划线法 ⑥每克土样中尿素分解菌的数量至少是3.8×106个 ⑦每克土样中尿素分解菌的数量是3.8×106个 关于本实验，以上说法正确的是（    ） A．①②④⑥ B．①③④⑤⑦ C．②③⑤⑦ D．②④⑤⑥ 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】培养基的类型及其应用、微生物的接种方法、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、其他微生物的分离与计数 【分析】微生物常见的接种的方法：平板划线法：将已经饹化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】①测定土壤中尿素分解菌的数量的实验中，取土样用的铁铲和取样袋在使用前都需要进行灭菌，①正确； ②③所用的培养基是以尿素为唯一碳源的选择培养基，而不能用牛肉膏蛋白胨培养基，②正确，③错误； ④⑤该实验需要进行计数，平板划线法不能计数，稀释涂布平板法可以计数，④正确，⑤错误； ⑥⑦据图可知，菌液在接种前到C试管，被稀释了104倍，计算可得纤维素分解菌的数量=38÷0.1×104=3.8×106个，但由于该计数方法导致结果偏小，故每克土样中尿素分解菌的数量至少是3.8×106个，⑥正确，⑦错误。 综上，①②④⑥正确，A符合题意。 故选A。 12．（2026·天津河北·二模）高中生物学实验中，下列实验操作能达成所述目标的是（　　） A．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境 B．用高浓度蔗糖溶液处理成熟植物细胞观察质壁分离 C．对外植体进行灭菌以杜绝接种过程中的微生物污染 D．在目标个体集中分布的区域划定样方调查种群密度 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】质壁分离及其复原实验、种群密度的调查方法及应用、无菌技术、泡菜的腌制 【详解】A、向泡菜坛盖边沿水槽注满水的目的是隔绝外界空气，为乳酸菌发酵提供无氧环境，A错误； B、高浓度蔗糖溶液渗透压远高于成熟植物细胞的细胞液渗透压，细胞会渗透失水，由于原生质层的伸缩性远大于细胞壁，可观察到明显的质壁分离现象，B正确； C、外植体是具有生物活性的植物组织，灭菌（强烈的杀菌处理）会杀死外植体本身，无法用于后续组织培养，只能对外植体进行消毒减少污染，C错误； D、样方法调查种群密度的核心原则是随机取样，在个体集中分布区域划定样方会导致调查结果远大于实际值，无法获得准确的种群密度，D错误。 13．（2026·天津·二模）动物细胞培养时操作不当会造成“黑胶虫”细菌的污染，该菌对氯霉素敏感，高温会使氯霉素失活。下列叙述错误的是（    ） A．配制细胞培养基时，湿热灭菌后加血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素 B．在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要同时考虑对细胞和细菌生长的影响 C．考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液等比稀释后涂布在平板上培养计数 D．采用更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养等操作可清除“黑胶虫”污染 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、其他微生物的分离与计数、动物细胞培养技术 【详解】A、配制细胞培养基时，湿热灭菌后通过过滤灭菌加入血清（含细胞生长必需蛋白）和氯霉素，A正确； B、在加入氯霉素防治“黑胶虫”污染过程中，需要考虑其对细胞和细菌生长的双重因素，保证动物细胞的正常生长，同时抑制细菌的生长，B正确； C、考察“黑胶虫”污染程度时，应取细胞培养液，稀释后涂布在平板上培养，待菌落数目稳定后进行计数，C正确； D、更换培养基、胰蛋白酶处理和分瓶培养仅能减少“黑胶虫”的数量，无法彻底清除已经存在的细菌污染，需要使用敏感的氯霉素才能起到防治作用，D错误。 二、解答题 14．（2026·天津和平·二模）生物技术在迅猛发展，它与人类的生活关系越来越密切，请回答下列有关生物技术与工程的问题。 I．如图1是谷氨酸发酵装置示意图，工业上常用谷氨酸棒状杆菌在30℃下发酵获得谷氨酸；如图2是谷氨酸生产的机理，谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为底物进行了如下过程： （1）图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，水在发酵罐夹层流动的作用是_____。图1中3为搅拌器，可以加快谷氨酸形成的速率，其原理是_____。 （2）改变菌体细胞膜的通透性，及时排出谷氨酸是提升产量的关键措施之一，原因是_____。 （3）对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养基中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为_____个/mL，计算得到的值比实际值偏小。 Ⅱ．利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇，对缓解全球能源危机有重大意义。科研人员开展选育高产纤维素酶菌株的相关研究，过程如图3。 （4）从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或_____法接种于CMC平板，培养一段时间后，可根据菌落的_____（写出一项）等特征，初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 （5）鉴定高产纤维素酶菌株是否产生，可使用刚果红平板法。其原理是纤维素被分解，刚果红无法与纤维素的分解产物结合，培养基中的菌落周围会形成透明圈，如图4。下列叙述错误的是_____（多选）。 A．采集的黑土壤需经过高压蒸汽灭菌再进行富集培养 B．配制CMC平板培养基需加入纤维素为唯一碳源 C．紫外线和γ射线处理可使产纤维素酶菌株发生基因突变和染色体畸变 D．图2中两个透明圈内的微生物均能将分解纤维素的酶分泌到细胞外 【答案】(1) 使温度控制在30℃（利于谷氨酸棒状杆菌发酵） 谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物（或搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触利于该菌发酵） （2）若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性（从而导致该合成途径中断） (3)3.3×109 （4） 平板划线 颜色（或形状、隆起程度） (5)AC 【难度】0.44 【知识点】培养基的类型及其应用、微生物的接种方法、分解纤维素的微生物的分离、其他微生物的分离与计数 【详解】（1）图1中1、2处是发酵罐夹层中冷凝水的进出口，这样可以降低发酵罐内的温度，因为微生物发酵过程中会产生热量，导致温度上升，即水在发酵罐夹层流动的作用是降温至30℃利于谷氨酸棒状杆菌发酵。图1中3为搅拌器，谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物，搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触有利于该菌发酵，可以加快谷氨酸形成的速率。 （2）发酵过程中，若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，从而导致该合成途径中断，因此提高产物产量的关键是改变菌体细胞膜的通透性，使谷氨酸释放出来，提高产量。 （3）对谷氨酸棒状杆菌进行硫酸二乙酯和紫外线相结合的复合诱变，经选育得到高产突变株LG-01。将其接种在含葡萄糖的液体培养基中，于30℃下培养48h。