专题18 基因工程与蛋白质工程-【创新大课堂】高考生物五年（2022-2026年）真题分类汇编168优化重组卷

专题十八 基因工程与蛋白质工程 考向一 基因工程的基本工具及操作程序 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行 1.(2026·山东卷)以4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、 电泳后，在紫外灯下观察结果 dGTP和32P标记的dTTP)为原料，以一段单链 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精 DNA为模板进行PCR,获得大量双链DNA。酶 灯火焰旁倒平板 W可切断DNA中5'碳与磷酸基团之间的化学键。 D.将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基 用酶W对上述PCR产物充分酶切后获得3'-核苷 上划线培养，获得单菌落 酸，如图所示。所有带32P的3'-核苷酸中，碱基均：5.(2024·山东卷)制备荧光标记的DNA探针时， T 为胞嘧啶。若用2P标记某种脱氧核苷酸，以相同： 需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠 单链DNA为模板进行PCR,产物经充分酶切后，： 杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱 带32P的3'-核苷酸的碱基均为腺嘌呤，则被标记 氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光 的脱氧核苷酸为 标记的dATP)的反应管①~④中，分别加入如 表所示的适量单链DNA。已知形成的双链 DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的 温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双 3-核苷酸 链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探 针的反应管有 注：→指示切割位点 反应管 加入的单链DNA A.dATP B.dGTP 5-GCCGATCTTTATA-3' C.dCTP或dGTP D.dATP或dCTP ① 3'-GACCGGCTAGAAA-5' 2.(2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为 ② 5-AGAGCCAATTGGC-3 致病基因a及HindⅢ切割位点。AluI限制 ③ 5-ATTTCCCGATCCG-3' 3-AGGGCTAGGCATA-5 ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' 区 爵识别厅列及切别位点为了下列相关 带 叙述正确的有 A.①② B.②③ C.①④ D.③④ ( Hind HindⅢ HidⅢ 6.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定” 敬 A因3-20bp 实验，下列说法正确的是 --400bp … A.整个提取过程中可以不使用离心机 HindⅢ 变 HindⅢ 200bp.88 B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分 ·400bp 摇匀再倒入烧杯中 交 A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后 端类型不同 可能变蓝的干扰 C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片：7.(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 段大小一致 PCR产物的实验，下列叙述正确的是 逊 D.产前诊断时，该致病基因可选用HidⅢ限 A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 开 制酶开展酶切鉴定 片段的大小 3.(2025·黑吉辽蒙卷)下列关于耐高温的DNA B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 黑 聚合酶的叙述正确的是 DNA分子的具体位置 A.基本单位是脱氧核苷酸 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极 郑 B.在细胞内或细胞外均可发挥作用 迁移速率越快 尔 C.当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被 反应 检测出来 D.为维持较高活性，适宜在70~75℃下保存 8.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶（酶1、酶 问 4.(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是 2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基 因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点） A.配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖 和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。 核苷酸溶液作为扩增原料 限制酶的切割位点如图所示。 157 紫外线 5'-GAATTC-35'-GGATCC-3 3'-CTTAAG-5'3'-CCTAGG-5' 酶3酶2 酶1 5'TTTTTTT13 酶1 酶2 损伤 抗生素 酶4 5'-CCCGGG-3'5'-AGATCT-3 入 抗性基因 3'-GGGCCC-5'3'-TCTAGA-5' 5TTTTTT TII13 3'1I1LLLLL1⊥5 酶3 酶4 一切▣ 切口、酶 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高 5'TTTTTT ITTTTT3 的是 3 ⊥L⊥⊥LL⊥⊥⊥L⊥5 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 5'TT 缺口 13 3'1ILL 1LLL L1LLL山5 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 T4DNA连接酶连接 修复完成 5TTTTTTTTTTT13' C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4: 3L⊥LLL⊥LLLL1I山5 DNA连接酶连接 A.修复过程需要限制酶和DNA聚合酶 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. B.填补缺口时，新链合成以5'到3'的方向进行 coli DNA连接酶连接 C.DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行 9.(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的 修复，对细胞最有利 基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列 D.随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌 叙述错误的是 的原因，可用突变累积解释 A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 12.(2023·浙江6月)某研究小组利用转基因技 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各 10.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因： 1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子 (AmpR)、四环素抗性基因(TeR)作为标记基 小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的 因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的： 基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩 DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构 增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌 Gata3 中。下列叙述错误的是 ( 启动子区 编码区 插入前5 非编码区3 Hind IlI 5 Pvu I Sph I Gata3 GEP 插入后5启动子区 编码区 引物1 Sal I 编码区非编码区3 Sca I AmpR TetR 31 质粒 5 引物3 引物2 图甲 23 A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可 大片段 能不同 B.若用PouI酶切，在含Tet(四环素)培养基 小片段 中的菌落，不一定含有目的基因 图乙 C.若用ShI酶切，可通过DNA凝胶电泳技 下列叙述正确的是 ( 术鉴定重组质粒构建成功与否 A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 D.若用SphI酶切，携带目的基因的受体菌在 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP 含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能 蛋白 形成菌落 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠 11.(2023·浙江6月)紫外线引发的DNA损伤， 是Gata3-GFP基因纯合子 可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机 D.若用引物1和引物3进行P℃R,能更好地 制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER 区分杂合子和纯合子 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现发13.(2026·山东卷)小鼠基因W编码的蛋白质可 炎等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展 调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母 成皮肤癌。下列叙述错误的是 ( 菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合 158 成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶：14.(2026·黑吉辽蒙卷)平沙绿僵菌是一种昆虫病原 (TdT),该酶不需要模板，可在DNA的3'端随 真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高， 机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核 但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因(Ts) 苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为 改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱 同聚物加尾。相关信息如图所示。 杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题 染色体DNA的 转录方向 EcoR I 部分结构 -0.7kb 1.1kb Tps基因 基因W BamH I EcoR V HindⅢ Sal I 启动子 T-DNA ,终止子 载体的 pPK2质粒 Kpn I Xho I Sal I 转入 导入 Pst I (5.0kb) 部分结构 复制原点 农杆菌 平沙绿 僵菌 卡那霉素抗性基因 限制酶切割位点 3端突出的黏性末端 5-GATATC-3 同聚物加尾过程 EcoR V: 3'-CTATAG-5' 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽 略不计；kb:千碱基对。 某种脱氧 核苷酸 TdT (1)为提高Ts基因在平沙绿僵菌中的表达效 率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列 NNN(n3 与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基 3'NNN(n)- 酸序列不变，获取该目的基因的方法是 注：限制酶识别序列及切割位点 Pst I 5-CTGCAG-3' 实验如图，用限制酶EcoR V切割pPK2质粒， Kpn I 5-GGTACC-3' 然后与Ts基因连接，用 (填“E.coli”或“T4”)DNA连接酶可获得更高 Xho I 5-CTCGAG-3' 的连接效率。 Sal I 5-GTCGAC-3' 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的 NNN(n):n个某种脱氧核苷酸 基因的重组质粒外，还可能存在 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是 ,载体上与其能自我复制相关的结 为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切 构是 割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小， (2)研究人员选取2种限制酶切开载体，再用 属于正确连接的是 和 TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物 A.BamH I/EcoR I0.7 kb+6.1 kb 加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的 B.BamH I /EcoR I,1.1 kb+5.7 kb 黏性末端为5'端突出，则需先用DNA聚合酶 C.HindⅢ/EcoR I、0.7kb+6.1kb 补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需 D.HindⅢ/EcoR I、1.1kb+5.7kb 要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切： 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移 下，据图分析，应选取的2种限制酶为 并整合到平沙绿僵菌的 上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行 (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形 鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5' 成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重 ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3',下列引 组载体需要的2种酶是 物对可用于扩增该片段的是 ,该过程中 (填“需 A.5'-ATGTC...-35-CCTCG...-3' 要”或“不需要”)添加引物，原因是 B.5'-ATGTC…-3'、5'-GGAGC-31 C.5'-TACAG-3'、5'-CCTCG…-3 (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相 D.5-TACAG..-35'-GGAGC...-3' 应蛋白，在分子水平上的检测方法是 (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌 培养物对蚊子的诱杀效果，如表。 159 相关 (2)根据限制酶识别序列和切割位点，以及目 访问次 停留时间/ 2小时 指标 的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的 数/ 感染率 LTs0/ 第7天死 (分钟/ 亡率/% ,限制酶2是 (次/小时) 小时) 天 限制酶1是 培养物 /% (3)琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 速率成反比。为检验重组表达载体是否构建 成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；IT5o(半数 的电泳结果如图2所示，条带 (填“a” 致死时间)：导致50%蚊子死亡所需的平均 或“b”)对应目的基因片段，理由是 时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中 M 样品 数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩 点样孔 2 短且第7天死亡率更高的原因是 (3)该工程菌制剂在推广前，需经过严格的 电泳方向 三 一条带a 一条带b 评价，符合标准后方可推广。 15.(2026·河南卷)4-a糖基转移酶(4αGT)在工 注：M为标准DNA片断 业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产， 图2 研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅 (4)将重组表达载体导入受体细胞，获得的工 用于目的基因的复制和保存)中获取目的基 程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养 因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的 液中4GT的含量，结果如图3所示。阶段2 工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： 中4αGT含量迅速升高的原因可能是 限制酶1 酶切 转录方向 重组克 3'-G GGTAC-5 隆载体 5-TCGAG (答出一点即可)。 C-3 目的基因 限制酶2 坦 40阶段1阶段2 阶段3 30 限制酶1 限制酶2 20 表达载体1 表达载体) 酶切 (3617bp)/ 10 连接 0 1224364860728496 时间/小时 重组表 四 图3 工程菌 ←- 达载体 (5129bp以 16.(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一 种机制。通过对Tⅰ质粒的改造，利用农杆菌 转化法将Ti质粒上的T一DNA随机整合到 Xho I 5'-CTCGAG-3 SalI 5'-GTCGAC-3 小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因 3-GAGCTC-5 3-CAGCTG-5' 的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变 Pst I 5'-CTGCAG-3 Nco I 5'-CCATGG-3 体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息 3-GACGTC-5 3-GGTACC-5 已知。 