2027届高三人教版高中生物一轮复习讲义第45讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

第45讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 考点一　重组DNA技术的基本工具 知|识|巩|固 1．基因工程的概念 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：DNA分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) (2)DNA连接酶 (3)载体 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。(　　) (2)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　) (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(　　) (4)质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(　　) 答案：(1)×　(2)×　(3)×　(4)× 延|伸|探|究 1．限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 2．天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？ 提示：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需经过人工改造后才能用于基因工程操作。 剖析难点·考点突破 重|难|精|讲 1．基因工程的理论基础 2．图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 特别提醒：(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。 (3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端，而在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。 3．与DNA有关的几种酶的比较 作用对象 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA切成两个或多个片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 将两个或多个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA链上 解旋酶 DNA分子 碱基对中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA酶 DNA分子 磷酸二酯键 将DNA片段水解为脱氧核苷酸 精|准|命|题 考向　围绕基因工程的基本工具，考查科学思维 》例　限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　) A．6 B．250 C．4 000 D．24 000 答案：C 解析：据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoR Ⅰ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000，C符合题意。 〔变式训练〕　(2025·连云港高三调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A．质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 答案：C 解析：质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 必备知识·夯实基础 知|识|巩|固 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 易错提醒：变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。 教材隐含知识 1．(选择性必修3 P79旁栏思考)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。 易错提醒：在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 教材隐含知识 2．(选择性必修3 P80旁栏思考)为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 辨析 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 (3)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 4．目的基因的检测与鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)目的基因一定是编码蛋白质的基因。(　　) (2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。(　　) (3)基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。(　　) (4)Ti质粒上的T－DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　) (5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(　　) (6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。(　　) 答案：(1)×　(2)√　(3)×　(4)√　(5)×　(6)× 延|伸|探|究 1．利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 2．不能将目的基因插入载体的标记基因中，为什么？ 提示：标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。 3．在构建质粒载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？ 提示：不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。 剖析难点·考点突破 重|难|精|讲 1．PCR技术和DNA复制的比较 2．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2 3.如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。 (3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基 因上游 目的基 因下游 mRNA 首端 mRNA 尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 精|准|命|题 考向一　考查PCR技术的原理和操作过程 》例1　利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　) A．用PCR方法扩增目的基因时不需知道基因的全部序列 B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 答案：D 解析：用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物，A正确；设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，从而不能进行子链的延伸，B正确；复性的目的是引物与模板DNA结合，故复性温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链(含引物A或引物B)，(2n－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为14/16＝7/8，D错误。 