2026届高三生物二轮复习知识清单发酵工程

该高中生物学高考复习讲义围绕发酵工程专题，涵盖传统发酵技术应用、微生物培养及发酵工程原理与应用等核心考点，按“原理-技术-应用”逻辑层次构建知识体系。通过考点梳理（如表格对比菌种代谢类型）、方法指导（无菌技术操作要点）、真题训练（发酵曲线分析）等环节，帮助学生突破实验操作和原理理解难点，体现复习的系统性与针对性。 资料突出科学思维与探究实践素养培育，创新采用“对比归纳+实验模拟”教学策略。例如通过设计“果酒果醋发酵条件控制”模拟实验，引导学生分析温度、氧气对发酵产物的影响，强化物质与能量观。设置分层练习（基础操作辨析、综合实验设计），配合即时反馈，确保高效复习，为教师把控复习节奏、提升学生应考能力提供有力支持。

发酵工程 第1节　传统发酵技术的应用 一、发酵与传统发酵技术 1. 发酵 概念 人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 应用 不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，利用它们就可生产出人们所需要的多种产物。 类型 传统发酵技术、现代发酵技术（单一菌种）/需氧发酵、厌氧发酵 注意： ①必修一中的微生物的无氧呼吸是发酵，狭义的发酵定义。 ②代谢的同化作用和异化作用 同化作用：又叫做合成代谢，是指生物体把从外界环境中获取的营养物质转变成自身的组成物质，并且储存能量的变化过程。（自养异养） 异化作用：又叫做分解代谢，是指生物体能够把自身原有的一部分组成物质加以分解，释放出其中的能量，并且把分解的终产物排出体外的变化过程。（呼吸类型） 2. 传统发酵技术 概念 直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术 特点 以混合菌种的固体（比如泡菜）发酵及半固体（比如大酱）发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。 优点 操作简单、是文化的传承。 缺点 生产条件不易控制，易受杂菌污染，生产效率低。 实例 利用酵母、曲霉和毛霉(起主要作用)等微生物发酵制作腐乳 二、尝试制作传统发酵食品 1. 制作泡菜、果酒和果醋所用菌种的比较 乳酸菌 酵母菌 醋酸菌 生物学分类 原核生物 真核生物 原核生物 代谢类型 异养厌氧 异养兼性厌氧 异养好氧 最适生长温度 — 约为28 ℃ 30~35 ℃ 主要应用 泡菜的腌制、乳制品的发酵 酿酒、制作馒头和面包 制作各种风味的醋 2. 泡菜制作的原理、步骤及注意事项 (1)原理：C6H12O62C3H6O3(乳酸)+能量。 在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸 反应式：C6H12O62C3H6O3＋能量 温度约20-30℃，一般10天后，亚硝酸盐含量开始下降。 注意：发酵期间，乳酸含量0.4%-0.8%时，泡菜口味品质最佳。 (2)步骤:盐水配制→菜料加工→密封菜坛 A.配制盐水：用清水和食盐配制质量分数为5%-20%的盐水，煮沸冷却待用。 5%-20%：盐的浓度过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；用量过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。 盐水煮沸：煮沸的作用一是除去水中的氧，二是杀灭盐水中的杂菌。（杀菌除氧） 冷却：防止微生物被高温烫死。 B.原料处理：将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状，装入泡菜坛至半坛时加入蒜瓣、生姜、香辛料继续装至八成满。 晾干：否则泡菜易变质。 半坛时装香辛料：防止调料因注入盐水上浮。 八成满：在泡菜发酵初期，由蔬菜表面带入的酵母菌等较为活跃，它们可进行发酵，发酵产物中有较多的CO2，如果泡菜坛装得太满，发酵液可能会溢出坛外。另外，泡菜坛装得太满，会使盐水不容易完全淹没菜料，从而导致坛内菜料变质腐烂。泡菜坛留有一定的空间，也更方便拿取泡菜。 C.装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入香辛料，继续装到八成满，再徐徐注入配制好的冷却的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。 没过：防止菜料变质腐烂，创造无氧环境。 D.封坛发酵：向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。要注意经常补充水槽中的水。 注满水、补充水：以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。 E成品：将封好的坛子，放在室温环境中约15天，便可制成清脆爽口的泡菜。 (3)腌制条件 在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生,膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡。 分析：泡菜坛长一层白膜：酵母菌繁殖 制作的泡菜“咸而不酸”的原因？ 可能是食盐浓度过高、发酵温度过低，导致泡菜未能正常发酵。 亚硝酸盐：硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的。 (4)注意事项 ①材料的选择及用量 a. 蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。 b. 用清水和食盐配制质量分数为5%~20%的盐水，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的杂菌。 ②防止杂菌污染：泡菜坛洗净并消毒处理、蔬菜洗净并晾干等。 ③氧气需求 a. 要选择密封性良好的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。 b. 向泡菜坛坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水。 ④控制适宜的发酵温度：温度过高易导致杂菌滋生，温度过低不利于乳酸菌发酵，会使发酵时间延长。 3. 果酒、果醋制作的原理及步骤 (1)酵母菌发酵制作果酒的原理 ①有氧条件，进行有氧呼吸，大量繁殖: C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O+能量。 ②无氧条件，进行酒精发酵，产生酒精： C6H12O62C2H5OH(酒精)+2CO2+能量。 ③菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。 (2)醋酸菌发酵制作果醋的原理 ①O2、糖源都充足时： C6H12O6+2O22CH3COOH(乙酸)+2H2O+2CO2+能量。 ②缺少糖源时： C2H5OH+O2CH3COOH(乙酸)+H2O+能量。 (3)实验流程 过程： A.器具的清洗、消毒：榨汁机要洗净晾干，发酵瓶要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒。 B材料的选择和处理：取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干。 清水冲洗1-2次：去除表面的灰尘、污物，不能多次清洗，防止野生菌种数量减少，影响发酵。 再去除枝梗：避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会。（避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会） C.榨汁装瓶：用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶，注意要留1/3的空间，盖好瓶盖。 留1/3的空间：先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生CO2造成瓶内压力增大，导致发酵液的溢出。 D.发酵： 果酒发酵：将温度控制在18-30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右拧松瓶盖，注意不能打开瓶盖，此后再拧紧瓶盖，发酵时间为10-12d，每天定时排出发酵产生的CO2，10d后开始从出料口抽样，监测酒精浓度或菌体数量。 18～30℃:野生酵母菌有多种，提供适合多种菌生长的温度范围。 拧松：排出发酵产生的气体，但不能打开瓶盖，防止空气中杂菌进入污染发酵液。 果醋发酵：当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布,用充气泵不断从充气口泵入空气，温度严格控制在30～35℃，发酵7～8d，即可制成果醋。 打开瓶盖，盖上一层纱布：通气，让空气中的醋酸菌进入进行发酵，并且防止外来杂菌灰尘污染。 果酒发酵时间长，酒精少：温度不适，菌种少。 制作果酒时瓶盖密封不严：变酸，液面会形成白膜（醋酸菌繁殖） （4）发酵条件 果酒制作 果醋制作 温度 18～25℃ 30～35℃ 时间 10～12d 7～8d 通气 先通气后密封，或预留约1/3的空间 始终通气 (5)发酵装置图分析 装置图 结构 目的 酒精发酵 醋酸发酵 充气口 醋酸发酵时连接充气泵进行充气，酒精发酵时关闭充气口 关闭 打开，接入气泵，管口可以放棉花或过滤装置 排气口 用来排出发酵过程中产生的气体 打开 打开 长而弯曲的胶管 防止空气中微生物的污染 出料口 便于取料，及时监测发酵的情况 关闭 关闭 （6）产物检测 果酒的制作 果醋的制作 相同 嗅味、品尝等 不同 通过酸性重铬酸钾检验酒精 通过酸碱指示剂(pH试纸)检测发酵前后发酵液的pH变化 4.制作果酒和果醋过程中的注意事项(以葡萄酒和葡萄醋的制作为例) (1)材料的选择与处理：选择新鲜的葡萄，榨汁前先冲洗后再去除枝梗和腐烂的籽粒。对于果酒的自然发酵，冲洗不要反复进行，以免酵母菌数量减少，发酵周期延长。 (2)发酵条件的控制 ①葡萄汁装入发酵瓶中时，要留有大约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸耗尽O2后，再进行酒精发酵，同时防止发酵过程中产生的CO2使发酵液溢出。 ②酒精发酵过程中先通O2以利于酵母菌大量繁殖，然后密闭充气口以利于酵母菌进行酒精发酵。发酵过程中，适时打开排气口，排出产生的CO2。醋酸发酵为有氧发酵，需适时通过充气口充入无菌空气。 ③严格控制温度：18~30 ℃利于酵母菌的酒精发酵；30~35 ℃利于醋酸菌的醋酸发酵。 (3)防止杂菌污染 ①发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精洗净，并用体积分数为70%的酒精消毒，杀灭部 分微生物，减少杂菌污染。 ②酒精发酵时，装入葡萄汁后发酵瓶要密封或后期密闭充气口。无氧、偏酸性、 18~30 ℃的条件下适合酵母菌的生存，不利于绝大多数其他微生物的生存。 5.果酒泡菜制作过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化情况 乳酸菌数量 乳酸含量 亚硝酸盐含量 发酵初期 少(有O2，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用) 发酵中期 最多(乳酸积累，抑制杂菌活动) 增多、pH下降 下降(硝酸盐还原菌被抑制，部分亚硝酸盐被分解) 发酵后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制乳酸菌活动) 继续增多，pH继续下降，直至稳定 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 变化曲线 亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的 亚硝酸盐的致癌机理是:在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物亚硝胺。 亚硝酸盐类食物中毒又称肠原性青紫病、紫绀症、乌嘴病。亚硝酸盐中毒是指由于食用硝酸盐或亚硝酸盐含量较高的腌制肉制品、泡菜及变质的蔬菜引起的中毒，或者误将工业用亚硝酸钠作为食盐食用而引起，也可见于饮用含有硝酸盐或亚硝酸盐苦井水、蒸锅水后，亚硝酸盐能使血液中正常携氧的低铁（2价）血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因而失去携氧能力而引起组织缺氧。亚硝酸盐是剧毒物质，成人摄入0.2一0.5克即可引起中毒，3克即可致死。同时食道癌与患者摄入的亚硝酸盐量呈正相关性. 亚硝酸盐中毒发病急速，一般潜伏期1一3小时，中毒的主要特点是由于组织缺氧引起的紫绀现象，如口唇、舌尖、指尖青紫，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫。头晕、头疼、乏力、心跳加速嗜睡或烦躁、呼吸困难、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者昏迷、惊厥、大小便失禁，可因呼吸衰竭而死亡。 临床上患“高铁血红蛋白症”的婴儿即是食用亚硝酸盐或硝酸盐浓度高的食品引起的，症状为缺氧，出现紫绀，甚至死亡. 第2节　微生物的培养技术及应用 一.培养基的配制 1.微生物的营养要求： 微生物为了生存就必须从环境中吸取各种物质以合成细胞物质、提供能量以及调节新陈代谢。这类物质就称为营养物质，除了水以外，主要分为碳源、氮源、无机盐、生长因子四大类。 2.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 3.