注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因 T质粒部分序列及限制酶酶切位点 LB Xba I Pst I Sma I BamH I BamH I RB Kan' 图1 5 31 (1)为确保目的基因正常复制，重组克隆载体 3' 启动子 终止子 和重组表达载体均应含有的元件为 目的基因信息 为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载 抗除草剂基因X 体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动 5 子外，还有 ,作用为 3' -20bp 550bp 转录的模板链 Sma 160 限制酶 酶切位点 BamH I EcoR I XBa I 5 3 Sma I 5'-CCCGGG-3' 111111111111111111111 限制酶 5'终止子启动子 Pst I 5'-CTGCAG-3' 切割位点 T-DNA 抗性基因2 Xba I 5-TCTAGA-3 启动子 终止子 BamHI 5'-GGATCC-3 Spe I 5'-ACTAGT-3 载体 注：LB/RB表示T-DNA的边界序列；Kan表 示卡那霉素抗性基因；bp表示碱基对 抗性基因 T 甲Tⅰ质粒与抗除草剂基因信息 了复制原点 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相 S基因转录方向 关的结构为 。选用图甲中的SmaI XBa I Nde I BamH I 对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择 SmaI和 对T1质粒进行完全酶切， S基因 31 将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。 利用DNA连接酶将酶切后的包含 限制酶 识别序列及切割位点 抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的T质 5'-A￥GATCT-3 BglII p 粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经 3'-TCTAGA-5' 卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 5'-CA￥TATG-3 Nde I 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结 3-GTATAC-5' 果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似 5'-CTCGAG-3' XhoI 为 bp,则一定为正向重组质粒。 3'-GAGCTC-5' (2)为证明这两个突变体是由T一DNA插入 5'-G￥AATTC-3 EcoR I 小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组 3'-CTTAAG-5' DNA,经酶切后产生含有T一DNA的基因组 5'-GGA T CC-3' BamH I 片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR 3-CCTAGG-5' 带 难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为 5'-GTCGAC-3' SalI (填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制 3'-CAGCTG-5' 酶，且T一DNA中应不含该酶的酶切位点。 5'-T'CTAGA-3' Xba I 需首先将图乙的片段 ,才能利用引物 3'-A GAT CT-5' P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引 知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断 物 、含Mg2+的缓冲液和耐高温 交 出2条片段的未知序列是否属于同一个基因 的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 的操作为 (填“琼脂糖凝胶电泳”或 步骤中起作用。 冲 “测序和序列比对”) (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割 P2 位点。为将S基因正确插人载体，PCR扩增S T-DNA 未知序列 未知序列 基因时需在引物的 (填“5端”或“3 Pl 端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上 注：P1、P2表示引物 游引物应添加的碱基序列是5'- -3, 乙基因组DNA酶切后含T一DNA的片段 切割载体时应选用的两种限制酶是 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基 PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后， 因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生 经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导 型基因， (填“能”或“不能”)确定该植 尔 入农杆菌。 株的表型为野生型。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈 17.(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物， 母 伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组 提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区 织细胞，将S基因整合到 ,抗性基因 域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。 的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入 栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答 该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育 下列问题。 可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 161 18.(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术 列，该限制酶识别序列应添加在引物的 在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题 (填“3′端”或“5端”) (I)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入 每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中 载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合 DNA双链打开成为单链的阶段是 基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基 引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞 后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点， 出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确， 限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒 但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图 时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶 甲分析，出现该问题的原因是 切的优点体现在 (答出2点即可)；使用酶c单酶切构建重组质 修改扩增P基因时使用的带有EcoR I识别序列 粒时宜选用的连接酶是 的引物来解决该问题，具体修改方案是 AGATCT AAGCTT GATATC EcoR BamH I TCTAGA TTCGAA CTATAG 重组载体 的部分结构 启动】 P基因 终止子 酶a 酶b 酶c 散大 编码FLAG的序列 EcoR I BamH T (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受 DNA编码链ATG GAC·AAG GCG AAT TCA TGT GCA...GGA TCC 体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 氨基酸序列MetAsp-Ly因Ala Asn Ser Cys Ala Gly Ser FLAG 若要验证转化的大肠杆 注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链 菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结 图甲 果是 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与 P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分 模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGAT- 成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG GA,编码从GGG开始，部分密码子见表。若 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序 UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知 列是 FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③ 组结果的差异推测，药物A的作用是 氨基酸 密码子 ；由②④组或 赖氨酸 AAG ③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的 精氨酸 AGA 作用是 丝氨酸 AGC CCA 脯氨酸 FLAG-P ①②③④⑤注：+表示有 ++- CCC FLAG-P△- -++ “_”表示无 亮氨酸 CUG 药物A UBC +++++ GGC 图乙 甘氨酸 GGG ①②③④⑤ 终止 UGA UBC一■ 19.(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P 图丙 引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解， (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机 药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗 理是 作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构20.(2022·广东卷)“绿水透迤去，青山相向开”大 建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和 力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于 FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P, 某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工 FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基 业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污 端，使融合蛋白能与含有FIAG抗体的介质 染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮， 结合，但不影响P或P△的功能。 构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 辅酶A 乙酰乙酸 特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物 硫解酶 转移酶 脱羧酸 需满足的条件是 ThlA CO2+H2+2×乙酸C0A 乙酰CfAB 乙酰 Adc 丙 为使PCR产物能被限制酶 乙酸CoA 乙酸 酮 切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序 梭菌细胞 162 回答下列问题： 下列说法正确的是 (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图） A.构建X十Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱 设计一对 ,利用PCR技术，在优化反 基序列相互影响而使蛋白功能异常 应条件后扩增得到目标酶基因。 B.内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用 保证获得的融合蛋白功能正常 于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后 C.不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识 提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终 别，发挥特异性切除和连接作用 止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基 D.为X十Y融合蛋白提供“内含肽十某蛋白”， 因的作用是 可赋予X十Y融合蛋白新的结构 3.(2025·浙江1月)科学家将拟南芥的细胞分裂 终止子的作用是 素氧化酶基因ACKX1和ACKX2分别导入 野生型烟草(WT)中，获得两种转基因烟草Y1 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶 和Y2,培养并测定相关指标，结果如表所示。 蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因 下列叙述正确的是 ( 可能是 主根长 侧根 不定根 植株 叶片 相对叶表 度(mm) 数（条） 数（条） 数（片） 面积(%) 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化 WT 32.0 2.0 菌株和工艺才能扩大应用规模。 2.1 19.0 100 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实 Y1 50.0 6.6 3.5 8.2 13.5 现了 体现了循环经济特 Y2 52.0 5.6 3.5 12.0 23.3 点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 注：表内数据为平均值 ,具有广泛的应用前景和良好的社会 A.与WT相比，Y2光合总面积增加 B.Y1和Y2的细胞分裂素含量相同且低于WT 效益。 考向二基因工程的应用及蛋白质工程 C.若对Y1施加细胞分裂素类似物，叶片数会增加 1.(2026·河南卷)胰蛋白酶可水解精氨酸与下一 D.若对Y2施加细胞分裂素类似物，侧根和不 位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的 定根数会增加 第27,96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第4.(2025：安微卷)质粒K中含有B半乳糖苷酶基 27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。： 因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶 改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活 可分解X-gal,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌 性。下列叙述错误的是 落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采 A.甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的 用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆 ( 般规律 菌中的高效表达。 下列叙述错误的是 B.胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的 启动 BamH I 专靴 蓝色菌落 专一性 质粒 导入 苷酶 ○ C.第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位 B-半乳糖 筛选平板 卡那霉素 苷酶基因 大肠杆菌 (含X-gal和卡那霉素) 点与抗体功能相关 抗性基因 D.由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因 A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率， 序列不一定改变 可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 2.(2026·云南卷)内含肽(Int)可通过自我催化 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白 实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码 色菌落不可判定为含目的基因的菌株 “内含肽十X蛋白”和“内含肽十Y蛋白”的基 C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长 因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除 出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 生成X十Y融合蛋白，如图。 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质 X蛋白的功能 结构外肽链 内含肽+Y蛋白 粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 5.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定” 实验，下列说法错误的是 内含肽自 A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了 ntA 我切除 防止DNA降解 > B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 X蛋自图 功能结构 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 内含肽+X蛋白 X+Y融合蛋白 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 163 6.(2026·云南卷)UW4菌株可表达ACC脱氨酶减 (3)我国科学家将来自玉米的α淀粉酶基因与 少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部 目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转 能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到 基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质 UW4中ACC趋化受体(ACCR)的羧基端。 粒不复制策略。