〔变式训练〕　(2025·福建厦门模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　) A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 答案：D 解析：根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度使子链沿着引物的3′端延伸，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23＝8，则需消耗引物③的数目为(8×2－2)÷2＝7，C错误；物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物，D正确。 考向二　基因工程的基本操作程序 》例2　(2023·全国甲卷)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是____________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是________。 (3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取______________________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是________________________________________________________ ____________________________________________________________________。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 ____________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)疫苗中不含乙肝病毒DNA　(2)用于筛选含有重组表达载体的细胞　RNA聚合酶　(3)染色体DNA(基因组DNA)　与目的基因特异性互补且带有标记的DNA片段(带标记的含有目的基因的DNA片段)　(4)从酵母细胞中提取总蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带 解析：(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。 (2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于重组表达载体的筛选。RNA聚合酶识别目的基因启动子并驱动转录。 (3)检测的目的是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体DNA进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记，且顺序是已知的、与目的基因互补的DNA片段。 (4)检测目的蛋白在宿主细胞中是否表达。要从细胞表达的众多蛋白中检测目的蛋白，通常采用抗原—抗体杂交的实验方法。因此，要检测目的蛋白在酵母细胞中是否表达，首先需要提取酵母细胞的总蛋白，然后用特异性抗体进行杂交，若出现杂交带，则说明酵母细胞表达了目的蛋白。 考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 必备知识·夯实基础 知|识|巩|固 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 (2)实验步骤 提醒：①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 ②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定 思|维|辨|析 易错整合，判断正误。 (1)DNA与蛋白质都溶于酒精。(　　) (2)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。(　　) (3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。(　　) (4)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　　) (5)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。(　　) 答案：(1)×　(2)×　(3)×　(4)×　(5)× 延|伸|探|究 可通过PCR技术扩增Bt抗虫蛋白基因的数量，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，回答下列有关问题： (1)是否成功扩增出DNA片段，判断的依据是什么？ (2)进行电泳鉴定的结果如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 提示：(1)可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 (2)如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 剖析难点·考点突破 精|准|命|题 考向一　考查DNA粗提取与鉴定 》例1　(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案：D 解析：裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。故选D。 〔变式训练1〕　(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 答案：B 解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 考向二　结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究 》例2　(2025·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是(　　) A．该载体最可能为环形DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂 答案：D 解析：单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列(两种限制酶切割产生的DNA片段等长)，可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D错误。 〔变式训练2〕　某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三名同学分别以酵母菌为材料，进行PCR扩增，各取20 ul产物进行凝胶电泳，得到的结果如下图。下列叙述错误的是(　　) A．凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱 B．甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多 C．丙同学所用的引物可能与甲乙同学的不一样 D．丙同学扩增得到的片段比甲乙同学的要大 答案：D 解析：在a端有点样孔，DNA分子带负电荷，在电场的作用下会向正极移动，故凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱，A正确；甲同学的电泳条带比乙同学条带宽，说明甲同学扩增的DNA产物多于乙同学，故甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多，B正确；由图可知，丙同学扩增出来的产物与甲乙同学产物不同，其DNA不同，其碱基序列可能不同，故丙同学所用的引物可能与甲乙同学的不一样，C正确；丙同学扩增产物的电泳条带比甲乙条带位置距离点样孔更远，说明丙同学扩增的DNA分子小，迁移速率快，D错误。