种类 a.按物理性质分 固体培养基（加琼脂）：用于实验室菌种的分离.鉴定.计数等 液体培养基（不含凝固剂）：用于工业生产（扩大培养） b.按用途分 选择培养基：从众多微生物中分离所需要的微生物 鉴别培养基：鉴别不同种类的微生物 c.按成分分 天然培养基（有些成分未知）：用于工业生产 合成培养基（各成分已知并按一定比例配制的）：用于实验室分离.鉴定.计数 比较 概念 举例 选择培养基 培养基中加入某种化学物质以促进所需要的微生物生长，抑制不需要的微生物生长 1. 培养基中加入青霉素：培养酵母菌和霉菌，抑制细菌生长 2. 加入高浓度食盐，培养耐盐菌，如金黄色葡萄球菌 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品 在培养基中加入伊红-亚甲蓝：鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌（菌落呈深紫色，并带有金属光泽） 4. 培养基的组成成分 (1)主要营养物质： 水、碳源、氮源和无机盐。 (2)其他条件：pH、特殊营养物质(如维生素)和O2的需求。 培养的微生物 需要满足的特殊条件 乳酸杆菌 培养基中添加维生素 霉菌 一般将培养基调至酸性 细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性 厌氧微生物 需要提供无氧的条件 如1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源.磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 2、 无菌技术——消毒和灭菌 1.无菌技术关键：防止杂菌污染。 2.无菌技术的目的： （1）可防止实验室的培养物被其他微生物污染。 （2）有效避免操作者自身被微生物感染。 3.无菌技术的选择原则： （1）考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。 （2）考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。 4.消毒与灭菌： 项目 条件 结果 常用方法 应用范围 消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 杀死物体表面或内部一部分微生物 煮沸消毒 日常用品 巴氏消毒 不耐高温的液体 化学药物消毒 操作的空间、操作者的衣着和手等 紫外线消毒 接种室、接种箱或超净工作台等 灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 湿热灭菌 培养基等 干热灭菌 玻璃器皿、金属用具等 灼烧灭菌 接种工具等 与煮沸消毒法相比，巴氏消毒法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失少。 三、微生物的纯培养（以酵母菌的纯培养为例） 1. 相关概念 (1)培养物：在微生物学中，接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。 (2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 (3)纯培养：获得纯培养物的过程。 (4)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞群体。 2. 酵母菌纯培养的实验 （1）原理：微生物群分散成单个细胞在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体，这就是群落。 （2）方法：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单一菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 （3）步骤： a配制培养基： b灭菌：培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，如图所示，然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。 c倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程： d平板划线法接种和分离酵母菌 ①平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 操作步骤 操作内容 ①接种环灭菌 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红 ②取菌种 a 在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞 b 将试管口通过火焰 c 在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 d 将试管口通过火焰，并塞上棉塞 ③平板划线 a 在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖 b 灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连 ②平板划线法结果： 平板划线示意图（A）及培养后菌落分布示意图（B）如下图所示。 ③几次灼烧的目的： 灼烧时期 目的 第一次操作（取菌种前） 杀死接种环上原有的微生物，避免污染培养物 每次划线之前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少 划线结束 杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 培养酵母菌：将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24~48 h。 简答： 1）.平板冷却后为什么要将平板倒置？ 可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染 2）.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线结束时，仍然需要灼烧接种环？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 杀死接种环上原有微生物 每次划线前 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 3.若要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？ 图中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。 