2027届高三生物人教版一轮复习讲义第十单元　第54课时　基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)

该高中生物学讲义围绕基因工程基本工具、操作程序及DNA粗提取核心考点，依据课标要求和近三年高考真题考情，按工具-操作-实验逻辑梳理知识，通过考点归纳、方法指导（如限制酶选择原则）、真题精讲（2025年江苏等多地真题）及分层练习（基础排查、课时精练），系统构建复习框架，针对性突破难点。 资料以科学思维和探究实践为导向，创新设计限制酶双酶切分析、双标记基因筛选等策略，结合DNA粗提取实验操作要点，培养学生实验技能与问题解决能力。设置基础到综合的练习梯度，配合即时反馈，助力学生高效掌握解题技巧，为教师把控复习节奏、提升学生应考能力提供有力支持。

第54课时 基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取) 课标要求 1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 考情 分析 1.基因工程的基本工具:2025 江苏 T19 2024 湖南 T5 2.基因工程的基本操作程序:2025 陕晋宁青 T21 2025 安徽 T15 2025 河北 T22 2024 贵州 T21 2024 湖南 T21 2024 甘肃 T21 2024 全国甲 T38 2023 湖北 T4 2023 新课标 T6 2023 广东 T20 2023 海南 T20 2023 山东 T25 2023 天津 T17 2022 广东 T22 2022 北京 T21 2022 山东 T25 考点一 基因工程的基本工具 1.基因工程(重组DNA技术)的概念 归纳总结 基因工程的理论基础 教材隐性知识 源自选择性必修3 P68“科技探索之路”:肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移;科学家发现,在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力,并可以在细菌细胞间转移;多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件;基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 提醒 ①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 ③原核生物中限制酶存在的意义是切割外源DNA以保证自身安全,防止外来病原物的危害。而限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(甲基化),使限制酶不能将其切开。 (2)DNA连接酶 (3)载体 归纳总结 ①在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ②噬菌体或某些动植物病毒作为载体的原理是利用了噬菌体或病毒对宿主细胞的侵染性。 ③载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞,原理如图所示: 分析限制酶的作用和选择 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中,需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR 和Nhe 切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题: (1)限制酶EcoR 和Nhe 切割产生的黏性末端分别是和。 (2)切割图中的目的基因应选用哪类限制酶?请说明理由。 提示 用限制酶Mun 和Spe 切割目的基因。限制酶Mun 和EcoR 切割后形成的黏性末端相同,限制酶Nhe 和Spe 切割后形成的黏性末端相同,实验人员使用限制酶EcoR 和Nhe 切割质粒,应选用Mun 和Spe 切割目的基因。 归纳总结 限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择Pst ,而不选择Sma 。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择Sma 。若载体上有两个及以上的标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst 和EcoR 两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。 考向一 辨析基因工程的基本工具 1.(2023 湖北,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( ) A.若用Hind 酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu 酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用Sph 酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph 酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案 D 解析 若用Hind 酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与原质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;Sph 的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用Sph 酶切,重组质粒中四环素抗性基因被破坏,因此在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。 2.(2025 江苏,19改编)如图为人体正常基因A突变为致病基因a及Hind 切割位点。Alu 限制酶识别序列及切割位点为。下列叙述错误的是( ) A.基因A突变为基因a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切基因A后,形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切基因a后,产生的片段大小不一致 D.产前诊断时,该致病基因可选用Hind 限制酶开展酶切鉴定 答案 A 解析 对比基因A和基因a的序列,基因A中“AAGCTT”变为基因a中“AAGCTG”,属于碱基替换(T G),A错误;Hind 切割产生黏性末端,Alu 切割产生平末端,二者形成的末端类型不同,B正确;基因a中Hind 有2个切割位点,Alu 有3个切割位点,用两种限制酶分别酶切基因a后,产生的片段大小不一致,C正确;因为正常基因A和致病基因a的Hind 切割位点不同,所以产前诊断时,该致病基因可选用Hind 限制酶开展酶切鉴定,D正确。 