第二十章 基因工程-【创新教程】2022-2026五年高考生物真题分类特训

第二十章基因工程 1.BD对比A基因和a基因的序列，A基因中 “AAGCTT”变为a基因中“AAGCTG”,是碱基替换(T →G),并非碱基增添，A错误；HindⅢ切割产生黏性末 端，AlI切割后产生的是平末端，二者末端类型不相 同，B正确；观察图中a基因，HimdⅢ有2个切割位点，切 割后会产生1个片段，A1uI有3个切割位点，切割后会 产生2个片段，一个片段长度是200bp左右，另一个是 400bp左右，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的 片段大小不一致，C错误；因为正常基因A和致病基因 的HidⅢ切割位，点不同，所以产前诊断时，该致病基因 可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 2.D图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有 ScaI和PuI的酶切位，点，四环素抗性基因(TetR)内含 有HindⅢ、SphI和SalI的酶切位点。A,若用HindⅢ 酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的 产物可能不同，A正确。B.若用PuI酶切，重组质粒 和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四 环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确： C.DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段， 重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成 功与否，C正确；D.ShI的酶切位点位于四环素抗性基 因中，若用ShI酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基 因(Amb),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄 青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不 能形成菌落，D错误。 3.C构建基因表达载体是基因工程的关键步骤，选择好 工具是这一步的关键。选择酶的时候需要满足：①质粒 与目的基因形成的末端是可以配对的。需要注意不 定用同一种酶，只要末端可以连接即可；②T4DNA连接 酶能连接两种末端，而E.coli DNA连接酶只能连接黏 性末端；③不能破坏质粒上所需要的结构，比如标记基 因、启动子等等。A.E.coli DNA连接酶不能连接平末 端，A错误；B.末端不相同，不能连接，B错误；C,用两种 酶切割，可以防止反向连接，是效率比较高的选择，C正 确：D.酶4会破坏抗生素抗性基因也就是破坏了标记基 因，不能使用，D错误。 4.解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能 够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必 需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞 中能自我复制。 (2)要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选 择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保 留。由图可知，基因W和载体上都有SalI的识别序列 和切割位，点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基 因失活，因此不能选用。若选用PstI和KpnI,酶切后 产生的黏性末端为3端突出，若要重新从重组载体上切 下，PstI切割载体后要加同聚物G尾，KpnI切割载体 后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完 整的识别序列而再次进行切割。若选用Xh0I,酶切后 产生的黏性末端为5'端突出，可以先用DNA聚合酶补 平，若要在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而 再次进行切割，则要加同聚物G尾。为了将质粒和基因 W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对， 故应选择KpnI和XhoI。 (3)由于用XhoI进行切割会产生黏性末端为5'端突出， 形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基 因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二 者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重 组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和 231 详解详析 DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因 是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合 酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 (4)检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的 产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原一抗体 杂交。 答案：(1)启动子复制原点 (2)KbnI、XhoI (3)DNA聚合酶、DNA连接酶不需要。同聚物尾配对 后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末 端延伸合成互补链，无需引物起始 (4)抗原一抗体杂交 5,解析：(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的 磷酸基团位于5′端，一OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸 链的两端基团有误：DNA连接酶能催化合成磷酸二酯 键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧 核苷酸链的3'端的一O)H相连，④符合题意。故选④。 答案：(4)④ 6.B受精卵具有发育的全能性，选用受精卵进行基因敲 除，突变的基因可随细胞分裂传递给子代个体，A正确； F。个体基因型为RR,杂交培育时，F的基因型为RR、 RR,无法获得纯合突变体(RR),最早需在F,中获 得，B错误；R基因编码序列缺失4个碱基，会导致移码 突变，使编码的氨基酸序列改变，纯合突变体可用于研 究R基因的功能，C正确；突变体体型变小、体色变浅， 说明R基因的功能影响多个性状，体现了一因多效，D 正确。 7.D蛋白质工程从预期蛋白质功能出发，经结构设计、氨 基酸序列推导最终改造对应基因，再通过基因表达获得 改造蛋白，整个过程遵循中心法则即遗传信息传递的一 般规律，A正确：酶的专一性指酶只能催化一种或一类 化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后 的甲无其可作用的位，点因此不能被水解，体现了酶的专 一性，B正确；改造后甲仍保持杭体活性，第96位精氨酸 未被替换，推测该位，点可能与抗体的功能密切相关，替 换后可能导致抗体活性丧失，C正确：密码子简并性是指 同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27 位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的 密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发 生改变，D错误。 8.C使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高 转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的 是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未 重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白 色和蓝色菌落数，A正确：如果筛选平板中仅含卡那霉 素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可 能是导入了重组质粒（含目的基因），也可能是其他情况 导致B一半乳糖苷酶基因不能正常表达而呈现白色，所 以不可判定为含目的基因的菌株，B正确：筛选平板中长 出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因）， 但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达 目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标 蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因 可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因 为自身环化的质粒K中B一半乳糖苷酶基因完整，能表 达活性B一半乳糖苷酶，分解X一g照l形成蓝色菌落，D 正确。 9.解析：(1)恒温培养箱内的C(),用于维持培养液的pH, 若CO,不足，培养液pH会异常；乳腺癌细胞为癌细胞， 失去了接触抑制现象：胰蛋白酶可分解细胞间的蛋白 最新真题分类特训·生物学 质，使贴壁细胞分散，处理时间过长会分解细胞膜上的 蛋白质，导致细胞损伤或死亡。 (2)构建重组质粒时，结合P基因转录方向与质粒酶切 位点，上游、下游引物依次选择③和④：探究P基因的作 用时，对照组应将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细 胞，排除质粒载体本身对实验的干扰。 (3)S基因可抑制肿瘤增殖，P蛋白能诱导S基因的启动 子甲基化，基因启动子甲基化会抑制基因的转录，因此P 基因抑制S基因的转录，解除S基因对肿瘤增殖的抑制 作用，进而促进肿瘤耐药。 答案：(1)H;不会：胰蛋白酶会分解细胞膜上的蛋白质，处 理时间过长会导致细胞损伤或死亡 (2)③和④：将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞（或 不导入质粒的乳腺癌细胞)》 (3)抑制：促进 10.解析：(1)载体要保证目的基因正常复制，必须含有复 制原，点(DNA复制的起始位，点)。基因表达过程中，启 动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于 保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载 体比克隆载体多了启动子和终止子。 (2)结合目的基因两瑞黏性末端和限制酶切割序列分 析：目的基因一端黏性末端为TCGA,与XhoI切割产 生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoI;另一端黏 性末端为CATG,与NcoI切割产生的黏性末端匹配， 因此限制酶2为NcoI。 (3)根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子 越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体 总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段 和1512bp的目的基因片段：目的基因长度小于载体 长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 (4)工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应 环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速 增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 答案：(1)复制原点终止子终止目的基因的转录 (2)Xho I Nco I (3)b重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到 3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段； DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移 更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大 量增加，合成的4GT总量升高 11.解析：(1)固体培养基能实现单菌落分离，是微生物纯 化的关键，故黑曲霉菌种的分离纯化应选用固体培 养基。 (2)根据题图1所示，片段A和片段C的转录产物可以 进行碱基互补配对形成链内双链结构，最终造成CreA mRNA降解，使其不能翻译出CreA蛋白。在引物上添 加限制酶识别序列时，应添加到引物的5'瑞。根据题 千信息，CreA基因D片段PCR扩增的部分产物酶切后 连接到载体中A所在的位置时，选用的限制酶为 KnI和SpeI;另一部分PCR扩增的产物应反向构 建到载体中C的所在位置，这样两个片段的转录产物 才可以互补配对，形成RNA链内双链结构，所以限制酶 ①应该是Sacl。 (3)基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、目的 基因和标记基因等。标记基因一般是抗生素抗性基 因，故进行筛选时需要在培养基中添加相应的抗生素， 利用选择培养基筛选出转基因成功的菌。 (4)根据题图2，G1淀粉酶活力远远高于G淀粉酶活 力，但G】生物量和G生物量比较接近。 23 (5)传统工艺将淀粉变成葡萄糖需要一系列步骤，而基 因工程获得的菌株G]淀粉酶活性高，可以简化操作流 程，同时可以在较温和的条件下快速获得更多葡萄糖。 答案：(1)固体 (2)碱基互补配对5'SacI (3)标记选择 (4)G1淀粉酶活力远远高于G淀粉酶活力；G1生物量 与G生物量比较接近 (5)不需要复杂的工艺化处理，简化了步骤：作用条件 较温和且产量高 12.解析：(1)①CARA细胞能特异性识别、吞噬和降解A3 (B一淀粉样蛋白)聚集体，据此可推知，图a中CAR基 因编码序列中胞外识别区表达产物能特异性识别A3 聚集体，此时A3聚集体作为抗原，所以胞外识别区应 选用AB聚集体的抗体特定片段编码序列，这样细胞才 能识别A3聚集体。 ②分析图a,特异性启动子能启动CAR基因编码序列 表达，使用特异性启动子能确保CAR基因编码序列只 在星形胶质细胞内表达，避免CAR基因在其他类型细 胞中表达，减少非特异性损伤。为使CAR基因正确插 入病毒载体，应使用双酶切，可避免自身环化，同时需 要通过绿色荧光蛋白示踪CAR基因成功导入星形胶 质细胞，故病毒载体需保留GFP基因，因此不能选择 HimdⅢ切割病毒载体；为保证CAR基因在星形胶质 细胞中特异性表达，需将特异性启动子和CAR基因编 码序列同时插入病毒载体，并且破坏病毒载体上的非 特异性启动子，则应选择限制酶KpnI和BamH I构 建基因表达载体。 (2)用含A3聚集体的培养基培养CAR-A细胞，让细胞 吞噬并降解AB聚集体，一段时间后更换不含A3聚集 体的培养基继续培养，为鉴定CARA细胞能吞噬和降 解A3聚集体，应检测0h和24h细胞内的A3聚集体 含量，检测0h细胞内A3聚集体含量的目的是确认 CARA细胞是否吞噬了AB聚集体并提供初始对照数 据，检测24h细胞内A3聚集体含量，与0h的对照，以 确定细胞是否降解AB聚集体，C正确。 (3)该实验组的处理为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠 注射携带CAR基因的病毒，为遵循单一变量原则，对 照组的处理应为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射 没有携带CAR基因的病毒；该实验结果为实验组模型 小鼠大脑A3聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白相对 表达量下降，说明携带CAR基因的病毒可减少阿尔茨 海默病模型小鼠大脑内A3聚集体，减轻神经元损伤， 对阿尔茨海默病具有治疗效果。 答案：(1)①抗体②使CAR基因编码序列在星形胶 质细胞中特异性表达Kpnl、BamHI (2)C (3)没有携带CAR基因的病毒携带CAR基因的病毒 能减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑的AB聚集体，减轻 神经元损伤 13.解析：(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据 库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发 布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检 索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或 基因数据库中查询基因VⅣ的编码序列，设计特定引物。 保证基因N与质粒力YL正确连接，需要使用双酶切 法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒 的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用 相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知， 质粒pYL应该选用SpeI和XhoI酶切，由于目的基因N 含有SpI识别序列，故N基因不能使用SpeI酶切，但 XbaI与其具有相同的黏性末端，基因V酶切时可以用 XbaI替换SpeI,即N基因两瑞应该含有XbmI和XhoI 识别序列：题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引 物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含 有引物1序列，而编码链的5端含有引物2序列，结合 质粒力YL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2 的5'端添加XaI、引物1的5′端添加XhoI识别序列。 PCR扩增基因N,特异性酶切后，利用DNA连接酶连 接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb(kb为千碱 基对)，假设构建重组质粒前后，质粒力YL对应部分大 小基本不变。 (2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的 模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA 的污染。