故选D。 素养提升·强化思维 构|建|网|络 真|题|再|现 1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案：B 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。故选B。 2．(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　) A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 答案：D 解析：不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；题意显示，用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸，该过程中L－谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coliA中没有L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L－谷氨酸，而E.coliB中含有该酶的基因，因而能高效生产γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了NcoⅠ和KpnⅠ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR产物也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。故选D。 3．(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案：D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。故选D。 4．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案：A 解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。故选A。 5．(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案：A 解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。故选A。 6．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案：D 解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。故选D。 7．(2023·山西卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案：C 解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。故选C。 8．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是____________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有____________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)　(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 (2)①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 9．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 答案：(1)低　256　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4 解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为256。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－GTTT－3′和5′－CAAT－3′。 (2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙所展示的电泳结果及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 (3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T－DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T－DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此其自交子代突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 10．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物______________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等　(2)F2与R1或F1与R2　a链 (3)J－V5融合蛋白　不是 解析：(1)基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 (2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′－5′，非模板链(也就是a链)是5′－3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′－3′，引物延伸的方向肯定是5′－3′，所以引物结合的单链其方向是3′－5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′－5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 11．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和__________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________。 (3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了______________________________ __________________________________________________________________________________________________________________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到__________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 答案：(1)野生型　(2)运载体　启动子和终止子 (3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100 解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。 (2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。 (3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。 ③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，如图： 提能训练　练案[45] A组 一、选择题 1．(2025·高中生物规范训练)下列关于基因工程的叙述错误的是(　　) A．基因的“剪刀”是限制酶 B．基因的“针线”是DNA聚合酶 C．常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒 D．基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建 答案：B 解析：限制酶能识别DNA分子中特定的碱基序列进而在该部位对DNA分子实现剪切，因而被称为基因的“剪刀”，A正确；DNA连接酶能够将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来，因而被称为基因的“针线”，B错误；目前常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒，C正确；基因工程的操作一般有四个步骤，目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，D正确。 2．(2024·北师大附中随堂检测)下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是(　　) A．用限制酶切割DNA分子获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个 B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 C．－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接 D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 答案：B 解析：用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，其识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；－CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为CATG和GATC，不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，也能形成重组质粒，D错误。 3．(2025·北师大附中模拟)在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体，下列关于质粒的说法正确的是(　　) A．质粒是独立于原核细胞拟核DNA之外的双链DNA分子 B．没有限制酶就无法使用质粒，其复制和表达不遵循中心法则 C．质粒只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达 D．真正被用作载体的质粒都是对天然质粒进行过人工改造的 答案：D 解析：质粒是存在于许多细菌拟核DNA之外以及酵母菌(真核细胞)细胞核外的、有自主复制能力的小型环状DNA分子，A错误；质粒的复制和表达都遵循中心法则，B错误；只需要将含有目的基因的质粒导入受体细胞，无需整合到受体细胞的DNA中也能表达，C错误；天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，D正确。 4．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　) 限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别 序列 A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割 D．T4 DNA连接酶即能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 答案：C 解析：BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；②④⑤对应的识别序列都存在GATC，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，②⑤是黏性末端，T4 DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。 5．(2025·东北育才学校适应性测试)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B．环化阶段，可选E.coli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶 C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对 D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 答案：A 解析：在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C错误；PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。 6．(2024·山东日照校际联合考试)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．可选用在液体培养基中培养的大肠杆菌作为实验材料 B．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质 C．将过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性 D．鉴定DNA时，将二苯胺试剂加入到含DNA的溶液中即可出现蓝色 答案：D 解析：大肠杆菌是细菌，含有拟核和质粒，DNA含量也较多，适合提取DNA，故可选用在液体培养基中培养的大肠杆菌作为实验材料，A正确；在2 mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度较高，搅拌过滤后，DNA存在于滤液中，有利于去除杂质，B正确；酶活性的发挥需要适宜的温度等条件，将过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性，避免DNA被水解，C正确；向DNA溶液中加入二苯胺试剂后还需要沸水浴加热才可出现蓝色，D错误。 7．用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是(　　) A．图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同 B．图1中X代表的碱基对数为4 500 C．推测图1中Y是限制酶B的酶切位点 D．推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 答案：C 解析：酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；从图2的A＋B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为500、1 500、3 500、4 500，而图1表示酶A和B切割时只会得到3个片段，长度应该是3 500、X、2 000，所以可推测Y是限制酶A或限制酶B的酶切位点，X代表的碱基对数为4 500，B正确，C错误；根据以上结论，图1中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个长度的片段：3 500、(4 500＋1 500)、500，正好与图2的①结果相符，故推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，D正确。 二、非选择题 8．