此类设计的主要目的是 回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a),复制原点(ori)不能 (4)要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在 在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 培养基中添加 ,即可筛选出UW4-1 插入位点 UW4菌株ACCR基因 菌株，筛选的原理是 上游 ;在第二次筛选 前端 后端 培养基中添加 筛选后，培养基中仍 PCR扩增 同时存在两种菌株，第一种菌株是UW42,另一 前端后饲 重径延伸PCR 种菌株的拟核DNA结构是 (填图c中 构建pEX质粒 五肽 序号)；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增 角 前端 后端 群切位点 后端 相应序列并 五武对应的碱基序列 切位 以下简称五肽 EX质起 酯切位点酶切位点 前端后端 前端后端 图a 前端五肽后端 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和 前端五肽后端 ③ 三步。 图c (2)构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是 7.(2026·陕晋宁青卷)研究人员筛选天然抗虫蛋 白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植 (答出2点)。 株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用 蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工 DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工 程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列 程菌UW4-2(图b). 问题。 庆大霉素蔗糖致 庆大霉素薜糖致 抗性基5 死基齿 抗性基因 死基因 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序 ZZZ2① ori 五肽后端 列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。 为避免该问题，基于密码子的 性，可 前端五肽后端 pEX质粒 后端 设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列 前端后端 相同的外源J基因(J)。确定获得的J*基因 第一次同源交换 第 次 选 是否与设计相符的方法是 (选填 序号：①PCR;②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序 UW4菌株拟核DNA 列比对)。 前端后端 (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题， ori 后端五肽前端 按照蛋白质工程的设计思路，利用如图所示载 庆人霉素 蔗糖致 抗性基因死基因 体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗 Uw4-1菌株拟核DNA 虫棉。在该载体中，启动子P属于 另一种同源 第二次 型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的 交换形式 另种+另种 筛选 另一种 酶与启动子P结合，启动融合基因SJ* 菌株 质粒 菌株 表达，之后检测到J蛋白在细胞外积累，则 前端 第二次同 SJ*融合蛋白中信号肽S的作用是 源交换 庆大霉素蔗糖致五肽前端 ←信号肽编 可供J*基因插入区域的核苷酸序列 抗性基因死基因 码序列 Xma I 前端后端 第二次 53个核苷酸 Xho I Sma I EcoR I Sal I Kpn I +ori 选 ZZ☑四 ATGACTGGAQGGCTCGAGGCATCCCCGGGTCGAATTCAACCGTCGACGCTACCGCD 后端五肽前端 庆人霉素蔗糖致 ATG:对应起始密码子AUG 抗性基因 死基因 P:启动子 S:信号肽编码序列 载体 下：终止子 (3)已合成的J基因两端仅含有对应的限制酶 后端五肽前端 UW4-2菌株拟核DNA 识别序列，无额外碱基序列，为使J*基因插入 图b 载体并正确表达SJ*融合蛋白，需使用两种限 164 制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可 ①5'-…GGATCCAGGCAT-31 选择的限制酶组合是 或 ②5'-…AGATCTTCCGTA-3 两种组合，原因是 ③5'-…AGATCTAGGCAT-3 ④5'-…ACTAGTCCGTGT-3 (4)为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大 ⑤5'-…ACTAGTGGCACA-3' 肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是 ⑥5'-…AAGCTTCCGTGT-3 ,可利用 图2 法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植 (3)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来 株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠 抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现， 道细胞核中， (填“促进”或“抑制”)组 P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明 救 蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升 P基因 S基因的转录， (填 高，诱导肠细胞调亡，棉铃虫死亡。 “促进”或“抑制”)肿瘤耐药。 8.(2026·安徽卷)肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的9.(2026·河北卷)黑曲霉中的淀粉酶R能直接将 DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激 不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的 活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐 表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程 药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科 手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行 研人员进行了相关研究。回答下列问题。 了相关检测。 (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会 回答下列问题： 抑 导致培养液 异常；乳腺癌细胞培养时！ (1)黑曲霉菌种的分离纯化应选用 (填“会”或“不会”)出现接触抑制现 (填“固体”或“液体”)培养基。 象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴 (2)细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关 壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理 酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别 时间，原因是 与自身序列互补的mRNA,引导该mRNA发生 降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录 产物能按照 原则自身折叠形成 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插 双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物 带 入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横 的 端分别添加两个限制酶识别序 线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切 列。一部分PCR产物用限制酶KpnI和Spe 位点)。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选 I酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分 择的一对引物为 (填图2中序号)。为 再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位 探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组 置。因此可判断，限制酶①应该是 质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对 载体的部分结构及其RNA产物： 照组的处理是 Kpn I Spe I Neo I Sac I 启动子 A B C 终止子 逊 P基因 转录后RNA形成 5-…CCGTGT…ATGCCT…-3 链内双链结构 3-…GGCACA…TACGGA-5 m之B降解 A CreA mRNA 转录方向 立 降解 Bgl II BamHI Spe I Hindll CreA片段D的引物及限制酶识别位点： 限制酶①KpnI ACAGATCTCGGATCCCACTAGTCAAGCTTAACG-3 引物1 目的基因插入位点 D 启动子 引物Ⅱ 终止子 SpeI限制酶② BamHI 质粒 图1 HindΠ (3)构建的基因表达载体除含有启动子、终止子 复制原点 卡那霉素 和目的基因外，还需具有 基因，以使 抗性基因 表达载体转入受体细胞后可利用 培 图1 养基筛选出转基因成功的菌株。 165 (4)构建的表达载体转入菌株G获得G1,将G 细胞，一段时间后更换不含AB聚集体的培养 和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状 基继续培养， (单选)的A3聚集体 况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图 含量。 2)表明 A.24h检测细胞内 (答出两点) B.24h检测细胞外 -·-G生物量◆G淀粉酶活力 -△-G1生物量·一G1淀粉酶活力 C.0h和24h检测细胞内 20。 D.0h和24h检测细胞外 500 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带 16 400 CAR基因的病毒，3个月后，大脑A3聚集体 12 300 减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下 8 200 降。该实验对照组应注射 100 ;该实验结论是 ◆ 024487296120144 时间/h 11.(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害 图2 (5)传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶 的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉 液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。 离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白 相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体 GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达 现的优势是 的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合 (答出两点) 成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉 10.(2026·湖南卷)阿尔茨海默病患者大脑中β 离子 淀粉样蛋白(A3)异常聚集，损伤神经元。为 回答下列问题： 了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了 (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧 一种嵌合抗原受体(CAR)基因，使其在星形胶 核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐 质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴 减少的是 和 。模板与引物 定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解A?聚 在PCR反应的 阶段开始结合。PCR 集体的能力。回答下列问题： 中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 (1)CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制 酶切割位点)分别如图a、b所示。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的 Kpn I EcoR I Xho I BamH I Hind lⅢ 特异性启动子 胞外识别区跨膜区胞内吞噬信号区小 部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP 基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向 CAR基因编码序列 图a 以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列， Kpn I 其中GP1两端应添加 (填两种限制酶) BamH I EcoR I HindⅢ 的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载 非特异性启动子 GFP 终止子 体和目的基因之间形成 键」 Xho I 载体示意图： Nhe I Sma I EcoR V 病毒载体 启动子 SP7 终止子 图b Xba I EcoR I ①胞外识别区应选用A3聚集体的 (填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。 拟构建载体的部分结构示意图： ②采用特异性启动子的目的是 启动子SP7 CADR GPI YFP终止子 限制酶识别序列及切割位点： 。 同时，为使该CAR基因正确插入病毒 载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成 Nhe I:GCTAGC EeoR I:GAATTC CGATCG CTTAAG 功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是 Xba I:TCTAGA EcoR V:GATATC Sma I:CCCGGG AGATCT CTATAG GGGCCC (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解AB聚 集体，可用含AB聚集体的培养基培养CAR-A 图1 166 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现： 1.20 25 为 ,初步表明融合蛋白表达成 功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离 0.80 子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻 0.60 15 0.40 细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 0.20 5 ,则表明融合蛋白能结合镉离子。 0 0.00 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子 对照 MJA处理 SA处理 miR160基因过表达 野生型 浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度， 结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉 敲除miR160基因 离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原 因可能是 4 3 2 240umol·L1镉离子浓度下，转基因衣藻和 0 野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 敲除ARFI基因 野生型 ARF1基因过表达 1.0 口野生型衣藻 回答下列问题： 三转基因衣藻 (1)青蒿素主要在叶片的腺毛中合成与积累， 其根本原因是： .5 (2)据图分析可知，miR160的表达量与青蒿素 0 含量间呈现 相关性，并且可以推测外 0 160 200 240 镉离子浓度（μmol·L-) 源MeJA处理对青蒿素含量的影响是： 图2 注：镉离子对渗透压的影响忽略不计 (3)基于上述材料，miR160通过直接影响 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施 调控青蒿素的合成。 加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势 (4)请写出SA、ARF1、miR160和DBR2调控 的两个特性是 和 。(填标 青蒿素生物合成的通路（用“→”表示促进，用 号) “”表示抑制，显示各成员间的调控关系)： ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 (5)请根据上述材料，提出一种培育青蒿素含 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻 量高的黄花蒿新品种的思路： 可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣 藻吸附的镉可沿食物链传递 13.(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功 12.(2025·湖北卷)治疗疟疾的药物青蒿素主要 效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵 从植物黄花蒿中提取，但含量低。为培育青蒿 母菌中表达外源香树脂醇合酶基因V,可高效 素含量高的黄花蒿新品种，科研工作者开展了 生产香树脂醇。回答下列问题。 相关研究，发现青蒿素主要在叶片的腺毛中合 (1)可从 中查询基因N的编 成与积累，并受到如水杨酸(SA)和茉莉酸甲 码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转 酯(MeJA)等植物激素的调节。研究表明，SA 录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连 和MeJA通过调控miR160的表达量(miR160 接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 是一种微小RNA,能与靶mRNA结合，引起 和 限制酶识别序列。PCR扩增 后者降解)，影响黄花蒿腺毛密度和青蒿素含 基因N,特异性酶切后，利用 连接 量。miR160的一种靶mRNA编码ARF1蛋 DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb(kb 白，该蛋白影响青蒿素合成关键酶基因DBR2 为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒 的表达。研究结果如图所示。 pYL对应部分大小基本不变。 167 EcoR 各限制酶的识别序列和切割位点 14.(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻 叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。 EcoR I 5'-GAATTC-3' 终止子 3'-CTTAAG-5' 科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相 标记基因 关研究。