质粒YL大小为7.2kb,重组质粒大小约 9.5kb,假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大 小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3kb(2一 2.3kb),结合图2电泳结果可知，实验组1的电泳条带 大小约为2300bp,说明实验组1的质粒中成功插入了 基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为 诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸 的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图 bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，根据 a引物5一端首位GCA为240位，则c引物5一端 GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA 外，还有GCC。 (4)题千研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂 醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇：由此可知，进 步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行 比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案：(1)基因数据库或（序列数据库）Xho I Xba I DNA连接酶(2)外源DNA(或外源基因、基因N)》 1基因N大小为重组质粒大小和质粒YL大小的 差值，约为2.3kb,对应实验组1的电泳条带（或实验组 1电泳条带大小加质粒力YL大小约等于重组质粒大 小)(3)GCC(4)香树脂醇 14.解析：(1)若使2HN仅在水稻胚乳中表达，则CtP应 为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因 下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所 需要的地方停下来。2HN应插入启动子GtP和终止 子Nos之间，由于GtP中有限制酶KnI的识别序列， 而SacI的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选 择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoR I对 r2HN和载体进行切割。 (2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈 伤组织。检测2HV是否表达，可以采用PCR技术检 测该基因是否转录出mRNA,通过抗原一抗体杂交技 术检测是否翻译出相关蛋白。 (3)设2HN为基因N,则单一位点插入目的基因的植 株的基因型为N,其自交后代的基因型及比例为 NN:Nn:nn=1:2:1,r2HN纯合体植株的比例为 1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯 合体进行后续研究。 (5)水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反 应器容易获得疫苗：水稻的产量高，作为生物反应器容 易从胚乳中大量获得疫苗。 答案：(1)在胚乳中特异性表达的基因使转录在所需 要的地方停下来HindⅢEcoR I(2)农杆菌转化 是否转录出mRNA抗原一抗体杂交(3)1/4纯 合体自交后代不发生性状分离 (5)水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能 够获得大量的疫苗（合理即可） 239 详解详析 15.解析：(1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶 段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物 与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。 (2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶 切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目 的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环 化。酶C单酶切后形成平末端，需用T,DNA连接酶 连接。 (3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用C+处 理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子 的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转 化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交 技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目 的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此 作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂 交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。 答案：(1)变性氢键 (2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和 质粒的自身环化T,DNA连接酶 (3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理 状态利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组 DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放 射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组 DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重 组质粒 16.解析：(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶， 其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取 过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶 解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 (2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR 技术扩增。 (3)穿梭质粒中35s为启动子，其作用是RNA聚合酶 识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个35s 启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同 表达及调控，提高转录的效率，从而降低基因工程的成 本与复杂性。 (4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上 的KanR和HVg BR两个标记基因的位置，用HygB 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染 色体DNA作模板，进行PCR,应选用的引物是F3和R2。 (6)蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生 物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造 现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产 和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白 质工程，理由是用1一1362合成基因序列和1363 1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，ABC不符合 题意，D符合题意。 答案：(1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离溶解 蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2)PCR技术扩增人工合成 (3)RNA聚合酶识别并结合的部位同时实现两个目 的基因的共同表达及调控，提高转录的效率，从而降低 基因工程的成本与复杂性 (4)HygBR (5)F3 R2 (6)D 17.解析：本题考查基因工程的相关步骤，考生需关注每一 步骤的具体操作以及操作目的。 (1)重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒 蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的 复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。 (2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛 选。RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。 最新真题分类特训·生物学 (3)检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取 酵母细胞核染色体DNA进行目的基因鉴定。基因探 针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互 补的核酸序列。 (4)检测目的基因是否表达，需要检测目的基因是否插 入染色体外，还需要检测目的基因是否转录与翻译。 检测是否转录，应从转基因生物中提取蛋白质，用相应 抗体进行抗原一抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的 基因已形成蛋白质产品。 答案：(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿 主体内增殖 (2)用于转化细胞的筛选RNA聚合酶 (3)核染色体DNA被标记的目的基因的单链DNA 片段 (4)从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行 抗原一抗体杂交，观察是否有杂交带出现。 18.解析：基因工程结合基因表达知识考查。 (1)基因文库的定义是将含有某种生物不同基因的许 多DNA片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分 别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 (2)从图中可以知道，转录方向是顺时针，所以①为终 止子；②为启动子，启动子是RNA聚合酶结合与启动 转录的位置。而标记基因是为了便于筛选出完成导入 的受体菌。 (3)基因突变但是性状不改变的情况，有多种可能，如 因为非编码区改变，但是编码区不变导致RNA不变， 或者由于密码子简并性导致的蛋白质序列不变等等。 (4)用基因工程导入真核细胞，检测是否黄色荧光即 可。如以酵母菌为受体菌，以YFP为目的基因，通过基 因工程技术，观察导入基因表达载体后的受体酵母菌 是否可以发黄色荧光 答案：(1)含有某种生物不同基因的许多DNA片段的 受体菌群体 (2)终止子启动子启动子是RNA聚合酶结合与启 动转录的位置便于筛选出含有目的基因的受体菌 (3)由于密码子的简并性，导致GFP突变基因转录产生 的mRNA与原来的正常mRNA翻译出的蛋白质相同， 仍是绿色荧光蛋白 (4)以酵母菌为受体菌，以YFP为目的基因，通过基因 工程技术，观察导人基因表达载体后的受体酵母菌是 否可以发黄色荧光 19,解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有 了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体，需要有复 制原，点、一个至多个限制酶切割位，点和便于重组质粒 筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组 质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引 物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒 序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的 序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则 不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或 F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是 否正确，都可扩增出目的基因序列。因为】基因的b 链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从 左到右，由于转录沿模板链3'到5′端方向合成RNA,所 以J基因b链左侧为3'端，引物要与DNA的3'端互补 配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推 知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗】蛋白抗 体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J-V5 融合蛋白，条带2仅能由抗J】蛋白抗体检测到，说明该 蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白 不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶标记基因、复制原点（或限制性 酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”)a链 (3)J-V5融合蛋白不是 20.解析：(1)根据题千信息可知，突变后的基因为隐性基 因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转 化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表 型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野 生型植株的种子大小相近。 (2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制 性内切核酸酶对DA1基因和运载体进行切割，再用 DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动 子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端， 因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游 序列需具备启动子和终止子。 答案：(1)野生型(2)Ti质粒启动子和终止子 21.解析：(1)负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的 效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系 统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。 植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成 过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量雏持在一 定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想 得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加 一定浓度的赖氨酸类似物。 (2)①从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物的 许多基因片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌 分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需 要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因 的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、 基因的转录产物，以及基因的表达产物蛋白质等特性 来获取目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞 膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次 分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能 性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融 合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一 般要培养到桑椹胚或囊胚阶段：植入代孕母牛子宫角， 直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期 结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影 响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳 性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面 预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不 利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对 照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。 应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为 了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆 转录形成cDNA,并以此为PCR的模板进行扩增。目 的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在 牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有 乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在 牛耳细胞中不能表达。 