(2024·辽宁高三联考三模)某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶：已知图中W基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图1中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序 列及切 割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT (1)限制酶主要是从____________中分离纯化出来的。应使用限制酶____________切割图1中质粒，使用限制酶____________切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (2)与质粒中启动子结合的酶是____________。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择________启动子(选填“植物”“真菌”或“放线菌”)。 (3)W基因转录的模板链是________(选填“甲链”或“乙链”)。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是________，子链的延伸方向是________。 (4)研究人员欲对W基因的mRNA进行RT－PCR，已知其mRNA的序列为5′－UGAACGCUA…(中间序列)…GUCGACUCG－3′。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为________。 A．5′－TGAACGCTA… B．5′－CCAGTCGAC… C．5′－GAATTCTGA… D．5′－AAGCTTCGA… 答案：(1)原核生物　MfeⅠ、HindⅢ　EcoRⅠ、HindⅢ　(2)RNA聚合酶　放线菌　(3)乙链　DNA半保留复制　5′→3′　(4)A 解析：(1)限制酶主要是从原核生物分离纯化出来的。根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRⅠ(切割出的黏性末端与MfeⅠ相同)、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒，因为限制酶MfeⅠ和限制酶EcoRⅠ切割露出相同的黏性末端。 (2)启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择放线菌启动子。 (3)W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5′→3′，与乙链从左向右3′→5′互补，故W基因转录的模板链是乙链。利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，子链延伸方向为5′→3′。 (4)引物与模板链的3′端结合，mRNA也与模板链结合，因此引物与mRNA序列相似，不同的是引物是一段DNA，因此将mRNA中的U替换成T即是引物序列，即5′－UGAAC－CCUA…(中间序列)…GUCCACUCG－3′⇒5′－TGAACCCTA…(中间序列)…GTCCACTCG－3′，与A相同。故选A。 B组 一、选择题 1．(2025·高中生物北师大版同步训练)如表为几种限制酶的切割位点，相关叙述不正确的是(　　) 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ 识别序列及 切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GATC CTAG↑ A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键 B．BamHⅠ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割 C．BclⅠ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割 D．以上信息说明限制酶没有特异性和专一性 答案：D 解析：限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端，A正确；Sau3AⅠ识别的序列为↓GATC，BamHⅠ识别的序列为G↓GATCC，后者识别序列中包含前者，因此BamHⅠ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割，B正确；BclⅠ识别序列包含Sau3AⅠ的识别序列，因此BclⅠ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割，C正确；限制酶需要识别特定的序列后进行切割，以上信息说明限制酶有特异性和专一性，D错误。 2．(2024·沈阳二中三模)将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法错误的是(　　) A．可使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因以便连接 B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面 C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高 D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况 答案：B 解析：使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因，可以形成相同的末端，以便连接，A正确；需要将荧光蛋白基因和目的基因连接在相同的启动子后面，B错误；荧光蛋白基因进入受体细胞后会表达出荧光蛋白，荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高，C正确；荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物具有荧光蛋白的特性，可以通过检测荧光强度来检测目的基因表达产物的转移和分布情况，D正确。 3．(2024·大连市高三二模)将棉花的酶D基因与拟南芥的转运肽基因相连，导入双子叶植物油菜的叶片细胞，可培育出高产转基因油菜品种。下图是需要用到的Ti质粒。下列叙述错误的是(　　) A．必须用相同的限制酶对目的基因和T－DNA进行切割 B．四环素抗性基因不可检测目的基因是否表达成功 C．将重组Ti质粒导入农杆菌后，再用其侵染油菜叶片细胞 D．两个基因的表达产物不能影响油菜叶片细胞的存活 答案：A 解析：对目的基因和T－DNA进行切割需要形成相同的黏性末端，除用相同的限制酶外，也可用同尾酶(不同的限制酶，却能形成相同的黏性末端)切割，A错误；四环素抗性基因属于标记基因，可用于重组质粒的初步筛选，但不能用于检测目的基因是否表达成功，B正确；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，将重组Ti质粒导入农杆菌后，再用其侵染油菜叶片细胞，C正确；目的基因不能影响植物正常的生长，故两个基因的表达产物不能影响油菜叶片细胞的存活，D正确。 4．(2024·沈阳市第二中学五模)下图为基因工程部分操作步骤，质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Ampr转录的模板链属于a链的片段。ALDH2基因编码区首端到末端(其中一条链)的序列为5′－ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG－3′。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。以下说法不正确的是(　　) 注：Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因 限制酶 BamHⅠ PstⅠ XhoⅠ XbaⅠ 识别序列和切 割位点(5′→3′) G↓GATCC C↓TGCAG C↓TCGAG T↓CTAGA A.质粒复制的模板链是“a和b”，基因Tetr转录的模板链是b链的片段 B．