2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和基本操作程序

该高中生物学高考复习学案系统梳理了基因工程核心考点，涵盖重组DNA技术的基本工具（限制酶、DNA连接酶、载体）和基本操作程序（目的基因获取、表达载体构建等），通过基础自测、考向分析、归纳总结等层次化设计，以问题导向引导学生自主构建知识网络，体现知识点的内在逻辑与系统性。 亮点在于自主诊断与科学思维培养，开篇设置5道教材边角判断题帮助学生定位薄弱点，能力进阶部分通过限制酶选择模型法、PCR原理真题演练等任务，培养学生分析推理能力。情境探究问题链和归纳总结表格支持个性化复习，教师可依据学情数据精准指导，助力学生提升自主复习效率。

2027届高考生物人教版一轮复习导学案：基因工程的基本工具和基本操作程序 课标要求：1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 考点一　重组DNA技术的基本工具 1．基因工程的概念 2．重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（也称“限制酶”） 教材边角 （选必3 P71“旁栏思考”）存在于原核生物中的限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全。 （2）DNA连接酶 （3）载体 基础自测 （1）（选必3 P70“图3-1”）重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。（×） （2）（选必3 P71“正文”）切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。（×） （3）（2024·贵州卷）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。（√） （4）（选必3 P72“正文”）DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。（×） （5）（选必3 P72“正文”）载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。（×） 能力进阶 考向1　工具酶的作用分析 1．Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如表所示。某线性DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（　　） 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC A.两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同 B．能被Sau3AⅠ识别的DNA位点均能被BamHⅠ识别 C．该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点 D．该DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6个片段 解析：C　BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A错误；分析表格可知，BamHⅠ的识别序列为GGATCC，Sau3AⅠ的识别序列为GATC，由此可知，能被Sau3AⅠ识别的序列中包含了被BamHⅠ识别的序列，所以能被BamHⅠ识别的序列也一定能被Sau3AⅠ识别，但能被Sau3AⅠ识别的序列不一定能被BamHⅠ识别，B错误；分析题意，某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段，由此可知，该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点，C正确；该DNA分子上有3个Sau3AⅠ的酶切位点，有1个BamHⅠ的酶切位点，但是Sau3AⅠ识别序列中包含BamHⅠ的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。 2．（2023·重庆卷）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（　　） A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 解析：B　根据扩增所得的DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体（质粒），质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。 归纳总结 与DNA有关的几种酶的比较 考向2　基因工程所需载体的作用及特点 3．（2026·广东广州模拟）下列有关基因工程中载体的说法，正确的是（　　） A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 解析：D　在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一个至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；细菌没有染色体，质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状双链DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。 4．（2026·湖北十堰模拟）质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入（插入点有a、b、c）后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是（　　） 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 解析：C　质粒的复制需要DNA聚合酶，复制原点上没有RNA聚合酶的结合位点，A错误；据表中信息分析可知，①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 归纳总结 载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示： 考点二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 （1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 （2）筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 （3）目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因 原理 DNA半保留复制 条件 DNA模板、两种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液 仪器 PCR扩增仪 过程 变 性 当温度超过90_℃时，碱基对之间的氢键断开，双链DNA解聚为单链 复 性 当温度下降到50 ℃左右时，两种引物与母链的3′端通过碱基互补配对结合 延 伸 当温度上升到72 ℃左右，脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成DNA子链 结果 DNA分子以指数形式扩增，约为2n，n为扩增循环次数 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 教材边角 （选必3 P79“旁栏思考”）PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。 提醒　明辨PCR技术的3个易错点 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 （1）构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成及作用 提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA上 mRNA上 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（正常情况下，不编码氨基酸） 3.将目的基因导入受体细胞 4．