答案：(1)负反馈调节一定浓度的赖氨酸类似物 (2)基因文库融合受体细胞激活桑椹胚或囊 胚含有目的基因的牛耳组织细胞DNA酶PCR 的模板构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子， 只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能 表达 22.A在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨 液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上 清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上 清液，A正确：研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后， DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴 定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变， C错误：加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分 钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察 到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除 二苯胺加热后可能变蓝的千扰，D错误。 23.DDNA粗提取和鉴定的原理：1.DNA的溶解性： DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCL溶液中溶 解度不同(DNA在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度 最低)：DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质 溶于酒精。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3.DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遢二苯胺会 被染成蓝色。A,裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释 放出DNA等物质，A正确；B.DNA在不同浓度的NaCI 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，将溶 液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分 离，B正确：C,DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒 精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯 度，C正确；D.将DNA溶解于NaCl,加入二苯胺试剂， 沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 24.解析：(1)显性性状的定义是：杂合子所表现出的性状 为显性性状。结合题千信息，只要携带SD1基因就能 合成有功能的酶，产生赤霉素，表现高秆，因此高秆对 半矮秆为显性。 (2)该过程是通过回交逐步定位目的基因：首先需要筛 选获得符合要求的低氨肥高产性状的半矮秆子代，之 后与亲本半矮秆稻回交，重复操作后，可淘汰千粒稻中 除目的基因所在片段外的其余染色质/DNA,仅保留带 目的基因的小段千粒稻染色质，缩小筛选范围。 (3)从题图可知：半矮秆稻的INCA2使染色质成环，抑 制RCN2表达，导致低氯肥低产；而千粒稻的gINCA2 不能成环，RCN2可正常表达，因此实现低氯肥高产。 (4)待改造的半矮秆稻含IVCA2,因此需要编辑其 INCA2基因，使其突变为gINCA2类型：水稻是二倍 体，一次编辑通常仅改变一对同源染色体中的一个 INCA2基因，因此第一代编辑水稻一般为杂合子；杂合 子自交后会发生性状分离，可从后代中筛选得到纯合 的低氨肥高产目标植株。 答案：(1)杂合子基因型为SD1sd1,其中SD1可编码产 生有功能的赤霉素20-氧化酶，合成赤霉素，表现为高 秆，因此高秆对半矮秆为显性 (2)低氨肥高产半矮秆稻千粒稻其余染色质 (DNA) (3)gINCA2没有使染色质成环的能力，无法将RCN2 基因锁定，RC2基因可以正常转录、翻译（正常表达）， 合成RCN2蛋白，因此水稻在低氮肥条件下表现高产 (4)INCA2基因杂合子自交 25.AB某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染 色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性 中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500，正常 基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占比 为2×1/3500×3499/3500，A错误；该男孩的母亲为 携带者，基因型为XX,该男孩基因型为XY,该男孩 的染色体倒位，故用R]和R2不能扩增出产物来，母亲 有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行 PCR检测的结果不同，B错误；该男孩的染色体倒位， 24】 详解详析， 故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列 顺序发生改变，C正确；利用SI和S2进行PCR检测， 有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基 因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 26.B配制PCR反应体系时，应加入4种脱氧核糖核苷酸 溶液作为扩增原料，A错误：凝胶中的DNA分子通过 染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来， 故B正确：配制的酵母培养基先进行高压蒸汽灭菌处 理，然后再倒平板，C错误；烧红的接种环需在酒精灯火 焰旁冷却后才能蘸取菌液，否则会杀死菌种，D错误。 27.D制备DNA探针时需要模板和引物，所以加入的单 链DNA要做为模板和引物。①组将两段DNA移动， 使其碱基互补配对，得到5'一GCCGATCTTTATA一 3',3′-CACCGGCTAGAAA-5',由于DNA只能由 5→3'延长，所以上述片断是得不到扩增产物的。同理 ②也不行：③反应管经多轮扩增后可得到3' AGGGCTAGGCATA-5',两端带有A,能产生被荧光 标记的DNA探针，③正确；④反应管中可得到5' ACTGGCCAGTGAA一3'，两端带有A,能产生被荧光 标记的DNA探针，④正确。综上可知，③④正确。 28.D由题可知，P,、P。为纯合子，F,为杂合子，且两对等 位基因的遗传符合自由组合定律，假设基因由上到下 依次为A、a、B、b,则P,基因型为AAbb,P,基因型为 aaBB,F1基因型为AaBb,据此分析选项。 ①基因型为AaBB,②基因型为Aabb,均为杂合子，F, 中，③基因型为AABb,占比1/8，⑤基因型为AABB,占 比1/16，③占比大于⑤，A正确：据图分析，图中缺少 aaBb的基因型对应的电泳图像，其电泳结果为3条带， 分别为第2条带、第3条带和第4条带，B正确；由题可 知，③×⑦对应杂交类型为AABb×aabb,因此后代基 因型为AaBb、Aabb,对应②基因型为Aabb,⑧基因型 为AaBb,电泳结果相同，C正确：①基因型为AaBB,其 自交后代基因型及比例为AABB:AaBB:aaBB=1:2 ：1,④的基因型为aaBB,因此①自交子代与④电泳结 果相同的占比1/4，D错误。 29.A琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁 移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分 离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片 段，比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度 的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。 而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段， 则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分 辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常 是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分 子，当涣酚蓝到凝胶2/3处时（可看蓝色条带），则停止 电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时， DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移， 同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的 DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下 被检测出来，D错误。 30.BPCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据 DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制 的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进 行大量复制的技术。A.分析图中可知，启动子在左侧， GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后， 可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制 GFP基因的表达，A错误；B.因启动子在左侧，转录的 方向向右，合成的mRNA从左向右为5'→3，刚好是翻 译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP 最新真题分类特训·生物学 蛋白，B正确；C,整合GFP基因后，核酸片段变长，2号 个体只有大片段，所以是Gata3一GFP基因纯合子， 4号个体只有小片段，是野生型，C错误：D.用引物1和 引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无 法较好的区分片段，D错误。 31.解析：(1)PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原 理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条 件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目 的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以 防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止 目的基因与质粒反向连接。 (3)在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格 控制，在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略，此 类设计的主要目的是防止工程菌（或重组质粒）扩散到 环境中，造成基因污染。 (4)据图可知，质粒上含有庆大露素抗性基因，所以第 一次在培养基中添加庆大霉素，由于DEX质粒上含有 庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在 含庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌 株；第二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原 理，应在培养基中添加蔗糖，原因是X质粒上带有蔗 糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该 基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源 交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养 基上存活：筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第 一种菌株是UW42,另一种菌株的拟核DNA结构是 ②，图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另 外一种类型应该是切前端重组；可以通过设计特异性 引物进行PCR扩增相应序列并测序来鉴定。 答案：(1)延伸(2)防止目的基因自身环化、防止质粒 自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因 污染 (4)庆大霉素pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导 入pEX质粒的UW41菌株能在含庆大霉素的培养基 上生长蔗糖②测序 32.解析：(1)已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基 因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV 切割产生平末端，T4DNA连接酶可以连接平末端，连 接效率高于E.coliDNA连接酶，因此选T4DNA连接 酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因 此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2 空质粒。原质粒5.0kb,目的基因总长度0.7+1.1 1,8kb,重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入 后：BamHI/EcoR I酶切得到0.7kb+6.1kb(6.8一 0.7=6.1):HindⅢ/EcoR li酶切得到1.1kb十5.7kb(6.8 一1.1=5.7)，因此正确组合是A和D。农杆菌转化法 中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA 上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延 伸方向为5'端3'端。转录模板链为5'一ATGTCGT TCC·AATTGGCTCC一3'，左侧引物序列为5'一AT- GTC…一3'，右侧引物与模板右侧的序列5'…GCTCC 一3′反向互补，序列为5'一GGAGC·一3′，因此选B。 (2)根据题千和表格数据，转入Ts基因后工程菌引诱 能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附 着量更高：而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更 快，LT50更短，最终第7天死亡率更高。 (3)转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性 评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 24 答案：(1)人工合成法（化学合成法）T4未插入目的 基因的pPK2空质粒AD染色体DNAB (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留 时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死 亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短， 第7天死亡率更高(3)安全性 33.解析：(1)实验①F2出现9：7的分离比，是9：3：3：1 的变形，说明该花型至少受两对独立遗传的等位基因 控制，遵循基因的自由组合定律。由思路分析可知，实 验②的F,单花个体(aabbD、A bbdd、aabbdd)中，纯合 子（子aabbDD,号AAbbdd,子aabd)占比为号。利用 甲(AAbbdd)与实验②的F,(AabbDd)进行杂交，子代多 花(AbD古地为1XIX号=之 (2)由思路分析可知，控制花型的基因至少涉及3对。 多花植株均含有两种显性基因，而甲参与的杂交组合 均能产生多花后代，推测甲含有控制多花所必须具有 的显性基因，即表现为多花的辣椒植株，必须具有甲中 参与控制多花的显性基因。 (3)实验①的F,(AaBbdd)与丙(aabbDD)杂交，子代基 因型（表型）及比例为AaBbDd(多花)：AabbDd(多花)： aaBbDd(中花)：aabbDd(单花)=1：1：1：1。只分析 A/这一对等位基因，甲基因型为AA,酶切后电泳只 有一条条带：丙基因型为aa,酶切后电泳有两条条带； 单花植林基因型为aa,酶切后电泳有两条条带。因此， 多花植株基因型为A,则酶切后电泳应有三条条带：中 花植株基因型为aa,酶切后有两条条带，与丙相同。其 中中花和单花的电泳结果与丙相同，在子代中占比为 子，条爷涂黑结果见答案。 (4)中花的基因型为aaB_D_,即aaBBDD、aaBbDD、 aaBBDd和aaBbDd4种，分别与甲、乙和丙杂交结果 见表。 甲(AAbbdd) 乙(aaBBdd) 丙(aabbDD) aaBBDD 全部多花 全部中花 全部中花 中花：单花 aaBbDD 全部多花 全部中花 =1：1 中花：单 aaBBDd 全部多花 全部中花 花=1：1 多花：单 中花：单 中花：单花 aaBbDd 花=3：1 花=1：1 =1:1 选择亲本乙(aaBBdd)与中花植株杂交，若子代出现单 花则中花植株含d:选择亲本丙(aabbDD)与中花植株 杂交，若子代出现单花则中花植株含b。即对多株基因 型相同的中花辣椒植株而言，选择亲本乙和丙与该类植 株杂交，根据子一代的表型及比例即可确定其基因型。 答案：(1)自由组合 32 (2)3显性 (3) 甲丙单花多花中花 (4)乙和丙（或乙、丙） 34.解析：(1)粉质品系A、硬质品系W为纯合品系，正反 交F,籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉 质，硬质为显性性状。 (2)PCR反应体系除引物、TagDNA聚合酶、缓冲液、脱 氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。 品系W是纯合V"V":引物1与引物2可扩增出100+十 196=296bp(约300bp)的片段，引物1与引物3可扩 增出100+196+1054+350=1700bp(接近2000bp) 的片段，共两个条带，对应图c的泳道⑤。 (3)要检测V"的表达是否受影响，需要检测转录产物， 因此提取胚乳的RNA,通过逆转录进行PCR检测。已 知V”高表达对应硬质，低表达对应粉质。 ①纯合转基因植株的V"表达被RNAi显著降低，因此 胚乳性状为粉质。 ②杂合转基因植株(V+V,V+为正常V",V为表达 被敲低的V")自交，胚乳由两个基因型相同的极核十 一个精子发育而来，仅当三个等位基因全为V时才表 现为粉质，其余均满足V”表达量足够，表现为硬质，因 此性状比例为硬质：粉质=3：1。 (4)据题千信息可知，V"编码的酶催化非极性胡萝卜 素转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足， 因此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚 乳的原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突 变，非极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为 硬质。 答案：(1)显性(2)模板DNA(或玉米基因组DNA) ⑤ (3)(胚乳的)RNA粉质硬质：粉质=3：1 (4)非极性胡萝卜素积累 35.解析：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 (4种)脱氧核苷酸、含Mg+的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸， DNA聚合酶在延伸步骤中起作用，即DNA聚合酶将 脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要 在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。为保证目 的基因的正确插入，应使用双酶切；载体中含有BamH I、 EcoR I和XbaI的酶切位，点，S基因上含有XaI、NdeI、 BamH I的酶切位点，为保证S基因结构的完整性，不 能在S基因两端添加XbaI、NdeI、BamH I的识别 序列；分析表格数据，Bg1Ⅱ切割产生的黏性末端和 BamH I切割产生的黏性末端相同，结合S基因的转录 方向和载体上启动子的转录方向可知，应在S基因上 游添加BglⅡ的识别序列，即5'一AGATCT一3'，下游 添加EcoR I的识别序列。因此，切割载体应选用的两 种限制酶为BamH I和EcoR I。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织 时，农杆菌能将基因表达载体中的TDNA转移到愈伤 组织细胞的染色体DNA上。分析载体，TDNA中含 有杭性基因2，若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色 体DNA上，则该细胞具有抗性基因2对应的抗性，因 此，抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈 伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力 显著增加的马铃薯植株。 答案：(1)脱氧核苷酸延伸(2)5'端AGATCT BamH I与EcoR I(3)染色体DNA2再分化 343 详解详析 36.解析：(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质 上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码 子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对 引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA 片段。在制备PC℉反应体系时，每次用微量移液器吸 取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交 叉污染。(2)A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组 DNA污染，可能扩增出其他DNA,从而出现另外一条 条带，A错误；B、每个引物与DNA模板存在2个配对 结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另 外一条条带，B错误：C、在基因组中Gpd基因有2个拷 贝，扩增出的DNA是相同DNA,电泳时只会出现一个 条带，C正确：D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列 高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从 而出现另外一条条带，D错误。(3)DNA在冷的95% 乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚 氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到 环形DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结 合图示可知，应选择P2和P3引物进行第二次扩增。 启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终 止子具有调控功能。(4)为确定克隆获得的Gpd基因 的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据 库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gd基因 准确。将G巾d基因的编码区与表达载体连接，构建重 组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行 表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 答案：(1)密码子（或遗传密码）琼脂糖更换微量移 液器的枪头(2)C(3)冷的95%乙醇D调控 (4)基因数据库（或序列数据库）表达载体 37.解析：(3)据图1可知，野生稻的电泳条带比栽培稻2电 泳条带距离进样口近，故野生稻的相关基因比栽培稻2 的相关基因长，故可知，与野生稻相比，栽培稻2是由于 Bh基因发生了碱基的缺失。已知，野生稻的碱基序列 是5'一GATTCGCTCACA一3'，栽培稻1相应的碱基 序列是5'一GATTAGCTCACA一3'，故可知，发现栽培 稻1是由于Bh基因中的DNA序列发生了碱基的替 换，导致相应的mRNA上的密码子发生改变，其指导合 成的蛋白质中氨基酸序列发生改变，颖壳表现为黄色。 答案：(3)碱基的缺失碱基的替换相应的mRNA上 的密码子发生改变，其指导合成的蛋白质中氨基酸序 列发生改变 38.解析：(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌 落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂 布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的 是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的 内生放线菌。 (2)PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、 延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加， 实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行 的。在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片 段长度为R-U(500bp)+R基因(2000bp)+R一 D(500bp)=3000bp。对应图2中的菌落①和③。在 成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp) 被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为R一U (500bp)+R-D(500bp)=1000bp。对应图2中的菌落 ②。菌落④的PCR产物大小约为7000bp。这个大小 最新真题分类特训·生物学 可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。 整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架十500bpR U十500bpR一D=4000bp)整合到了基因组中。整合 后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度 (3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp),即3000十 4000=7000bp。因此，这是单交换同源重组整合 的结果。 (3)设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低 铁)浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了 足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位 置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适 宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟 病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大 小)。预期结果与结论：如果实验组（高铁培养基）中内 生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消 失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该 内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生 长的。 答案：(1)稀释涂布平板法分离不同条件下生长的内 生放线菌 (2)指数级扩增②重组质粒通过（单交换）同源重 组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的 培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。 在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟 病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后， 观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如 菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显 弱于低铁组，则支持该推测 39.解析：本题考查凝胶电泳技术以及电泳条带的解析 问题。 (1)电泳时，分子质量越大，迁移距离越小。根据题中 给出甲的相对分子质量是乙的2倍，故甲的迁移距离相 对乙较小，可判断出迁移方向是从上到下 (2)题中给出甲、乙均由一条肽链组成，凝胶电泳时分 别出现1个条带，故丙出现2个条带，说明丙是由2条 肽链组成。 (3)凝胶色谱法主要根据蛋白质的相对分子质量差异 来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质只能在凝胶 外部移动，故移动距离较短，会先被洗脱出来，分子质 量较小的蛋白质进入凝胶内部通道，移动距离较长，会 后被洗脱出来。丙的分子质量最大，最先被洗脱出来， 乙的分子质量最小，最后被洗脱出来。 (4)酶的保存在低温条件下进行。 答案：(1)从上向下 (2)丙由两条肽链组成 (3)相对分子质量丙乙 (4)低温 40.C题千中X十Y融合蛋白由两个独立基因表达后经 自我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合 基因，故不存在碱基序列相互影响问题，A错误；从图 中可以看到，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构 内，而是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋 白功能结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误；从 图中过程可以看出，内含肽的IntAN与IntA、lntB与 IntB通过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切 24 除和连接作用，C正确；由图可知，内含肽在反应后被完 全切除，得到的X十Y融合蛋白不含内含肽结合部位， 所以再为X十Y融合蛋白提供“内含肽十某蛋白”，也不 能实现自我切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X十Y 融合蛋白新的结构，D错误。 41.D由题千信息可知，镉胁迫显著偏离于苦草适宜生活 需求的环境条件，会影响其生存，而水杨酸可激活苦草 体内抗氧化酶系统，缓解镉的胁迫。A.水杨酸可激活 苦草体内抗氧化酶系统，故能缓解H,O,对苦草的氧化 作用，A正确：B.环境容纳量的大小取决于生物所生存 的环境，在胁迫环境下，苦草种群的环境容纳量下降，B 正确：C镉属于重金属，能够通过生物富集作用，沿食 物链传递到更高营养级，C正确：D.胁迫是一种显著偏 离于生物适宜生活需求的环境条件，因此在镉的胁迫 下，苦草已经不能通过自身的调节作用雏持稳态， D错误。 42.解析：(1)构建转基因按蚊属于基因工程，属于基因重 组；翻译过程中，tRNA上的反密码子和mRNA上的密 码子配对。 (2)抗菌肽基因仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按 蚊肠道内疟原虫的发育，所以推测转基因按蚊中调控 MM一CP表达的启动子类型为诱导型启动子。该启动 子使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸 血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即 使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保 证MM一CP基因能够传递给子代。 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功 能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有 蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类 的生产和生活的需求，所以设计思路：从预期改造后抗 菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影 响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸 序列，进而改造MM一CP的基因序列，获得符合要求 的抗菌肽。 (3)结合图示可知，Cs9切割野生型染色体后，会以携 带MM一CP的染色体为模板完成同源修复，让原本的 野生型染色体也变成携带MM一CP的染色体，最终体 细胞两条同源染色体均带MM一CP,减数分裂产生的 配子几乎都携带该基因，因此后代携带MM一CP的比 例显著升高。 (4)从生物进化角度，基因驱动会快速改变按蚊种群的 基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平 衡：也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出 抗性，引发新的风险。 答案：(1)基因重组反密码子 (2)诱导型启动子使MM一CP仅在吸血后的雌蚊中 表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基 因按蚊的存活：即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死 亡前完成繁殖，保证MM一CP基因能够传递给子代 从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低 对按蚊存活的影响)出发，设计抗菌肽的空间结构，推 测对应的氨基酸序列，进而改造MM一CP的基因序 列，获得符合要求的抗菌肽 (3)以携带MM一CP的染色体为模板完成同源修复 (4)基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影 响种群数量和种间关系，破坏生态平衡：也会对疟原虫 起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的 风险年真题 分类特训 第二十章 ◆基因工程的基本工具 1.（不定项)(2025·江苏卷，19,3分)图示人体 正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切 割位点。AluI限制酶识别序列及切割位点 3-TCGA-5,下列相关叙述正确的有( 5-AGCT-3 为 HindⅢ HindⅢ HindⅢ AAGCTT AAGCTT3 A林用AC-200bp--400bp--5 lindⅢ 突变↓ HindⅢ s因-20p-一S--40mp-流烈 A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的 末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片 段大小一致 D.产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限 制酶开展酶切鉴定 2.(2023·湖北，4,2分)用氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基 因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构 建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌 中。下列叙述错误的是 HindⅢ Pvu I Sph I Sca I Tet Sal I 质粒 A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可 能不同 B.若用PwuI酶切，在含Tet(四环素)培养基 中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphI酶切，可通过DNA凝胶电泳技 术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphI酶切，携带目的基因的受体菌在 含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能 形成菌落 第二十章基因工程 基因工程 3.