回答下列问题 DYL Spe I5'-ACTAGT-3' (7.2kb) 3-TGATCA-5 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨 Xho 15'-CTCGAG-3 处理，制备研磨液。此后，采用 (填方 复制原点 3'-GAGCTC-5 法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别 置于不同温度下培养，目的是 Spe I Xba I5'-TCTAGA-3' 3'-AGATCT-5' mra链 引物1 引物2 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效 HindⅢ5'-AAGCTT-3 b链 3-TTCGAA-5 合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁 基因N 离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。 图1 科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功 空白 实验组对照组 能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片 M12345 段R-U和下游片段R一D;然后构建重组质粒； 碱基对 最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中 3000 同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行 2000 1000 敲除。如图1所示。 750 500 复制原点 250 3000bp 注：M指示分子大小的标准参照 500 bp 500 bp 物，14为菌株号 质粒 R-U R-D 图2 (2)进一步筛选构建的质粒，以1~4号菌株中 酶切，连接 提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行 PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第 5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的 重组质粒 之RD 模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 引物1 交换 的污染。初步判断实验组 内生放线菌DN 500bp 2000bp300b (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因 R-UR基因中间序列R-? N,理由是 引物2 图1 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第 240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序 Marker 菌落① 菌落② 菌落③ 菌落④ 列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密 8000bp 码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编 6000bp 5000bp 码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中 4000bp 条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对 3000bp 模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸 2000bp 的密码子除GCA外，还有 1000bp 500bp a:5'-..GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/ TTT/CCC/TCT/TTC/TTC...-3' 图2 b:5'-..GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/ 说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增 AAC/TAC/TTC/TCT/GAG..-3 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR e:5'-.GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/ 通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现 TTC/TTC/CCC/TAC/CAC...-3 基因片段的 。R基因敲除过程中，可 d:5-GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG 发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结 AAG/GCC/ATG/CGA/AAG...-3 果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 (填序号)，出现菌落④的可能原因 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 是 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂 醇合酶基因的改造方案。 168 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁 (5)利用水稻作为生物反应器生产2HN疫苗 元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离 的优点是 子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。 (答出两点即可) 设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 16.(2024·山东卷)研究发现基因I能够通过脱 落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基 因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品 系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆 基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细 15.(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性 胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基 败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因 因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目 T 改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达，制 标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了 图甲：载体信息 检测。 Bsa I Bsa 回答下列问题： 启动 核酸酶基因Ka十Am吧 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别 RB 位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使 5'-ATTGTGAGACCTGAATTCAGGTCTCAGTTT-3 r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 3-TAACACTCTGGACTTAAGTCCAGAGTCAAA-5' 启动子。Nos为终止子，其作用为 LB/RB:T-DNA的边界序列；Kan:卡那霉素抗性基因： Amp:氨苄青霉素抗性基因 r r2HN基因内部不含 图乙：目标基因L部分序列 载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进 目标序列5'-AGTCGACTCTGGATCCGAATTCTTCTCCGAGCGCCAGGCG-3' 突变序列5'-AGTCGACTCTGGATCCGAATTCTTCTCCGAGCTCCAGGCG-3' 行酶切，用于表达载体的构建 GtP Sac I Kpn I 图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 Nos ①②③④ BamH I 5'-GGATCC-3'EcoR I 5'-GAATTC-3" Kpn I HindⅢ EcoRI 3'-CCTAGG-5 3-CTTAAG-5 注：KpnI、HindⅢ、SacI和EcoRI 标注的位点为各限制酶的识别位点 5-GAGCTC-3' Bsa I 5-GGTCTCN-3' 图1 3-CTCGAG-5' 3-CCAGAGNNNNN-5 (2)利用 方法将r2HN基因导人水稻愈 注：N代表任一碱基 伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR (I)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目 技术检测 ,通过 技术检 标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 测是否翻译出r2HN蛋白。 (填“高”或“低”)。限制酶在切开 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插 DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末 家 入目的基因的植株进行研究。此类植株自交 端，若用Bsal酶切大豆基因组DNA,理论上 一代后，r2HN纯合体植株的占比为 可产生的黏性末端最多有 种。载体 那 选择纯合体进行后续研究的原因是 信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留 的黏性末端序列应为5′ -3和5′ (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对 3'。 实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用 测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应 抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的 答的CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）水平，结 植株①一④。为了鉴定基因编辑是否成功，以 果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗 上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增 能够成功激活鸡的 免疫和 目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位 免疫。 点如图乙所示，P℃R产物完全酶切后的电泳 ▣对照组 结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ▣实验组 ,其中纯合的突变植株是 (填 序号)。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植 0 株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细 抗体 GD8+T细胞 胞中只有1条染色体有T-DNA插人。用抗生 图2 素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合 169 且对抗生素敏感的植株所占比例为 ,筛：18.(2024·浙江1月)锌转运蛋白在某种植物根部 选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和 17.(2024·吉林卷)将天然Ti质粒改造成含有 转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌 Vir基因的辅助质粒（辅助T一DNA转移）和 转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功 不含有Vir基因、含有T一DNA的穿梭质粒， 能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型 共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉 酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题： 花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强 (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列 为材料提取并纯化mRNA,反 问题。 转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进 苏云金杆菌 行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热 强 金棉花植株 变性处理，该处理的效果类似于生物体内 :组织培养 的作用效果。对PCR产物进行琼 分离和扩增B基因 棉花叶圆片 与毒性有关 1848与毒性无关3540 脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 B基因ZZZZ777777 2K27770777272☑ 农杆菌 个共培养、转化 酶切 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极 365 1849 辅助质粒 接口；当2个PCR产物相对分子质量接近时， R R3 导入 若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距 1363-1848基因序列 人工合成序列 。 回收DNA片段，连接至克隆 人工合成 35 离会 1-1362基因序列 拼接 氨基酸序列不变) T-DNA-LB 天然序列 载体，转化大肠杆菌，测序验证。 守梭质粒 g 重组 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因 T-DNA-RB 的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切 注：F1-F3,R1-R3表示引物；T-DNA-IB 处理，然后利用 连接，将得到的重组 表示左边界；T一DNA-RB表示右边界；Ori 表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证转 表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基 化是否成功，此反应可以用大肠杆菌悬液当模 因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 板的原因是 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加人蛋白 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母 酶，其作用是 菌株，直接在固体培养基进行 培养， 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒 活化后接种至液体培养基，采用 以扩 精，其目的是 大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检 测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显 (2)本操作中获取目的基因的方法是 著差异。 和 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至 ,驱动目的基因转录；插人两 OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀 个35s启动子，其目的可能是 释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各 取10L菌液用涂布器均匀涂布在固体培养 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR 基上，培养2天，菌落生长情况如图。该实验 两个标记基因的位置，用 基因对应的 中阴性对照为 。 由实验结果可初步 抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织 推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更 (5)为检测棉花植株是否导入日的基因，提取 强的是 ,依据是 棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR,应 选用的引物是 和 野生型酵母+空载体 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工 锌吸收缺陷型酵母+空载体 程，理由是 (单选)。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体 B.将苏云金杆菌B基因导入棉花细胞中表达 锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体 C.将1一1362基因序列改变为棉花细胞偏好 涂布菌液0Dm0.60.060.0060.0006 密码子的基因序列 注：OD6o0为波长600nm下的吸光值，该值越 D.用1一1362合成基因序列和1363-1848 大，菌液浓度越高；空载体为未插入M、N基因 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 的表达载体。 170 19.(2024·浙江1月)小鼠毛囊中表达F蛋白。 HindⅢ Hindll 画非编码区 为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因 Ⅲ启动子区 工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体 ☐编码区 小鼠，简称「小鼠，突变基因用f表示。「小鼠 DNA探针 HindⅢ 皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛茸茸的 样子，其他表型正常。（注：野生型基因型用十 HindⅢ 丢失DNA片段 十表示；f杂合子基因型用十f表示) g基因■ 回答下列问题： 图丙 (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码 :20.(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基 区插入一个DNA片段P,引起F基因产生 因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建 ,导致mRNA提前出现终止密码子， 高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有 使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧 N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2 失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特 片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段 定碱基进行 和 甲，片段甲两端分别为M1与M2;利用 HindⅢ HindⅢ 翻非编码区 CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入 田启动子区 ☐编码区 B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(I~ DNA探针 V)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换 HindIl Hind Ill 区如图所示，→表示引物5′→3'方向。