4.在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？ 划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。 四．微生物的选择培养与计数 1.选择培养基 （1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 （2）选择培养基概念：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 （3）选择培养基配方的设计： a原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。 b培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。 自然界中目的菌的筛选 a.实例：聚合酶链式反应（PCR）中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的。 b.依据：水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生产，而绝大多数微生物在此条件下不能生存（生物与环境相适应） 2.微生物的选择培养 （1）方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 （2）稀释涂布平板法的操作过程： a系列梯度稀释操作： b涂布平板操作。 ①取菌液：取0.1mL菌液，添加到培养基表面。 ②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃烧，酒精燃尽后，冷却涂布器。 ③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。 用平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时，也会杀死一部分菌类。 （3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温培养箱中培养，观察。 3.微生物的数量测定 项目 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量 计算公式 每克样品中的菌落数=(C÷V)×MC：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌 结果 比实际值偏小 比实际值偏大 4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （1）实验原理 ①分解尿素的原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。 ②筛选菌株的原理：利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？ 不一定，因为有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。 （2）实验流程示意图： （3）实验操作过程： 流程 具体操作 操作提示 土壤取样 先铲去表层土，取距地表 3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样 ②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌 制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用 样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本 ②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作 ②对所用的平板、试管做好标记 ③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液 培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养 ②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录 ③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300 的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格 ②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等 ③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目 五、两种常用接种方法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 连续划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 注意事项 (1)接种环的灼烧 ①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；②每次划线后：杀死残留菌种，保证每 次划线菌种来自上次划线末端；③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。 (2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度过高杀死菌种。 (3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连。 (4)划线力度要适当，防止用力过大将培养基表面划破。 (5)培养皿盖不能完全打开，应只打开一条缝隙 (1)稀释操作：每支试管及其中的9 mL无菌水、移液管等均需灭菌。 (2)涂布平板①涂布器用酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧；②不要将过热的涂布器放入盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿之间的距离要合适，移液管管头不能接触任何物体；④培养皿盖不能完全打开，应只打开一条缝隙 相同点 都能获得单细胞菌落 不同点 不能对微生物计数 能对微生物计数 六、选择培养和鉴别培养基的比较 1. 原理 类型 原理 选择培养基 人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长 鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的微生物 2. 