(2023·新课标，6,6分)某同学拟用限制酶 (酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具， 将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和 切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组 表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 酶32 南1 5'-GAATTC-3'5-GGATCC-3'5'-CCCGGG-3'5'-AGATCT-3' 抗生素 3-CTTAAG-5'3-CCTAGG-5'3'-GGGCCC-5'3-TCTAGA-5' 抗性基因 4 酶1 酶2 所3 酶4 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高 的是 ) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用 E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 T4DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 T4DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 E.coli DNA连接酶连接 4.(2026·山东卷，25,12分)小鼠基因W编码的 蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W 转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的 高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转 移酶(TdT),该酶不需要模板，可在DNA的3 端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱 氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸， 称为同聚物加尾。相关信息如图所示。 染色体DNA的 部分结构 基因W Sal I 载体的 Pst I Kpn I Xho I Sal I 部分结构 3'端突出的黏性末端 同聚物加尾过程 注：限制酶识别序列及切割位点 3 —3 Pst I 5'-CTGCAG-3 某种脱氧 Kpn I 5'-GGTACC-3' 核苷酸 TdT Xho I 5'-CTCGAG-3' Sal I s-CrCGAC-3 NNN(n)3 3'NNN(n)- NNN(n:n个某种脱氧核苷酸 最新真题分类特训·生物学 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是 ,载体上与其能自我复制相关的结构 是 (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用 TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物 加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的 黏性末端为5'端突出，则需先用DNA聚合酶 补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需 要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切 下，据图分析，应选取的2种限制酶为 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形 成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重 组载体需要的2种酶是 ,该过程中 (填“需要”或“不需 要”)添加引物，原因是 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相 应蛋白，在分子水平上的检测方法是 5.(2023·湖北，22(4)，3分)某病毒对动物养殖 业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳 蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速 检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 入一整图一国白人一免皮个风一图密图 离体培养的小 鼠骨髓瘤细胞 诱导融合 单克隆抗体筛选、—杂交榴细胞筛选 回答下列问题： (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下 列属于DNA连接酶底物的是 OHOH PP smmms s'mh3 311iiis 3 1i山5 OHOH PP ① ② POH OHP 5'T3 5'TTTTTTTTT3' 3'⊥LLLL5 34LL5 OHP POH ◆基因工程的操作程序 6.(2026·安徽卷，12,3分)为研究某种鱼中新 发现的R基因的功能，对该种鱼的受精卵进行 基因敲除，使R基因的编码序列缺失4个连续 的碱基成为R一，获得1条能正常生长的F。代 个体(RR一)，经杂交培育获得了纯合突变体。 15 与野生型相比，纯合突变体的体型变小，体色 变为浅红色。下列叙述错误的是 ( A.选用受精卵进行基因敲除，目的是确保突 变的基因可以遗传给子代 B.用F。个体进行杂交培育，最早可以在F,获 得纯合突变体 C.Rˉ编码的氨基酸序列发生改变，纯合突变 体可用于R基因功能的研究 D.突变体有多种表型变异，说明一个基因的 功能可能影响多个性状 7.(2026·河南卷，13,3分)胰蛋白酶可水解精 氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽 键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过 蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位 替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解， 并保持抗体活性。下列叙述错误的是 () A.甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一 般规律 B.胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的 专一性 C.第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位 点与抗体功能相关 D.由于密码子的简并性，改造后编码甲的基 因序列不一定改变 8.(2025·安徽卷，15,3分)质粒K中含有B-半 乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞 后，其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质， 进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该 质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干 扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙 述错误的是 ( 启动子 BamH 质粒 导人 ,（O碑到)表达活性日半乳精苷膨， B一半乳糖苷臀基因 大肠杆菌 缔选平板 贵 (含X-gl和 卡那霉素) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效 率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白 色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中 长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是 质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠 杆菌 9.(2026·安徽卷，20,11分)肿瘤化疗通过诱导 肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。 肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿 瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌 中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回 答下列问题。 (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO,不足， 会导致培养液 异常；乳腺癌细胞培养 时 (填“会”或“不会”)出现接触抑制 现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理， 使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制 处理时间，原因是 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因 插人位点的相关信息如图1所示（实线方框内 横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶 切位点)。为构建重组质粒，扩增P基因时，应 选择的一对引物为 (填图2中序号)。 为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重 组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组， 对照组的处理是 P基因 5'-…CCGTGT…ATGCCT…-3 3…GGCACA.…TACGGA-5' 转录方向 BglⅡ BamHI Spe I HindⅢ 5-ACAGATCTCGGATCCCACTAGTCAAGCTTAACG-3 目的基因插人位点， 启动子 终止子 BamH I- 质粒 HindⅢ 复制原点 、卡那霉素 抗性基因 图1 D5'-.GGATCCAGGCAT-3' ②5'-…AGATCTTCCGTA-3' ③5'-…AGATCTAGGCAT-3 ④5'-…ACTAGTCCGTGT-3' ⑤5'-…ACTAGTGGCACA-3' ⑥5'-…AAGCTTCCGTGT-3' 图2 (3)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径 来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发 现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这 表明P基因 S基因的转录， (填“促进”或“抑制”)肿瘤耐药。 151 第二十章基因工程 10.（2026·河南卷，21,10分)4-a糖基转移酶 (4aGT)在工业生产中发挥重要作用。为实 现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重 组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存） 中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效 表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回 答下列问题： 限制隋1 意酵切 转录方向 3_C 5'-TCGAG COTAG-S 目的基因 限制酶2 连接 工程菌 5129p 限制酶1 限制酶2 表达载体 酶切。 表达载体 3617bp ◆ 注：Amp为氨苄青霉素抗性基因 PaCAccn e 图1 (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和 重组表达载体均应含有的元件为 为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆 载体，重组表达载体目的基因两端的元件除 启动子外，还有 作用为 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目 的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用 的限制酶1是 ,限制酶2 是 (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁 移速率成反比。为检验重组表达载体是否构 建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行 电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产 物的电泳结果如图2所示，条带 (填 “a”或“b”)对应目的基因片段，理由是 M 样品 点样孔 泳 一条带a 向 一条带b 注：M为标准DNA片段 图2 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工 程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养 液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2 最新真题分类特训·生物学 中4αGT含量迅速升高的原因可能是 (答出一点即可)。 三40阶段1阶段21 阶段3 2 10 0 1224364860728496 时间（小时） 图3 11.(2026·河北卷，22,13分)黑曲霉中的淀粉 酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡 萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究 者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CrA基因 的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： (1)黑曲霉菌种的分离纯化应选用 (填“固体”或“液体”)培养基。 (2)细胞中具有特定结构的双链RNA可被相 关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可 识别与自身序列互补的mRNA,引导该 mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段 A和C的转录产物能按照 原则 自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段 时，可在两个引物的 端分别添加两个 限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶 KpnI和SpeI酶切连接到载体中A所在 的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到 载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶 ①应该是 载体的部分结构及其RNA产物： Kpn I Spe I NcoI Sac I 启动子ABC终止子 转录后RNA形成 链内双链结构 。OB降解 CreA mRNA 降解 CreA片段D的引物及限制酶识别位点： 限制酶①KpnI 〔引物1 D 引物Ⅱ SpeI限制酶② 图1 152 (3)构建的基因表达载体除含有启动子、终止 子和目的基因外，还需具有 基因， 以使表达载体转入受体细胞后可利用 培养基筛选出转基因成功的 菌株。 (4)构建的表达载体转入菌株G获得G1,将 G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生 长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验 结果（图2）表明 (答出两点) 20。·G生物量◆G淀粉酶活力 1500 。G1生物量◆G1淀粉酶活力 400 300 8 200 4 0 ◆◆一◆ 0 024 487296120144 时间h 图2 (5)传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉 酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄 糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利 用所体现的优势是 。 (答出两点) 12.(2026·湖南卷，21,12分)阿尔茨海默病患 者大脑中阝一淀粉样蛋白(A3)异常聚集，损 伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法， 研究人员合成了一种嵌合抗原受体(CAR)基 因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成 CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识 别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列 问题： (1)CAR基因和病毒载体的部分结构（含限 制酶切割位点)分别如图a、b所示。 Kpn I EcoR I BamH I HindⅢ 特异性启动子>胞外识别区跨膜区胞内吞噬信号区山 CAR基因编码序列 图a Kon I BamH I EcoR I HindⅢ 非特异性启动子 GFP终止子 Xho I 病毒载体 图b ①胞外识别区应选用A3聚集体的 (填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是 同 时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并 能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入 星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是 (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解AB聚 集体，可用含AB聚集体的培养基培养CARA 细胞，一段时间后更换不含AB聚集体的培养 基继续培养， (单选)的A3聚集体 含量。 A.24h检测细胞内 B.24h检测细胞外 C.0h和24h检测细胞内 D.0h和24h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携 带CAR基因的病毒，3个月后，大脑AB聚集 体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达 量下降。该实验对照组应注射 ;该实验结论是 13.