回答 基因p 下列问题。 DNA探针 启动子 图甲 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提 N基因 细菌B1基因组 取DNA,用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖 质粒 P21 一片段甲替换区一 凝胶电泳，用DNA探针检测。探针的结合位 终止子 P3 置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合 MI P4 M2 子对应的DNA片段分别位于第 泳道 和第 泳道。 标记基因 (1)限制酶切割的化学键是 为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段 甲时，应将M1与2片段分别插入质粒的I和Ⅱ、 Ⅲ和V酶切位点之间，原因是 方 图乙 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因 (3)g小鼠是长毛隐性突变体(gg),表型与f小 组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA 鼠相同。「基因和g基因位于同一条常染色体 与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基 上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果 对有G一C和 是 ,则g和f是非等位基因；若杂交 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插 结果是 ,则g和f是等位基因。（注： 入了细菌B1基因组，所用的模板是 ;若 不考虑交叉互换；野生型基因型用十十表示；g 用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结 杂合子基因型用十g表示) 果是 (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的 基因，分别提取野生型(+十)、g杂合子（十g) 细菌处理秸秆的优点是 和g小鼠(gg)的mRNA,反转录为cDNA后 (答出2点即可)。 用(2)小题同样的DNA探针和方法检测，探针：21.(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量 的结合位置如图丙。g小鼠样品泳道没有条 性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行 带的原因是 诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗 组织学检查发现野生型和g杂合子均表达F 传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一 蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白 个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性 具有的作用是 基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展 相关实验。 171 回答下列问题： 杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体 (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因 诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株 转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造 再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株 成，则转基因植株的种子大小应与 植 回答下列问题： 株的种子大小相近。 (1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行 (2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性核 体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是 酸内切酶对PCR产物和 进行切割， 否具备形成 的能力。为了便于观察 用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的 细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体 DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备 进行融合，若甲植物原生质体来自幼苗的根 则乙植物原生质体来自幼苗的 (2)植物细胞壁的主要成分为 和果 (3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂 胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行 时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可 去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体 以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基 进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位 失活。对处理后的原生质体在显微 点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗 镜下用 计数，确定原生质体密 传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表 度。两种原生质体1：1混合后，通过添加适 型的关系。 宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过 (O农杆菌(T-DNA携带DA1基因和卡那霉素抗性基因) 量的培养基进行稀释，稀释的目的是 花序浸没于农杆菌菌液进行转化 ET 关卡那霉素选择培 卡那霉素选择培 卡那霉素选择培 养基筛选种子 养基筛选种子 养基筛选种子 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混 T代 T代 T2代 T代 合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散 ①农杆菌转化T。代植株并自交，将T1代种 固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组 子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳 织。同一块愈伤组织所有细胞源于 性个体即表示其基因组中插入了 下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单 种细胞的理由是哪几项？ (A.甲、乙 株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 %的培养基中幼苗继续培养 B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体 ③将②中选出的T2代阳性植株 (填 失活而不能生长、分裂C.培养基含有抑制物 “自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所 质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D.杂 得的T?代种子按单株收种并播种于选择培养 种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂)。 基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗 (4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽 即为目标转基因植株。 胚状体能长出 ,直接发育形成再生 为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 植株。 PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用 (5)用PCR技术鉴定再生植株。己知甲植物 限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳 细胞核具有特异性DNA序列a,乙植物细胞 即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳 质具有特异性DNA序列b;M1、M2为序列a 图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引 GGAAAAGTAA 物。完善实验思路： 突变型 CCTTTTCATT-AGGACTCTGCCTT…TTACAAGTTA3 3 GGAAAACTAATTCCTGAGACGGAA..AATGTTCAAT5 (150 bp) I.提取纯化再生植株的总DNA,作为PCR 10-… 50 150bp 扩增的 限制性内切酶X AAGGNNNNNNCCTT 识别及切割序列 TTCCNNNNNNGGAA(N代表任意核苷酸) Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系， 核酸电泳图 为特异性引物，扩增序列a;用同样的方法 标淮参照物野生型突变型 150h 扩增序列b。 100b 50 bp (bp指核苷酸对) Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经 后 22.(2023·浙江1月)甲植物细胞核基因具有耐 若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期 盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。 的 个条带，则可初步确定再生植株来 某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞 自于杂种细胞。 172萌发，没有野生型菌落，故A正确。基因突变具有不定向性和！ 随机性等特点，所以V组和Ⅲ组中均可能有M产量未提高的： 突变体菌落，B错误。V组中粗提液浓度比Ⅲ组高，与Ⅲ组相比，！ 若诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体（包括M什突变体和非· M突变体)在V组中被抑制，则Ⅲ组和V组中M中株占比不会接！ 近，C错误。与Ⅲ组相比，若诱变处理后的孢子悬液中更多的· M什株在V组中被抑制，可能会导致Ⅲ组和V组中M什株占比接！ 近，且在筛选平板上形成的菌落有差异，D正确。 【答案】(1)碱基序列(2)随机性和不定向(3)抑制 (4)①与Ⅲ组相比，W组粗提液对野生型孢子萌发的抑制作用· 更强②AD10mL/100mL 12.微生物的培养和计数 【解析】(1)用蔺落计数法计数时，当两个或多个细胞连在一 起时，平板上观察到的只是一个菌落，故活菌统计值比实际值 小；用显微镜直接计数法计数时，不能区分死菌和活菌，故测定！ 的细菌数量往往大于实际的活菌数，因此使用显微镜直接计数， 法计数的结果比菌落计数法计数的结果大。(2)100个菌落代！ 表100个活菌，其来自200L(0.2mL)稀释液，推出1mL稀释： 液中大约有500个活菌，稀释液由细菌原液稀释10倍获得，进！ 而推出细菌原液中细菌浓度为5X103个/mL。(3)将涂布器！ 放在火焰上灼烧的目的是灭菌，以防止杂菌污染：涂布器冷却！ 后再进行涂布的目的是以免高温杀死菌种。(4)由曲线图可 以直接看出，用消毒液A处理后活细菌减少量最大且活细菌！ 减少得最快，说明消毒液A杀菌效果最好。(5)在伊红美蓝培： 养基上培养大肠杆菌，大肠杆菌菌落呈黑色。 【答案】(1)用菌落计数法计数时，只有活菌被统计，且两个 或多个细胞可能连在一起形成一个菌落：用显微镜直接计数！ 法计数时，不能区分死菌和活菌，统计的结果一般是活菌数和 死菌数的总和(2)5×103(3)灭菌，以防止杂菌污染避： 免杀死菌种(4)A活细菌减少量最大且减少得最快 (5)黑 13.【解析】(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组1 成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。： 生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体 内可以参与合成这些物质。 (2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈】形曲！ 线增长，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一 代的2倍，根据公式N,=N。·入，入=2，繁殖n代后细菌的数 量是N。·2”。 (3)分析表格数据可知，实验的结果是：在平板I上，A菌株降： 解石油的能力高于B菌株：在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石！ 油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推！ 测该同学的思路是：分别向培养基I、Ⅱ的甲、乙两孔内注入： 等量且适量同浓度的A、B菌液，一段时间后观察菌液周围培 养基透明图的大小。 (4)由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A菌林· 仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氦且被石！ 油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株在缺少氯源的 培养基Ⅱ上也能生长良好并降解石油，但B菌株在平板Ⅱ上！ 无透明图形成，不能降解石油。 【答案】(1)石油DNA、RNA、蛋白质(2)N。·2(3)分： 别向培养基I、Ⅱ的甲、乙两孔内注入等量且适量同浓度的 A、B菌液，一段时间后观察菌液周围培养基透明圈的大小。 (4)AA菌株在缺少氮源的培养基Ⅱ上也能生长良好并降解： 石油，但B菌株在平板Ⅱ上无透明圈形成，不能降解石油 14.【解析】(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可 以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在· 固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。！ 21 分析图可知，在以纤雏素为碳源的培养基中，细胞数量最多， 可推知拟杆菌新菌株在以纤雏素为碳源时生长状况最好。 (2)培养基的营养成分不能满足部分微生物的营养需求：培养 条件不利于微生物繁殖；与其他微生物之间存在互利共生关 系，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微 生物不能被分离筛选出来。 (3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将动植 物遗体残骸中的有机物分解为无机物，归还到无机环境中，有 利于碳循环的顺利进行。 (4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种 多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证 拟杆菌的正常生命活动所需。 【答案】(1)高压蒸汽灭菌平板划线纤维素(2)培养基 的营养成分不能满足部分微生物的营养需求；培养条件不利 于微生物繁殖；与其他微生物之间存在互利共生关系(3)能 将动植物遗体残骸中的有机物分解成无机物(4)耐低温 专题十八基因工程与蛋白质工程 考向一 .B2.BD3.B4.B5.D6.A7.A8.C9.D10.D 11.C12.B 3.【解析】基因工程(1)启动子是一段有特殊序列结构的 DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA,最终表达出蛋白质。复制原，点是DNA复制的起始位 点，载体上与其能自我复制相关的结构是复制原，点。(2)因后 续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下， 而基因W中含有限制酶SalI的识别位点，因此不能选用限 制酶SalI切割载体，具体切割机制如图所示： 限制酶XI切剂载体后，产 限制酶P1切割载体后，产 生的黏性末端为5”端突出，需 生的上末比为3成空出 为保证重组载体中仍含有限 先用DNA聚合酶补平后再进行 同聚物加尾，为保证重组载体 制酶PI的识别位点，需在 其3”端添加鸟嚎呤脱氧核苷 中仍含有限制酶XoI的识别位 酸进行同聚物加尾。 点，需在其3端添加鸟嘌吟脱 氧核苷酸进行同聚物加尾。 5 TGCAGGG…3'5 GGTACCCC…3'5'CTCCACCG3 3GGCACGTC-5'3.. 3..GGGAGCTC5 Pst I Kpn I 限制酶pI切割载体后，产生的粘性末瑞为3'瑞突出 为保证重组载体中仍含有限制酶Kpn【的识别位，点，需在 其3”端添加胞密啶脱氧核苷酸进行同聚物加尾 由于载体需要提供相同的脱氧核苷酸进行同聚物加尾，限制 酶PstI和XhoI切割载体后，均需要用鸟嘌呤脱氧核苷酸 (G)进行同聚物加尾，因此应远取PstI和XhoI切割载体。 为了将进行同聚物加尾后3'端具有多个鸟骠呤脱氧核苷酸 (G)的载体与基因W进行连接，需在基因W的3'端添加胞嘧 啶脱氧核苷酸(C)进行同聚物加尾，如图。 5'-CCC…3' 3..CCC-5 对基因W进行同聚物加尾 (3) 基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组找体存在部 分单链区，以图中上方链（单链区）为模板，DNA聚合酶能结 合在单链区互补DNA的3'端，添加税氧核苷酸，延仲子链， 然后再用DNA连接酶连接片段，园此该过程不需要添加引物。 tCcC (4)可以采用抗原一抗体杂交法在分子水平上检测基因W是 否在酵母菌中表达出相应蛋白。 【答案】(1)启动子复制原点(2)PstI和XhoI (3)DNA聚合酶和DNA连接酶不需要DNA聚合酶可结 合到单链区互补DNA的3'端，以单链区为模板延伸合成 DNA(4)抗原一抗体杂交法 14.【解析】基因工程、转基因生物的安全性、实验分析(1)根： 据题目要求，需要重新设计编码序列但不改变编码的氨基酸： 序列，没有天然模板可直接扩增，故可采用人工合成的方法获！ 取目的基因。EcoR V切割产生平末端，E.coli DNA连接酶 和T4DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被！ 限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平 末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶（教材链！ 接：人教版选必3P72),因此用T4DNA连接酶可获得更高的！ 连接效率。单个限制酶切割后，质粒可能会发生自身环化，出 现未结合目的基因的空质粒，因此除重组质粒外，还可能存在！ 空质粒。由题图可知，Tps基因总长1.8kb,被EcoR I酶切 后，距离启动子近的一段（上游）长0.7kb,另一段（下游）长 1.1kb,结合酶切位点与质粒长度(5.0kb)计算（质粒中限制 酶切割位点间碱基对长度可忽略不计)，用BamH I十EcoR! I切割：得到0.7kb和6.1kb片段，对应A;用HidⅢ十 EcoR I切割：得到1.1kb和5.7kb片段，对应D。平沙绿優I 菌是真菌，属于真核生物，农杆菌转化法后，T质粒上的 T-DNA会转移并整合到平沙绿優菌的染色体DNA上，从而！ 