归纳提升 与DNA有关的几种酶的比较 考点二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因。 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 归纳总结 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下,不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 农杆菌转化法:将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体DNA上 表达 将含有目的基因的表达载体提纯 取卵(受精卵) 显微注射 受精卵发育 获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 基因表达载体导入 辨析 (1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同,实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 4.目的基因的检测与鉴定 分析基因工程的基本操作程序 科学家将苏云金杆菌中“杀虫基因”转入棉花中,棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。回答以下问题: (1)能否让游离的杀虫基因直接进入棉花细胞?并说明理由。 提示 游离杀虫基因一般会在棉花细胞中被分解,即使能表达,也不能随细胞分裂进行复制,不能稳定地遗传给子代。 (2)如何让杀虫基因稳定存在于棉花细胞? 提示 通过构建基因表达载体实现将杀虫基因整合到染色体DNA上,或者能在细胞内独立稳定存在,且能自我复制并表达,随着细胞分裂传给子代。 (3)为确保杀虫基因可以正常表达,在基因表达载体中,其上下游序列需具有启动子和终止子。 (4)杀虫基因导入棉花细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从棉花细胞中提取染色体DNA(基因组DNA)并用PCR扩增,电泳后观察是否扩增出目的基因。 (5)若要通过实验检测杀虫基因在棉花细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路:从棉花细胞中提取蛋白质,再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测是否出现杂交带。 考向二 辨析基因工程的基本操作程序 3.(2025 安徽,15)质粒K中含有 -半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( ) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 答案 C 解析 使用氯化钙处理大肠杆菌,可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数,A正确;如果筛选平板中仅含卡那霉素,能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性,白色菌落可能导入了重组质粒(含目的基因),筛选平板因未加入X-gal无法检验 -半乳糖苷酶基因是否被破坏,也可能是导入了未重组的质粒K,所以不可判定该白色菌落为含目的基因的菌株,B正确;筛选平板中长出的白色菌落,可能导入了重组质粒(含目的基因),但导入的目的基因不一定成功表达目标蛋白,不能仅仅因为是白色菌落就判定其为表达目标蛋白的菌株,C错误;若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌,因为自身环化的质粒K中 -半乳糖苷酶基因完整,能表达活性 -半乳糖苷酶,分解X-gal进而形成蓝色菌落,D正确。 归纳总结 双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌,如图1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4.(2025 陕晋宁青,21)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题: (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、_、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的_步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的_(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5′-_-3′,切割载体时应选用的两种限制酶是_,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到_,抗性基因_可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经_形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案 (1)4种脱氧核苷酸 延伸 (2)5′端 AGATCT BamH 、EcoR (3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上 2 再分化 解析 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步,其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamH 、EcoR 和Xba 的识别序列,而S基因内部含有Xba 、Nde 和BamH 的识别序列,要用BamH 、EcoR 或Xba 切割载体,又不能用Xba 、Nde 或BamH 切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点,可知需要用BamH 、EcoR 切割载体,用BamH 的同尾酶Bgl 和EcoR 切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′-AGATCT-3′。(3)T-DNA属于可转移DNA,用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上,抗性基因1位于T-DNA外部,用于筛选含有重组载体的农杆菌,而抗性基因2位于T-DNA内部,可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 考点三 DNA的粗提取与鉴定 1.