(2025·黑吉辽蒙卷，25,11分)香树脂醇具 有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率 低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶 基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列 问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序 列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录 模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连 接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR 扩增基因V,特异性酶切后，利用 连 接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb (kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后， 质粒YL对应部分大小基本不变 EcoR1 各限制酶的识别序列和切割位点 EcoR I 5'-GAATTC-3' 终止子 3-CTTAAG-5 标记基因 PYL Spe I 5'-ACTAGT-3 (7.2kb) 3-TGATCA-5 复制原点 Xho I 5'-CTCGAG-3' 3-GAGCTC-5' Spe I Xba I 5'-TCTAGA-3' 3-AGATCT-5' ra链 引物1 引物2 HindⅢ5'-AAGCTT-3' b链 3-TTCGAA-5' 基因N 图1 153 第二十章基因工程 空白 实验组 对照组 M12345 碱基对 3000 2000 1000 750 ■ 500 250 注：M指示分子大小的标准参照物，1~4为 菌株号。 图2 (2)进一步筛选构建的质粒，以1一4号菌株 中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2 进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。 在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实 验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中 是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插 入了基因N,理由是 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第 240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序 列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的 密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨 酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、 d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引 物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分 析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 a:5-GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/ TTT/CCC/TCT/TTC/TTC...-3' b 5-GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/ AAC/TAC/TTC/TCT/GAG..-3' c 5.GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/ TTC/TTC/CCC/TAC/CAC..-3' d:5'-.GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/ AAG/GCC/ATG/CGA/AAG..-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的 香树脂醇合酶基因的改造方案。 14.(2024·河北卷，22(1)(2)(3)(5))新城疫病 毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学 家将该病毒相关基因改造为2HN,使其在 水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并 对其免疫效果进行了检测。 最新真题分类特训·生物学 回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识 别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若 使2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Nos为终止子，其作用为 。2HN基因内部不 含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限 制酶 和 对2HN基因与载 体进行酶切，用于表达载体的构建。 GtP SacI KpnI Nos ■ KpnI HindⅢEcoRI SacI 注：Kpnl、HindⅢ、SacI和EcoR I标注的 位点为各限制酶的识别位点 图1 (2)利用 方法将2HN基因导入水 稻愈伤组织。为检测2HN表达情况，可通 过PCR技术检测 ,通过 技 术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插 入目的基因的植株进行研究。此类植株自交 一代后，2HN纯合体植株的占比为 选择纯合体进行后续研究的原因是 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫 苗的优点是 。(答出两点即可) 15.(2024·全国甲卷，38(1)(2)(3)某同学采用 基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回 答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每 次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中 DNA双链打开成为单链的阶段是 ,引物与模板DNA链碱基之间 的化学键是 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点， 限制酶的切割位点如图所示。 AGATCT AAGCTT GATATC TCTAGA TTCGAA CTATAG 酶a 酶b 酶c 构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶 a和酶b双酶切的优点体现在 (答出两点即可)；使用酶c单 酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 15 (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受 体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ;若要验证转化的大 肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和 预期结果是 16.(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成 含有Vir基因的辅助质粒（辅助T一DNA转 移)和不含有Vir基因、含有T一DNA的穿 梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。 细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译 效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操 作。回答下列问题。 苏云金杆菌 弼 棉花植株 !组织培养 分离和扩增B基因 ⊙棉花叶圆片 1与毒性有关1848与毒性无关3540 B卧基因zzzz2 M 农杆菌 共培养、转化 切 136184 一辅助质粒 540 zaaz2z2d 佛○图 RI R2 R3 导入 3 1363-1848基因序列 人工合成 人工合成序列 1-1362基因序列 】拼接 (怎基酸序列不变) T-DNA-LB穿梭质粒 天然序列 重组 T-DNA-RB r 注：F1-F3,R1-R3表示引物；T-DNA IB表示左边界；T一DNA一RB表示右边界； Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性 基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白 酶，其作用是 。提取过程中加入 体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 (2)本操作中获取目的基因的方法是 和 (3)穿梭质粒中35s为启动子，其作用是 驱动目的基因转录；插入两个35s启动子， 其目的可能是 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR 两个标记基因的位置，用 基因 对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤 组织。 (5)为检测棉花植株是否导入日的基因，提取 棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR,应 选用的引物是 和 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质 工程，理由是 (单选)。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中 表达 C.将1一1362基因序列改变为棉花细胞偏好 密码子的基因序列 D.用1一1362合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 17.(2023·全国甲，38，(15分))接种疫苗是预 防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用 可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎 发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组 乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获 得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回 答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产 生乙肝病毒，原因是 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达 载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导 入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含 有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用 是 。能 识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的 酶是 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的 基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中 提取 进行DNA分子杂交，DNA分子 杂交时应使用的探针是 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞 中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验 思路。 18.(2023·全国乙，38,15分)GFP是水母体内 存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员 以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得 了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋 白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基 因的不同突变基因分别插人载体，并转入大 肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。 通常，基因文库是指 155 第二十章基因工程 (2)构建目的基因表达载体，科研人员从构建 的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为 突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示 (箭头为GFP突变基因的转录方向)，图中① 为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性 基因是一种标记基因，其作用是 复制原点 氨苄青霉素 抗性基因 ② 表达载体 GFP突变基因 ① (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的 表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大 肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有 的不发荧光。请从密码子特点的角度分析， 发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上 述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其 所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基 序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基 因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。 若要通过基因工程的方法探究YFP基因能 否在真核细胞中表达，实验思路是 19.(2023·山东，25,10分)科研人员构建了可 表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检 测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。 启动子J基因V5编码序列终止子 /F2F1 a链 条带1 条带1 -b链 条带2 Ri R2 注：F1、F2、R1、R2表示引物 抗J蛋白抗体抗V5抗体 图甲 图乙 (1)与图甲中启动子结合的酶是 除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需 具备的结构有 (答出 2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到 质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测， 最新真题分类特训·生物学 若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。 已知J基因转录的模板链位于b链， 由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序 列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗 J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白 是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。 其中，出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填 “是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表 达的。 20.(2023·广东，20(1)(2)，4分)种子大小是作 物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥 (2n=10)进行诱变，筛选到一株种子增大的 突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变 后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表 型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因 转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造 成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性核 酸内切酶对PCR产物和 进行切割， 用DNA连接酶将两者连接。为确保插人的 DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具 备 21.(2023·浙江6月，23,14分)赖氨酸是人体 不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中 的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食 物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时， 能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致 赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节 方式属于 。 根据这种调节方 式，在培养基中添加 ,用于筛 选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖 氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再 生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和 发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞 核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克 隆奶牛。其基本流程为： 156 ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的 发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的 基因)，可通过检索 获取其编 码序列，用化学合成法制备得到。