过程②是基因工程的核心步骤，过程④的培养基具有鉴定作用 C．为扩增目的基因，需选择的引物对为：5′－TCTAGACGCTACTCACTG－3′和5′－GGATCCATCCATGCGCTC－3′ D．根据选定的引物，经过5次循环，即可获得32个符合要求的目的基因 答案：D 解析：质粒的a和b两条链都作为模板进行复制，Tetr的转录方向与Ampr的转录方向相反，说明Tetr的转录模板和Ampr转录模板不在一条链上，Ampr转录的模板链属于a链的片段，则Tetr的转录模板链属于b链的片段，A正确；过程②表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，过程④表示目的基因的检测与鉴定，所以该培养基具有鉴定作用，B正确；扩增目的基因需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。根据ALDH2基因编码区首端到末端的序列为5′－ATCCATGCGGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG－3′，且引物5′端需要添加BamHⅠ、XbaⅠ的识别序列，可推测引物链为5′－TCTAGACGCTACTCACTG－3′，5′－GGATCCATCCATGCGCTC－3′，C正确；利用PCR技术可以扩增目的基因，根据DNA半保留复制的特点，根据PCR反应原理，前两次循环无法得到符合要求的目的基因，第3次循环可以得到等长双链，这样的双链DNA分子的两端两条链均有限制酶识别序列。3次循环可以得到2个，4次循环后有8个符合要求的目的基因，以此类推，可推知，经过6次循环，可获得32个符合要求的目的基因，D错误。 5．(2024·山东德州一中三模)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是(　　) A．该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点 B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系 C．用T4 DNA连接酶或E.coliDNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来 D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子 答案：D 解析：该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确；根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确；图中经酶切后形成的片段均是黏性末端，T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端，而E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，片段乙和片段丁黏性末端互补，C正确；根据图中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。 6．(2025·辽宁省朝阳市期末试题)花粉管通道法是我国科学家独创的介导植物基因转化的一种方法，其原理是在植物受粉的特定时期，将外源DNA溶液涂于柱头上，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步整合到受体细胞的基因组中，过程如图所示。下列相关说法错误的是(　　) A．外源DNA需要构建基因表达载体才能借助图示方法实现转化 B．构建的基因表达载体必须含有起始密码子，以作为转录的起始位点 C．外源DNA进入图中的受精卵后，可以整合到其染色体的DNA上 D．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法可省去植物组织培养这一操作 答案：B 解析：要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建基因表达载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体才能借助图示方法实现转化，A正确；起始密码子存在于mRNA上，不在基因表达载体(DNA)上，B错误；外源DNA进入图中的受精卵后，可以整合到染色体的DNA上，从而实现复制和表达，C正确；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，而花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，D正确。 7．(2024·东北师大附中模拟)“DNA粗提取与鉴定”的操作步骤为研磨→去杂→析出→鉴定。某研究组欲探究不同去杂方法对实验结果的影响(如下表)。下列叙述不正确的是(　　) 去杂质方式 沉淀质量(g) DNA浓度 (ng·μL－1) OD260/OD280 二苯胺鉴定 离心 0.0680 81.50 1.53 蓝色 4 ℃冰箱静置 0.1028 336.4 1.41 蓝色 注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度；纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。 A．猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料 B．对研磨液进行离心的目的是加速DNA的沉淀 C．离心法可以获得更高纯度的DNA D．析出时的离心转速明显高于去杂质时 答案：B 解析：DNA粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝、菜花、草莓均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；据表可知，离心时DNA浓度是81.5 ng·μL－1,4 ℃冰箱静置时是336.4 ng·μL－1，说明静置时蛋白质含量较多，沉淀质量离心时是0.068 g,4 ℃冰箱静置时是0.102 8 g，比较可知DNA的沉淀质量小，故析出时的离心转速明显高于去杂质时，D正确。 二、非选择题 8．(2025·湖南九校联盟)在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基因(长度1.5 kb)导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 (1)提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR扩增，PCR引物碱基数一般在20～30个之间，过短则导致________________________。 (2)如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1为获得的目的基因及末端(除黏性末端序列外，其他碱基序列省略)，图2为要使用的质粒，其中的Tetr、Ampr分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质粒进行切割时，选用的两种限制酶为____________。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是__________________________，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是__________________________________。 限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别位点及 切割位点 —G↓GATCC— —T↓GATCA— —CCC↓GGG— —↓GATC— (3)将转化后的大肠杆菌接种在含________的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中 (4)已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序：________________。