2027届高考生物人教版一轮复习导学案：DNA片段的扩增（PCR技术）

该高中生物学高考复习学案系统梳理了PCR技术专题，围绕原理（DNA半保留复制、解链机制、引物作用等）、过程（变性-复性-延伸）及计算（引物数量、循环产物分析）构建考点网络，通过问题链驱动学生自主梳理知识内在联系，形成完整认知框架。 亮点在于“亮考帮”反思设计与真题导向训练，如“亮考帮”引导学生自我诊断疑惑，课堂训练整合2024-2026年模拟题，培养科学思维与探究实践素养。任务驱动式活动（如引物设计分析）助力学生自主提升，教师可依学情精准指导，实现因材施教。

2027届高考生物人教版一轮复习导学案：DNA片段的扩增（PCR技术） 学习目标 1.概述DNA片段扩增（PCR）技术的原理及其过程。2.熟悉PCR技术的相关计算。 核心体系 活动方案 活动一 概述PCR技术的原理及其过程 PCR技术（聚合酶链式反应）成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如下图所示），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。请回答下列问题。 （1）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。这两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的__________。 （2）当温度降低时，引物与模板________端结合，在______________的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是______________，遵循的原则是________________。 （3）PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：含________（离子，作用为____________）的液体环境、适宜的________和________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠________来维持。 （4）为什么PCR过程需要添加引物？PCR引物的化学本质是什么？其与细胞内DNA复制所需引物有何区别？ （5）PCR的首要任务就是引物设计，引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物设计的依据是什么？设计引物时应注意哪些方面？ （6）PCR技术中两条子链都是连续合成的，体内DNA是半不连续复制的，其原因是什么？不同的PCR体系，设置温度的主要区别是退火步骤，该步骤温度主要取决于什么？ （7）PCR技术需要的条件适宜，但又不同于细胞内DNA复制的条件，请从酶、原料、ATP等角度比较两者的区别。 （8）目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？ （9）哪些原因可能导致PCR非特异性扩增，请尝试写出几个常见的原因？ 活动二 概述PCR的实验操作方法 在实验室中进行PCR的实验操作步骤主要包括准备、移液、混合、离心、反应五个步骤。PCR实验操作中，通常要用到微量离心管，具体操作时用微量移液器按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可，一次PCR一般要经历30多次循环。请回答下列问题。 项目 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min — — 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行怎样的处理？ （2）PCR实验操作时首先应进行预变性处理，其目的是什么？ （3）从上表可以看出PCR扩增过程中温度是关键因素，退火温度既不能过高又不能过低的原因什么？ （4）一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物？扩增第n次时，需要多少个引物？第几次循环后，最可能出现两端等长的目的基因片段？从理论上推测第四轮循环产物中，含有某种引物（如引物Ⅰ）的DNA片段占比多少？ （5）如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA? 课堂训练 1. [2026南通如皋质量检测]下列关于PCR技术的叙述，错误的是（　　） A.引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差 B.不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异 C.利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量 D.含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个 2. PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是（　　） A.dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作为DNA合成的原料 B.dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖 C.DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋 D.CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一 3. [2024南通如皋适应性考试]在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列说法正确的是（　　） A.细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+ B.PCR技术中的DNA聚合酶在90 ℃条件下不会失活 C.DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3′端延伸子链 D.真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白 4. [2026江苏百校联考]关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述错误的是（　　） A.实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前可进行高压灭菌处理 B.PCR复性温度过低可能导致引物与模板非目标序列结合，电泳出现非目标条带 C.扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散 D.待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶 5. [2025江苏十一校联考]PCR仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3个步骤间进行温度切换，主要过程如下图所示，图中a、b、c表示过程。下列叙述错误的是（　　） A.PCR循环过程控制的温度高低关系为a>c>b B.延伸的温度和时间与引物和待扩增片段的长度均有关 C.每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同 D.若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度 6. [2026扬州期中]下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。下列有关说法正确的是（　　） A.农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 B.图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 C.