再将获得 的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应 载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。 将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内， 与BEF膜发生 ,表达载体最 终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细 胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去 核后作为 将两种细胞进行 电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同 时起到了 重组细胞发育的 作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细 胞体外培养至 ,植入代孕母牛 子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以 非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因 牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平 检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基 因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细 胞，提取总RNA,对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形 成cDNA,并以此为 ,利用特 定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基 因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而 不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ ◆DNA的粗提取与鉴定 22.(2024·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与 鉴定”实验，下列说法正确的是 A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充 分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热 后可能变蓝的干扰 23.(2023·广东，11,2分)“DNA粗提取与鉴 定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→ 鉴定。下列叙述错误的是 A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 24.(2026·黑吉辽蒙卷，24,11分)我国科学家 在半矮秆水稻性状改良研究领域中取得了突 破性进展。 (1)已知水稻高秆和半矮秆性状受一对等位 基因SD1/sd1控制。SD1基因编码有功能 的赤霉素20-氧化酶，催化底物产生赤霉素， 控制高秆性状：s1基因不能产生有功能的 酶，控制半矮秆性状。杂交结果说明高秆对 半矮杆为显性，从基因型和基因产物功能的 角度，对此结论的解释是 (2)半矮秆稻抗倒伏，但高氮肥下才能高产。 为使其在低氮肥下高产，科学家找到一种名 为“千粒稻”的高秆水稻，该水稻具有低氮肥 下高产的相关基因。为寻找该基因，将千粒 稻与半矮秆稻杂交，筛选 性状的半 矮秆子代，再与 杂交。重复以上操 作，得到一系列只包含一小段千粒稻染色质 但低氮肥高产的杂交品系(C系)、上述过程 是为了尽可能避免 流入C系，以缩小 筛选范围。 (3)从C系中筛选到一段DNA序列，命名为 gINCA2。gINCA2与半矮秆稻的同源序列 INCA2只有一个核苷酸差异，均不编码蛋白 质。在低氮肥条件下，INCA2导致局部染色 质成为稳定的环，把RCN2基因“锁”在其中 (下图b),而gINCA2没有使染色质成环能 力（如图）。gINCA2控制低氧肥高产性状的 分子水平解释为 a半矮秆稻，高氯肥高产 b半矮秆稻，低氮肥低产 c“千粒稻”，低氮肥高产 RCN2 RCN2 INCA2 -RCN2 gINCA2 RCN2 mRNA 0024 RCN2 mRNA RCN2 RCN2 (4)基于以上机制欲用基因组编辑技术（可以 精准快速改变DNA序列)改造另一种氮肥依 赖型半矮秆稻品种，培育低氮肥高产型纯合 子。合理的方案是先编辑该半矮秆稻的 ,筛选得到低氮肥高产型第一代基因组 编辑水稻。由于该水稻可能是 ,需 再让其进行 ,然后从中筛选获得目 标水稻。 57 第二十章基因工程 ◆PCR技术 25.（不定项)(2025·河北卷，15,3分)X染色体 上的D基因异常可导致人体患病，在男性中 1 发病率为3500·某患病男孩（其母亲没有患 病)X染色体上的基因D和H内各有一处断 裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。 研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检 测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不 考虑其他变异，下列分析错误的是 () 引物组合 引物组合 正常X染色体及引物示意图： S1和R1 S2和R2 S1断裂点 1断裂点 母亲患儿母亲患儿 %DZ流H2 $2 R2 ■ 注：引物组合S1和S2、R1和R2可分别用于 对正常基因D和H序列的扩增检测 A.该病患者中男性显著多于女性，女性中携 带者的占比为330 B.用R1和R2对母亲和患儿DNA进行 PCR检测的结果相同 C.与正常男性相比，患病男孩X染色体上的 基因排列顺序发生改变 D.利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲 再次孕育的胎儿是否患该病 26.(2024·河北卷，13)下列相关实验操作正确 的是 ) A.配制PCR反应体系时，加入等量的4种核 糖核苷酸溶液作为扩增原料 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进 行电泳后，在紫外灯下观察结果 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒 精灯火焰旁倒平板 D.将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养 基上划线培养，获得单菌落 27.(2024·山东卷，5)制备荧光标记的DNA探 针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只 含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O 和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和 碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④ 中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已 知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原 则，且在本实验的温度条件下不能产生小于 9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带 有荧光标记的DNA探针的反应管有() 最新真题分类特训·生物学 反应管 加入的单链DNA 5'-GCCGATCTTTATA-3' ① 3-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5-AGAGCCAATTGGC-3 5'-ATTTCCCGATCCG-3 ③ 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3 A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 28.(2024·新课标卷，5)某种二倍体植物的P 和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体 的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如 图所示，其中①⑧为部分F2个体，上部2 条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条 带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等 位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误 的是 () PP2F ①②③④⑤⑥⑦⑧ 电源负极一 三 电源正极 A.①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例 大于⑤ B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有 3条带 C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与 ②⑧电泳结果相同 D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电 泳结果相同的占1/2 29.(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电 泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是 () A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离 DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负 极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下 被检测出来 58 30.(2023·浙江6月，19,2分)某研究小组利用 转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整 合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所 示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合 子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3 GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得 的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和 引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如 图乙所示。 Gata3 启动子区 编码区 非编码区 插人前5 -31 5 GFP 启动子区 Gata3引物1 编码区 5 编码区非编码区3 插人后 3 51 引物3 引物2 图甲 1234 大片段 小片段 图乙 下列叙述正确的是 ( ) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因 的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP 蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠 是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地 区分杂合子和纯合子 31.(2026·云南卷，21,12分)UW4菌株可表达 ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生 长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强 定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化 受体(ACCR)的羧基端。 回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a),复制原点(ori) 不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制 策略)。 插入位点 U四4葡ACCR基 PCR扩增】 前端后端 前端后端 重叠延伸PCR 货先器 构建pEX质粒 前端后端 KnI除切位点BoRI酶切位点n通 五肽对应的碱基序列 八KpnI酶切位点 肤Eco I酶切位点 以下简称五耻 KpnI酶切位点EcoR I酶切位点 pEX质粒 图a (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性 和 三步。 (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的 是 (答出2点)。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用 DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到 工程菌UW4-2(图b)。 货备梵林贵 庆木高死高 能端后网 的烟后端 第次同原交换 带一次店 一后编社能孕 凭霜 七4离体板核DNA 另种菌株 第二次蟑店 另一种质粮 另一种 丹一将颜交热形式 是 五政候场 赠 后网五庆前装 图b (3)我国科学家将来自玉米的α一淀粉酶基 因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活， 防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中 使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目 的是 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一 次在培养基中添加 ,即可筛选 出UW4-1菌株，筛选的原理是 ；在第二次筛选培养基中 添加 。 筛选后，培养基中仍同 时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2,另 一种菌株的拟核DNA结构是 (填图c中序号)；可以通过设计特异性引物 进行PCR扩增相应序列并 前端后端 前端后端 前端五肽后端 前端五肽后端 ① ④ 图c 32.(2026·黑吉辽蒙卷，25,11分)平沙绿僵菌 是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊 子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松 树长叶烯合酶基因(Ts)改造平沙绿僵菌， 增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭 蚊剂。回答下列问题。 59 第二十章基因工程 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达 效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序 列与天然基因序列存在较大差异，但编码的 氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是 转录方向EcoR I -0.7kb+-1.1kb 三s基因 EcoR V BamH I- ☐5 -HindⅢ 启动子 T-DNA 终止子 pPK2质粒 转人(@O人（丙 (5.0kb) 复制原点、 农杆菌 平沙绿僵菌 卡那霉素抗性基因 限制酶切割位点 EcoR V:S-GATATC-3 3-CTATAG-5 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可 忽略不计：kb:千碱基对。 实验如上图，用限制酶EcoR V切割 pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用 (填“E.coli”或“T4”)DNA连接酶可获得更 高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含 有目的基因的重组质粒外，还可能存在 。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用 限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和 片段大小，属于正确连接的是 和 A.BamH I/EcoR I,0.7 kb+6.1 kb B.BamH I /EcoR I ,1.1 kb+5.7 kb C.HindⅢ/EcoR I、0.7kb+6.1kb D.HindⅢ/EcoR I、1.1kb+5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转 移并整合到平沙绿僵菌的 上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行 鉴定。TPS基因的转录模板链部分序列为： 5'-ATGTCGTTCC...AATTGGCTCC- 3',下列引物对可用于扩增该片段的是 最新真题分类特训·生物学 A.5'-ATGTC…-3'、5'-CCTCG-3' B.5'-ATGTC...-3'5'-GGAGC...-3 C.5-TACAG..-35'-CCTCG...-3' D.5'-TACAG..-35'-GGAGC...-3 (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程 菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 、相关指标访问次数 停留时间 2小时感 LT50第7天死 培养物 (次/小时)（分钟/小时）染率(%)（天） 亡率(%) 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50(半 数致死时间)：导致50%蚊子死亡所需的平 均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表 中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显 著缩短且第7天死亡率更高的原因是 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的 评价，符合标准后方可推广。 33.（2026·河北卷，23,14分)根据开花的特点， 辣椒植株的花型可分为单花、中花和多花3 种类型。为探究该性状的遗传规律，研究者 利用甲、乙和丙3种单花纯合体进行了杂交 实验，结果见表。 实验编号杂交组合 F,表型 F表型及比例 ① 甲×乙 多花 多花：单花=9：7 ② 甲×丙 多花 多花：单花=9：7 乙×丙 中花 中花：单花=9：7 回答下列问题： (1)根据实验①结果推断，控制花型的基因遗 传遵循 定律。实验②的F2单 花个体中，纯合体占比为 。 利用 甲和实验②的F进行杂交，子代中多花占比为 (2)根据3个杂交实验结果判断，控制花型的 基因至少涉及 对。