实现目的基因的稳定遗传。PCR中引物是一小段能与DNA 母链3'端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，由题中转 录模板链序列可知，一种引物与模板链5'端序列一致，即： 5'-ATGTC-3'；另一种引物与摸板链3'端序列互补，即 5'-GGAGC·-3',选B。(2)比较表格中平沙绿優菌组和工程 菌组的数据可知，与平沙绿優菌组相比，工程菌组访问次数和！ 停留时间均显著提高，说明工程菌培养物对蚊子的引诱能力· 更强，使更多的孢子附着于蚊子，从而提高了蚊子的死亡速！ 度。(3)任何基因工程产品在推广前都必须进行严格的安全 性评价，评估其对人类健康、生态环境等的潜在风险，符合标 准后方可推广。 【答案】(1)人工合成T4空质粒（未连接目的基因的！ pPK2质粒)AD(顺序可颠倒)染色体DNA(基因组) B(2)工程菌培养物对蚊子的引诱能力更强（工程菌组蚊子！ 访问次数更多、停留时间更长)，使更多的孢子附着于蚊子 (3)安全性 15.【解析】基因工程(1)重组克隆载体与重组表达载体均需 包含复制原点，以保障目的基因在宿主细胞中稳定复制。为 确保目的基因正常表达，重组表达载体上的目的基因两端需！ 要有启动子和终止子，终止子的作用为使RNA聚合酶在特定！ 位置终止转录。(2)根据图1中目的基因两端的黏性末端序！ C-5' 列可知，左侧黏性末端为5'-TCGAG3-',匹配X0I切制后产 生的末端，根据转录方向判断，限制酶1为Xh0I。右侧黏性· 末端为5'-CATGG-3',匹配VcoI切割后产生的末端，根据！ C-5' 转录方向判断，限制酶2为Nc0I。(3)双酶切后重组表达载： 体产生两个片段，目的基因片段长度为5129bp-3617bp=: 1512bp。空载体长度为3617bp。由于DNA迁移速率与· DNA片段长度成反比，DNA片段长度越小，迁移速度越快， 位置越靠下，图2中条带b迁移距离更远，DNA片段长度更： 小，对应目的基因片段电泳的结采。(4)阶段2中4aGT含量： 迅速升高，可能原因为工程菌进入对数生长期，菌体数量快速 增加，同时4αGT基因高效表达。 【答案】(1)复制原点终止子终止转录(2)XhoI NcoI(3)b目的基因片段长度小于载体，迁移速率更快， 位置更靠下(4)工程菌快速生长繁殖，同时高效转录、翻译！ 合成4aGT 16.【命题点】基因工程及其应用 【解析】(1)Ti质粒含有复制原点，使其在农杆菌细胞中能进！ 21 行自我复制。质粒上含有的酶切位点有XbaI、PstI、SmaI 和BamHI,BamHI酶切会破坏质粒上的终止子，故不能选 择BamHI对质粒进行酶切。由于目的基因应插入在启动子 和终止子之间，所以应选择XbaI和SmaI(或PstI和 SmaI)对Ti质粒进行完全酶切。由于抗除草剂基因X使用 SmaI对其进行完全酶切，两端均为平末端，为构建基因表达 载体，Ti质粒被X加I或PstI酶切产生的黏性末端需要被 补平，如图表示XbaI或PstI酶切产生的黏性末端： Pst I :5-CTGCA 3'-G Xba I :5-T 3-AGATC 由上图可知，只有XbI酶切产生的黏性末端能被补平（关键 点：DNA链的延伸方向)，故应选择XbaI和SnaI对Ti质粒 进行完全酶切。DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA 链的3'端，因此，将黏性末端补平时使用的酶是DNA聚合酶。 根据抗除草剂基因X的转录方向，构建基因表达载体的正向 连接和反向连接的示意图如下： 正向连接： SmaI 5 LB RB-3' 启动子 抗除草剂 终止子 3 基因X -5' 200bp550bp Spe I 较短条带，其余部分为较长条带 向连接 Sma I 5'LB 启动子 抗除草剂 终止子 3 基因 5/ 550bp 200 bp Spe I 较短条带，其余部分为较长条带 由上图可推知，应远择限制酶SmaI和SpeI对重组质粒进 行酶切并电泳检测。若重组质粒为正向连接，则电泳结果呈 现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp(易错点： 若为反向连接，电泳结果也呈现一长一短2条带，但较短的条 带长度近似为200bp)。 (2)本实验目的为证明这两个突变体是由T一DNA插入小麦 基因组中同一基因导致的。实验步骤：提取基因组DNA,经 酶切后产生含有T一DNA的基因组片段，由于后续PCR难以 扩增大片段DNA,因此，在对基因组DNA酶切过程中，应使 用识别序列为4个碱基对的限制酶（且T一DNA不含该酶的 酶切位点)，因为识别序列越短，基因组DNA可能存在的限制 酶酶切位，点越多，获得较短DNA片段的概率越大。分析图 乙，因为引物P1和P2向外侧延伸，利用引物P1和P2扩增未 知序列，应先将该DNA片段连成环状。PCR扩增出未知序 列后，可通过测序和序列比对来判断2条片段的未知序列是 否属于同一个基因，琼脂糖凝胶电泳只可判断2条片段未知 序列的大小，不能确定两者的碱基排列顺序。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转 入突变植林，如果能在突变植株内检测到野生型基因，但由于 不知道该突变是否为显性突变，故不能确定该植株的表型是 否为野生型。 【答案】(I)复制原点Xba I DNA聚合酶SnaI和 SpeI550(2)4连接（或环化）测序和序列比对 (3)不能 7,【命题点】基因工程及其应用 【解析】(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 (4种)脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合 酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸，DNA聚合酶在 延仲步骤中起作用，即DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的 3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要在引物 的5'端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确 插入，应使用双酶切；载体中含有BamH I、EcoR I和XbaI! 的酶切位，点，S基因上含有XaI、NdeI、BamH I的酶切位 点，为保证S基因结构的完整性，不能在S基因两端添加 XaI、NdeI、BamH I的识别序列：分析表格数据，BglⅡ切 割产生的黏性末端和BamH I切割产生的黏性末端相同，结！ 合S基因的转录方向和载体上启动子的转录方向可知，应在 S基因上游添加BglⅡ的识别序列，即5'-AGATCT-3',下 游添加EcoR I的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限 制酶为BamHI和EcoR I。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，农杆： 菌能将基因表达载体中的T-DNA转移到愈伤组织细胞的染： 色体DNA上。分析载体，T-DNA中含有抗性基因2，若T- DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上，则该细胞具： 有抗性基因2对应的抗性，因此，抗性基因2可用于筛选成功： 转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育！ 可获得抗寒能力显著增加的马铃薯植株。 【答案】(1)脱氧核苷酸延伸(2)5'端AGATCT BamHI与EcoR I(3)染色体DNA2再分化 18.基因工程和基因表达 【解析】(1)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需！ 提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱： 氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA! 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列通过氢键结 合。(2)用酶a单酶切，产生的黏性末端相同，目的基因和载！ 体容易发生自身环化以及目的基因的反向连接：用酶a和酶b 双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反向} 连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率。使用· 酶c单酶切只能形成平末端，T,DNA连接酶可以“缝合”双链} DNA片段的平末端。(3)感受态细胞的特点是能吸收周围环· 境中DNA分子。欲验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可！ 将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因： 的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此为探针，使探！ 针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠！ 杆菌中含有重组质粒。(4)依据DNA分子模板链和编码链的1 碱基配对情况、转录过程的碱基配对情况，可推出转录形成的： mRNA上的碱基序列和编码链相近，只存在T和U的差别， 即正常mRNA碱基序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,编！ 码序列缺失第一个核苷酸G后，产生的异常mRNA碱基序列！ 为GGCCCAAGCUGAGAUGA,对应的密码子依次是GGC! (甘氨酸)、CCA(脯氨酸)、AGC(丝氨酸)、UGA(终止密码 子)，即突变后相应肽链的序列是甘氨酸一脯氨酸一丝氨酸。 【答案】(1)变性氢键(2)用酶a和酶b双酶切可防止载！ 体和目的基因自身环化以及目的基因的反向连接，保证目的 基因和载体正确连接，从而提高重组率T,DNA连接酶 (3)能吸收周围环境中DNA分子将转化的大肠杆菌的基因： 组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性： 同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，： 如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒（合： 理即可)(4)甘氨酸一脯氨酸一丝氨酸 19.【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互 补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两！ 种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合： 酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的 基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 22 (2)据图分析，P基因编码链起始序列“ATGTGCA”中的第一 个碱基A与E(oRI识别序列最右侧的两个碱基在转录后编 码氨基酸时构成了一个密码子，导致P基因的密码子读取顺 序发生改变，从而导致P基因对应的氨基酸序列与P不同。 扩增P基因时引物除含有EcoR I识别序列外再添加一个核 苷酸，可以使P基因转录形成的mRNA正常翻译出正确的氨 基酸序列。 (3)由①②③组结果的差异可以看出，加入药物A后检测出的 UBC与其抗体结合的条带更宽，因此可以推测，药物A的作 用是促进UBC与P蛋白的结合；由②④组和③⑤组的比较可 以看出，P△不能与UBC结合，由此推测，P△中缺失的特定序 列的作用是与UBC相结合。 (4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结 合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【答案】(1)两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互 补配对5'端(2)EcoR I的插入导致转录形成的mRNA中 P基因的密码子读取顺序发生改变扩增P基因时引物除含 有EoRI序列外再添加一个核苷酸(3)促进UBC与 FLAG-P的结合与UBC相结合(4)药物A促进UBC与 FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到 治疗的目的。 20.【解析】(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据 目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结 合后，Taq酶才能从引物的3'端延仲子链。 (2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的 细胞筛选出来。 (3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用 下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌 的生长，所以会导致生长迟缓。 (4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以 高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了 废物的资源化，体现了循环经济特，点。从“碳中和”的角度看， 该技术生产丙酮的过程减少了碳排放，有利于减缓温室效应， 并实现较高的经济效盏，所以具有广泛的应用前景和良好的 社会效益。 【答案】(1)引物(2)鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来终止转录，使转录在 需要的地方停下来(3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质 和能量(4)废物的资源化减少了碳排放 考向二 1.D2.C3.C4.C5.B 6.【解析】基因工程(1)PCR每次循环一殷可以分为变性（高 温解开DNA双链)、复性（温度降低，引物与模板链结合）和延 伸(4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱 基互补配对原则合成新的DNA链)三步。(2)双酶切的目的： ①产生的黏性末端不同，可防止质粒和目的基因自身环化，提 高连接效率；②可保证目的基因片段按正确方向定向插入载 体。(3)将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物，花粉中淀 粉被分解→花粉失活→防止转基因花粉向环境扩散；PEX质粒 的oi不能在UW4菌林中启动复制，质粒导入后通过同源重组 整合到宿主基因组的基因才能传递，否则将随细胞分裂丢失→ 防止转入基因向环境扩散，保障生物安全。（4)第一次筛选：添 加庆大露素，只有EX质粒上的抗性基因通过同源重组整合 迸基因组的UW4-1才能存活。第二次筛选：添加蔗糖，未完成 第二次同源交换的UW4菌株因拟核DNA中含蔗糖致死基因 而死亡，完成第二次同源交换的UW4菌株拟核DNA中不含 蔗糖致死基因而存活。另一种同时存在的非目标菌株拟核 DNA结构是序号②，同源交换过程如图。 后端 ori 后端五肽 Z☑-m四 庆大霉素蔗糖致 抗性基因死基肉 前端五肽后端 前端后端 ori X 一Z22☑m 庆大霉素蔗糖致 另一种菌株 抗性基因死基因 拟核DNA 另一种质粒 与②拟核DNA相比，UW4-2菌株拟核DNA的前端和后端中 间多了一段五肽序列，因此可以通过设计特异性引物进行PCR 扩增相应序列并用凝胶电泳进行区分。 【答案】(1)延伸(2)防止质粒和目的基因自身环化、保证目 的基因定向插入(3)防止转入基因扩散，保障生物安全 (4)庆大霉素只有同源交换成功的UW4-1菌株才能在添加 庆大霉素的培养基中存活蔗糖②电泳 7.【解析】基因工程(1)密码子具有简并性，即多个不同的密！ 码子可编码同一种氨基酸。PCR能扩增特定片段，无法鉴定碱 基序列。琼脂糖凝胶电泳能检测目的片段的大小或有无，无法 确认碱基序列。通过测序并与设计序列比对，可确定J基因！ 是否与设计相符。(2)根据题意，启动子P需要在棉铃虫啃食 后才启动基因表达，因此属于诱导型启动子（受特定的外界信 号诱导才能启动基因转录)。转录时，RNA聚合酶与启动子结 合，启动基因转录。根据题意可知，J“蛋白在细胞外积累，说明 J蛋白被分泌到细胞外，推测信号肽S能引导】蛋白分泌到： 细胞外。(3)分析图中限制酶的识别序列和酶切位，点，SmaI 切割后产生的是平末端，不能远择SmaI切割：XhoI和Sal! I是同尾酶，切割后产生相同的黏性未端，不能同时选择这两 种酶进行切割：考虑融合蛋白的正确表达，翻译时，从起始密码！ 子（对应图中ATG)开始，需要读取连续的三个碱基（如图），故 需选择EoRI切割，这样可保证J基因正确表达，故可以选 择的限制酶组合有EcoR I和SalI、EcoR I和KpnI。 ←信号肽编十 可供体基因插入区域的核苷酸序列 码序列 53个核苷酸 Xho I Smal EcoR I Sal I Kpn I 小T本：A(e匹c不TTOAACCCTOGACCCTACCCCD ATG:对应起始密码子AUG P:启动子 3:信号肽编码序列 载体 下终止子 (4)振荡培养可增加溶解氧，同时促进大肠杆菌与营养物质接！ 触，促进大肠杆菌生长。将目的基因导入植物细胞常用的方法， 有农杆菌转化法、基因枪法等。J蛋白进入肠道细胞核后导！ 致组蛋白乙酰化水平升高，说明抑制了组蛋白去乙酰化酶的· 活性。 【答案】(1)简并③(2)诱导RNA聚合引导J蛋白 分泌到细胞外(3)EcoR I和Sal I EcoR I和KpnI使！ 用两种不同的限制酶切割，产生不同的黏性末端，可避免载体！ 和目的基因自身环化和反向连接；同时确保J基因按正确方： 向插入信号肽编码序列的下游，从而正确表达S-J融合蛋白！ (4)提供充足的氧气，促进大肠杆菌与营养物质接触，提高质】 粒复制效率与菌体生长速度农杆菌转化（或基因枪）抑制 8.【解析】细胞工程、基因工程(1)动物细胞培养时，C)2的主 要作用是雏持培养液的pH。若恒温培养箱内C()2不足，培养！ 液的pH就会发生异常。乳腺癌细胞培养时不会出现接触抑！ 制现象（名师点津：癌细胞会无限增殖）。细胞传代培养时，需！ 用胰蛋白酶处理贴壁细胞，使之分散为单个细胞：操作时需要！ 22 严格控制消化时间，因为胰蛋白酶在解离细胞的同时也会水解 细胞膜蛋白，处理过度将导致细胞受损。(2)质粒复制原，点上、 复制原，点和启动子之间分别含有限制酶HindⅢ、BamH I的 酶切位，点，所以应选择BglⅡ、SpI切割目的基因；为使目的 基因正确插入，应在P基因两侧添加限制酶BglⅡ、SpI的 识别序列：P基因的转录方向是从右向左，结合启动子方向可 知，目的基因插入质粒时必须旋转180°（反向）插入；引物应结 合在模板链的3'端，绘制图示如下： P装因3 -TCTAGA 5-…CCCTGT-…ATGCCT3 3'-…GGCACATACGGA…5 ACTAGT、3' 六转录方向子 BglⅡBamHI Spe↓HindⅢ 5-ACAGATCTCGGATCCCACTAGTCAAGCTTAACG-3 、目的基因插入位点， 启动子、 终止子 BamH I- 质粒 Hind Ill- 复制原点 卡那霉素 抗性基因 所以扩增P基因时，应选择引物对③④。为探究P基因对乳 腺癌细胞增殖的影响，实验组将携带P基因的重组质粒导入乳 腺癌细胞，对照组则应导入空质粒（即相同质粒骨架但无P基 因插入)，以排除质粒本身及导入操作对乳腺癌细胞增殖的千 扰。(3)启动子发生甲基化修饰后，RNA聚合酶不能有效识别 启动子，转录无法正常启动，所以P基因抑制S基因的转录。 S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿璃增殖，所 以，P基因能够促进肿瘤耐药。 【答案】(1)pH不会胰蛋白酶处理时间过短无法使细胞 分开，处理过度会水解膜蛋白，导致培养的细胞受损(2)③④ 将空白质粒导入乳腺癌细胞(3)抑制促进 得分保障思路保障设计/选择引物类试题解题步骤：①选 择目的基因两端添加的限制酶识别序列，注意限制酶不能破坏 质粒关键元件和目的基因。②牢记DNA延伸方向是5’→3。 ③根据质粒上启动子方向和目的基因的转录方向，确定目的基 因插入时的正向与反向，只有目的基因的转录方向与启动子驱 动方向一致时，重组质粒才能正确转录。④构建“酶识别序列 十基因特异序列”的完整引物。 9.【解析】基因工程的应用、微生物的培养(1)分离纯化菌种 应选用固体培养基，液体培养基主要用于扩大培养或提取代谢 产物等。