实例 类型 实例 选择培养基 培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌 以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌 不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物 石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生长，达到分离能消除石油污染的微生物的目的 培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物 鉴别培养基 伊红—亚甲蓝琼脂培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色，并有金属光泽) 七、微生物的筛选与鉴别方法 1. 微生物的筛选方法 单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物 选择培养法 利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物 鉴别培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物 2. 微生物的鉴别方法 菌落特征鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小和颜色等特征进行鉴别 指示剂鉴别法 如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素 染色鉴别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物 第3节　发酵工程及其应用 一、发酵工程的基本环节 1. 基本环节 基本环节 条件 选育菌种 可从自然界中筛选，也可通过诱变育种或基因工程育种获得；优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，会赋予发酵产品独特的风味， 菌种选育环节在很大程度上 决定了生物发酵产物的成败 扩大培养 工业发酵罐对菌种总体积需求量大，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。 培养基的配制 在菌种确定之后，要选择原料制备培养基；在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。 灭菌 发酵工程种所用的菌种大多是 单一菌种 ，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大降低。培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。 接种 将扩大培养后 的菌种投放到 发 酵 罐中 ，要注意防止杂菌的污染，发酵罐冷却后才可加入 发酵罐内发酵 中心环节，发酵过程中，要随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等，以 了解 发 酵 进 程 ;及时添加必需的营养物质 ,要严格控制 温度pH和溶氧量等发酵条件。 分离、提纯产物 发酵产品是微生物细胞本身时，可在发酵结束之后，采用过滤、 沉淀 等方法将菌体分离和干燥； 发酵产品是代谢物时，可根据产物的性质采取适当的提取 、 分离 和 纯化措施来获得产品。 获得产品 单细胞蛋白、味精等 2. 环节分析 (1)选育菌种时可从自然界中筛选，也可通过诱变育种或基因工程育种获得；如果生产的是微生物直接合成的产物：可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。如果生产的是一般微生物不能合成的产品：可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传持性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的。 (2)菌种扩大培养的目的是促使菌体快速增长，满足发酵生产需求。 (3)发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节，此阶段在了解发酵进程的同时，还要控制发酵条件。 (4)发酵产物有代谢物和微生物细胞本身，前者需要提取、分离和纯化，后者可通过过滤、沉淀等方法分离和干燥。 二、发酵工程的应用 1. 发酵工程的特点：生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等。 2. 应用 应用 内容 实例 在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品 酱油、酒类 生产各种各样的食品添加剂 (1)通过黑曲霉的发酵制得柠檬酸；(2)由谷氨酸棒状杆菌发酵可以得到谷氨酸，谷氨酸经过一系列处理就能制成味精 生产酶制剂 α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等 在医药工业上的应用 生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等 生长激素释放抑制激素、乙型肝炎疫苗等 在农牧业上的应用 生产微生物肥料 根瘤菌肥、固氮菌肥等 生产微生物农药 利用苏云金杆菌防治农林虫害等 生产微生物饲料 用单细胞蛋白制作微生物饲料 在其他方面的应用 能源物质上的应用 利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等 极端微生物的应用 嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量 3. 实例——啤酒的工业化生产流程 啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的，其工业化生产流程如下：   (1)发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段，其中主发酵完成酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成；后发酵是在低温、密闭的环境下储存一段时间，以形成澄清、成熟的啤酒。 (2)焙烤的目的是加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。 (3)蒸煮的目的是产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。 (4)在啤酒的发酵生产过程中，菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒等，都有助于提高啤酒的产量和品质。 学科网（北京）股份有限公司 $