因此推测，上述 实验中表现出多花的辣椒植株，必须具有甲 中参与控制多花的 (填“显性”或“隐 性”)基因，该等位基因用A/a表示。 160 (3)现将实验①的F1和丙杂交，对其子代单 株和甲、丙的A/a基因进行PCR扩增，产物 经酶切后电泳结果的带型如图所示。若(2) 中的推测正确，在图中将多花和中花植株检 测结果对应位置的条带涂黑，杂交子代中，电 泳结果与亲本丙相同的个体理论上占比 为 甲丙单花多花 中花 (4)现有多株基因型相同的中花辣椒植株，从 亲本甲、乙和丙中选择 与该类植株杂 交，根据子一代表型及比例即可确定其基 因型 34.(2026·广东卷，21,12分)玉米籽粒胚乳的 粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对 性状。我国科学家在对玉米粉质品系A和 硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等 位基因VA和VW可能参与该性状的调控。 进一步研究发现，这对基因的序列长度存在 差异（图a),且在胚乳发育过程中VA的表达 量显著低于VW的表达量。为明确这对基因 参与性状调控的机制，开展如下研究。 100-缺失片段-350 VW 100196 1054350 引物1引物2 引物3 注：数字示碱基对bp)数量 图a 回答下列问题： (1)将两个品系进行正反交，获得的F1籽粒 胚乳均表现为硬质，可知硬质为 性状。 (2)根据这对基因的序列设计了3种引物（图 a),便于通过PCR技术进行区分。PCR反应 体系中包括这3种引物、Taq DNA聚合酶 (延伸速度约为1000bp/min)、缓冲液（含 Mg2+)、水、4种脱氧核苷酸和 反应参数见图b。预测品系W植株PCR产 物电泳结果符合①~⑤（图c)中泳道 的带型。 温度 时间 循环数 94℃ 5 min 94℃ 30s 55℃ 30s 30 72℃ 30s 72℃ 10 min 1 图b 标准 参照物 ①②③④⑤ 2000bp ■ 1000bp 500bp 300bp 图c (3)基于品系W构建了针对VW基因的 RNAi(可通过切割靶基因mRNA显著降低 其表达)转基因植株。鉴定转基因植株中 VW基因表达是否受到影响，应提取植株 进行PCR检测。若VW基 因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列 结果（胚乳由极核和精子结合后发育而成，极 核和卵细胞携带的基因相同)： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为 ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状 及比例为 (4)已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过 程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。 研究人员据此对胚乳性状的产生提出了一个 假设，并设计研究思路：对品系A植株进行 诱变，筛选胚乳变为硬质的突变体，进而分析 其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因 发生突变。推测研究人员提出的假设。最合 理的是： 是产生品系A粉质胚乳的原因。 35.(2025·陕晋青宁卷，21,10分)马铃薯作为 重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马 铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生 马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有 关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强 其抗寒能力。回答下列问题。 16] 第二十章基因工程 BamH I EcoR I Xba I 3 限制酶 5终止子启动子 切割位点 ☆ 启动子 T-DNA 抗性基因2 终止子 载体 抗性基因1 复制原点 S基因转录方向 Xba I Nde I BamH I 3' S基因 5' 限制酶 识别序列及切割位点 5-AG AT C T-3' Bgl II 3-T C TA GAA-5' Nde I 5'-C AT A T G-3 3-G T A TA C-5 Xho I 5'-C'T CG A G-3' 3'-G A G C TAC -5' EcoR I 5'-GYA A TT C-3' 3'-C TT A AG-5' BamH I 5'-GG A T C C-3' 3-C C T A GG-5' Sal I 5'-GYT C GA C-3 3-C A G C TAG-5 Xba I AR48, (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引 物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的 DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切 割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩 增S基因时需在引物的 (填“5'端” 或“3'端”)添加限制酶识别序列，结合上表分 析，上游引物应添加的碱基序列是5′ 一3'，切割载体时应选用的两种限制酶 是 ,PCR扩增产物和载体分别被限 制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的 表达载体并导人农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈 伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组 织细胞，将S基因整合到 ,抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该 愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获 得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 最新真题分类特训·生物学 36.(2025·1月浙江卷，24,12分)3-磷酸甘油脱 氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键 酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有 高效催化效率的3磷酸甘油脱氢酶的基因 (Gpd)。采用的方案是先通过第1次PCR 扩增出该基因的中间部分，再通过第2次 PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得 完整基因的序列，如图所示，回答下列问题。 Sal 第2次PCR 引物P1序列引物P2序列 引物序列引物r学列 第1次PCR 第2次PCR (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋 白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸 所对应的 ,确定DNA序列，进而 设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模 板进行第1次PCR,利用 凝胶电泳 分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产 物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用 微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调 整刻度和量程，还需要 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条 阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能 的原因是 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合 位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高 度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性 核酸内切酶PstI和SalI单酶切基因组 DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形 DNA,再用苯酚一氯仿抽提除去杂质，最后 加入 沉淀环形DNA。根据第一次 P℃R产物测定获得的序列，重新设计一对引 物，以环形DNA为模板进行第二次PCR,最 后进行测序。用于第二次PCR的一对引物， 其序列应是DNA链上的 (A.P1和 162 》 P2B.P3和P4C.P1和P4D.P2和 P3)。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基 因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性， 可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重 组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒 酵母高效合成甘油的目的。 37.(2025·安徽卷，19，(3))水稻籽粒外壳（颖 壳)表型有黄色、黑色、紫色和棕红色等，种植 颖壳表型不同的彩色稻，既可满足国家粮食 安全需要，又可形成优美画卷，用于旅游开 发。回答下列问题。 基因C 基因R 基因A 浅绿色前体物质酶工黄绿色色素酶Ⅱ棕红色色素酶Ⅲ紫色色素 图1 (3)科研小组采用PCR技术，扩增出野生稻 和栽培稻Bh/bh基因的片段，电泳结果见 图2。 Marker 野生稻 栽培稻1 栽培稻2 冷 图2 A G C A TG 冥 冷 野生稻Bh基因部分序列测序图 栽培稻1bh基因部分序列测序图 图3 说明：野生稻Bh基因的部分序列为：5′一GAT TCGCTCACA一3'，该链为非模板链，编码的肽 链为天冬氨酸一丝氨酸一亮氨酸一苏氨酸， UAA、UAC为终止密码子。 与野生稻相比，栽培稻2是由于Bh基因发生 了 ,颖壳表现为黄色。栽培稻 1和野生稻的PCR扩增产物大小一致，科研 小组进行了DNA测序，结果见图3（图中仅 显示两者含有差异的部分序列，其余序列一 致；A、T、G、C表示4种碱基)。比较两者 DNA碱基序列，发现栽培稻1是由于Bh基 因中的DNA序列发生 ,导致 ,颖壳表现为黄色。 38.(2025·安徽卷，20,11分)稻瘟病是一种真 菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病 菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放 线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研 磨处理，制备研磨液。此后，采用 (填方法)将研磨液接种于不同的选择培养 基，分别置于不同温度下培养，目的是 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效 合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收 铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之 一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载 体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因 的上游片段R一U和下游片段R一D;然后构 建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线 菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理， 对目标基因进行敲除。如图1所示。 复制原点 3000bp 500 bp 500 bp 质粒 R-U R-D 酶切，连接 重组质粒 农B四 引物1 交换 500bp 2000bp 500bp 内生放线菌DNA R-UR基因中间序列R-D 引物2 图1 163 第二十章基因工程 Marker 菌落② 菌落③ 菌落④ 8000bp 6000bp 5000bp 4000bp 3000bp 2000bp 1000bp 500bp 图2 说明：用图1中的引物1和2进行PCR 扩增。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。 PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环， 可实现基因片段的 。R基因敲除过 程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR 检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为 菌落 (填序号)，出现菌落④的可能 原因是 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需 要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过 对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致 病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出 实验思路。 39.(2023·全国甲，37,15 甲 乙丙 分)为了研究蛋白质的 结构与功能，常需要从 生物材料中分离纯化 蛋白质。某同学用凝 胶色谱法从某种生物材料中分离纯化得到了 甲、乙、丙3种蛋白质，并对纯化得到的3种 蛋白质进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，结 果如图所示(“十”“一”分别代表电泳槽的阳 极和阴极)。己知甲的相对分子质量是乙的 2倍，且甲、乙均由一条肽链组成。回答下列 问题。 最新真题分类特训·生物学 (1)图中甲、乙、丙在进行SDS一聚丙烯酰胺 凝胶电泳时，迁移的方向是 (填“从 上向下”或“从下向上”)。 (2)图中丙在凝胶电泳时出现2个条带，其原 因是 (3)凝胶色谱法可以根据蛋白质 的 差异来分离蛋白质。据图判断，甲、乙、丙3 种蛋白质中最先从凝胶色谱柱中洗脱出来的 蛋白质是 ,最后从凝胶色谱柱中洗 脱出来的蛋白质是 (4)假设甲、乙、丙为3种酶，为了减少保存过 程中酶活性的损失，应在 (答出1点 即可)条件下保存。 ◆蛋白质工程 40.(2026·云南卷，16,3分)内含肽(Int)可通过 自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽 链。构建编码“内含肽十X蛋白”和“内含肽 十Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达 后，内含肽自我切除生成X十Y融合蛋白， 如图。 X蛋白的功能 结构外肽链 内含肽+Y蛋白 内含肽自我切除 IntA IntB' X蛋白的 功能结构内含肽+X蛋白 X+Y融合蛋白 下列说法正确的是 () A.构建X十Y融合蛋白基因导入细胞，会因 碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B.内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内， 以保证获得的融合蛋白功能正常 C.不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识 别，发挥特异性切除和连接作用 D.为X十Y融合蛋白提供“内含肽十某蛋 白”，可赋予X十Y融合蛋白新的结构 41.(2023·湖北，9,2分)胁迫是指一种显著偏 离于生物适宜生活需求的环境条件。水杨酸 可以减轻胁迫对植物的不利影响。在镉的胁 迫下，添加适宜浓度的水杨酸可激活苦草体 内抗氧化酶系统，降低丙二醛和H2O2含量， 有效缓解镉对苦草的氧化胁迫。下列叙述错 误的是 A.水杨酸能缓解H2O2对苦草的氧化作用 B.在胁迫环境下，苦草种群的环境容纳量 下降 164 C.通过生物富集作用，镉能沿食物链传递到 更高营养级 D.在镉的胁迫下，苦草能通过自身的调节作 用维持稳态 42.(2026·广东卷，20,12分)疟疾是由疟原虫 引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成 严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸 血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因 (MM一CP)按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后 高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发 育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列 问题： (1)构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类 型属于 。MM一CP转录形 成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的 与mRNA上的密码子互补配对，将 氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 (2)研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转 基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个 体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中 调控MM一CP表达的启动子类型为 从基因传递的角度分析，选用该类 启动子的原因是 为降低抗菌肽对按蚊的不利影 响，运用蛋白质工程原理提出一种改造 MM一CP的设计思路。 (3)基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技 术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率 显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研 究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊 (如图)。与非驱动型相比，驱动型后代中携 带MM一CP的个体比例显著增加，其原因 是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然 后 使更多配子携带MM一CP。 ⑩ 配 基因驱动 形 成过程 的（驱动成功） ⑧① ⑧⑧ 携带MM-CP的染色体 非驱动型 驱动型 ·野生型染色体 (4)若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可 能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提 出一种潜在风险。