目的基因的检测与鉴定 类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子 水平 检测 导入 检测 目的基因是否插入受体细胞的DNA上 PCR技术 电泳结果对比 表达 检测 目的基因是否转录出mRNA PCR技术 电泳结果对比 目的基因是否翻译出相应蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带 个体生物学水平的鉴定 确定是否具有抗性及抗性程度 抗虫、抗病、抗低温等实验 是否赋予了预期抗性 教材边角 （选必3 P83“到社会中去”）转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？ 抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 基础自测 （1）（选必3 P77“相关信息”）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（√） （2）（选必3 P80“正文”）基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。（×） （3）（选必3 P80“正文和图3-6”）基因表达载体中含有启动子和密码子。（×） （4）（选必3 P82“正文”）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。（√） （5）（选必3 P82“正文”）从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。（×） 情境探究 BamHⅠ、Hind Ⅲ、SmaⅠ三种限制酶识别序列和切割位点分别为G↓GATCC、A↓AGCTT、CCC↓GGG，图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo 表示新霉素抗性基因。 （1）质粒和获取目的基因若都用SmaⅠ切割，在构建重组表达载体时，往往使用T4 DNA连接酶，而不用E.coli DNA连接酶。为什么？ 提示：T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于E.coli DNA连接酶。 （2）在构建重组质粒时，若只用SmaⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，会导致什么结果？ 提示：除形成重组质粒外，还会导致目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接。 （3）在构建重组质粒时，限制酶应该选SmaⅠ和Hind Ⅲ，原因是什么？ 提示：能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。 　“模型法”解读限制酶选择的四个要求 （1）位置要求：限制酶的切割位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选切割位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的切割位点，不能选择。 （2）酶切要求 ①单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割（如图，选用XhoⅠ），但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和反向连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。 ②双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。 （3）数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行切割，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个切割位点。 （4）特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。 能力进阶 考向1　PCR技术的原理 1．（2026·黑龙江大庆模拟）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（　　） A．引物A、B的碱基不能进行互补配对 B．复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C．延伸时，DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸 D．第二轮循环后，同时含有引物A、B的DNA占100% 解析：D　如果引物A和引物B发生碱基互补配对则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C正确；DNA复制方式为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成22＝4（个）DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段占50%，D错误。 2．融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。下列说法正确的是（　　） A．对基因B进行PCR需至少进行3次循环，才能获得含引物3且双链等长的DNA B．若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接成类似上图所示的融合基因，需要设计6种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有3种 C．将第一阶段的产物（图中ab和cd）混合，先变性再复性，使能够互补配对的DNA单链相互结合，理论上有4种结合的可能，其中在PCR体系中能进一步延伸的有2种 D．引物2和引物3部分核苷酸序列碱基互补配对，因此二者不能共存于同一PCR体系中 解析：D　对基因B进行PCR的过程中，由于引物4位于基因的一端，因此需至少2次循环才能获得含引物3且双链等长的DNA，A错误；结合图示可以看出，通过融合PCR技术，每一次将两个DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用，依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，需要设计6种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有4种，B错误；将第一阶段的产物（图中ab和cd）混合，先变性再复性，使能够互补配对的DNA单链相互结合，理论上有2种结合的可能，其中在PCR体系中能进一步延伸的有1种，C错误；引物2和引物3部分核苷酸序列碱基互补配对，因此二者不能共存于同一PCR体系中，否则可能会因为引物之间发生碱基互补配对导致没有产物出现，D正确。 归纳总结 PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个目的基因在PCR中经过n轮循环，得到2n个DNA分子。 （1）PCR中的数量关系 含引物的DNA分子数 含其中一种引物的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子 2n 2n－1 2n－2 消耗引物数量 含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 2n+1－2 2n 2n－2n （2）要得到等长的双链DNA分子，至少需要经过3次循环。 考向2　基因工程的基本操作程序 3．（2025·武汉一中模拟）中国农业科学院棉花研究所棉花分子遗传改良创新团队成功将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，如图是利用基因工程培育粉红色棉花的示意图，下列有关该研究的说法错误的是（　　） A．通过基因工程创制出彩色纤维棉可有效减少化学染料使用量 B．过程①～②完成需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与 C．在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，就代表粉红色棉花培育成功 D．