摇匀并取培养液稀释107倍后，向四个培养皿中分别涂布0.1mL，四个培养皿中生长的菌落数依次为31个、33个、35个、33个，则稀释前菌液的菌体密度为（31+33+35+33）÷4÷0.1×107=3.3×109个/mL， （4）从物理状态来看CMC平板属于固体培养基。富集培养后的菌种常采用稀释涂布平板法或平板划线接种于CMC平板，实现菌种的筛选和分离，培养一段时间后，可根据菌落的特征（颜色、形状、隆起程度）初步鉴定并挑取产纤维素酶菌株XZ-33。 （5）A、采集的黑土壤中含有目标菌株，若经过高压蒸汽灭菌，会杀死土壤中的所有微生物，后续无法进行富集培养来筛选产纤维素酶的菌株。因此不能灭菌，A错误。 B、CMC（羧甲基纤维素钠）是纤维素的衍生物，配制以 CMC 为唯一碳源的平板培养基，只有能分解利用 CMC（纤维素类碳源）的菌株才能生长，可起到选择作用，B正确。 C、产纤维素酶的菌株多为细菌（原核生物），原核生物没有染色体，因此紫外线和 γ 射线处理只能诱发基因突变，无法发生染色体畸变，C错误。 D、刚果红染色法中，透明圈的形成是因为菌株分泌到细胞外的纤维素酶将菌落周围的纤维素分解，刚果红无法与分解产物结合，从而形成透明圈。因此透明圈内的微生物均能分泌胞外纤维素酶，D正确。 15．（2025·天津·模拟预测）发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展．产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图所示。回答相关问题：    （1）对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了______法，其统计得到的菌落数比实际数量往往偏_____。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH调至______性。 （2）接种之前的过程①、②都属于扩大培养，整个发酵过程的中心环节是______。 （3）研究发现，某些青霉菌属于维生素营养缺陷型菌株，失去合成某种维生素的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的维生素后才能生长。某研究小组筛选出某种维生素营养缺陷型菌株，为了进一步确定该菌株的具体类型，他们把15种维生素按照不同组合分为5个小组，用5个滤纸片分别蘸取不同小组的维生素，然后覆于接种后的琼脂平板上培养一段时间，结果如下： 组别 维生素组合 1 维生素A 维生素B1 维生素B2 维生素B6 维生素B12 2 维生素C 维生素B1 维生素D2 维生素E 烟酰胺 3 叶酸 维生素B2 维生素D2 胆碱 泛酸钙 4 对氨基苯甲酸 维生素B6 维生素E 胆碱 肌醇 5 生物素 维生素B12 烟酰胺 泛酸钙 肌醇 进行涂布之前，常需要检验培养基是否成功灭菌，方法是________，实验结果显示1组和2组滤纸片周围产生生长圈（图2），则该营养缺陷型青霉菌不能合成的维生素是________。叶酸和生物素的双营养缺陷型青霉菌，在此培养基上形成菌落的位置是________。 【答案】(1) 稀释涂布平板 小 酸 （2）发酵罐内发酵 （3） 随机取若干灭菌的空白平板进行培养，一段时间后观察平板是否出现菌落 维生素B1 3组与5组的交界处 【难度】0.65 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、发酵工程的基本环节 【分析】1、人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质—培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。 2、发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品的分离、提纯等方面。发酵罐中发酵是发酵工程的中心环节。 【详解】（1）对微生物进行分离纯化并计数通常采用稀释涂布平板法。将菌液进行一系列梯度稀释后，取一定量的稀释液涂布在固体培养基表面，经过培养后，一个菌落通常是由一个活菌繁殖形成的，所以可以通过统计菌落数来估算活菌数。由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以用稀释涂布平板法统计得到的菌落数比实际数量往往偏低。产黄青霉菌是霉菌，霉菌生长适宜在酸性环境中，所以在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将 pH 调至酸性。 （2）发酵罐中发酵是发酵工程的中心环节。 （3）进行涂布之前，检验培养基是否成功灭菌的方法是随机取若干灭菌的空白平板进行培养，一段时间后观察平板是否出现菌落。如果没有菌落产生，说明培养基灭菌成功，没有杂菌污染；如果有菌落产生，则说明培养基灭菌不彻底，含有杂菌。实验结果显示1组和2组滤纸片周围产生生长圈，比较表格中各种维生素组合，1组和2组含有而其他组不含有的维生素是维生素B1，所以该营养缺陷型青霉菌不能合成的维生素是维生素B1；只有3组含有叶酸，只有5组含有生物素，所以若菌株为叶酸和生物素的双营养缺陷型青霉菌，则其在培养基上形成菌落的位置是3与5的交界处。 一年重难·情境应用 一、单选题 1．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2025·贵州黔东南·模拟预测）固氮菌能固定空气中的氮气，为豆科植物制作“氮餐”，使其枝繁叶茂。共生固氮菌不仅可大大提高相应农作物的产量，同时可以“肥田”。研究人员常常通过对土壤中固氮微生物的计数来评估土壤的“肥力”，对某地土壤取样并对土壤中固氮菌进行计数，相关流程和结果如图。下列有关分析正确的是（     ） A．图中纯化培养的培养基应以尿素为唯一氮源 B．还可以用平板划线法对土壤中的固氮菌进行计数 C．需要培养未接种的培养基做对照 D．每克土样中大约含有4×107个固氮菌 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、筛选固氮菌需使用无氮选择培养基，固氮菌可利用空气中的氮气作为氮源，而以尿素为唯一氮源的培养基是用于筛选尿素分解菌的，A错误； B、平板划线法仅可用于微生物的分离纯化，无法对微生物进行计数，计数需采用稀释涂布平板法，B错误； C、培养未接种的空白培养基作为对照，可检验培养基灭菌是否合格、是否被杂菌污染，保证实验结果的可靠性，C正确； D、三个平板的平均菌落数为个，总稀释倍数为（10g土加90mL水稀释10倍，后续共5次10倍梯度稀释，总稀释倍数为），涂布体积为0.1mL，因此每克土样中固氮菌数量为个，D错误。 2．（2026·湖南长沙·模拟预测）下列关于微生物培养与发酵工程的拓展实验分析，正确的是（     ） A．稀释涂布平板法计数的菌落数，与实际活菌数相比数值偏高 B．连续培养时稳定期的微生物种群增长率最大，代谢产物积累量最高 C．发酵罐中通入无菌空气，可促进酵母菌有氧呼吸，提升酒精发酵产量 D．筛选耐高盐菌株时，需在选择培养基中设置高盐压力，抑制普通微生物生长 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】培养基的类型及其应用、其他微生物的分离与计数、果酒和果醋的制作原理 【详解】A、稀释涂布平板法计数时，若两个或多个活菌连在一起，平板上只会形成一个菌落，因此统计的菌落数与实际活菌数相比数值偏低，A错误； B、微生物连续培养时稳定期种群出生率等于死亡率，增长率为0，是代谢产物积累量最高的时期，B错误； C、酒精是酵母菌无氧呼吸的产物，发酵罐中通入无菌空气会抑制酵母菌的无氧呼吸，降低酒精发酵产量，C错误； D、筛选耐高盐菌株时，高盐的选择培养基可抑制普通不耐盐微生物的生长，只有耐高盐菌株可以存活，达到筛选目的，D正确。 3．（2026·陕西·模拟预测）耐盐芽孢杆菌具有耐盐、能形成芽孢、产耐高温耐盐淀粉酶（最适温度60-70℃，耐盐8%NaCl）的特性。下列有关筛选耐盐芽孢杆菌的叙述错误的是（     ） A．该菌产生的淀粉酶宜在65℃条件下保存 B．对培养基和接种环进行灭菌的方法不同 C．