基本原理 2.操作流程 提醒 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 (2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 (1)DNA的粗提取与鉴定实验中,可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”(2025 湖南,2)( ) 提示 猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器,不含DNA,用猪成熟红细胞替代猪肝细胞用于DNA的粗提取与鉴定实验达不到实验目的。 (2)土豆DNA溶于酒精后,与二苯胺试剂混合呈蓝色(2025 四川,5)( ) 提示 DNA的鉴定需在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应呈蓝色。 (3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻璃棒上有白色丝状物( ) 提示 向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,鸡血细胞吸水涨破,DNA溶于蒸馏水,观察不到白色丝状物。 (4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022 湖北,4)( ) 提示 动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。 考向三 DNA的粗提取与鉴定 5.(2024 安徽,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( ) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案 D 解析 研磨液中含有NaCl,有利于DNA的溶解,若换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,因此利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B正确;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取,C正确;在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA,不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D错误。 6.(2024 山东,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列叙述正确的是( ) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案 A 解析 研磨液在4 冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;加入二苯胺试剂后沸水浴处理5分钟,且要等到冷却后再观察结果,这样才可以观察到较为明显的显色反应,仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。 一、基础排查 1.判断下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述 (1)与洋葱相比,猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料( ) 提示 猪血主要包括红细胞、白细胞和血小板,其中红细胞和血小板无细胞核,不适合用于提取DNA。 (2)因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质( ) 提示 DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可初步分离DNA与蛋白质。 (3)研磨液在4 冰箱中放置几分钟后,取沉淀进一步实验( ) 提示 研磨液在4 冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,故取上清液进一步实验。 (4)预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性,防止DNA水解( √ ) (5)加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌( √ ) (6)两次离心,第一次DNA主要存在于上清液中,第二次主要存在于沉淀物中( √ ) (7)将提取的丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,将二苯胺试剂加入就能出现蓝色( ) 提示 将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,经过沸水浴加热5 min才会出现蓝色。 2.判断下列关于基因工程中工具酶的叙述 (1)限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取( √ ) (2)限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA( ) 提示 限制酶能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列,不能识别剪切RNA。 (3)不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端( √ ) (4)DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键( ) 提示 DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。 (5)E.coli DNA 连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来( ) 提示 E.coli DNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段,也能连接具有平末端的DNA片段,只是连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 3.判断下列关于基因工程中载体的叙述 (1)基因工程中所用的载体除质粒外,还有噬菌体、动植物病毒等( √ ) (2)基因工程中用的载体大多数为天然质粒( ) 提示 在基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (3)质粒是常用的载体,有2个游离的磷酸基团( ) 提示 质粒是一种双链环状DNA分子,无游离的磷酸基团。 (4)载体质粒必须具有自我复制能力( √ ) (5)载体质粒具有一个至多个限制酶切割位点,以便目的基因的插入( √ ) (6)载体质粒中必须有抗生素抗性基因,便于重组DNA分子的筛选( ) 提示 载体质粒中必须有标记基因,但不一定是抗生素抗性基因。 4.判断下列关于基因表达载体及其构建过程的叙述 (1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建( √ ) (2)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代( √ ) (3)一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构( ) 提示 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。 (4)基因表达载体的构建至少需要两种工具酶( √ ) (5)基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对( √ ) (6)诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达( √ ) (7)基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位,启动复制过程( ) 提示 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,启动转录过程。 5.判断下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述 (1)农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞,然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上( ) 提示 农杆菌转化法是将目的基因插入农杆菌的Ti质粒中的T-DNA上,让携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞,通过农杆菌的转化作用,就可以把目的基因整合到植物细胞的染色体DNA上。 (2)将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时,可以用钙离子处理细菌( √ ) (3)应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内( √ ) (4)将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞,采用显微注射技术进行操作( ) 提示 动物受精卵全能性最高,应采用显微注射技术将目的基因导入受精卵中。 (5)可采用PCR技术检测目的基因是否转录和翻译( ) 提示 可采用PCR技术检测目的基因是否转录,采用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 (6)检测某抗虫基因转基因是否成功,最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状( √ ) 二、要语必背 1.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 2.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。 3.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 4.(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种,除目的基因、标记基因外,还必须有启动子、终止子等。 5.(选择性必修3 P80)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。 6.(选择性必修3 P81)转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 课时精练 [分值:100分] [1~4题,每题4分;5~10题,每题5分。共46分] 一、选择题 1.(2024 湖南,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( ) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案 B 解析 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;在酶切条件不合适时,可能会出现DNA完全没有被酶切的情况,需要调整反应条件如温度、pH等,但调整酶的用量没有作用,B错误;质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。 2.(2023 广东,11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程:裂解 分离 沉淀 鉴定。下列叙述错误的是( ) A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案 D 解析 裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质,针对不同的实验材料,可选择不同的方法破坏细胞,如植物细胞可选择研磨的方法,而动物细胞可选择吸水涨破的方法,A正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 mol/L的NaCl溶液,将溶液过滤,即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离,B正确;DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA的纯度,C正确;将DNA溶于NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,沸水浴五分钟,待冷却后,溶液能呈现蓝色,D错误。 3.(2025 茂名一模)基因在不同生物间转移的研究,推动了遗传学的发展。下列叙述错误的是( ) A.肺炎链球菌转化实验,证明DNA可在同种生物不同个体之间转移 B.质粒作为基因工程的载体可将外源基因导入受体细胞,实现物种间基因交流 C.我国转基因抗虫棉的成功培育,实现了基因由植物向微生物的定向转移 D.