2027届高考生物人教版一轮复习导学案：PCR技术和基因编辑技术

该高中生物学高考复习导学案系统梳理PCR技术和基因编辑技术核心考点，PCR技术涵盖引物设计原则及RT-PCR、重叠延伸PCR等应用类型，基因编辑聚焦CRISPR/Cas9原理，通过问题链引导学生自主构建技术原理与应用的知识网络，体现考点梳理的系统性和层次性。 亮点在于诊断性提升演练和案例式探究设计，如“提升演练”8道模拟题覆盖技术应用场景，结合水蛭素基因定点突变等案例培养科学思维与探究实践素养。学生可通过真题演练自主诊断薄弱点，教师依据学情精准指导，助力个性化复习与能力提升。

2027届高考生物人教版一轮复习导学案：PCR技术和基因编辑技术 素养必备 一、PCR技术的应用 1．PCR引物碱基序列的设计与选择 （1）引物设计的原则 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣对PCR反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括： ①引物长度通常为20～30个核苷酸，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。 ②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 ③引物5′端碱基可添加与模板无关的序列（如限制酶的识别序列、启动子序列等），便于克隆和表达。 ④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。 （2）PCR引物的设计 ①根据目的基因的特定序列设计PCR引物 ②根据PCR扩增方向选择引物 2．PCR技术的应用 （1）RT-PCR技术与病毒检测 RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示： （2）重叠延伸PCR技术与基因定点突变 重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 （3）反向PCR技术 反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物，扩增已知序列两侧的未知序列扩增思路是：先从未知序列的两侧把DNA切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已知序列是反向配置的，所以子链反向延伸（如图）。PCR反向扩增后，经测序可以确定未知序列。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。 （4）巢式PCR技术 巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。 （5）融合PCR技术与融合蛋白 融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。 （6）利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接 鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置。理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙，如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都相等；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，如图所示。 提升演练 1．（2025·河北石家庄模拟）土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为（　　） A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′ B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′ C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′ D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′ 解析：A　图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′（上面链的引物）和5′－TCTGTTGAAT－3′（下面链的引物）作为引物对，A符合题意。 2．（2025·安徽芜湖期末）通过咽拭子取样进行RT-PCR检测是目前临床上诊断某RNA 病毒感染疑似患者的常用方法，用于检测的RT-PCR试剂盒的部分工作原理如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的双链核酸 B．若用RT-PCR 技术扩增胰岛素基因，应选择胰岛B细胞进行mRNA的提取 C．用RT-PCR 技术扩增目的基因时需要逆转录酶和DNA 聚合酶 D．若用PCR 技术扩增1个DNA分子10次，则需要在缓冲液中至少加入（211－2）个引物 解析：A　引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，A错误；胰岛B细胞分泌胰岛素，若用RT-PCR技术扩增胰岛素基因，应选择胰岛B细胞进行mRNA的提取，B正确；RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，故用RT-PCR技术扩增目的基因时需要逆转录酶和DNA聚合酶，C正确；若用PCR技术扩增DNA分子10次，则一共得到210个DNA分子，共有211 条脱氧核苷酸链，除了亲代DNA的2条链没有结合引物外，其余每条链各结合了1个引物，因此总共需要在缓冲液中至少加入（211－2）个引物，D正确。 3．（2025·山西太原模拟）反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点，部分过程如图所示，下列相关叙述正确的是（　　） A．过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3 B．过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合 C．过程③所用的酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 D．PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列 解析：C　反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，过程②设计引物时，应根据已知序列（目的基因两侧的部分核苷酸序列）来设计引物1和4，A错误；PCR过程中，复性的温度一般在50 ℃左右，而72 ℃左右是延伸的温度，所以过程③中复性不是在72 ℃左右，B错误；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，过程③PCR所用的酶也是从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，C正确；PCR第一轮循环得到的两条DNA链长度不同，第二轮循环得到的DNA片段也都不等长，至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的DNA片段，所以PCR第二轮循环不能获得两条链等长的未知序列，D错误。 4．（2026·山东烟台模拟）巢式PCR是一种使用两对引物扩增完整的片段的PCR。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对为内部引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增，其过程如图所示。下列说法错误的是（　　） A．两轮扩增所需引物不同，原料和酶相同 B．DNA的合成总是从子链的5′端向3′端延伸与耐高温的DNA聚合酶的作用有关 C．用内引物进行PCR时，扩增n次后理论上需要2n个引物 D．