可以将10g土样加入90mL一定浓度的灭菌NaCl溶液中进行稀释 D．筛选该菌可以从盐碱地或者盐矿附近获取土样 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】培养基的类型及其应用、其他微生物的分离与计数 【详解】A、酶适宜在低温条件下保存，以降低酶活性同时避免酶空间结构被破坏，65℃属于该淀粉酶的最适温度范围，此时酶活性较高，不适合用于酶的保存，A错误； B、培养基通常采用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环通常采用灼烧灭菌法灭菌，二者灭菌方法不同，B正确； C、将10g土样加入90mL一定浓度的灭菌NaCl溶液中进行稀释，既可以完成土样的梯度稀释前的制备，还可初步筛选耐盐微生物，操作合理，C正确； D、筛选耐盐芽孢杆菌需要从该菌适宜生存的高盐环境取样，盐碱地、盐矿附近属于高盐环境，该菌分布更多，是合适的取样地点，D正确。 4．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·江苏徐州·模拟预测）泡菜中存在大量的乳酸菌，摄入一定量的乳酸菌利于保持肠道菌群平衡，但要发挥良好的保健作用，则要有足够量的活性菌经过胃到达小肠才可实现。下列叙述正确的是（     ） A．平板倒置培养可为乳酸菌生长创造无氧环境 B．图2中过程Ⅰ采用的接种方法可以纯化计数乳酸菌（平板划线法不能计数） C．图2中富集培养所用培养液的pH可控制在1.5左右 D．经图1过程获得了菌落数分别为80、79、81的三个平板，则10毫升陈泡菜水中的活菌数为8.0×106个 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、平板倒置培养的作用是防止皿盖的冷凝水滴落污染培养基、减少培养基水分蒸发，不能为乳酸菌创造无氧环境，A错误； B、图2过程Ⅰ是平板划线法，该方法仅能纯化乳酸菌，无法对活菌进行计数，B错误； C、据题干可知要发挥乳酸菌良好的保健作用，则要有足够量的活性菌经过胃到达小肠才可实现。胃中的pH为1.5左右，故富集培养所用培养液的pH可控制在1.5左右，C正确； D、三个平板的平均菌落数为（80＋79＋81）/3=80个，总稀释倍数为104，涂布体积为0.1mL，每毫升原泡菜水活菌数=C÷V×M（C为平均菌落数、V是涂布液的体积、M是稀释倍数）=80÷0.1×104=8.0×106个，则10毫升陈泡菜水中的活菌数为8.0×107个，D错误。 5．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·广西桂林·三模）研究人员采用图1中甲所示流程获得高耐酒精的高产醋酸菌，其中图2是“纯化培养”后的结果图。下列相关叙述错误的是（　　） A．产醋酸能力最强的醋酸菌菌落是B B．葡萄糖可以为醋酸菌提供碳源和能源 C．自然发酵的甘蔗渣经灭菌后再加入培养基中 D．通过增加酒精浓度进一步筛选高耐酒精的高产醋酸菌 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、其他微生物的分离与计数 【详解】A、醋酸能与培养基中的碳酸钙反应，使菌落周围呈现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明产酸能力越强，与菌落A、C相比，菌落B的该比值最大，因此产醋酸能力最强的菌落是B，A正确； B、葡萄糖是能源物质，含有C、H、O元素，可以为醋酸菌提供碳源和能源，B正确； C、自然发酵的甘蔗渣含有醋酸菌菌株，不能灭菌，C错误； D、通过增加酒精浓度，高耐酒精的高产醋酸菌可以被筛选出来，D正确。 6．（2026·陕西西安·模拟预测）下图表示利用指示菌和测试菌从土壤中筛选产生某种抗生素的目的菌的流程。相关叙述正确的是（　　） A．③过程没有产生透明圈的菌株一定不能产生抗生素 B．③过程挑取菌落时，透明圈直径越大，其产生的抗生素抑制指示菌S的效果越好 C．过程⑤的平板中第2、5号测试菌能产生较强的抗生素抗性，因此第2、5号测试菌为目标菌种 D．过程④划线五种测试菌时，若使用同一个接种环，则每次划线前后均需灼烧，共需灼烧灭菌6次 【答案】D 【难度】0.62 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、③中未观察到抑菌区域的菌株，可能是该菌株产生的抗生素浓度太低，不足以形成肉眼可见的抑菌圈；该抗生素对指示菌S没有抑制作用，但可能对其他菌有抑制作用；抗生素分泌量少，扩散慢，透明圈未形成，A错误； B、抗生素是目的菌产生的，透明圈直径和菌落直径的比值越大，才能说明目的菌产生抗生素抑制指示菌的效果越好，仅看透明圈直径不能确定效果，B错误； C、过程⑤中，测试菌2和5距离产生透明圈菌株的距离近，说明测试菌2、5对指示菌S产生的抗生素具有抗性，该实验中能产生抗生素的菌落才是目标菌种，C错误； D、过程④划线五种测试菌时，若使用同一个接种环，最初划线前需要灼烧一次灭菌，之后每次划线结束后都要灼烧灭菌，划线五次后，还需要再次灼烧杀灭残留菌种，因此总共需要灼烧灭菌6次，D正确。 7．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·山东泰安·三模）臭豆腐一般是以含蛋白质高的优质黄豆为原料，经过泡豆、磨浆、滤浆、点卤、前期发酵、腌制、灌汤、后期发酵等多道工序制成的。其加工制作流程如图所示。下列说法不正确的是（    ） A．上图中卤水发酵的菌种可能来源于B，原因是B未采取灭菌措施 B．取样检测时，按上图所示发酵时间并注意取样时摇匀即可 C．在发酵过程中，由于不止有一种微生物，发酵液的pH前期可能会下降 D．若要对样品中某一菌种计数，适宜采取的方法是稀释涂布平板法 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、其他微生物的分离与计数、腐乳制作的原理 【详解】A、A 中原料经过高温灭菌，而 B是现做熟豆腐片或豆腐脑等，仍含有微生物，因此发酵所需的微生物有可能主要来自 B，A正确； B、微生物发酵过程的取样检测需采取无菌操作，而不仅是摇匀，B错误； C、发酵中常有多种微生物共同作用，前期易因产酸菌的活动导致 pH 下降，C正确； D、微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，若要对样品中某一菌种计数，适宜采取的方法是稀释涂布平板法，D正确。 8．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·吉林松原·模拟预测）为分离土壤中高效降解石油的微生物，科研团队设计了3组培养基（成分如表所示），并对菌株生长情况进行检测。已知石油中烃类物质为主要污染物，且微生物对石油的降解能力与菌株生物量呈正相关。下列叙述正确的是（　　） 培养基编号 碳源 氮源 无机盐（含微量元素） 凝固剂 菌株生物量（相对值） Ⅰ 葡萄糖 硝酸铵 适量 琼脂 85 Ⅱ 石油 硝酸铵 适量 琼脂 32 Ⅲ 石油+葡萄糖 硝酸铵 适量 琼脂 68 A．培养基Ⅰ为选择培养基，能筛选出高效降解石油的菌株 B．培养基Ⅱ中的菌株生物量较低的原因是培养基无碳源 C．培养基Ⅲ中添加葡萄糖可能导致菌株对石油的降解效率下降 D．三组培养基均需先进行高压蒸汽灭菌处理后再调节pH 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、培养基的类型及其应用、无菌技术、其他微生物的分离与计数 【详解】A、筛选高效降解石油的菌株的选择培养基需要以石油为唯一碳源，培养基Ⅰ的碳源为葡萄糖，可支持所有能利用葡萄糖的微生物生长，不属于选择培养基，无法筛选目标菌株，A错误； B、培养基Ⅱ的碳源为石油，并非无碳源，仅能支持可降解石油的微生物生长，因此菌株生物量较低，B错误； C、葡萄糖是更易被微生物利用的碳源，培养基Ⅲ中添加葡萄糖后，微生物会优先利用葡萄糖，减少对石油的分解利用，可能导致菌株对石油的降解效率下降，C正确； D、培养基制备的正确流程为先调节pH，再进行高压蒸汽灭菌，若灭菌后再调节pH会引入杂菌造成污染，D错误。 