(2)据图1可知，含片段A和C的转录产物能按照碱 基互补配对原则自身折叠形成双链。扩增目的基因时，为了保 证目的基因能够与载体正确连接，可在两个引物的5'端分别添 加两个限制酶识别序列（点拨：DNA延伸方向为5'→3）。一 部分PCR产物(CreA基因D片段)用限制酶KpnI和SpeI 酶切连接到载体中A所在的位置：另一部分PCR产物(CreA 基因D片段)用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置，为 了确保转录后的产物能够自身折叠形成双链，此部分应反向连 接，因此限制酶①应该是SacI。(3)基因表达载体一般含有启 动子、终止子、目的基因和标记基因等。其中，标记基因的作用 是便于后续利用选择培养基进行重组DNA分子的筛选。 (4)实验的自变量是黑曲霉细胞中CreA基因能否表达。转入 基因表达载体的菌株G1中，CrA基因不能表达，不能合成 CreA蛋白。根据题千信息R基因的表达受CreA蛋白抑制，可 知菌株G1中R基因能够表达，其淀粉酶活性较高。图2实验 结果显示，抑制黑曲雾CreA基因表达不影响菌体生长(，点拨：！ G与G1生物量无显著差异)，但会提高淀粉酶的活性。(5)传1 统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等！ 处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发· 利用所体现的优势是节省资源、加快反应速率、提高产物纯！ 度等。 【答案】(1)固体(2)碱基互补配对5'SacI(3)标记！ 选择(4)抑制黑曲霉CrA基因表达不影响菌体生长，但会 提高淀粉酶活力(5)节省资源、加快反应速率，提高产物纯度 10.【解析】基因工程(1)①AB聚集体在体内相当于一种“抗 原”，要让CARA细胞能特异性识别这个抗原，需要给它“安！ 装”抗体（名师点津：抗体能特异性地识别并结合抗原），因此 胞外识别区应选用AB聚集体的抗体特定片段编码序列。！ ②为保证CAR基因只在星形胶质细胞中表达，必须使用特异 性启动子来启动CAR基因表达。要使该CAR基因正确插入 病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白示踪其成功导入星形胶质！ 细胞，选择限制酶时需要注意：去除病毒载体原有的非特异性！ 启动子；保留绿色荧光蛋白基因，以便示踪CAR基因是否成！ 功导入细胞：采用双酶切法产生不同的黏性末端，避免载体和 目的基因自身环化，保证正确连接。因此，应选择KpnI和} Bam HI。 Kpn I EcoR I Xho I BamH I Hind llΠ 特分性启动子胞外识别区跨膜区胞内吞噬信号区」 CAR基因编码序列 Kpn I BamH I EcoR'Hind lⅢ 非特异性启动子 cP终业子 Xho I ! 病毒载体 (2)在含AB聚集体的培养基中培养CAR-A细胞，是为了让细 胞有机会吞噬AB聚集体。随后将培养基更换为不含A3聚！ 集体的培养基，目的是阻断细胞从外界继续摄取AB聚集体， 确保后续观察到的AB聚集体含量变化只来自细胞内已有的· AB聚集体。在更换不含AB聚集体的培养基时（记为0h)取！ 样检测，若细胞内检测到AB聚集体，说明吞噬确已发生，同时 这一数值可作为后续分析的初始参照；继续培养24后再次！ 检测，将24h的结果与0h的比较：若0h时在CAR-A细胞 内检测到AB聚集体，24h时CAR-A细胞内AB聚集体含量！ 明显下降，则证明CAR-A细胞不仅能吞噬AB聚集体，还具备 将其降解的能力，故选C。(3)该实验旨在探究携带CAR基 因的病毒对阿尔茨海默病的治疗效果。实验组处理为：给6！ 月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒。实！ 验设计遵循单一变量原则，对照组应排除CAR基因本身以外！ 的千扰因素，因此，对照组处理应为：注射等量但不携带CAR: 基因的病毒（空载体病毒）。实验结采显示，实验组小鼠大脑} AB聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。： 由此可推出：携带CAR基因的病毒进入小鼠体内后，在星形！ 胶质细胞中特异性表达CAR,形成的CAR-A细胞能特异性 识别吞噬和降解AB聚集体，从而减轻AB聚集体异常聚集引： 发的神经元损伤。综上，该实验结果表明携带CAR基因的病！ 毒对阿尔茨海默病糢型小鼠具有治疗效果。 【答案】(1)①抗体②使CAR基因在星形胶质细胞中特异！ 性表达KpnI、Bam H I(2)C(3)不携带CAR基因的1 病毒携带CAR基因的病毒对阿尔茨海默病模型小鼠具有 治疗效果 考情速递 基因工程治病：从分子设计到模型验证的完整逻辑链 本题以阿尔茨海默病为情境，呈现了基因工程技术应用于！ 疾病治疗的核心逻辑：基因工程设计→细胞验证→模型治疗。 221 基因层面，胞外识别区选用AB聚集体抗体的片段编码序 列，赋予细胞特异性识别抗原的能力：利用特异性启动子实现基 因只在星形胶质细胞中表达；友酶切构建载体保证正确连接。细 胞层面，通过更换培养基阻断外源AB聚集体摄取后检测0h和 24h的AB聚集体含量变化，鉴定CAR-A细胞吞噬与降解功能。 个体层面，注射携带CAR基因的病毒后，模型小鼠大脑中AB聚 集体减少、神经元损伤标志蛋白下降，证实治疗效果。 备考启示：基因工程题已从单一工具考查转向“工程思 维”的综合设计，要求考生能沿“基因→细胞→个体→疾病”的 完整链条，进行功能需求反推基因工程方案的逻辑推理。 1.【命题点】基因工程 题图解读 (2)为了防止目的基因出现自身环化和反向连接，目的基因的 两端不能添加同尾酶的识别序列。 二者酶切后的黏性末端相同，为同尾酶，其识别序 列不能添加在同一个目的基因的两端 载体示意图： Nhe T Sma I EcoR V 启动子入SP7 十终止子卧 Xba I EcoR I heI或aI 拟构建载体的部分结构示意图： 启动子SP7 CADR GPI YFP终止囝 Sma I EcoR I EcoRV 【解析】(1)PCR过程中，每进行一轮的扩增，都需要消耗引 物和作为原料的脱氧核苷酸，所以随着PCR反应进行，引物 和脱氧核苷酸的数量逐渐减少，可作为模板的DNA会越来越 多，DNA聚合酶的数量基本保持不变。PCR的过程包括变性 (温度超过90℃，双链DNA解聚为单链)、复性（温度下降到 50℃左右，引物和模板结合)、延仲（温度上升到72℃左右，耐 高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)。由 于PCR反应中，变性过程温度较高，DNA聚合酶的化学本质 为蛋白质，为防止高温导致蛋白质变性失活，所以PCR过程 中需要用耐高温的DNA聚合酶。 (2)由题图解读可知，GP1基因两端应分别添加SnaI和 EcoR I的识别序列。DNA连接酶催化DNA片段之间磷酸二 酯键的形成，完成DNA片段的连接。 (3)结合题千信息可知，该转基因体系构建了SP7,CADR GP1、YFP融合蛋白表达载体，其中黄色荧光蛋白(YFP)基因 可看作标记基因。若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出 黄色荧光，说明YFP表达成功，即融合蛋白表达成功。将两 种衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因 衣藻细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻，则说明融合蛋白 可结合镉离子。 (4)结合题图2可知，在不同镉离子浓度的培养液中培养6天 后统计细胞密度，镉离子浓度为0时，两组的细胞密度相对值 差异不大，镉离子浓度增大后，两组的衣藻数量均出现不同程 度的减少，但转基因衣藻的细胞密度相对值均大于野生型衣 藻，可能是转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中 的镉离子，减小了镉离子对细胞的毒害。当外界镉离子浓度 为2404mol·L时，转基因衣藻的生长也被明显抑制，原因 可能是培养液中的镉离子浓度过高，融合蛋白的吸附能力有 限，镉离子对转基因衣藻也造成了较强的毒害。 (5)与施加化学药物相比，转基因衣藻在环境治理上的优势有 衣藻作为生物材科料在水体中可进行自我繁殖，免去了反复施 加药物的危害和麻烦；同时衣藻可吸收水体中的N、P等元 素，在一定程度上减轻了水体富营养化。衣藻生长速率受镉 离子浓度影响和衣藻吸附的镉可沿食物链传递不是其在环境 治理上的优势。 【答案】(1)引物脱氧核苷酸复性变性过程中温度！ 较高 (2)SmaI和EcoR I磷酸二酯(3)发出黄色荧光高 (4)转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中的镉离！ 子，减小了镉离子对细胞的毒害培养液中的镉离子浓度过 高，融合蛋白的吸附能力有限，镉离子对转基因衣藻和野生型 衣藻均造成了较强的毒害(5)①③ 回归教材人教版选择性必修3P77PCR技术 含义聚合酶链式反应的缩写，是一种体外 迅速扩增DNA片段的技术 原理DNA半保留复制 条件模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、耐 PCR 高温的DNA聚合酶等 技术 扩增DNA的合成方向总是从子链的5'端 方向向3'端延伸 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基 序列互补配对的短单链核酸 目的短时间内大昼扩增目的基因 12,【解析】植物激素调节(1)青蒿素的合成需要特定酶的催 化（如DBR2基因表达的酶），这些酶的基因会在腺毛细胞中： 特异性表达。(2)据图可知，miR160基因过表达对应的青蒿： 素含量低，而miR160基因敲除对应的青蒿素含量高，说明！ miR160的表达量与青蒿素含量间呈现负相关性。据图可知，！ 与对照组相比，MeJA处理组miRl60的表达量较低，可推测 外源MeJA通过抑制miRl60的表达，从而降低其对青蒿素合： 成的抑制作用，使青蒿素含量提高。(3)miR160的一种靶！ mRNA编码ARF1蛋白，该蛋白影响青蒿素合成关键酶基因！ DBR2的表达，而miRl60能与靶mRNA(如ARF1mRNA)结t 合并导致其降解，从而减少ARF1蛋白的含量，因此miR1601 通过直接影响ARF1蛋白的含量，调控青蒿素的合成。(4)SA 抑制miRI60的表达，miRI60可降解ARF1mRNA,即 miR160抑制ARF1蛋白的合成：ARF1基因过表达对应 DBR2相对表达量较高，说明ARF1对DBR2是促进作用：： DBR2是青蒿素合成关键酶基因，可促进青蒿素合成。调控关： 系见答案。(5)培育青蒿素含量高的黄花蒿新品种的思路有： 分子水平上，抑制miRI60,可以利用CRISPR-Cas9敲除！ miR160基因，或转入miR160的抑制因子。传统育种上，筛选1 miR160低表达或ARF1过表达突变体。 【答案】(1)青蒿素合成相关基因只在腺毛细胞中特异性表： 达(2)负外源MeJA处理可提高青蒿素含量(3)ARF1: 蛋白的含量(4)SA4miR1604ARF1→DBR2→青蒿素合成 (5)通过基因工程降低miR160的表达（如敲除miR160基因） 13.【命题点】基因表达载体的构建、PCR及电泳鉴定 题图解读 据图1分析： (1)为保证目的基因N与质粒pYL正确连接，需要把基因N! 插入启动子和终止子之间，便于基因N的转录。因为a链为 转录的模板链，RNA聚合酶识别和结合启动子之后，会从模！ 板链a链的3'端向5'端转录，所以a链的3'端需要连接到启动！ 子右侧，故在引物2的5'端引入SpeI限制酶识别序列：a链！ 的5'端需要连接到终止子左侧，故需要在引物1的5'端引入： XhoI限制酶识别序列。 22 (2)因为a链上有SpeI限制酶识别序列，用SpeI限制酶识 别切割基因N时会破坏基因N,所以需要在引物2的5'端引 入与SpeI限制酶识别序列具有相同黏性末端(5'一CTAG一 3')的限制酶识别序列，即在引物2的5'端引入XbaI限制酶 识别序列。结果如图： 5 -3a链 o1识别序列45引物！3 3' ,5'+XaI识别序列 3 引物2 一5'b链 【解析】(1)可从基因序列数据库中查询基因N的编码序列， 设计特定引物。由题图解读可知，为保证基因N与质粒pYL 正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入Xh0I和 XaI限制酶识别序列。PCR扩增基因V,特异性酶切后，利 用DNA连接酶连接DNA片段。 (2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板 DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质 粒pYL大小为7.2kb,重组质粒大小约9.5kb,假设构建重 组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小 为二者的差值，约为2.3kb(22.3kb),结合图2电泳结果可 知，实验组1的电泳条带大小约为2300bp,说明实验组1的 质粒中成功插入了基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列 的引物(GCA为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同)，b、 C、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨 酸鳊码序列的引物，其配对模板与：的配对模板相同，据此分 析，除编码第243位装丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序 列，与丙氨酸的密码子序列相同，其后的编码序列应该与相 同，为TGG/CTG/TTT…,所以该引物是c,其中GCC为第 243位诱变序列，故丙氨酸的密码子还可以是GCC。 (4)本题旨在通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N 并进行改造，提高香树脂醇合酶的催化效率，高效生产香树脂 醇，所以检测转基因酵母菌发酵产物香树脂醇的含量并进行 比较，可以远出香树脂醇合酶催化效率较高的香树脂醇合酶 基因改造方案。 【答案】(1)基因序列数据库（或Gen Bank或DNA序列数据 库)Xho I Xba I DNA连接酶(2)外源DNA(或外源 基因、基因N)1基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL 大小的差值，约为2.3kb,对应实验组1的电泳条带（或实验 组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等于重组质粒大小) (3)GCC(4)香树脂醇 4.【命题点】微生物的培养、PCR技术、实验设计 【解析】(1)可采用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的 选择培养基，并分别置于不同温度下培养的目的是探究内生 放线菌最适的营养条件和温度。 (2)PCR的实质是体外的DNA复制，所以PCR可以实现基因 片段的快速扩增。由图1可知，未发生同源重组前，在引物1、2 的作用下可扩增出的片段为3000bP,故菌落①③未发生同源 重组。若R一U和R一D都发生同源重组，则会减少R基因中 间的2000bp的序列，从而使扩增的片段减小到1000bp,故菌 落②为发生同源重组后的R基因敲除株。裉据题千信，息，R 基因敲除过程中可发生多种形式的同源区段交换，菌落④的 大小约为7000bp,则可以推测在同源重组过程中，只发生了 R一U或R一D一处同源重组，导致整个质粒片段接入。 (3)若要验证内生放线菌通过与稻瘟病致病菌竞争性利用铁 离子抑制稻瘟病致病菌的生长，则实验的自变量应为内生放 线菌是否能利用培养液中的铁离子，即R基因的有无，因变量 应该为稻痘病致病菌的生长情况，最后可观测两种菌的数量！ 和培养液中的铁离子含量变化情况来验证实验结论。所以实！ 验可分为两组，甲组：将适量的含R基因的内生放线菌和稻瘟！ 病致病菌混合培养在含铁的培养液中培养；乙组：将等量的R! 基因敲除内生放线菌与稻瘟病致病菌混合培养在相同的含铁· 培养液中培养；将两组培养液放在适宜的条件下，间隔合适时！ 间记录每组培养液中铁离子含量变化和两种菌的数量变化。 【答案】(1)稀释涂布平板法探究内生放线菌最适的营养！ 条件和温度(2)快速扩增②只有R一U或R一D一处发！ 生了同源重组(3)将野生型内生放线菌、R基因敲除内生放· 线菌分别与稻瘟病致病菌混合培养在含铁培养液中，统计培！ 养液中铁离子含量及两种菌的数量变化。 15.基因工程 【解析】(1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在 胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端· 有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下： 来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP! 中有限制酶KpnI的识别序列，而SacI的一个识别序列位i 于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择！ HindⅢ和EcoR I对r2HN和裁体进行切割。(2)通常采用， 农杆菌转化法将目的基图导入水稻的愈伤组织。检测2HV! 是否表达，可以采用PCR技术检测孩基因是否转录出R-! NA,通过抗原一抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白。 (3)设r2HN为基因N,则单一位点插入目的基因的植株的基： 因型为Nn,其自交后代的基因型及比例为NN:Nn:nn=! 1:2:1,r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代 不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。(4)抗体！ 参与体液免疫，CD8+T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免： 疫。分析图形，实验组的抗体水平及CD8+T细胞水平的相！ 对值都高于对照组，说明获得的2HN疫苗能够成功激活鸡！ 的体液免疫和细胞免疫。(5)水稻属于常见的农作物，易于种： 植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生· 物反应器容易从胚乳中大量获得疫苗。 【答案】(1)在胚乳中特异性表达的基因使转录在所需要！ 的地方停下来HindⅢEcoR I(2)农杆菌转化是否转 录出mRNA抗原一抗体杂交(3)1/4纯合体自交后代不 发生性状分离(4)体液细胞(5)水稻易于种植，容易获· 得疫苗：水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗（合理即可） 16.基因工程 【解析】(I)引物的长短会影响共在目标DNA序列上的结合： 能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可！ 能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导！ 致非特异性产物的形成，影响PC℉的特异性和准确性。 结合BsaI识别序列可 Bsa I 5'-GGTCTCN3 知.BsaI酶切后产生 3'-CCAGAGNNNNN 5' 的黏性末端含有4个碱 基.故若用BsaI酶切 注：N代表任一碱基 大豆基因组DNA,理论 上可产生的黏性末端最 多有4×4×4×4-4'（种）。 图甲：载体信息 Bsa I Bsa I 十启动 一核酸基因一{Ka配十Am印 RB 6-ATTGTGAGACCTGAATTCAGGTCTCAGTTT-3 3'-TAACACTCTGGACTTAAGTCCAGAGTCAAA-5 BRB中-不A的边界序列：Kan:个那霉素抗蟹基因： Amp:氨苄青霉素抗性基因 分析图甲可知，BsaI的酶切位点如图所示。 则经Bsa【酶切后，载体上保留的黏性末端 序列应为5GTTT-3和5-CAAT-3'。 22: (2)分析载体信息可知，卡那露素抗性基因位于T一DNA上， 故重组载体中含有卡那霉素抗性基因，重组载体通过农杆菌 导入大豆细胞，使用抗生素卡那露素可筛远到具有该抗生素 抗性的植株。 图乙：目标基因L部分序列 目标序列5-AGTCGACTCTGGATCCGAATTCTTCTCCGAGGGCCAGGCG-3' 突变序列5'-AGTCGACTCTGGATCCGAATTCTTCTCCGAGCTCCAGGCG-3 图两：限制酶识别序列，切割位点及电泳结采 ①②③4 BamH I 5'-GGATCC-3'EcoR I 5'-GAATTC-3' 3'-CCTAGG-5' 3'-CTTAAG-5' Sae I 5'-GAGCTC-3'Bsa I 5'-GGTCTCN-3' 3'-CTCGAG-5' 3'-CCAGAGNNNNN-5' 注：N代表任一碱基 分析图乙和图丙可知.