(用箭头表示) ①重组DNA分子导入大肠杆菌 ②随机改变凝乳酶基因的序列 ③分析突变蛋白功能，设计结构 ④改变凝乳酶基因的特定序列 ⑤培养细胞后提纯突变蛋白 ⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组 答案：(1)特异性降低　(2)BclⅠ和SmaⅠ　有相同的黏性末端可发生碱基互补配对　遗传信息的传递都遵循中心法则或生物界共用一套遗传密码 (3)四环素　2　(4)③→④→⑥→①→⑤ 解析：(1)引物与模板之间遵循碱基互补配对原则，若引物太短则特异性降低。 (2)基因表达载体构建时，需要将目的基因和载体切出相同的黏性末端，图示BamHⅠ会破坏目的基因，故对质粒进行切割时，选用的两种酶为BclⅠ和SmaⅠ。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是有相同的黏性末端可发生碱基互补配对，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是遗传信息的传递都遵循中心法则或生物界共用一套遗传密码。 (3)图中构建目的基因表达载体时，氨苄青霉素抗性基因被限制酶破坏，故将转化后的大肠杆菌接种在四环素的培养基上进行培养及筛选；如果用BclⅠ和SmaⅠ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得分别含有质粒和目的基因的两条条带，2、3含有两条条带，2中其中一条条带为1.5 kb,3中其中一条条带为1 kb，由于牛凝乳酶的基因大小为1.5 kb，所以对应电泳图是菌落2很可能是含目的基因的重组质粒。 (4)蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)，其前提是基因工程，故运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝乳酶，具体过程为：③分析突变蛋白功能，设计结构→④改变凝乳酶基因的特定序列→⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组→①重组DNA分子导入大肠杆菌→⑤培养细胞后提纯突变蛋白。 C组 一、选择题 1．(2025·北师大附中模拟)限制性内切酶介导的整合技术(REMI)是一种研究基因的新方法。用限制酶切得到的线性质粒与该酶组成的转化混合物进入并转化细胞时，会切割受体细胞基因组，产生与线性质粒互补的黏性末端，线性质粒通过碱基配对插入基因组。如果插入发生在一个已知基因的内部，则该基因的功能可能改变或丧失，即发生了基因突变。下列相关叙述，不正确的是(　　) A．当外源质粒带有抗性基因时，可根据其在受体细胞内的表达情况筛选转化细胞 B．REMI技术使基因突变具有随机性，且限制酶识别序列越长，随机性越大 C．所有的限制酶都具有专一性 D．限制酶、DNA连接酶、载体是REMI技术的三种分子工具 答案：B 解析：抗性基因属于标记基因，标记基因可将含有目的基因的重组质粒筛选出来，故当外源质粒带有抗性基因时，可根据其在受体细胞内的表达情况筛选转化细胞，A正确；分析题意可知，REMI技术是一种切割基因的方法，其本质是基因工程，该技术可引发基因突变；由于限制酶能够识别特定序列，并在特定位点进行切割，故限制酶识别序列越长，随机性越小，B错误；限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，即所有的限制酶都具有专一性，C正确；结合题意可知，REMI技术需要用限制酶切割质粒，且需要进入受体细胞发挥作用，则其本质是基因工程技术，基因工程中需要用到限制酶、DNA连接酶、载体三种工具，D正确。 2．CRISPR－Cas9是近年来生物学科研的热门技术，该技术是细菌的一种防御机制。如图所示，当细菌感知到噬菌体侵入时，会通过gRNA识别噬菌体DNA，并通过Cas9蛋白切断目标DNA，从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述正确的是(　　) A．噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性 B．gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸 C．Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键 D．高倍光学显微镜可观察到该现象 答案：C 解析：噬菌体被细菌gRNA识别并被Cas9蛋白切割属于特定位点的切割，不是基因突变，不能体现基因突变的不定向性，A错误；gRNA为RNA，最多含有4种核糖核苷酸，DNA含有4种脱氧核苷酸，故gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸，B错误；Cas9蛋白可切断目标DNA，该过程破坏的是DNA分子的磷酸二酯键，C正确；该过程属于分子水平的改变，光学显微镜下无法观察到该现象，D错误。 3．(2025·山东潍坊安丘一中模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是(　　) A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后可用二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理 D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 答案：D 解析：由于蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，A正确；由于DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，B正确；DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。 4．(2024·沈阳第120中学第十次质量监测)菊花是两性花，LFY基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有过量表达的LFY基因的转基因菊花。重组Ti质粒的部分信息及实验流程如下图所示，其中启动子均为真核细胞启动子。下列叙述正确的是(　　) A．在含潮霉素的培养基上存活的农杆菌才可用于侵染菊花叶片 B．过程①②③所使用的培养基中植物激素的浓度和配比可以相同 C．I是一团具有一定组织结构松散的薄壁细胞团，具有较强的分裂和分化能力 D．诱导出芽和根的试管苗要先炼苗以适应外界的低湿强光环境才可进行移栽 答案：D 解析：重组质粒中含有潮霉素抗性基因，能表达出潮霉素抗性物质，在含潮霉素的培养基上存活的农杆菌不一定是导入LFY基因的农杆菌，还有可能是只导入质粒的农杆菌，因此只有在含潮霉素的培养基上存活并导入LFY基因的农杆菌才可用于侵染菊花叶片，A错误；植物组织培养的培养基中的生长素和细胞分裂素的含量和比例会影响愈伤组织的生长和分化，在脱分化形成愈伤组织的过程中要求生长素和细胞分裂素的比例相当，而在再分化过程中生长素和细胞分裂素比例高有利于根的分化，比例低有利于芽的分化，B错误；愈伤组织是一团排列疏松而无规则、高度液泡化的、呈无定形状态的、具有分生能力的薄壁细胞，不具有特定的结构和功能，C错误；诱导出芽和根的试管苗要先炼苗有助于试管苗逐渐适应室外环境，并减少在移栽后因气候和土壤变化而造成的伤害，适应外界的低湿强光环境才可进行移栽，D正确。 5．(2024·山东省实验中学二模)由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列，下列叙述正确的是(　　) A．构建重组载体P时，应选择EcoRⅤ进行酶切，再用T4 DNA连接酶连接 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为它不含起始密码子和终止密码子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 答案：A 解析：由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列，故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端只能用T4 DNA连接酶，A正确，B错误；由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。 6．(2024·东北三省三校第二次联考)荧光定量PCR是通过在PCR体系中添加荧光染料来记录PCR产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。CT值表示每个反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。通常情况下将已知浓度的DNA标准样品经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到一系列的CT值，以梯度稀释后的浓度对数值作为横坐标，浓度所对应的CT值为纵坐标绘制曲线，即可得到一个标准曲线，如下图所示，下列叙述错误的是(　　) A．荧光定量PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 B．荧光定量PCR可以用于检测样品中待测病毒核酸的浓度 C．若两组样品中待测病毒核酸的浓度差了10倍，则两组CT值的差异在3与4之间 D．若标准样品的DNA出现降解，则利用所得的标准曲线分析，待测样品所测CT值偏低 答案：D 解析：PCR的过程包括变性、退火和延伸。DNA的双链主要是靠氢键联系在一起，高温时，氢键很容易就被断开了，双链变成了单链，提供了PCR的模板。荧光定量PCR是反复多次进行PCR，所以需要添加耐高温的DNA聚合酶，A正确；根据题意和图示可知，荧光定量PCR的CT值与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，循环数越少，CT值越小，B正确；根据图中CT值与梯度稀释后的浓度对数值之间的关系可知，如果PCR产物的浓度增加10倍，其荧光强度也会增加10倍，但是CT值会减少大约3.3个单位(即1个对数单位)，C正确；据图所示，DNA标准样品的浓度越高，达到设定的荧光阈值时所经历的循环数越少，CT值越小，所以，若标准样品的DNA出现降解，DNA浓度下降，则标准曲线值偏高，待测样品所测CT值偏高，D错误。 7．(2024·福建三校联考)20世纪70年代，Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4个试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正确的是(　　) A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾 C．测得未知DNA的序列为5′－GATTCGAGCTGA－3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5′末端 答案：B 解析：这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶，A错误；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾，B正确；测得未知DNA的序列为5′－TCAGCTCGAATC－3′，C错误；ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D错误。 二、非选择题 8．(2025·山东师大附中适应性测试)P·pastoris(某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌)可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白(HBsAg)基因的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌(在缺失组氨酸的培养基中无法生存)中进行扩增，再经酶切后导入酵母菌，经同源重组整合到其染色体DNA上。请回答下列问题： (1)科研人员构建HBsAg基因表达载体时，应选用________酶对质粒进行酶切处理，并使用E.coliDNA连接酶将扩增后的HBsAg基因正确插入图1所示质粒。目的基因一般插入启动子的________(填“上游”或“下游”)，启动子的作用是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)已知HBsAg基因的a链的序列为5′－CGCTACTCATTGCTGCG……CGGATGAGCGCGTAGAT－3′。利用PCR技术获取HBsAg基因时，引物A结合的单链是________(填“a链”或“b链”)。某同学设计了如下的4种引物，其中可选用的引物组合是________。 A．5′－GGATCCATCTACGCGCTCATCCG－3′ B．5′－CCCGGGCGCTACTCATTGCTGCG－3′ C．5′－CGCAGCAATGAGTAGCGGGGCCC－3′ D．5′－CGGATGAGCGCGTAGATGGATCC－3′ (3)将重组载体导入大肠杆菌时，应在含有________、不含________的培养基上进行筛选。欲从大肠杆菌中提取DNA，需向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液后进行离心，取________(填“上清液”或“沉淀物”)即获得大肠杆菌的DNA。将重组质粒导入大肠杆菌的目的是__________________________。 (4)转化的酵母菌在培养基上培养时，需向其中加入甲醇，目的是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)XmaⅠ、BclⅠ　下游　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA　(2)b链　AB　(3)氨苄青霉素　组氨酸　沉淀物　大量扩增含目的基因的重组质粒　(4)诱导HBsAg基因表达，为酵母菌提供碳源 解析：(1)在构建重组DNA分子时，质粒用XmaⅠ酶切，与目的基因用XmaⅠ酶切获得的黏性末端一侧相连；质粒用BclⅠ酶切获得的黏性末端和目的基因用BamHⅠ酶切获得的黏性末端相连，以防止目的基因、载体自身环化或目的基因反向连接，因此科研人员利用限制酶XmaⅠ、BclⅠ和E.coliDNA连接酶将HBsAg基因正确插入图1所示质粒。目的基因一般插入启动子的下游，启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 (2)在PCR技术获取HBsAg基因时，引物是与模板链的3′端结合，因此，引物A结合的单链是b链。在PCR扩增过程中应在5′端添加相应的酶切位点。利用PCR扩增目的基因时，需要与模板的3′端(b链的左边)结合，并遵循碱基互补配对原则，同时在引物的5′端添加相应的限制酶酶切位点。采用PCR技术扩增HBsAg基因需要使用的引物序列为5′－GGATCCATCTACGCGCTCATCCG－3′和5′－CCCGGGCGC－TACTCATTGCTGCG－3′。 (3)将重组载体导入大肠杆菌时，应在含有氨苄青霉素、不含组氨酸的培养基上进行筛选。提取DNA时需向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液后进行离心，取沉淀物，获得大肠杆菌的DNA。将重组质粒导入大肠杆菌的目的是让重组质粒在大肠杆菌中大量扩增。 (4)将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入P·pastoris后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇。加入甲醇的作用有两点：一是提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢；二是启动甲醇代谢相关的基因表达，从而启动目的基因的表达。 学科网（北京）股份有限公司 $