噬菌体侵染细菌实现了基因转移,实现了外源基因在原核细胞中的表达 答案 C 解析 肺炎链球菌的转化实验中,S型细菌DNA可以将R型活细菌转化为S型细菌,证明DNA可在同种生物不同个体之间转移,A正确;质粒作为基因工程的载体可将外源基因导入受体细胞,受体细胞与供体细胞可能属于不同物种,从而实现物种间基因交流,B正确;我国转基因抗虫棉的成功培育,是将来自微生物的抗虫基因导入棉花细胞中,实现了基因由微生物向植物的定向转移,C错误;噬菌体侵染细菌时,将噬菌体自身的DNA注入细菌细胞内,实现了基因转移,且噬菌体的基因能在细菌细胞内表达,最终组装出新的子代噬菌体,即实现了外源基因在原核细胞中的表达,D正确。 4.(2025 广州阶段考)研究人员将外源鲫鱼Mx基因(该基因产物能抵抗黏病毒)与质粒相连接构建基因表达载体,利用显微注射的方法将其导入草鱼体内,获得转基因抗病草鱼。下列叙述正确的是( ) A.获得抗黏病毒草鱼方法的原理是基因重组 B.重组载体的受体细胞一般是已分化的体细胞 C.转录Mx基因需要解旋酶和DNA连接酶 D.构建重组载体的质粒一般是天然质粒 答案 A 解析 利用基因工程技术获得转基因抗病草鱼,其原理是基因重组,A正确;若要获得转基因动物,则应将重组载体导入受精卵,而不是已分化的体细胞,B错误;转录过程需要RNA聚合酶,其具有解旋的作用,所以转录过程不需要解旋酶和DNA连接酶,C错误;在基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行人工改造的,D错误。 5.(2026 广东深圳罗湖质检)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述正确的是( ) A.①中Ti质粒应包含启动子、复制原点等元件 B.②的构建需要限制酶和DNA聚合酶等物质的参与 C.③侵染后,重组Ti质粒的全部序列都整合到④的染色体上 D.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就一定表现出抗虫性状 答案 A 解析 Ti质粒作为基因工程的载体,应包含启动子(用于启动目的基因的转录)、复制原点(使质粒能在宿主细胞中复制)等元件,这样才能保证目的基因在受体细胞中正常表达和复制,A正确;②是构建重组Ti质粒,需要限制酶(切割目的基因和Ti质粒)和DNA连接酶(连接目的基因和Ti质粒),DNA聚合酶用于DNA复制,B错误;③含重组质粒的农杆菌侵染植物细胞后,重组Ti质粒上的T-DNA整合到受体细胞的染色体上,C错误;④的染色体上含抗虫基因,⑤植株不一定表现出抗虫性状,这是因为目的基因可能没有正常转录、翻译,或者表达的蛋白质没有生物活性等,D错误。 6.(2022 山东,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列叙述错误的是( ) A.过滤液沉淀过程在4 冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 答案 B 解析 离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀,B错误;在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确。 7.(2026 广东六校联考)遗传性视网膜病变是一类由RPE65基因突变导致的视网膜退化性疾病,通过视网膜下注射技术,利用腺相关病毒(AAV)递送功能正常的RPE65基因是治疗遗传性视网膜病变的最新疗法(如图),已使大量患者的视力得到改善。下列叙述错误的是( ) A.步骤①通过构建基因文库获取目的基因,此过程需RNA聚合酶催化 B.构建AAV表达载体时应在RPE65基因前连接视网膜特异性启动子 C.在视网膜下注射转入可让AAV载体更准确、高效地导入视网膜细胞 D.检测患者在低光照下的导航能力是否增强属于个体生物学水平的鉴定 答案 A 解析 步骤①是从RPE65 mRNA通过逆转录法获取RPE65基因,此过程需要逆转录酶催化,A错误;构建AAV表达载体时,为了使RPE65基因在视网膜细胞中特异性表达,应在RPE65基因前连接视网膜特异性启动子,B正确;通过视网膜下注射转入,能够让AAV载体更准确、高效地导入视网膜细胞,从而实现对病变细胞的治疗,C正确;检测患者在低光照下的导航能力是否增强,是从个体生物学水平对治疗效果进行鉴定,D正确。 8.(2026 湛江调研)以RNA干扰技术为原理,研制的新型农药dsRNA(双链)进入害虫细胞后,经过一系列蛋白质的作用引发RNA干扰,导致与害虫生长的相关基因被“沉默”,直至死亡。用于防治马铃薯甲虫的dsRNA农药制备与使用的部分技术路线如图所示。下列叙述正确的是( ) 注:T7是质粒上允许双向转录的特殊启动子。 A.重组质粒上只需其中一个T7启动子转录就可得到dsRNA B.dsRNA可以通过降解mRNA来实现害虫相关基因的“沉默” C.马铃薯甲虫不会对该dsRNA农药产生抗性 D.dsRNA农药不会对其他害虫产生毒害作用 答案 B 解析 由于dsRNA是双链,需要DNA两条链分别作模板进行转录获得,因此需要T7两个方向都有启动子才行,A错误;dsRNA可与目标mRNA特异性结合并降解,来实现害虫相关基因的“沉默”,以达到防治目的,B正确;由于马铃薯甲虫存在变异,通过dsRNA农药的选择,导致无法被“沉默”的相关基因频率升高,从而产生抗药性,C错误;dsRNA特异性地与某类mRNA结合影响基因的表达,此类基因可能也会出现在其他害虫体内,从而对其也产生毒害作用,D错误。 9.(2025 江西,11)为了获得抗白叶枯病的水稻品种,研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图),通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株。下列叙述正确的是( ) A.水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B.在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 答案 B 解析 通过农杆菌将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株,说明D基因上游的U6启动子能够被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别,启动D基因表达,使水稻植株表现出抗病性状,A错误;图中重组Ti质粒中U6启动子位于D基因上游,能启动D基因表达,但并非位于卡那霉素抗性基因的上游,不能驱动卡那霉素抗性基因的表达,B正确;当农杆菌侵染愈伤组织后,T-DNA整合到水稻染色体DNA中,通常情况下,若D基因能够表达,那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达,使导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性,因此,可在培养基中加入潮霉素,筛选成功转化的愈伤组织,C错误;愈伤组织再分化获得含有D基因的幼苗,只是含有抗病基因,但该基因不一定成功表达,所以不能直接判定为抗病植株,需要进一步检测,D错误。 