故选C。 9．【新情境·将科研实情境与知识点相结合】（2026·湖南长沙·一模）饮用水卫生标准规定总菌数小于 100个/mL，且不能检测出大肠杆菌。下列关于饮用水中微生物计数的检测方法的说法，不合理的是（　　） A．将水样滴加到血细胞计数板上，在显微镜下计数 B．取一定量水样过滤，将滤膜贴在平板培养基上，培养后计数 C．在一定水样中加入细胞裂解液，通过检测 ATP 含量来估算微生物数量 D．若在伊红—亚甲蓝培养基上观察到1个金属光泽、深紫色的菌落，则水质不合格 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】其他微生物的分离与计数 【详解】A、血细胞计数板适用于单细胞微生物、血细胞计数，水样中杂菌形态多样，不适用，A 错误； B、滤膜法是水体微生物经典计数法（B），取一定量水样过滤，由于细菌细胞不能透过滤膜，因而可将滤膜贴在平板培养基上，培养后计数，B正确； C、由于细胞中ATP含量是相对稳定的，因此通过检测 ATP 含量来估算微生物数量，C正确； D、伊红 - 亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌，出现金属光泽、深紫色的菌落，说明含大肠杆菌，水质不合格，D正确。 10．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·陕西渭南·三模）塑化剂（DEHP，化学式为C24H38O4）被很多国家认定为毒性化学物质。图为某实验小组从土壤中筛选可降解DEHP细菌的过程。下列叙述错误的是（　　） A．图中多次接种，所使用的方法均为稀释涂布平板法 B．可用DEHP作唯一碳源配制选择培养基筛选目的菌 C．扩大培养时需调控温度、pH、溶氧量等培养条件 D．获取目的菌后，还需经无害化处理才能投入使用 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、培养基的类型及其应用、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、稀释涂布平板法是仅适用于固体培养基的接种方法，作用是分离获得单菌落，图中存在多次接种到液体振荡培养基的操作，该过程不使用稀释涂布平板法，A错误； B、以DEHP为唯一碳源配制选择培养基时，只有能降解利用DEHP的目的菌可以获取碳源生长，其他微生物因缺乏可利用碳源无法存活，可实现筛选目的菌的作用，B正确； C、微生物生长需要适宜的温度、pH、溶氧量等环境条件，扩大培养目的菌时需调控上述条件，满足菌株生长需求，C正确； D、筛选得到的目的菌可能存在致病性、生态入侵等潜在风险，因此投入使用前需要经过无害化处理，避免危害人体和环境，D正确。 11．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·山东聊城·二模）研究者用酸笋开发具有降低胆固醇功能的益生菌。先将酸笋发酵液接种到含有的固体培养基上，筛选出乳酸菌。然后将乳酸菌接种到含有胆固醇的培养液中，筛选出能够降解胆固醇的乳酸菌。下列叙述错误的是（    ） A．胆固醇属于脂质，主要为微生物的生长提供氮源 B．腌制酸笋需要水封，为乳酸菌发酵提供无氧环境 C．将酸笋发酵液用稀释涂布法接种到固体培养基中 D．溶钙圈直径与菌落直径比值大的菌落为目标菌落 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】培养基的成分及其功能、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、脂质的种类及功能 【详解】A、胆固醇属于脂质，含有C、H、O元素，主要为微生物的生长提供碳源，不能为微生物的生长提供氮源，A错误； B、乳酸菌是厌氧菌，腌制酸笋需要水封，为乳酸菌发酵提供无氧环境，B正确； C、可用稀释涂布法将酸笋发酵液接种到固体培养基中，C正确； D、乳酸菌发酵产生的乳酸能与CaCO3发生反应，使CaCO3分解成可溶性物质乳酸钙和气体二氧化碳，导致菌落周围出现透明圈，故溶钙圈直径与菌落直径的比值可代表微生物溶解CaCO3的能力大小，比值越大微生物溶解CaCO3的能力越大，所以溶钙圈直径与菌落直径比值大的菌落为目标菌落，D正确。 12．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·四川宜宾·模拟预测）袋装酸奶的包装上通常都会注明“胀袋勿食”。某同学选择一过期的胀袋密封酸奶，按图中的操作流程，研究其中的某微生物生长情况，下列有关叙述正确的是（　　） A．巴氏消毒法可以杀死牛奶中的所有微生物和芽孢，且基本不破坏牛奶的营养成分 B．酸奶胀袋是由于其中的乳酸菌无氧呼吸产生了CO2 C．利用图示方法向培养基接种前和接种后都要对涂布器进行灼烧灭菌 D．若3个平板的平均菌落数是180个，则1 mL酸奶中该微生物个数为1.8×106个 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、酸奶的制作 【详解】A、巴氏消毒法为低温消毒法，仅能杀死牛奶中的绝大多数有害微生物，无法杀灭芽孢和孢子，且基本不破坏牛奶营养成分，A错误； B、乳酸菌无氧呼吸产物仅为乳酸，不产生CO2，酸奶胀袋是杂菌代谢产生CO2导致的，B错误； C、涂布器接种前灼烧灭菌可杀灭杂菌，避免污染培养基；接种后灼烧灭菌可杀灭残留微生物，避免污染环境，因此接种前后都需要对涂布器灼烧灭菌，C正确； D、由流程可知酸奶总稀释倍数为104，取0.2mL稀释液涂布，1mL酸奶中微生物数为（180÷0.2）×104=9×106个，并非1.8×106个，D错误。 二、解答题 13．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·甘肃武威·模拟预测）细菌性传染病已成为制约骆驼产业健康发展的关键因素。某机构针对分离自某地区骆驼场发热骆驼血液的菌株开展研究，内容聚焦病原微生物的精准鉴定、耐药特征解析及致病机制研究三大核心问题。回答下列问题： （1）采用无菌技术采集某地区骆驼场发热骆驼血液样本，并将血液样本用___________（填工具名称）均匀涂布于BHⅠ琼脂平板，室温静置干燥后，将平板___________于37℃恒温箱内孵育18～24h，完成初代培养。随后，选取典型单菌落进行纯化培养，经二次分离后，挑取优势菌落转接至血琼脂平板观察形态特征，进一步通过革兰染色、镜检，筛选出1株革兰阳性球菌。在纯化培养时，可采用___________（填两种方法名称）将单个微生物分散在固体培养基上。 （2）通过PCR技术对分离菌株进行12种耐药基因的检测，扩增结果如图所示。由图可知，分离菌株携带___________种耐药基因。扩增过程中，在DNA聚合酶作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的___________端。这些耐药基因的引物序列互不相同，故在每次扩增循环时，___________的温度可能不同。 M．Trans2000  DNA  Marker；N．阴性对照；1~12．分别为mecA、blaTEM-1、blaCMY-2、ermA、ermB、ermC、tetM、aacA-aphD、aadA1、glrA、qnr、sul1。 （3）研究分离菌株致病机制时，将25只健康小鼠随机分为5组：对照组（生理盐水）及4个实验组（菌液浓度梯度为2.2×106~2.2×109CFU/mL，用___________配制）。各组小鼠腹腔注射0.2mL相应浓度菌液或生理盐水，连续观察14d，记录死亡情况并即时剖检死亡个体，开展__________________、病理学观察及组织切片制备等。 【答案】(1) 涂布器 倒置 平板划线法、稀释涂布平板法 (2) 8 3′ 复性/退火 （3） 无菌生理盐水 病原菌分离鉴定 【难度】0.51 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、PCR扩增的原理与过程 【详解】（1）对菌液进行涂布平板时，使用涂布器使菌液均匀分布在固体培养基，微生物恒温培养时，为防止冷凝水滴落污染培养基，需要将平板倒置后孵育，纯化培养时，可通过平板划线法、稀释涂布平板法，将单个微生物分散在固体培养基上，获得单菌落。 （2）电泳图中，出现目的条带说明对应耐药基因存在，计数1~12号泳道的不同阳性条带，共8个，因此该菌株携带8种耐药基因。DNA子链合成方向为5'→3'，DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸连接到引物的3'端，不同引物的碱基序列不同，与模板DNA结合的最适温度不同，因此每次扩增循环中退火（复性）的温度可能不同。 （3）实验需要遵循单一变量原则，对照组注射无菌生理盐水，因此实验组的菌液需要用无菌生理盐水配制。对死亡小鼠剖检后，需要先分离鉴定病原菌，再开展病理学观察等后续研究。 14．【新情境·将科研情境与知识点相结合】（2026·四川宜宾·模拟预测）青霉素可采用深层通气、分批补料、变温发酵等技术以青霉菌（多细胞丝状真菌）为生产菌株进行生产，细胞中青霉素合成流程如图1所示，回答下列问题： （1）由于青霉菌是需氧菌，需要采用深层通气____（填“液体”或“固体”）发酵技术，在发酵过程中，可通过__________措施（写出1点）对青霉菌持续高效供氧。 （2）结合图1，为使青霉菌只生产青霉素可采取的措施是__________；发酵结束后，根据青霉素的性质采取适当的提取、______措施（写出2个）来获得青霉素产品。 （3）在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉，因此发酵过程中所需的_______（写出2个）都必须经过严格的灭菌。在发酵过程中，要随时检测培养基中的____________和______等，以了解发酵的进程。可用_______（填“大肠杆菌”或“酵母菌”）为指示菌检测青霉素的产量。 【答案】(1) 液体 （通入无菌压缩空气）增大通气量、搅拌、提高罐压，将血红蛋白基因导入青霉菌等（其他合理答案也可得分） （2） 敲除扩环酶基因（或敲除差向异构酶基因、均敲除，或抑制扩环酶、差向异构酶活性） 分离和纯化 （3） 培养基（液）和发酵设备 微生物数量 产物浓度 大肠杆菌 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、其他微生物的分离与计数、发酵工程的应用 【详解】（1）青霉菌是需氧菌，需要采用深层通气液体发酵技术，在发酵过程中，可通过增大通气量增加发酵罐内氧气含量，也可通过不断搅拌增大发酵液中的溶解氧，提高罐压可增大氧分压增大发酵液中的溶解氧，还可将血红蛋白基因导入青霉菌提高氧气的利用率等。 （2）敲除扩环酶基因或差向异构酶基因（或抑制扩环酶、差向异构酶活性），使异青霉素N全部用来生成青霉素。发酵结束后，根据青霉素的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得青霉素产品。 （3）在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉，因此培养基（液）和发酵设备都必须经过严格的灭菌。在发酵过程中，要随时检测培养基中的微生物数量和产物浓度等，以了解发酵的进程。由于青霉素是抗生素，会抑制细菌增殖，但对真菌不起作用，所以应使用大肠杆菌为指示菌检测青霉素的产量。 15．【新情境·将生活真实情境与知识点相结合】（2026·河南南阳·模拟预测）酸奶中的益生菌对改善肠道有益菌群的平衡有帮助。某酸奶中标注的参与发酵的乳酸菌类群有：保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等。回答下列问题： （1）酸奶是以新鲜的牛奶为原料，加入一定比例的蔗糖，经密封发酵而成的一种奶制品。发酵过程中，对发酵装置进行密封的目的是________。 （2）为鉴别市售酸奶中的菌种，工作人员采用稀释涂布平板法在固体培养基上进行接种，该方法中用到的接种工具是________。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是________。 （3）图甲采用了________法接种和分离微生物，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是________。 （4）研究小组在培养基灭菌后加入了碳酸钙粉末，乳酸菌产生的乳酸与碳酸钙反应会产生透明圈，从而筛选出了高产的乳酸菌菌株。图乙中降解碳酸钙能力最强的菌株是________，理由是________。 【答案】(1）乳酸菌是厌氧菌，保持无氧环境有利于乳酸菌的代谢和繁殖 （2） 涂布器 检测培养基平板灭菌是否合格 （3） 平板划线 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 （4） 菌株2 透明圈直径与菌落直径比值最大 【难度】0.72 【知识点】无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、酸奶的制作 【详解】（1）乳酸菌是厌氧型微生物，只有保持无氧环境有利于乳酸菌的代谢和繁殖，密封发酵装置的目的就是隔绝氧气，为乳酸菌提供无氧环境。 （2）稀释涂布平板法的接种工具是玻璃涂布器；接种前培养空白平板，若空白平板长出菌落，说明培养基灭菌不彻底、已经被杂菌污染，因此该操作目的是检测培养基平板灭菌是否合格。 （3）据图甲中菌体的分布，可知图甲采取了平板划线的方法进行接种。第二次及以后划线时，从上一次的末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释，使菌液中的细菌数量越来越少，最终获得由单个细菌繁殖而来的单个菌落。 （4）乳酸能与培养基中的碳酸钙反应产生透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明菌株产生的乳酸越多，降解碳酸钙的能力越强。图乙中菌株 2 的透明圈直径与菌落直径比值最大，因此降解碳酸钙能力最强。 高考真题·考向感知 一、单选题 1．（2026·广东·高考真题）“酵母菌的纯培养”实验中，下列操作不规范的是（     ） A．在火焰旁冷却接种环 B．试管棉塞放超净台上 C．接种前灼烧试管口 D．划线时轻柔而迅速 【答案】B 【难度】0.95 【知识点】无菌技术、微生物的接种方法 【详解】A、接种环灼烧灭菌后需在酒精灯火焰旁的无菌区冷却，既可以避免高温烫死待接种的酵母菌，也能防止接种环被环境杂菌污染，操作规范，A不符合题意； B、试管棉塞放在超净台台面上时，会被台面上可能存在的杂菌污染，后续塞回试管时会造成培养基、菌种污染，正确操作应将棉塞夹在手指缝隙中，该操作不规范，B符合题意； C、接种前灼烧试管口可以杀灭试管口附着的杂菌，避免杂菌侵入试管内部污染培养物，属于标准无菌操作，C不符合题意； D、划线时动作轻柔可防止划破固体培养基表面影响菌落分离，动作迅速可减少培养物和空气的接触时间，降低杂菌污染概率，操作规范，D不符合题意。 2．（2026·河南·高考真题）自然界存在着甲、乙两种降解PET塑料（含碳有机物）的细菌。为筛选这两种细菌，并探究两种细菌的协同降解效果，研究人员进行了相关实验。下列叙述错误的是（　　） A．为筛选出目的菌，培养基应以PET塑料为唯一碳源 B．细菌纯培养时，需用涂布器蘸取单个菌落进行涂布 C．利用显微镜直接计数，可估算出菌悬液中细菌的总数 D．探究甲、乙降解效果的协同性，至少需设三个实验组 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】培养基的类型及其应用、其他微生物的分离与计数、验证性实验与探究性实验 【详解】A、以PET为唯一碳源的选择培养基中，只有能分解利用PET的目的菌可以获取碳源存活繁殖，其他微生物无法生长，能实现目的菌的筛选，A正确； B、细菌纯培养时，涂布器的作用是将梯度稀释后的菌悬液均匀涂布在培养基表面；若要利用单个菌落进行纯培养，应使用接种环挑取单个菌落，进行平板划线或接种到液体培养基中，不能用涂布器蘸取单个菌落涂布，B错误； C、使用血细胞计数板可在显微镜下直接统计单位体积菌悬液中的细菌数量（含活菌和死菌），能够估算菌悬液的细菌总数，C正确； D、探究甲、乙的协同降解效果，需要设置单独接种甲、单独接种乙、同时接种甲和乙三个实验组，对比三组的降解效果才可判断是否存在协同作用，因此至少设三个实验组，D正确。 