巢式PCR可增强扩增的特异性 解析：C　第一轮所用引物为外引物，第二轮所用引物为内引物，两次所用原料均为dNTP（四种游离的脱氧核苷酸），酶均为耐高温的DNA聚合酶，A正确；耐高温的DNA聚合酶只能识别引物的3′端，因此DNA的合成总是从子链的5′端向3′端延伸，B正确；PCR为体外DNA复制，每合成一条子链即需要一个引物，扩增n次后一共有2n个DNA，新合成了（2n－1）个DNA，合成了（2n－1）×2＝2n+1－2条新链，需要2n+1－2个引物，C错误；巢式PCR可增强扩增的特异性，因为如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低，D正确。 5．（2025·江西景德镇期末）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基因（Aro基因，存在EcoRⅠ酶切位点）和抗冻基因（Cor基因，存在BclⅠ酶切位点）采用融合PCR技术（原理如图所示）连接起来构建为Aro-Cor融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。下列相关叙述错误的是（　　） A．图中引物2和引物3部分碱基可互补配对 B．若要对Aro-Cor融合基因进行扩增，可选择引物1和引物4 C．按如图所示对融合基因和质粒1双酶切，并将融合基因和质粒1重组构成重组质粒，即可获得正确的融合蛋白 D．图中步骤④，培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素的比例会影响植物细胞的发育方向 解析：C　融合PCR中，引物2和引物3部分碱基互补，才能让Aro基因和Cor基因连接，A正确；扩增Aro-Cor融合基因，用引物1（扩增Aro基因前端）和引物4（扩增Cor基因后端），B正确；融合基因和质粒1双酶切后重组，还需检测，且要保证启动子、终止子等元件正确，融合基因和质粒正向连接，还要将重组质粒导入受体细胞，才可能表达正确的融合蛋白，C错误；步骤④是植物组织培养，生长素和细胞分裂素的比例影响细胞发育方向（如生根、生芽），D正确。 素养必备 二、基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。 CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定的碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 提升演练 6．（2026·福建厦门模拟）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（sgRNA）引导下，Cas 9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因，其工作原理如图所示。下列分析错误的是（　　） A．sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后，其功能类似于限制酶 B．若设计的sgRNA基因越短，则该基因编辑技术的精准度越高 C．sgRNA与目标DNA之间的特异性结合遵循碱基互补配对原则 D．根据目标DNA特定位点设计相应的sgRNA，可实现对目标的定点切割 解析：B　据题图分析可知，sgRNA和Cas9蛋白形成复合体的功能类似于限制酶，能精准定位到所需切割的基因上，A正确；sgRNA基因越短，其特异性越差，与目标DNA结合的精准度就越低，B错误；sgRNA与目标DNA之间的特异性结合遵循碱基互补配对原则，C正确；根据目标DNA特定位点设计相应的sgRNA，sgRNA和Cas9蛋白形成复合体的功能类似于限制酶，可实现对目标的定点切割，D正确。 7．（2025·湖南长沙模拟）基因编辑技术中CRISPR/Cas9系统的问世源于对细菌免疫机制（如图）的研究。细菌CRISPR序列的间隔区储存入侵过细菌的外源DNA信息，sgRNA（向导RNA）能识别外源DNA的靶序列，Cas9基因表达的核酸内切酶Cas9能对外源DNA的靶序列进行切割。下列说法错误的是（　　） A．细菌CRISPR序列间隔区储存外源DNA信息，为sgRNA合成提供模板 B．Cas9/sgRNA复合物与基因工程的限制性内切核酸酶类似，切割具有序列特异性 C．外源DNA入侵后，Cas 9基因表达产物随即切割外源DNA D．sgRNA识别外源DNA靶序列时，有可能会发生错配 解析：C　细菌CRISPR序列间隔区储存的外源DNA信息是转录生成sgRNA的模板，A正确；由于sgRNA能识别外源DNA的靶序列，Cas9/sgRNA复合物与限制性内切核酸酶类似，具有序列特异性，B正确；外源DNA入侵后，并非Cas 9基因表达产物随即切割外源DNA，而是要与sgRNA进行一系列组装过程，形成有靶向切割能力的复合体，C错误；sgRNA识别外源DNA靶序列遵循碱基互补配对原则，但在实际过程中可能会受到多种因素影响而出现错配的情况，D正确。 8．（2025·广东清远期末）CRISPR/Cas9系统可表达sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA引导Cas9蛋白靶向结合到特定基因上并对基因进行切割，可应用于基因的敲除。单纯性少毛症的发生与角蛋白基因（Krt71）的突变有关。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对小鼠的Krt71基因进行编辑。Krt71基因的部分序列和基因编辑技术流程见图。回答下列问题： （1）Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因。Cas9蛋白的功能与基因工程常用的______酶功能类似。对Krt71基因进行编辑时，质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因________（填“序列1”“序列2”或“序列3”）的部分碱基序列相同。 （2）质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为__________。过程③通常将受精卵培养至________阶段。 （3）与直接导入质粒pUC57相比，将Krt71-sgRNA和Cas9-mRNA直接注入小鼠受精卵，可减少转录的时间从而快速启动基因编辑过程；同时可降低外源基因整合到______的风险。 （4）敲除Krt71基因后对小鼠的毛发生长情况和毛发量等方面进行表型分析。该实验构建了单纯性少毛症小鼠模型，其研究价值是__________________（答出一点即可）。 答案：（1）限制（限制性内切核酸）　序列3 （2）启动子　桑葚胚（或囊胚）　（3）DNA/染色体　（4）用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗 解析：（1）Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因，故Cas9蛋白的功能与基因工程常用的限制酶功能类似。由于Cas9蛋白通过识别NGG（N代表任意碱基、G代表鸟嘌呤）的序列并切割靶基因，而Krt71基因在序列3中含有TGG序列（序列1和2不含NGG），因此需要sgRNA能识别序列3的部分碱基序列，进而通过Cas9蛋白切割序列3的相应位点，故质粒pUC57中序列4的部分碱基序列应当与Krt71基因序列3的部分碱基序列相同，保证转录形成的Krt71-sgRNA能通过碱基互补配对识别序列3。（2）过程①为转录，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录形成RNA，即质粒pUC57中驱动过程①进行的DNA序列称为启动子；胚胎移植时应选发育良好的桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行移植。（3）由于质粒上的T－DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上，因此将目的基因与质粒构建形成表达载体后，可能会将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，而将Krt71-sgRNA和Cas9-mRNA直接注入小鼠受精卵，则可降低外源基因整合到受体细胞的染色体DNA上的风险。（4）敲除Krt71基因的生物体不在有Krt71基因的表达产物，会表现出相应的性状，相当于利用减法原理去除相应基因来观察该基因的功能，因此该实验构建的单纯性少毛症小鼠模型，可用于了解Krt71基因对毛发生长发育的影响、用于疾病的治疗。 2027届高考生物人教版一轮复习导学案 第1页（共1页） 学科网（北京）股份有限公司 $