10.(2025 深圳福田红岭中学适应考)土壤农杆菌天然Ti质粒的结构如图所示。当植物受伤后会释放酚类物质,可激活农杆菌vir基因,其中vir基因是一组基因,可编码virA、virB、virC等一系列对T-DNA转移及整合必不可少的蛋白质;冠瘿碱为农杆菌提供碳源和氮源,可诱导植物产生瘤状结构。Ti质粒需经过改造才能广泛应用于植物基因工程,下列对于Ti质粒功能及改造过程的叙述,错误的是( ) A.农杆菌中的Ti质粒作为遗传物质,侵染植物细胞时并不是整个Ti质粒进行转移 B.当农杆菌附着在植物细胞表面后,Ti质粒vir基因便会被激活和表达,从而发挥作用 C.冠瘿碱合成基因只能在宿主植物体内表达,表达产物会被农杆菌利用 D.需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,以便于后续筛选 答案 B 解析 农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上,并非整个质粒转移,A正确;植物受伤后释放的酚类物质,可激活农杆菌vir基因,而不是农杆菌附着在植物细胞表面后就激活,B错误;冠瘿碱合成基因在T-DNA上,可转移到植物细胞染色体DNA上,在宿主植物体内表达,产生的冠瘿碱为农杆菌提供碳源和氮源,即表达产物会被农杆菌利用,C正确;在T-DNA区域加标记基因,可筛选出T-DNA整合到植物染色体上的细胞,在T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,可在重组Ti质粒构建时,筛选成功导入质粒的农杆菌,D正确。 二、非选择题 11.(18分)(2025 河南,21)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题: (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_ _。 将培养后的菌液混匀并充分_,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5′端最好含有_酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是_ _。 限制酶的识别序列和切割位点如下: (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是_ _,随后在含_和_的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第_位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是_ _。 答案 (1)海藻和海泥中富含卡拉胶,在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释 (2)BamH 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素 (4)44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小 解析 (2)转录过程沿模板链的3′端到5′端进行,所以转录模板链的5′端为靠近终止子的一端,由于E.coliDNA连接酶连接平末端的效率低,因此不选用EcoR V和Sma 酶切,Xba 与Spe 切割产生的黏性末端相同,容易自连或反向连接,切割质粒时Xba 酶与Spe 酶只能选择一个,另一端需要选择BamH 酶切,所以cg基因转录模板链的5′端最好含有BamH 的酶切位点。T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端。选择不同的双酶切组合后,若重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列,会导致重组质粒无法使用构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3)用Ca2+处理大肠杆菌细胞,可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出成功导入表达载体的大肠杆菌,应在培养基中添加卡拉胶和四环素,培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈来判断。(4)空间上相近的半胱氨酸容易形成二硫键,提升蛋白质的耐热性,第44位赖氨酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键提升蛋白质的耐热性,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小。 12.(22分)乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统,该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。图1表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程。回答下列问题: (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖,同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌,早期大肠杆菌主要是利用_(填“①”或“②”)途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完,大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢,此时乳糖作为_为大肠杆菌提供营养,阻遏蛋白主要与_结合,从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造,利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构,如图2。用蓝光照射时,GFP基因的表达情况是_。根据该原理,研究人员构建了如图3基因表达载体,除未标出终止子外,该表达载体缺少的结构是_。 (3)(8分)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果,研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG(诱导物)、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验,请完成表格中4组实验的设置情况,表格里填“-”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果,将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上,蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基(图4),适宜温度下培养一段时间后,紫外灯下培养基的实验现象为_。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案,需要进行的调控是_。 答案 (1)① 碳源 诱导物 (2)GFP基因不表达 光控化改造后的调节基因(或表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因) (3) 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG - + - - 蓝光 - - + - (4)显示三角形的荧光区域 用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射 解析 (1)同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌,大肠杆菌会优先利用葡萄糖,此时,大肠杆菌主要利用①途径来阻断结构基因(乳糖代谢相关基因)表达;当培养基中的葡萄糖消耗完,大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢,此时,乳糖(二糖)作为碳源为大肠杆菌提供营养;由图1可知,诱导物与阻遏蛋白结合,促进结构基因的表达,进而促进乳糖代谢。(2)分析图2,蓝光照射时,阻遏蛋白与操纵区结合,使启动子P表达受阻,导致GFP基因不表达;根据该原理,即光控化改变阻遏蛋白的结构来调节GFP基因的表达,由图3可知,该基因表达载体缺少表达光控化改造后的阻遏蛋白的调节基因(光控化改造后的调节基因)。(3)本实验目的为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果,使用野生型大肠杆菌和光控化改造后的大肠杆菌进行对比,对于野生型大肠杆菌来说,可通过是否添加诱导物IPTG,来调控GFP基因的表达,而且不需要蓝光照射,因为蓝光对野生型大肠杆菌的阻遏蛋白无作用;对于光控化改造后的大肠杆菌来说,阻遏蛋白不需要与IPTG结合来促进GFP基因的表达,故都不需要添加IPTG,而是通过是否有蓝光照射来改变阻遏蛋白的结构,来调控GFP基因的表达。(4)本实验目的是验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果,根据图2分析可知,蓝光照射,GFP基因不表达,黑暗条件下,GFP基因表达形成荧光蛋白,并在紫外光下发荧光,分析图4,三角形区域遮光,黑暗条件下,GFP基因表达,在紫外灯下发荧光,其他区域蓝光照射,GFP基因不表达,不发荧光,因此,该培养基在紫外灯下会显示三角形的荧光区域;为构建其他形状的荧光图案,可采用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射。 13.(14分)(2025 广东,21)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题: (1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及_检测,筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有_(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是_。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是_ _。 (3)研究者选用启动子PX 、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为_ _。 (4)(4分)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:_ _ _。 答案 (1)荧光(强度) (2)显微镜直接计数法 作为检测mKate2蛋白荧光强度的对照 PGeo停止转录,mKate2蛋白合成停止,但特异性降解持续(分解) (3)快速生长期荧光强度低,进入生长稳定期迅速增强 (4)先敲除野生型菌株中的酶B基因,再将质粒①中的mKate2替换为酶B基因,将质粒②中的mKate2替换为酶A基因,将两个质粒导入敲除酶B基因的菌株中 解析 (1)利用PCR技术可检测目的基因导入是否成功,依据是否出现红色荧光、红色荧光强度可检测目的基因是否成功表达及其表达量。(2)定时取样检测培养液中细胞密度常用显微镜直接计数法。该实验需要检测菌体的荧光强度,因此需要在实验前检测液体培养基荧光强度,以便与之后检测菌体的荧光强度作对照。在W1快速生长期,PGeo驱动mKate2-SsrA基因转录,可合成C-末端带SsrA短肽的mKate2,使菌体发出红色荧光;进入生长稳定期后,PGeo停止驱动mKate2-SsrA基因的转录,荧光蛋白不能合成,且因mKate2的C-末端带有SsrA短肽,被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解,导致W1进入生长稳定期后荧光强度逐渐下降。(3)在W2快速生长期,PGeo启动子驱动X-SsrA基因转录,X-SsrA基因编码的C-末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X阻遏了PX开启转录,mKate2基因无法表达,故细胞快速生长期荧光强度低;进入生长稳定期后,PGeo启动子停止驱动X-SsrA基因转录,且C-末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解,逐渐解除对PX的抑制作用,PX开启mKate2基因的转录,可合成mKate2,培养基荧光强度逐渐增强。(4)先敲除野生型菌株中的酶B基因,再向野生型菌株中导入2个质粒,如图: 处于快速生长期时,质粒①合成C-末端带SsrA短肽的酶B,质粒②酶A基因的表达被抑制(避免合成过多酶A造成物质和能量浪费),质粒①合成的酶B和野生型菌株自身的酶A基因表达的酶A共同合成细胞生长必需物,满足菌株快速生长的需求;进入生长稳定期后,C-末端带SsrA短肽的酶B和阻遏蛋白X被降解,质粒②酶A基因表达,合成酶A,与菌株原有酶A基因表达的酶A,共同快速合成莽草酸,以改进酶A活性弱造成的莽草酸合成速率慢的问题。此外,生长稳定期酶B因不能合成且被降解而缺失,莽草酸难以转化为细胞生长必需物,可实现在生长稳定期的细胞内莽草酸的大量积累。 学科网(北京)股份有限公司 $