过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理 解析：C　通过基因工程将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，可有效减少化学染料使用量，A正确；过程①→②为基因表达载体的构建，完成该过程需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B正确；在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，但该基因不一定能进行转录和翻译，故检测到甜菜红素合成相关的基因，不代表该粉红色棉花一定能培育成功，C错误；过程④→⑤为植物组织培养，植物组织培养的原理是植物体细胞具有全能性，D正确。 4．（2023·湖北卷）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 解析：D　若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有TetR，因此在Tet培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 归纳总结 双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落 （1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 （2）被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 （3）筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 课堂训练 1．（2025·江苏卷，改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型相同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 解析：D　对比A基因和a基因的碱基序列，A基因中“AAGCTT”变为a基因中“AAGCTG”，是碱基替换（T→G），A错误；HindⅢ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B错误；观察图中a基因，HindⅢ有2个切割位点，切割后会产生1个片段，AluⅠ有3个切割位点，切割后会产生2个片段，一个片段长度是200 bp左右，另一个是400 bp左右，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 2．（2025·广东卷）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（　　） A．1′－碱基　　　　　　 B．2′－氢 C．3′－羟基 D．5′－磷酸基团 解析：C　已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′端→3′端，原因是脱氧核苷酸的3′碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3′－羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C符合题意。 3．（2025·安徽卷）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 解析：C　使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可能是导入了重组质粒（含目的基因），也可能是导入了质粒K（无目的基因）而呈现白色，所以不可判定为含目的基因的菌株，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），也可能是导入了重组质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。 创新情境 同源重组技术的应用 木糖醇是一种重要的甜味剂，在食品工业中应用广泛，尤其是糖尿病患者等特殊人群理想的替代糖源。然而，木糖醇在自然界植物中的含量极低，提取成本高昂，难以满足市场的巨大需求。为了解决这一问题，科研人员尝试利用基因工程技术，将毕赤酵母中负责合成木糖醇脱氢酶（XDH）的基因导入大肠杆菌中，实现木糖醇脱氢酶的高效表达，从而为工业化生产木糖醇提供新的途径。同源重组技术在此过程中发挥了关键作用，它能够让目的基因（XDH基因）与载体DNA在同源序列的引导下准确重组，提高基因表达的成功率，其过程如图所示。回答下列问题： 注：XDH：木糖醇脱氢酶基因；GFP：绿色荧光蛋白基因；Kanr：卡那霉素抗性基因；→表示PCR引物；相同背景方框表示同源序列；环状质粒经处理后可获得线性化载体 角度1　考查PCR 技术的应用 （1）PCR扩增目的基因时，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是______________________________________________________________________。 PCR过程中需要控制温度条件，其中温度最低的阶段为________。在PCR扩增过程中，应选择在引物________的5′端添加线性化载体的同源序列，以获得目的产物。若扩增获得了较多的非目的片段，其可能的原因有______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________（答出1点即可）。 角度2　考查重组酶的作用 （2）根据图示过程分析，PCR产物和线性化载体混合后加入重组酶的作用是______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________。 将重组质粒转入大肠杆菌后需在培养基上添加________以便对重组质粒进行筛选，重组质粒转入大肠杆菌后，若____________，说明融合基因已转入大肠杆菌并成功表达。 角度3　考查同源重组技术敲除目的基因的思路 （3）除导入目的基因外，同源重组技术还可以用于在生物体基因组中进行精确的基因敲除，试阐述同源重组技术敲除目的基因的思路：______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________。 答案：（1）激活耐高温的DNA聚合酶　复性　F1－F和F2－R　模板DNA被污染（或复性温度过低或引物设计不合理等）　（2）催化目的基因片段和线性质粒片段之间发生同源重组　卡那霉素　大肠杆菌发出绿色荧光 （3）首先构建打靶载体，即该载体含有与目的基因（要敲除的基因）两侧基因组序列同源的序列，且该同源序列中包含标记基因；而后将该载体导入目标细胞（含有目的基因的细胞），在该细胞内，打靶载体的同源序列与基因组中目的基因发生同源重组，导致目的基因进入到打靶载体中，被标记基因取代，实现基因敲除 解析：（1）PCR扩增目的基因时，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是激活耐高温的DNA聚合酶。PCR过程中需要控制温度条件，即高温变性、低温复性、中温延伸，可见温度最低的阶段为复性。在PCR扩增过程中，应选择在引物F1－F和F2－R的5′端添加线性化载体的同源序列，以获得带有同源序列的目的产物。若扩增获得了较多的非目的片段，其可能的原因有模板DNA被污染、复性温度过低或引物设计不合理等。（2）根据图示过程分析，PCR产物和线性化载体混合后加入重组酶的作用是催化目的基因片段和线性质粒片段之间发生同源重组，进而获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌后需在培养基上添加卡那霉素，以便对重组质粒进行筛选，因为重组质粒上带有卡那霉素抗性基因；利用同源重组法构建木糖醇脱氢酶（XDH）与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因表达载体转入大肠杆菌，绿色荧光蛋白（GFP）基因表达成功会发出绿色荧光，即大肠杆菌发出绿色荧光意味着绿色荧光蛋白GFP基因成功表达，说明融合基因已转入大肠杆菌并成功表达。（3）除导入目的基因外，同源重组技术还可以用于在生物体基因组中进行精确的基因敲除，若要实现同源重组技术敲除目的基因，则需要进行反向的思维过程，即首先构建打靶载体，即该载体含有与目的基因（要敲除的基因）两侧基因组序列同源的序列，且该同源序列中包含标记基因；而后将该载体导入目标细胞（含有目的基因的细胞），在该细胞内，打靶载体的同源序列与基因组中目的基因发生同源重组，导致目的基因进入到打靶载体中，被标记基因取代，实现基因敲除。 2027届高考生物人教版一轮复习导学案 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