3．（2026·安徽·高考真题）某种营养缺陷型细菌在完全培养基上能生长，但在基本培养基上需添加组氨酸才能生长。将等量的营养缺陷型菌株涂布到两种培养基上（基本培养基中添加了少量组氨酸供细菌繁殖，但不足以形成菌落），再分别放入含低浓度和高浓度物质M的滤纸片，培养一段时间后菌落的生长情况如图。下列叙述正确的是（　　） A．固体培养基配制后需要采用干热灭菌法进行灭菌 B．牛肉膏蛋白胨培养基能用于培养该营养缺陷型细菌 C．物质M有诱变作用，菌落a中细菌合成蛋白质时不需要组氨酸 D．物质M有抑制作用，抑菌圈边缘的菌落多数能在基本培养基上生长 【答案】B 【难度】0.55 【知识点】基因突变、培养基的类型及其应用、无菌技术 【详解】A、培养基需要采用湿热灭菌法进行灭菌，A错误； B、牛肉膏蛋白胨培养基中含有微生物生长所需的碳源、氮源（包括组氨酸在内的有机氮源）、磷酸盐和维生素等，属于完全培养基，因此牛肉膏蛋白胨培养基能用于培养该营养缺陷型细菌，B正确； C、已知基本培养基中添加了少量组氨酸供细菌繁殖，但不足以形成菌落，据图示可知，基本培养基上只有滤纸片周围出现了少数的几个菌落a，其他部位的营养缺陷型菌体没有形成菌落，因此可推测低浓度的物质M具有诱变作用，可使营养缺陷型菌体突变为可自身合成组氨酸的突变体，该突变体可利用自身合成的组氨酸合成蛋白质，因此可形成菌落a，并非菌落a中细菌合成蛋白质时不需要组氨酸，C错误； D、根据右图可知，含有高浓度M的滤纸片周围缺陷型菌体不能生长形成菌落，说明物质M有抑制作用，即使M有诱变作用，但由于基因突变的频率较低，因此抑菌圈边缘的菌落大多数仍为缺陷型菌体，不能在基本培养基上生长，D错误。 4．（2025·广西·高考真题）利用微生物分解厨余垃圾可实现资源的再利用。下列说法错误的是（　　） A．厨余垃圾分解过程产生的热量，会影响分解效率 B．对组成复杂的厨余垃圾再分类，可提高利用效率 C．厨余垃圾中的淀粉，可作为微生物的碳源和氮源 D．含盐量高的厨余垃圾，可选用耐高盐的微生物分解 【答案】C 【难度】0.85 【知识点】培养基的成分及其功能、分解纤维素的微生物的分离 【详解】A、微生物分解有机物时通过呼吸作用释放热量，若温度过高可能导致酶活性下降，从而影响分解效率，A正确； B、厨余垃圾成分复杂，分类后可根据不同成分选择适宜微生物或处理条件，提高分解效率，B正确； C、淀粉由C、H、O组成，仅含碳元素，可为微生物提供碳源，但无法提供氮源（氮源需含N元素），C错误； D、高盐环境会抑制普通微生物生长，但耐高盐微生物（如嗜盐菌）可适应此环境并分解有机物，D正确。 故选C。 5．（2025·贵州·高考真题）金龟子绿僵菌（Ma）是一种昆虫病原真菌，可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子（单细胞后代）萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素，导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是（　　） A．可利用Ma开发成微生物杀虫剂 B．为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样 C．稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma D．接种培养Ma时使用的器具需消毒 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】无菌技术、微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【详解】A、金龟子绿僵菌（Ma）作为昆虫病原真菌，可通过寄生导致害虫死亡，符合微生物杀虫剂的特点，可用于生物防治，A正确； B、僵化死亡的昆虫体内含有大量Ma菌体，因此从研磨的僵虫组织取样是分离Ma的合理方法，B正确； C、稀释涂布平板法可通过梯度稀释和菌落形成来分离纯化微生物，适用于分离样品中的Ma，C正确； D、微生物培养中，接种环等直接接触菌种的器具需严格灭菌（如灼烧灭菌），而非仅消毒，消毒无法彻底杀灭微生物的芽孢或孢子，D错误。 故选D。 6．（2025·四川·高考真题）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X:Y=1:1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率=剩余量/添加量×100%），结果如下图。下列叙述正确的是（    ） A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数 B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高 C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种 D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数 【分析】接种最常用的方法： （1）平板划线分离法：由接种环以菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 （2）稀释平板法：首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。 【详解】A、平板划线法主要用于微生物的分离和纯化，不能用于测定活菌数，测定活菌数常用稀释涂布平板法，A错误； B、Y菌组微塑料残留率较高，说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱，而不是菌浓度高，微塑料残留率与菌对微塑料的降解能力有关，而非直接与菌浓度相关，B错误； C、由图可知，X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组，说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种，C正确； D、该培养基中含有蛋白胨，能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等，但不一定都能降解微塑料，D错误。 故选C。 7．（2025·湖南·高考真题）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（　　） A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数 B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照 C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸 D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质 【答案】B 【难度】0.85 【知识点】培养基的类型及其应用、微生物的接种方法、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、果酒和果醋的制作原理 【分析】微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线主要是用来纯化的，稀释涂布主要用来计数；此外，利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，制备选择培养基，从而使该微生物大量增殖，也可用于微生物的分离和纯化。 