应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 D.将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 7. （多选）[2026南通月考]已知T DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的有（　　） 图1 图2 A.以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2 B.仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉 C.根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3 D.子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株 8. RT-PCR是将RNA逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。请回答下列问题。 （1）过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、_______、_______和引物A等。 （2）过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是______________、__________________。 （3）过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。 （4）利用RT-PCR技术获取的目的基因__________（填“能”或“不能”）在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是___________________________________________________________。 （5）RT-PCR过程中主要借助对________的控制来影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。 9. [2026南京七校联考]2，3-丁二醇是一种在诸多领域具有广泛应用价值的化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2，3-丁二醇的同时，也会生成乳酸等多种副产物，影响产量。已知P基因（位于拟核DNA分子中）与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关，研究人员欲利用生物技术敲除P基因以获得高产2，3-丁二醇的产气肠杆菌。请回答下列问题。 图1　融合片段N及质粒A限制酶酶切位点 （1）利用PCR扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时，模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为____________________。 （2）融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应先选择图1中的限制酶________和________对质粒A进行完全酶切，利用________酶将质粒特定的黏性末端补平后，再在________酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。 （3）用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到________个条带，原因是_________________________________________________ ______________________________________________________________________。 图2 图3 （4）将重组质粒B（长度为4 000 bp）导入到用_______处理的产气肠杆菌细胞中，利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除（如图2），敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后用图2中的引物________进行PCR扩增，检测结果如图3所示，其中菌落________（填序号）为P基因敲除株。 亮考帮 一、亮闪闪 本节课我掌握了 核心知识点，理清了 的解题逻辑；通过课堂小组讨论，学会了用 思路分析题型，纠正了之前混淆的概念，整体搭建起本节知识框架，这是我本节课最大的收获。 二、考考你 我出一道思考题： 解答： 出题后自测发现，这类题型的 步骤容易粗心出错，后续做题要重点留意。 三、帮帮我 我存在的疑惑： 1. 知识点的原理没有完全理解； 2.遇到 类题目不知道怎么切入解题； 3. 概念容易和之前学的内容弄混，希望课堂互助环节可以和同学探讨。 参考答案 活动方案 活动一 （1） 解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键 （2） 3′　耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）　dNTP（脱氧核苷三磷酸）　碱基互补配对 （3） Mg2+　激活DNA聚合酶　温度　酸碱度　缓冲液 （4） DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。PCR所需引物的化学本质是一段长度为20～30个核苷酸组成的DNA片段。细胞内复制所用引物是RNA短链，在体外扩增（PCR）需要的引物是DNA单链片段。 （5） PCR设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列。PCR扩增DNA片段进行引物设计时，需要设计两种分别与两条模板链碱基互补的引物，两引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对，引物的长度既不能过长也不能过短。 （6） 在细胞内DNA复制时，双链只有部分打开，其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的。引物序列的长度和碱基比例。 （7）细胞内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，原料为4种游离的脱氧核苷酸，需添加ATP；PCR技术不需要添加ATP，4种dNTP既可作为原料又可提供能量，不需解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。 （8）PCR反应体系需要在较高温度条件下进行，因此PCR反应中需使用热稳定性高的Taq酶，而大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会失活。 （9）退火（复性）温度过低、引物过短、循环轮次过多、模板和引物浓度过高、引物内和引物间形成二级结构等。 活动二 （1） 高压蒸汽灭菌。 （2） 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合。 （3） 复性（退火）阶段温度过高，引物与模板不易结合；温度过低，引物与模板结合时特异性差。 （4） 2n+1－2。2n。3。15/16。 （5） ①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测。②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。 归纳： 引物的归类分析 1 DNA的复制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′－OH上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合。 （1） 引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段已知碱基互补配对。 （2） 细胞内DNA复制以RNA作引物，PCR反应一般以DNA作引物（因为RNA易降解）。 2 设计引物的主要原则 （1） 引物长度应大于16个核苷酸（通常为20～30个核苷酸），可防止随机结合。 （2） 引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列。 （3） 2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。 （4） 引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。 3 引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。 4 PCR技术中的数量关系 复制次数/次 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A（或B）的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物（A和B）数量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n+1－2 两条单链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n DNA分子种类 2 4 5 5 课堂训练 1 C　引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确；不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确；PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误；DNA为半保留复制，第n次循环是以a×2n-1个DNA分子为模板合成a×2n个DNA分子，故需a·2n个引物，D正确。 2 B 3 B　细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2+，A错误；DNA聚合酶不需与启动子结合，C错误；真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。 4 D　PCR实验使用到的器具和试剂如微量离心管、枪头和蒸馏水等，在使用前必须进行高压灭菌处理，避免对实验结果产生影响，A正确；PCR复性温度过低时，引物可能与模板DNA的非特异性位点结合，导致非目标条带扩增，电泳时出现杂带，B正确；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，以防样品飘散，C正确；待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，D错误。 5 B　PCR循环过程包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性温度（a）最高，超过90 ℃，目的是使DNA双链解开；复性温度（b）较低，一般为50 ℃左右，使引物与模板链结合；延伸温度（c）一般为72 ℃左右，是DNA聚合酶催化DNA合成的温度，温度高低关系为a＞c＞b，A正确。延伸过程是在DNA聚合酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成DNA的过程。延伸的时间与待扩增片段的长度有关，片段越长，所需的延伸时间越长，但延伸温度主要由DNA聚合酶的最适温度决定，B错误。PCR每次循环中，引物Ⅰ和引物Ⅱ都分别与模板链的两端进行结合，参与DNA的合成，所以每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量是相同的，C正确。PCR技术中，复性过程是引物与模板链结合的过程，若设计的引物与模板不完全配对，适当降低PCR复性的温度，可使引物与模板更易结合，提高引物与模板的结合效率，D正确。 6 D　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误；图中T DNA两侧应该用相同限制酶切割，以便酶切后连接成环状，B错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，D正确。 7 ABD　根据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的TDNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0，A错误；仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为A0Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0），该植株会产生AA、A0、Aa、a0，其中a0花粉不育，即产生3种可育基因型的花粉，B错误；该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型及比例为AAAA∶AAA0∶AA00∶AAAa∶AAa0∶AAaa∶Aa00∶Aaa0＝1∶2∶1∶2∶3∶1∶ 1∶1，利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出600 bp（a）和900 bp（A）条带，Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900 bp条带，其中Ⅰ型植株占比为2/3，C正确；F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株，D错误。 8 （1） RNA提取物　逆转录酶 （2） 让逆转录酶变性失活　使mRNAcDNA杂合双链解开 （3） 2n-1　 （4） 能　增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测　 （5） 温度 9 （1） 复性　PCR需要在高温下进行变性（普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活） （2） BamHⅠ　SpeⅠ　DNA聚合　DNA连接 （3） 1　重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被限制酶SmaⅠ酶切得到1个条带 （4） Ca2+　1和4　④ 解析：（2） 融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应选择图1中的限制酶BamHⅠ和SpeⅠ对质粒A进行完全酶切，这是因为限制酶BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，PstⅠ切割后黏性末端无法补平。（3） BamHⅠ和BclⅠ相同的黏性末端连接后，重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被限制酶SmaⅠ酶切，所以用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到1个条带。（4） 将重组质粒B导入到用Ca2+处理的产气肠杆菌细胞中，这样可以提高转化率。利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除（如图2），敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后，用图2中的引物1和4进行PCR扩增，因为引物需要与模板链的3′结合，沿着5′到3′延伸子链，检测结果如图3所示，其中菌落④为P基因敲除株，因为其中的目标DNA片段为1 200 bp，即为融合基因的长度。 2027届高考生物人教版一轮复习导学案 第1页（共1页） 学科网（北京）股份有限公司 $