目标序列中含有限衡BamH I和EcoR I的识别序 列.突变序列中含有限制BamH I,RT和ScI的识别序列，再结合 电泳结果分析可知选用的是限制降S心【切断CR产物，根据电泳结果图可 知，①和表示杂合子，②表示纯合抗生植株。④表示纯合的突变植株。 (3)设基因L突变为基因L',则该株基因L成功突变的纯合 植株的基因型为L'L',由题中信息知，一条染色体插入了T DNA,若其插入了L'所在染色体，其所在染色体记为L',,则 共自交子代的基因型及比例为L'L'1:L',L':L'L'=1: 2：1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代，筛远出来的子 代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L')所占的比例 为1/4。若其插入了其他染色体，所得结采相同。 【答案】(1)低44 GTTT CAAT(2)卡那霉素 SacI④(3)1/4 7,基因工程、蛋白质工程 【解析】(1)提取DNA时，要加入蛋白酶水解DNA酶以防止 提取的DNA被DNA酶水解，同时水解其他的蛋白质以去除 杂质；提取过程中加入预冷的酒精的目的是利用DNA不溶于 酒精的特点来析出DNA分子。(2)根据题千信息可知，本操 作中获取目的基因的方法有PCR和人工合成。(3)启动子位 于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，可以驱 动目的基因转录出mRNA。插入两个启动子有利于目的基因 的稳定高效表达，提高转录的效率。(4)根据图中穿梭质粒上 的KanR和HVg BR两个标记基因的位置分析可知，潮露素B 抗性基因位于T-DNA左右边界之间，可随着T一DNA一同 转化进入受体细胞，故用HygBR基因对应的抗生素可初步筛 选转化的棉花愈伤组织。(5)根据图中信息知，目的基因是人 工合成的1一1362基因序列与天然的1363一1848基因序列 结合体，应该选择引物F1(或F3)和R2进行PCR检测棉花植 株是否导入目的基因。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质， 属于蛋白质工程。 【答案】(I)水解DNA酶以防止提取的DNA被DNA酶水 解，同时水解其他的蛋白质以去除杂质利用DNA不溶于酒 精的特点来析出DNA分子(2)PCR人工合成(3)识别 和结合RNA聚合酶保证目的基因的稳定高效表达，提高转 录的效率(4)HygBR(5)F1(或F3)R2(6)D 8.微生物的培养、基因工程、电泳 【解析】(1)由题千信息“锌转运蛋白在某种植物根部细胞特 异性表达并定位于细胞质膜”可知，应以该植物的根为材料提 取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。热变性处理的目的是 使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。进行琼脂糖 凝胶电泳时，DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，凝胶 点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同相 对分子质量的DNA分子在凝胶中的距离逐渐变长。(2)DNA 连接酶可将限制酶处理后的质粒和目的基因连接。由于RCR 过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌 悬液当糢板，利用PCR快速验证转化是否成功。(3)取冻存 的锌吸收缺陷型酵母菌，直接在固体培养基进行划线培养，活！ 化后转至液体培养基中增殖，培养过程中需进行振荡，有利于· 增加培养液的溶氧量并使酵母菌和培养液充分接触。(4)由！ 题意可知，菌液经逐级稀释后()D00为0.06、0.006和0.0006，！ 说明对菌液进行了梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母： 十空载体组不会吸收锌，为阴性对照组。由图可知，转入N基！ 因的这组酵母菌数量较多，说明转运蛋白N转运Zn2+能力： 更强。 【答案】(1)根解旋酶磷酸基团变长(2)DNA连接 酶热变性使大肠杆菌细胞破裂，DNA流出(3)划线 振荡培养(4)梯度稀释锌吸收缺陷型酵母十空载体 转运蛋白N转人N基因的这组酵母菌数量较多 19.基因工程、遗传规律的应用 【解析】(1)据题中信息知，在F基因的编码区插入一个 DNA片段P,引起F基因产生编码序列错位，从而导致 mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序！ 列变短，蛋白质结构发生改变，导致合成的蛋白质丧失活性。· 除此之外，还可以敲除或者替换基因中的特定碱基，从而达到！ 相同目的。(2)由图甲可知，野生型基因和「基因都含有2个· 限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此用限！ 制酶HindⅢ切割野生型基因和「基因后，所得能与探针结合· 的片段大小不一致，「基因经酶切后得到的能与探针结合的片 段较长（相对分子质量较大），在电泳时迁移速度较授，已知野： 生型基因型用十十表示，「杂合子基因型用十「表示，综合分析 知，「小鼠和「杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和 第2泳道。(3)据题意可知，野生型基因型用十十表示，g小鼠！ 是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，「杂合子小鼠基因型用 十「表示，「基因和g基因位于同一条常染色体上。如采g和f: 是非等位基因，则「杂合子小鼠（十/十十）与g小（十十/熙） 杂交，后代的基因型为十十/十g和十/十g,全是野生型；如果： g和「是等位基因，「杂合子小鼠（十）与g小鼠(gg)杂交，后！ 代中十g:fg=1:1,即野生型与突变型的比例为1：1。 (4)据图丙可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随一 部分DNA片段丢失，g基因无法转录出mRNA,不能得到相 应cDNA,故PCR扩增时缺少摸板，不能扩增出相应DNA片！ 段，因此g小鼠样品泳道没有条带。g小鼠表型与「小鼠相· 同，表现出毛茸茸的样子，野生型和g杂合子均表达F蛋白，g! 小鼠不表达F蛋白，即不表达F蛋白的小鼠表现出长毛，说明！ F蛋白在毛发生长中起抑制作用。 【答案】(1)编码序列错位/基因突变氨基酸序列替换 敲除/缺失(2)32(3)子代全为野生型（短毛）野生型：· 突变型（短毛：长毛）=1：1(4)野生型基因发生突变，导致！ g基因丢失了启动子，无法转录出mRNA:反转录没有相应产！ 物，检测不出结果。抑制毛发生长 20,限制酶的作用、碱基互补配对、实验分析 【解析】(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序 列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建 片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的I和Ⅱ、Ⅲ和V· 酶切位，点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，从而使N 基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，： 含有碱基A,U,C,G;B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含 有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对！ 可形成的碱基对有G-C、A-U、A-T。(3)由题中信息“利用1 CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，！ 得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插 入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。: 22 结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计 的引物，故以菌株2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物 进行PCR,不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸杆会污染环境，利用 高效降解纤雏素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境 污染。 【答案】(1)磷酸二酯键片段甲含有启动子和终止子 (2)A-U、A-T(3)菌株B2的基因组DNA无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染（合理即可给分） 21.【解析】(1)据题千信息可知，突变体是由野生型DA1基因 发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型DA1基因 转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入 的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植 株的种子大小相近。(2)构建基因表达载体时，需要用限制性 核酸内切酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为运载体的Ti 质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达，DA1 基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。(3)①卡 那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细 胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞篩 远出来。用农杆菌转化T。代植株并自交，将T,代种子播种 在含有卡那露素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即 表示其基因组中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。 ②假设DA1基因用A表示，结合题中信息知，T,代中能在含 有卡那霉素的培养基上生长的植株的基因型为Aa或AA或 多位点插入，T,代阳性植株自交所得T2代种子按单株收种 并播种于含有卡那露素的培养基上，T,代阳性植株基因型为 Aa时，该植株上所结种子有75%能够萌发并长成幼苗，因此， 应选择阳性率约为75%的培养基中幼苗继续培养。③T2代 阳性植株的基因型为1/3AA、2/3Aa,将②中选出的T2代阳 性植株自交，所得的T3代种子按单株收种并播种于含有卡那 露素的培养基上，基因型为AA的植株自交，其后代不会发生 性状分离，在含有卡那露素的培养基上，所有种子都能够萌发 并生长，而基因型为A的植株自交，其后代会发生性状分离， 在含有卡那露素的培养基上部分种子不能萌发，因此阳性率 达到100%的培养基中的幼苗为纯合子(AA),即目标转基因 植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性核酸内 切酶X的识别序列，不能被该酶切割，已知DA1基因的长度 为150bp,因此，野生型相关基因被限制性核酸内切酶X切割 并电泳后得到的条带为150bp。突变型相关基因中含有限制 性核酸内切酶X的识别序列，用该酶切翻后，突变基因被切割 成100bp、50bp两种DNA片段，经电泳后得到的条带为100bp 和50bp。突变型和野生型相关基因经限制性核酸内切酶X切 割并电泳后得到的结采如图所示。 标准参照物野生型突变型 150bp 100 bp 50bp■ (bp指核苷酸对) 【答案】(1)野生型（2)Ti质粒启动子和终止子 (3)①DA1/基因（和卡那霉素抗性基因）②75③自交 100如图所示 标准参照物野生型突变型 100bp 50bp■ (bp指核苷酸对) 2.【解析】(1)在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前应检验 两种植物的原生质体是否具备形成再生植株的能力。为了便 于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融 合，若甲植物原生质体来自幼苗的根，则乙植物原生质体应来 自幼苗的叶片（注：叶片细胞中含有叶绿体，叶片细胞的原生 质体呈绿色)。(2)植物细胞壁的主要成分是纤雏素和果胶。！ 由于甲原生质体提供的是核基因，因此需使其细胞质失活：乙 原生质体提供的是细胞质基因，因此需使其细胞核失活。可！ 采用血细胞计数板对原生质体进行计数。加入过量的培养基 可降低PEG浓度，使原生质体融合终止。(3)由于将融合原： 生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合后，在凝固前倒入培养基，！ 融合原生质体分散固定在平板中，可独立生长、分裂形成愈伤 组织，因此同一块愈伤组织所有细胞来源于一个融合原生质！ 体。综合分析可知，甲原生质体的细胞质失活，乙原生质体的！ 细胞核失活，因此，未发生融合的甲原生质体、未发生融合的！ 乙原生质体，以及同种龄合（甲原生质你与甲原生质休融合 乙原生质体与乙原生质体融合)的原生质体无法生长，分裂，！ A、B项符合题意：杂种细胞的结构和功能完整，能够进行生 长、分裂形成愈伤组织，D项符合题意。(4)愈伤组织经再分！ 化能形成胚状体或芽。胚状体能长出根、芽，直接发育成再生 植株。(5)提取纯化再生植株的总DNA,可作为PCR扩增的1 模板。扩增序列a时所用的特异性引物是M1和M2。PCR! 的扩增产物常用凝胶电泳进行鉴定。若在2个PCR扩增体· 系中能分别扩增出a序列和b序列，则将2个PCR扩增体系： 扩增的产物进行凝胶电泳后，可观察到1个凝胶中含a序列！ 对应的1个条带，1个凝胶中含b序列对应的1个条带。 【答案】(1)再生植株叶片(2)纤维素细胞质、细胞核 血细胞计数板终止原生质体融合(3)一个融合原生质体 ABD(4)再分化根和芽(5)模板M1、M2电泳1 专题十九细胞工程 考向一 1.A2.B3.A4.A5.C6.C7.D8.A9.B10.C 11.B12.A13.BD14.D15.C16.C17.A 18.【解折】()芜培养物通常是由一个微生物生长，警殖所形成 的单菌落，根据题中信息“从豆科植物……获得纯培养物”可！ 知，此实验中的纯培养物是根痛茵单菌落。(2)植物组织培养 的简单过程：取外植体并消毒→脱分化（也叫去分化）形成愈！ 伤组织→再分化形成组织或器官→发育成一株完整的植林。！ 植物细胞全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整！ 有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。植物细胞的全： 能性是植物组织培养的理论基础。(3)若接种到试管苗上的 根瘤菌具有固氮作用，剥该试管苗可以在无氮的培养液中正！ 常生长。(4)微生物菌肥的作用有提高作物的产量，提高土壤· 肥力，改善土壤结构等。 【答案】(1)根瘤菌单菌落(2)脱分化再分化细胞经分！ 裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞 的潜能和特性(3)无氮接种到试管苗上的根瘤菌具有固！ 氮作用(4)增加土壤肥力，改善土壤结构，提高作物的产量： (答出2点即可) 考向二 1.C2.B3.C4.B5.B6.C7.ABD8.D9.D。10.D 11.【解析】(1)一殷认为，已免疫的脾细胞（含浆细胞）中已含足1 够数量的能产生特异性抗体的效应B细胞，不需要通过原代 培养扩大细胞数量。聚乙二醇(PEG)分子能改变膜结构，使· 两细胞接触，点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细 胞接触，点处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作！ 用，使细胞融合。(2)淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合后，有的细1 胞未融合，有的细胞已融合：融合细胞中有的是具有同种核的！ 细胞，有的是具有不同种核的细胞（杂交瘤细胞）。使用远择 培养基的目的是筛选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞：在该： 22 培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞的 生长受到抑制，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)将抗体 与该病毒外壳蛋白进行杂交的目的是从杂交瘤细胞中筛远出 能分泌特定抗体的杂交瘤细胞。(4)在核酸中，一个核苷酸的 3'端羟基与另一个核苷酸的5'端磷酸基团发生脱水缩合，形 成磷酸二酯键。故④符合题意。 【答案】(1)不需要改变细胞膜结构（使两细胞接触点处质膜 的脂类分子发生疏散和重组)(2)未融合的（亲本）细胞融合 的具有同种核的细胞(3)筛选能分泌与该病毒外壳蛋白A特 异性结合的抗体的杂交瘤细胞(4)④单克隆抗体的制备、基因 工程 2.【解析】(1)通过抑制或减弱一开始的变化，雏持物质含量稳定， 这种调节方式属于负反馈调节。人为添加一定浓度的赖氨酸类 似物，使不抗赖氨酸类似物的细胞死亡，而抗赖氨酸类似物的细 胞突变体能够存活。(2)①可通过检索生物信息数据库（或遗传 序列数据库)获取目的基因的编码序列。②脂质体由磷脂等构 成，脂质体可以与牛胚胎成纤维细胞的细胞膜发生融合，从而使 表达载体进入细胞，最终进入细胞核，发生转化。③卵母细胞去 核后作为受体细胞。经核移植的重组细胞需利用电刺激进行胚 激活。④将重组细胞体外培养至早期爱胚后，可移植至代孕母牛 子宫角。⑤DNA水平检测的目的是，检测转基因牛中是否含有 目的基因。分析可知，可以转基因牛耳组织细胞作为阳性对照。 进行RNA水平检测时，需利用DNA酶(DNA水解酶)处理总 RNA,以去除DNA污染。RNA经逆转录形成的cDNA可作为 PCR扩增的模板，通过PCR技术可获取大量的目的基因片段。 目的基因只在转基因牛乳腺细胞中表达的原因是在构建基因表 达载体时，将目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连 接，构建出了乳腺专一表达载体，该表达载体中的特异性启动子 使目的基因仅在乳腺细胞中表达，而不会在其他细胞中表达。 【答案】(1)负反馈调节一定浓度的赖氨酸类似物(2)①生 物信息数据库/遗传序列数据库②融合③受体细胞激活 ④早期囊胚⑤转基因牛耳组织细胞DNA酶模板构建的 表达载体含乳腺特异性启动子，使目的基因仅在乳腺细胞中表达 专题二十胚胎工程 考向 1.B2.A3.B4.C5.C6.B7.C8.D9.A10.D 11.C12.D13.C 4.【解析】(1)精液可以冷冻保存，使用前再将特液解冻离心分 离。刚排出的特子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后 才能受精，故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采 用的体外获能方法有培养法和化学诱导法，化学诱导法是将 特子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化 学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂 中期(MⅡ中期)才能具备与精子受粉的能力。 (2)进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机盐、激素、血清 外，还含有雏生素、氨基酸、核苷酸等。 (3)由题千信息“以…非繁殖期受体母羊为材料”可知，在进行 胚胎移植前，需对母羊进行发情处理，主要的操作步骤见答案。 【答案】(1)液氮冷冻保存刚排出的精子必须在雌性生殖 道内发生相应生理变化后才能受精肝素或钙离子载体 A23187MⅡ中期(2)维生素、氨基酸、核苷酸(3)第一步 对非繁殖期的受体母羊用激素处理，使其发情：第二步，将质 量好的囊胚移植到受体母羊的子宫：第三步，一段时间后，对 受体母羊进行是否妊娠的检查；第四步，一段时间后，受体母 羊生产胚胎移植的小羊。