【详解】A、稀释涂布平板法可通过菌落数进行计数，而平板划线法仅用于分离纯化菌种，无法计数，A错误； B、平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照，以验证培养基灭菌是否彻底，B正确； C、醋酸菌为严格好氧菌，其代谢需氧气，无氧条件下无法将葡萄糖转化为乙酸，C错误； D、筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源，若含蛋白胨（含其他氮源），则无法筛选目标菌，D错误。 故选B。 8．（2025·江苏·高考真题）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（    ） A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌 B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布 C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线 D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存 【答案】B 【难度】0.85 【知识点】无菌技术、微生物的接种方法、微生物的培养与菌种保藏 【分析】微生物常见的接种方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，紫外线仅用于表面或空气消毒，无法灭菌，A错误； B、将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确； C、连续划线时，每次应从上次划线的末端开始，以逐步稀释菌体，若从起始端开始无法有效分离单菌落，C错误； D、斜面培养基保存菌种需置于4℃短期保存，长期保存应使用甘油管藏法（-20℃），室温下无法长期保存，D错误。 故选B。 9．（2025·福建·高考真题）下列高中生物学实验的部分操作，正确的是（    ） 选项 实验名称 实验操作 A 探究抗生素对细菌的选择作用 涂菌前，需将抗生素均匀涂抹在培养基平板上 B 制作果酒和果醋 当葡萄酒制作完成后，需拧紧瓶盖，促进葡萄醋的发酵 C 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 稀释土壤样品时，每个梯度稀释时都需更换移液器枪头 D DNA片段的扩增及电泳鉴定 接通电源后，看到DNA条带迁移至凝胶边缘时，停止电泳 A．A B．B C．C D．D 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】无菌技术、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、果酒和果醋的制作原理、PCR扩增的原理与过程 【详解】A、抗生素不能涂抹在培养基上，而是将含有少量细菌的培养液均匀涂抹在培养基上，将培养皿分成4个区域，在3个区域放含有抗生素的纸片，在另外一个区域放不含抗生素的纸片，A错误； B、制作果醋需在有氧条件下进行，拧紧瓶盖会抑制醋酸菌（需氧型）的发酵，B错误； C、稀释涂布平板法中，更换枪头可避免不同浓度菌液交叉污染，确保稀释梯度准确，C正确； D、DNA电泳应通过指示剂（如溴酚蓝）判断停止时间，若DNA迁移至凝胶边缘可能已流失，D错误。 故选C。 10．（2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（    ） A．镍是组成脲酶的重要元素 B．镍能提高尿素水解反应的活化能 C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 【答案】B 【难度】0.85 【知识点】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【分析】1、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 【详解】A、根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确； B、脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误； C、产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确； D、产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。 故选B。 11．（2019·江苏·高考真题）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是 A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养 B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌 C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力 D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值 【答案】A 【难度】0.85 【知识点】分解纤维素的微生物的分离 【分析】纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 【详解】应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A错误；木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B正确；用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高饲用价值，D正确。故选A。 二、解答题 12．（2026·江西·高考真题）检测食品中维生素B12(VB12）的含量具有重要意义。微生物法是一种检测VB12含量的常用方法，其基本原理是测试菌的生长依赖VB12，培养的生物量与培养基提供的VB12量成对应关系，流程如图（培养物OD值是一种能反映菌体浓度的测量指标，与菌体浓度正相关）。 回答下列问题： （1）图中液体培养基（b）与（c）________（选填“相同”或“不相同”）。 （2）制备测试菌液的“洗涤”和“重悬”操作需使用________溶液，以防止杂菌污染、保证菌体活性。 （3）在“检测食品中的VB12含量”过程中需设计空白（阴性）对照实验，其培养管内包括________[选填序号①液体培养基（c）；②测试菌液；③一定浓度的VB12；④待测样品液；⑤用于提取VB12的溶液]；同时还需设计“不接种测试菌液”的培养管作为另一组对照实验，具体目的是___________________________________。 （4）实验中需每隔一段时间检测培养物OD值。当OD值________时才能用于计算食品中VB12浓度，原因是___________________________________。 【答案】(1）不相同 （2）无菌等渗 （3） ①②⑤ 检测培养基和培养过程是否被杂菌污染，排除杂菌污染对OD值检测结果的干扰 （4） 稳定不再变化 VB12是测试菌生长的限制因子，只有当菌体生长达到稳定期，菌体浓度不再改变，OD 值才能稳定，OD值才能与VB12浓度形成稳定对应关系，保证计算结果准确 【难度】0.48 【知识点】培养基的成分及其功能、无菌技术、微生物的培养与菌种保藏、其他微生物的分离与计数 【详解】（1）液体培养基（b）用于培养活化测试菌，需要含有VB12才能供测试菌生长繁殖；液体培养基（c）用于检测样品中VB12含量，本身不含VB12，因此二者成分不相同。 （2）无菌的等渗溶液，可维持菌体正常形态和活性，同时无菌条件能防止杂菌污染，符合操作要求。 （3）阴性空白对照的目的是排除提取VB12的溶剂本身对实验的影响，因此需要保留液体培养基（c）、测试菌液，用提取VB12的溶液代替待测样品液，故选①②⑤。不接种测试菌的对照，可通过OD值变化判断培养体系是否被杂菌污染，排除杂菌对结果的干扰。 （4）该方法依靠最终菌体生物量反映初始VB12浓度，VB12是测试菌生长的限制因子，只有当菌体生长达到稳定期，菌体浓度不再改变，OD 值才能稳定，OD值才与VB12浓度形成稳定对应关系，保证计算结果准确。 13．（2025·北京·高考真题）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。 （1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的_______，诱发基因突变。 （2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的_______性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。 （3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。 由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有_______作用。 （4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M产量，统计结果如下表。 组别 I II Ⅲ IV V VI 筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15 所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3 ①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因________________。 ②表中Ⅲ组和V组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有_______（多选）。 A、Ⅲ组中有野生型菌落，而V组中没有野生型菌落 B、V组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有 C、与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在V组中被抑制 D、与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在V组中被抑制 综上所述，用____________粗提液筛选是获得M+株的有效方法。 【答案】(1）碱基序列（或脱氧核苷酸序列） （2）随机性、不定向 （3）抑制 （4） Ⅳ组粗提取液浓度高于Ⅲ组，野生型孢子萌发率为0，没有野生型菌落，Ⅲ组中有野生型菌落 ACD 10 mL/100mL 【难度】0.4 【知识点】基因突变、其他微生物的分离与计数 【分析】基因突变的原因主要有以下两类： 外因： 物理因素：如紫外线、X 射线及其他辐射，这些射线能损伤细胞内的 DNA，改变其碱基序列引发突变。 化学因素：像亚硝酸、碱基类似物等，可改变核酸的碱基，从而导致基因突变。 生物因素：某些病毒的遗传物质能影响宿主细胞的 DNA，引发突变。 内因：DNA 复制过程中，偶尔会发生碱基对的增添、缺失或替换，导致基因结构改变，引发基因突变 。 【详解】（1）紫外线和亚硝酸均通过改变 DNA 的碱基序列（或脱氧核苷酸序列），诱发基因突变。因为基因突变是指 DNA 分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而这些处理会影响 DNA 的碱基组成和排列顺序。 （2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的随机性、不定向性，M＋株在全部突变体中的占比低。要获得 M＋株，需进行筛选。基因突变具有不定向性，即一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因，所以即使发生了基因突变，也不一定是我们想要的 M＋株。 （3）由图可知，随着培养基中粗提液浓度的升高，野生型孢子萌发率下降，所以粗提液对野生型孢子萌发有抑制作用。 （4）①Ⅳ 组粗提液浓度高于 Ⅲ 组，结合前面得出的粗提液对孢子萌发有抑制作用，且M＋株可能对粗提液有更强的耐受性，所以在较高浓度的粗提液下，更多的野生型孢子萌发受抑制，而 M＋株相对更容易存活，导致 Ⅳ 组 M＋株占比明显高于 Ⅲ 组。 ②A、Ⅲ组粗提液浓度较低，对野生型孢子抑制作用较弱，筛选平板上有野生型菌落，据（3）表可知，Ⅴ组粗提液浓度较高，野生型孢子萌发率为0，筛选平板上没有野生型菌落，A 正确； B、Ⅲ 组和 V 组中都可能有 M 产量未提高的突变体菌落，B 错误； CD、与Ⅲ组相比，Ⅳ、Ⅴ组粗提液浓度较高，筛选平板上的菌落可能均为突变体，但Ⅵ组M+株显著少于Ⅳ组，说明诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体株在Ⅴ组中被抑制，CD正确。 故选ACD。 据表可知，用10 mL/100mL_粗提液筛选是获得M+株的有效方法。 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $ 第42讲 微生物的培养技术和应用 （天津专用） 分层专练·靶向攻关 两年模拟·基础通关 参考答案 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 D C D A A A C A B A 题号 11 12 13 答案 A B D 14．(1) 使温度控制在30℃（利于谷氨酸棒状杆菌发酵） 谷氨酸棒状杆菌为需氧型微生物（或搅拌能增加发酵液中的溶解氧，可使其与营养物质充分接触利于该菌发酵） (2)若谷氨酸积累过量，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性（从而导致该合成途径中断） (3)3.3×109 (4) 平板划线 颜色（或形状、隆起程度） (5)AC 15．(1) 稀释涂布平板 小 酸 (2)发酵罐内发酵 (3) 随机取若干灭菌的空白平板进行培养，一段时间后观察平板是否出现菌落 维生素B1 3组与5组的交界处 一年重难·情境应用 参考答案 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 C D A C C D B C A A 题号 11 12 答案 A C 13． (1) 涂布器 倒置 平板划线法、稀释涂布平板法 (2) 8 3′ 复性/退火 (3) 无菌生理盐水 病原菌分离鉴定 14． (1) 液体 （通入无菌压缩空气）增大通气量、搅拌、提高罐压，将血红蛋白基因导入青霉菌等（其他合理答案也可得分） (2) 敲除扩环酶基因（或敲除差向异构酶基因、均敲除，或抑制扩环酶、差向异构酶活性） 分离和纯化 (3) 培养基（液）和发酵设备 微生物数量 产物浓度 大肠杆菌 15． (1)乳酸菌是厌氧菌，保持无氧环境有利于乳酸菌的代谢和繁殖 (2) 涂布器 检测培养基平板灭菌是否合格 (3) 平板划线 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 (4) 菌株2 透明圈直径与菌落直径比值最大 高考真题·考向感知 参考答案 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 B B B C D C B B C B 题号 11 答案 A 12．(1)不相同 (2)无菌等渗 (3) ①②⑤ 检测培养基和培养过程是否被杂菌污染，排除杂菌污染对OD值检测结果的干扰 (4) 稳定不再变化 VB12是测试菌生长的限制因子，只有当菌体生长达到稳定期，菌体浓度不再改变，OD 值才能稳定，OD值才与VB12浓度形成稳定对应关系，保证计算结果准确 13．(1)碱基序列（或脱氧核苷酸序列） (2)随机性、不定向 (3)抑制 (4) Ⅳ组粗提取液浓度高于III组，野生型孢子萌发率为0，没有野生型菌落，Ⅲ组中有野生型菌落 ACD 10 mL/100mL 20 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $