专题十八 基因工程与蛋白质工程-【创新大课堂】2026年高考生物五年真题分类汇编168优化重组卷

专题十八 基因工 考向一 基因工程的基本工具及操作程序 1.(2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为 致病基因a及HindⅢ切割位点。AluI限制 酶识别序列及切割位点为AGCT3 3TCGA5,下列相关 T 叙述正确的有 HindⅢ HindⅢ HindⅢ A基因流烈 AAGCTT 200 bpGAA --400bp Hindli 突变！ Hind llⅢ 堂 a基因-200bp… .---…400bp A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 p B.用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末 那 端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片 段大小一致 D.产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限 制酶开展酶切鉴定 2.(2025·黑吉辽蒙卷)下列关于耐高温的DNA 聚合酶的叙述正确的是 ( 带 A.基本单位是脱氧核苷酸 ; B.在细胞内或细胞外均可发挥作用 C.当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化 反应 D.为维持较高活性，适宜在70~75℃下保存 3.(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是 超 A.配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖 核苷酸溶液作为扩增原料 逊 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行 电泳后，在紫外灯下观察结果 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精 。 蝶 灯火焰旁倒平板 D.将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基 郑 上划线培养，获得单菌落 龄 4.(2024·山东卷)制备荧光标记的DNA探针时， 需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠 问 杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱 氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光 标记的dATP)的反应管①~④中，分别加入如 表所示的适量单链DNA。已知形成的双链： 15 程与蛋白质工程 DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的 温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双 链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探 针的反应管有 反应管 加入的单链DNA 5'-GCCGATCTTTATA-3' ① 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' 5'-ATTTCCCGAT℃CG-3' ③ 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5-TTCACTGGCCAGT-3 A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 5.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定” 实验，下列说法正确的是 () A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分 摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后 可能变蓝的干扰 6.(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR产物的实验，下列叙述正确的是( A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示 DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极 迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被 检测出来 7.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶（酶1、酶 2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基 因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点） 和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。 限制酶的切割位点如图所示。 5-GAATTC-3'5'-GGATCC-3' 3'-CTTAAG-53'-CCTAGG-5' 酶3酶2酶1 酶1 酶2 抗生素 酶4 5'-CCCGGG-3'5-AGATCT-3' 抗性基因 3-GGGCCC-53'-TCTAGA-5' 酶3 酶4 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高： 的是 ( A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用： T4DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E coli DNA连接酶连接 8.(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的 基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列： 叙述错误的是 A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 9.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)、四环素抗性基因(Tet)作为标记基 因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建： 基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。 下列叙述错误的是 HindⅢ Pou I Sph I Sca I -Sal I AmpR 质粒 A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可！ 能不同 B.若用PwuI酶切，在含Tet(四环素)培养基 中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用ShI酶切，可通过DNA凝胶电泳技 术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用ShI酶切，携带目的基因的受体菌在 含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能 形成菌落 10.(2023·浙江6月)紫外线引发的DNA损伤， 可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机 制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现发 炎等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展 成皮肤癌。下列叙述错误的是 ) 158 紫外线 5'TTTTTTTTTTTT113 3'L⊥11 11111LL15” ,损伤 5TTTTTT TTI3 3111111111111115 酶 切口 入 切口、酶 5'TTTTTT TTTTT13 3'LL⊥LLLLL1LLLL15' 5'TT 缺口 T13 3'L⊥LLL5' 修复完成 5T13 3⊥⊥⊥LL⊥⊥L111115 A.修复过程需要限制酶和DNA聚合酶 B.填补缺口时，新链合成以5到3'的方向进行 C.DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行 修复，对细胞最有利 D.随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌 的原因，可用突变累积解释 1.(2023·浙江6月)某研究小组利用转基因技 术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型 小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到 能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各 1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子 小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的 基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩 增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 插入前5启动子 Gata3 编码区 非编码区3 3' -5 Gata3 GEP 插入后5启动子区 编码区 引物1 编码区非编码区3 3 -5 引物3引物2 图甲 1234 大片段 小片段 图乙 下列叙述正确的是 ) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因 表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP 蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠 是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地 区分杂合子和纯合子 12.(2021·山东)粗提取DNA时，向鸡血细胞液 中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤 液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液 中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量 较高的白色丝状物的处理方式是 ( A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%： 的冷却的酒精 D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→凋 节滤液中NaCl浓度至0.14mol/I 13.(2021·湖北卷)限制性内切酶EcoR I识别并 切割CG-双链DNA,用EcoR I完全酶 切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的： 平均长度（碱基对）约为 ( A.6 B.250 C.4000 D.24000 14.(2021·湖北)某实验利用PCR技术获取目的 基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与 模板完全配对)外，还有2条非特异条带（引物： 和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异 条带的产生，以下措施中有效的是 ( A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 15.(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一 种机制。通过对Tⅰ质粒的改造，利用农杆菌 转化法将Ti质粒上的T一DNA随机整合到 小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因 的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变 体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息 已知。 T质粒部分序列及限制晦酶切位点 LB Xba I Pst I Sma I BamH I BamH I RB Kan 动厅 5' 终止子 目的基因信息 5' 抗除草剂基因X 3 3'7 转录的模板链sma 20bp 550bp Se】 Smal 159 限制酶 酶切位点 Sma I 5'-CCCGGG-3' Pst I 5'-CTGCAG-3" Xba I 5'-TCTAGA-3' BumHI 5'-GGATCC-3 Spe I 5'-ACTAGT-3' 注：IB/RB表示T-DNA的边界序列；KanF表 示卡那霉素抗性基因；bp表示碱基对 甲Tⅰ质粒与抗除草剂基因信息 (1)Tⅰ质粒上与其在农杆菌中的复制能力相 关的结构为 。选用图甲中的SmaI 对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择 SmaI和 对Tⅰ质粒进行完全酶切， 将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 利用DNA连接酶将酶切后的包含 抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的T质 粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经 卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结 果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似 为 bp,则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由T一DNA插入 小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组 DNA,经酶切后产生含有T一DNA的基因组 片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR 难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制 酶，且T一DNA中应不含该酶的酶切位点。 需首先将图乙的片段 ,才能利用引物 P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未 知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断 出2条片段的未知序列是否属于同一个基因 的操作为 (填“琼脂糖凝胶电泳”或 “测序和序列比对”)。 P2 末知序列T-DNA未知序列 PI 注：P1、P2表示引物 乙基因组DNA酶切后含T一DNA的片段 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基 因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生 型基因， (填“能”或“不能”)确定该植 株的表型为野生型。 6.(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物， 提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区 域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因 的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入 栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答 下列问题。 BamH I EcoR I XBa I 5 13 3 限制酶 5终止子启动子 切割位点， 启动子 T-DNA 抗性基因2 终止子 载体 抗性基因 复制原点 S基因转录方向 XBa I Nde I BamH I S基因 73 限制酶 识别序列及切割位点 5-A'GATCT-3' BglⅡ 3-TCTAGA-5' 5-CA'TATG-3' Nde I 3-GTATAC-5' 5'-CTCG AG-3' XhoI 3'-GAGCTAC-5 5-GAATTC-3' EcoRI 3-CTTAAG-5' 5GGATCC-3' BamHI 3'-CCTAGG-5 Sal I 5'-G￥TCGAC-3 3-CAGCTAG5 5'-TCTAGA-3' Xba I 3-AGATCT-5' (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引 物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温 的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割： 位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S 基因时需在引物的 (填“5′端”或“3 端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上 游引物应添加的碱基序列是5' -3′， 切割载体时应选用的两种限制酶是 PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后， 经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导 入农杆菌。 160 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈 伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组 织细胞，将S基因整合到 ,抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。 该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育 可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 7.(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术 在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的 每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中 DNA双链打开成为单链的阶段是 引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点， 限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒 时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶 切的优点体现在 (答出2点即可)：使用酶c单酶切构建重组质 粒时宜选用的连接酶是 AGATCT AAGCTT GATATC TCTAGA TTCGAA CTATAG 酶a 酶b 酶c (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受 体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 若要验证转化的大肠杆 菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结 果是 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与 模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGAT GA,编码从GGG开始，部分密码子见表。若 第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序 列是 氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC CCA 脯氨酸 ccC 亮氨酸 CUG GGC 甘氨酸 GGG 终止 UGA 五年真题分类汇编·生物学 学校 班级 学号 姓名 密 禁 答 深用电 /联喜集URC·BOOG FI 姚石程。各用华品棉合合沙际施防金RLAG PA/S地A洲UC移绵房区中际程合工发分 BGALP.华：石出玻达磊在语合推)((3 FLAG 请k糖各1: 华韩 EcoR (提3精m双15。)。 Ser Cys Ala DNAATG GAC.AAG GCG AAT TCA TGT GCA...GGA TCC BamH 熟件可”与绿型下LAG的联光观一个限合 (2)PC交U塔有国航卫县国标障材接帮福 P.P团业乐院县高定华人县克A.FI 18.(2022.江林养)执新社际型的庄川格电港工！ Gly Ser 四 ①②③④⑤注：“+表示有 FLAG-P-++- FLAG-PA - -++ “_”表示无 药物A +-+ UBC +++++ 图乙 ①②③④⑤ UBC一 图丙 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机 理是 9.(2022·广东卷)“绿水透迤去，青山相向开”大 力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于 某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工 业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污 染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮， 构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 辅酶A 乙酰乙酸 硫解酶 转移酶 脱羧酸 ThlA CtfAB CO2+H→2×乙酸CoA →乙酰 乙酰Adc,丙 乙酸CoA 乙酸 梭菌细胞 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图） 设计一对 ,利用PCR技术，在优化反 应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用 于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后 提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终 止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基 因的作用是 终止子的作用是 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶 蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因 可能是 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化 菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实 现了 ,体现了循环经济特 点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好的社会 效益。 20.(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病 原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原 菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结 果；②从病人组织样本中提取DNA;③利用 PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。 回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺！ 序应该是 (用数字序号表示) (2)操作③中使用的酶是 。PCR反 应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引 物应该能与 特异性结合， (4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指 该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 21.(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予 生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要 的生物产品。在此过程中需要使用多种工具 酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如： 图所示。 GAATTC CCCGGG CTGCAG GATATC CTTAAG GGGCCC GACGTC CTATAG 限制酶：EcoR I Sma I PstI EcoR V 回答下列问题： ! (I)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接 酶和T4DNA连接酶。上图中 酶 切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接 酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA 连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载 体片段之间形成的化学键是 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有 些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以 保证质粒在受体细胞中能 ;质粒 DNA分子上有 ,便于外 源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因 (如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选 出含质粒载体的宿主细胞，方法是 (4)表达载体含有启动子，启动子是指 162 2.(2021·海南)CRISPR/Cas9是一种高效的基 因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一 把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引 导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入 新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工 作原理如图所示。 (RISPR②导人受 CRISPR Cas9八重组质粒 休细胞 ERNA 表达 父转录 基因 编码 ①构建重序列 蛋智运弟成议合体RNA 组质粒 ④sgRNA引导识别 目标DNA序列 基因组DNAM5Cas9蛋白 进行切割 敲除目标基因 或插人新的基因 回答下列问题。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质 粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理 过的质粒上，插入时所需要的酶是 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞 的方法是 (3)过程③~⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成 复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目 标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的 原则是 。】 随后，Cas9蛋白 可切割 序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一 个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判 断基因敲除是否成功所采用的方法是 ,基因敲除成功的判断依据是 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。 科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9 质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌 细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因 组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的 工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在 受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组 DNA的编辑过程： 23.(2021·天津)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但 耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力 较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸 脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产 生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发 酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的 关键条件。 含有乳酸菌LDH基因的DNA片段 GTC 引物2 5 葡萄糖 3 工二3 引物 乳酸脱氢酶编码序列 丙酮酸 原核生物 酿酒酵母 丙酮酸脱羟酶 复制原点 基因终止子 乳酸脱氢酶 Xba I 乙醛 真核生物 复制原点 BamH I 乙醇脱氢酶 质粒 酿酒酵母 /基因启动子 乳酸 乙醇 尿嘧啶 合成酶基内 氨卡青霉素 乳酸菌 酿酒酵母 抗性基因 图1 图2 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧 发酵的场所应为 (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下： ①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。为使 扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原 核生物偏好的GTG,转变为真核生物偏好的 ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒， 需设计引物1和2。其中引物1的5'端序列应 考虑 和 ②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠 杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上 有 ,所以能在大肠杆菌中扩增。 启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系 统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱 氢酶编码序列 (能/不能)在大肠 杆菌中高效表达。 ③提取重组质粒并转人不能合成尿嘧啶的酿 酒酵母菌株，在 的固体培养基上 筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 (3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母 进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。 若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合 理的是 (单选)。 A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌IDH基因自身的启动子 C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种 24.(2021·辽宁)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖 的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制 人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据 库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称 phb2基因)，大小为0.9kb(1kb=1000碱基 对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列 问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的 总RNA,再经 过程得到cDNA,将 其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性 引物来扩增目的基因。 163 (2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶 的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基 因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序 列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端 分别引入 和 两种不同限制 酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基 因和载体进行连接时，可选用 (填 “E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。 HindⅢ PuⅡ BamH I 启动子 Kpn I 氨苄青霉素 -EcoR I 抗性基因终止子、 复制原点 Kpn I 图1 相关限制酶的识别序列及切割位点 识别序列及切 识别序列及切 名称 割位点 名称 割位点 AAGCTT GAATTC HidⅢl TTCGAA EcoR I CTTAAG 个 CAGCTG CTGCAG PvuⅡ Pst I GTCGAC GACGTC 个 GGTACC GGATCC Kpn I BamH I CCATGG CCTAGG 个 注：箭头表示切割位点 (3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其 处于 的生理状态，以提高转化效率。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素 的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编 号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用 的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分 离，结果如图2， 号菌落的质粒很可 能是含目的基因的重组质粒。 M123 点样孔 4k b 2k b Ik b (0.2kb 图2 注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb 的DNA分子条带未出现在图中 (5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加 到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检 测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的 细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制 人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞 在细胞周期的 (填“G1”或“S”或“G2/ M”)期。 M期（分裂期） 翩G期Zs期☐GM期 50 G期 G期 20 10 s期 对照 PHB2 图3 图4 注：间期包括G期、S期和G期 注：G/M表示G,和M 25.(2021·福建)微生物吸附是重金属废水的处 理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存 在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金 属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入 大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计 了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT 基因。已知A位点和B位点分别是起始密码 子和终止密码子对应的基因位置。选用的引 物组合应为 甲 引物31引物4 5 引物1引物2 MT eDNA A位，点 B位点 启动子 Xho I Xho I 复制原点 EcoR V复制原点 Kpn I -Pst I Pst I 载体P 载体矩 Sma I 终止子 抗性基因 抗性基因 TCGAG --GATATC- -CTGCAG -CCCGGG -GGTAC GAGCTC -CTATAG- GACGTC- -GGGCCC- CCATGG Xho I EcoR V Smal "Kpn I 图1 (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增 出的MT基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间 载体P将MT基因接入载体E。载体P和载 体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙 所示。 ①选用 酶将载体P切开，再用 (填“T4DNA或“E.coli81DNA”)连接 酶将MT基因与载体P相连，构成重组载 体P ②载体P'不具有表达MT基因的 和 ,选用 酶组合对载体 P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载 体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合 164 物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出 MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。 结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废 水中重金属的MT工程菌，理由是 65 43 1 0 大肠杆菌MT工程菌 图2 26.(2021·山东)人类Y基因启动子上游的调控 序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结 合BCL11A蛋白后，Y基因的表达被抑制。通 过改变该结合位点的序列，解除对Y基因表达 的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治 疗。科研人员扩增了Y基因上游不同长度的 片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转 化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点 的具体位置。相关信息如图所示。 调控序列及启动子 R y基因 T XhoI F7 Mun I Sall终止子 尚子 荧光蛋白基因 R,BCLI1A基因 T7 工%1 Nhe I EcoR I Mun I EcoR I Xho I 终止子 注： F1-F7,R:引物 P:雌激素诱导下发挥 作用的启动子 限制酶识别序列及切割位点： Mun I CAATTG Xho I:CTCGAG EcoR I GAATTC Sal I:GTCGAC Nhe I:GCTAGC (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光 蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别 序列。据图可知，在F1~F7末端添加的序列 所对应的限制酶是 ,在R末 端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建 完成的整个过程共需要 种酶。 (2)将构建的载体导人除去BCL11A基因的受 体细胞，成功转化后，含F1~F6与R扩增产 物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与 R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1一F4 与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。 若Y基因上游调控序列上与引物序列所对应 的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列， 据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是 27.(2021·江苏)某小组为研究真菌基因m的功 能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质 粒。请结合实验流程回答下列问题： 叔 经S单酶切 /物PI 基因 5,PCR扩增3 我体A启动学 g序列 泽加同源字列的m 混合处理 R客 动子 序列 R43:膝母临达标基因，缺失该 A-m结合体 岸列 入大杆南 咖 动子 ag序列 导入酵母 整的蛋白M (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞 ,经逆转录获得cD NA,进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物 ! P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序 列，否则将导致 量 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是： 先将除Tag DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成 分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直 接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有 和 A.Taq酶最适催化温度范围为50~60℃ 赵 B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应 起始时引物错配形成的产物 C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端 泄 延伸 D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了 Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 蝶 ①将SmaI切开的载体A与添加同源序列的 ! m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然 尔 后降温以促进 ,形成A-m 结合体。将Am结合体导人大肠杆菌，利用 大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶 问 等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A-m仍能被Sma 切开，则SmaI的酶切位点可能在 16 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺 失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-,然 后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的 菌株，其机理是 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋 白中含tag标签，说明 ,后续实验可借助tag标签 进行蛋白M的分离纯化。 考向二基因工程的应用及蛋白质工程 1.(2025·浙江1月)科学家将拟南芥的细胞分裂 素氧化酶基因ACKX1和AICK X2分别导人 野生型烟草(WT)中，获得两种转基因烟草Y1 和Y2,培养并测定相关指标，结果如表所示。 下列叙述正确的是 ( 主根长 侧根 不定根 叶片 相对叶表 植株 度(mm) 数（条） 数（条） 数（片） 面积(%) WT 32.0 2.0 2.1 19.0 100 YI 50.0 6.6 3.5 8.2 13.5 Y2 52.0 5.6 3.5 12.0 23.3 注：表内数据为平均值 A.与WT相比，Y2光合总面积增加 B.Y1和Y2的细胞分裂素含量相同且低于WT C.若对Y1施加细胞分裂素类似物，叶片数会 增加 D.若对Y2施加细胞分裂素类似物，侧根和不 定根数会增加 2.(2025·安徽卷)质粒K中含有B-半乳糖苷酶基 因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶 可分解X-gal,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌 落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采 用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆 菌中的高效表达。下列叙述错误的是() 启动子本 表达活性 BamH I B半乳糖 蓝色菌落 质粒K 导入 O 苷酶 ⑧ B-半乳糖 筛选平板 卡那霉素 苷酶基因 大肠杆菌 (含X-gal和卡那霉素) 抗性基因 A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率， 可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白 色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长 出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质 粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 3.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”： 实验，下列说法错误的是 A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了 防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 4.(2021·辽宁)腈水合酶(N0)广泛应用于环境 保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利 用蛋白质工程技术在N。的α和3亚基之间加 入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶 (N,)。下列有关叙述错误的是 A.N1与N。氨基酸序列的差异是影响其热稳 定性的原因之 B.加人连接肽需要通过改造基因实现 C.获得N1的过程需要进行转录和翻译 D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合， 再置于高温环境 5.(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的 镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子 结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和 黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体， 转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌 并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。 回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核 苷酸中，随着P℃R反应进行，分子数量逐渐减 少的是 和 。模板与引物在 PCR反应的 阶段开始结合。PCR中 使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的 部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP 基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向 以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列， 其中GP1两端应添加 (填两种限制酶) . 的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载 体和目的基因之间形成 键。 载体示意图： Nhe I Sma I EcoR V 启动子SP7 终止子 Xba I EcoR I 拟构建载体的部分结构示意图： 启动子SP7 CADR GPI YFP终止子 限制酶识别序列及切割位点： Nhe 1:GCTAGC EeR I:GAATTC CGATCG CTTAAG 1 Xba I:TCTAGA EcoR V:GATATC Sma I:CCCGGG AGATCT CTATAG GGGCCO 图1 16 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现 为 ,初步表明融合蛋白表达成 功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子 的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细 胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ,则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子 浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结 果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子 的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能 是 。 240μmol·L1镉离子浓度 下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑 制的原因可能是 1.01 口野生型衣藻 口转基因衣藻 5 0 160 200 240 镉离子浓度(umol·L) 图2 注：镉离子对渗透压的影响忽略不计 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加 化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的 两个特性是 和 。(填标号) ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可 吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸 附的镉可沿食物链传递 6.(2025·湖北卷)治疗疟疾的药物青蒿素主要从 植物黄花蒿中提取，但含量低。为培育青蒿素 含量高的黄花蒿新品种，科研工作者开展了相 关研究，发现青蒿素主要在叶片的腺毛中合成 与积累，并受到如水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯 (MeJA)等植物激素的调节。研究表明，SA和 MeJA通过调控miR160的表达量(miR160是 一种微小RNA,能与靶mRNA结合，引起后者 降解)，影响黄花蒿腺毛密度和青蒿素含量。 miR160的一种靶mRNA编码ARF1蛋白，该(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A菌株 仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氯且被石！ 油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株在缺少氯源的 培养基Ⅱ上也能生长良好并降解石油，但B菌株在平板Ⅱ上· 无透明圈形成，不能降解石油。 【答案】(1)石油DNA、RNA、蛋白质(2)N。·2m(3)分 别向培养基工、Ⅱ的甲、乙两孔内注人等量且适量同浓度的 A、B菌液，一段时间后观察菌液周围培养基透明圈的大小。 (4)AA菌株在缺少氮源的培养基Ⅱ上也能生长良好并降解 石油，但B菌株在平板Ⅱ上无透明圈形成，不能降解石油 13.【解析】(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可 以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在 固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。！ 分析图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，！ 可推知拟杆菌新菌株在以纤雏素为碳源时生长状况最好。 (2)培养基的营养成分不能满足部分微生物的营养需求；培养！ 条件不利于微生物繁殖：与其他微生物之间存在互利共生关 系，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微！ 生物不能被分离筛选出来。 (3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将动植！ 物遗体残骸中的有机物分解为无机物，归还到无机环境中，有 利于碳循环的顺利进行。 (4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种， 多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证 拟杆菌的正常生命活动所需。 【答案】(1)高压蒸汽灭菌平板划线纤维素(2)培养基} 的营养成分不能满足部分微生物的营养需求；培养条件不利： 于微生物繁殖：与其他微生物之间存在互利共生关系(3)能 将动植物遗体残骸中的有机物分解成无机物(4)耐低温 专题十八 基因工程与蛋白质工程 考向一 1.【命题点】限制酶 题图解读 HindⅢ HindⅢ HindⅢ A基供盈瓷p AAGCTT AAGCTT序 …40bp“TTCG 片段1 片段2 Hind Ill HindⅢ a基因C·2mpCC0p器 AAGCTG AAGCTTB' 片段1 由上图可知，产前诊断时，可用ndⅢ开最酶切鉴定，D正确。 a基因2mpC…mp图 片段1 片段2 用两种限制酶分别酶切台基因后，产生的片段大小不一致，！ C错误。 BD[分析题图可知，基因A突变为致病基因a是T一A被！ G一C替换造成的，A错误：用限制酶Hi1dⅢ酶切A基因后会 形成黏性末端，用限制酶AluI酶切A基因后，形成的是平末！ 端（常考点：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧切开DNA分 子，产生的是黏性末端：限制酶在它识别序列的中心轴线处切！ 开DNA分子，产生的是平末端)，B正确。] 2.【命题点】酶的本质与作用 B[耐高温的DNA聚合酶的化学本质是蛋白质，基本单位是！ 氨基酸，A错误；酶既可以在细胞内发挥作用，也可以在细胞外 发挥作用，B正确；DNA复制时需要模板、能量、原料和酶，而！ 酶发挥作用需要适宜的温度和H,因此只有模板DNA和脱氧！ 核苷酸存在时并不一定能催化反应，C错误：高温会破坏酶的· 空间结构使酶失活，低温条件下酶的活性受到抑制，但空间结 构稳定，因此酶适宜在低温条件下保存，D错误。] 易错警示过酸、过碱、高温等都会破坏酶的空间结构，使酶永！ 久失活，而低温时酶活性很低，但酶的空间结构稳定，在适宜的} 温度下酶活性会升高。 3.B[生物实验配制PCR反应体系时，应加入4种脱氧核糖！ 核苷酸溶液作为扩增原料，A错误：凝胶中的DNA分子通过染！ 26 色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，故B正确 配制的酵母培养基先进行高压蒸汽灭菌处理，然后再倒平板，C 错误；烧红的接种环需在酒精灯火焰旁冷却后才能蘸取菌液， 否则会杀死菌种，D错误。] L.D[PCR分析反应管①~④中分别加入的适量单链DNA可 知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列(10个连续 碱基对)，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行 DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链 DNA分子内具有互补的序列，由于在本实验的温度条件下不 能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故该条单链DNA 分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于 DNA合成的序列(5'一TCT一3')中不含碱基A,不能得到带有 荧光标记的DNA探针：③中两条单链DNA分子之间具有互补 的序列(10个连续碱基对)，且双链DNA区之外的5'端有凸出 的碱基（含碱基T),因此进行DNA合成能得到带有荧光标记 的DNA探针：④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，结 合题中信息知该条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可 以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的5'端有凸出的碱基 (含碱基T),因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA 探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 ③④，故答案选D。] 5.A[DNA的粗提取和鉴定实验研磨后，可以将研磨液过滤 到烧杯中，在4℃冰箱中放置儿分钟后，再取上清液，可以不使 用离心机，A正确，B错误。鉴定过程中的沸水浴加热可使 DNA双螺旋结构发生改变，C错误。该实验中，为排除二苯胺 加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加 DNA的对照组，D错误。] 5.A[琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物应根据待分离DNA片 段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积 比为0.8%一1.2%的琼脂糖溶液，A正确：凝胶载样缓冲液中 指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具 体位置，B错误：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓 度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA 片段（带负电）越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误：凝 胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下 被检测出来，D错误。] 7.C[只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基 因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误； 用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产 生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和 酶2切割后，可使用T4DNA连接酶连接，使目的基因定向插 到质粒中，C正确：酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易 导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向 连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。] 8.D[DNA粗提取与鉴定实验的基本过程是：裂解，分离、沉淀， 鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正 确。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原 理，可以初步分离DNA与蛋白质等，DNA分离过程中混合物 中的多糖、蛋白质等可被去除，B正确。DNA在不同浓度的 NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCI溶液的浓度去除杂 质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确。进行DNA鉴定 时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜 色变化，D错误。门 D[若用HidⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用 DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向 连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可 能不同，A正确；若用PI酶切，会破坏氨苄青露素抗性基 因，在含Tt(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的 重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet (四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确：若用 ShI酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此 可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正 确：若用SphI酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性 基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Ap(氨苄青 舞素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tt(四环素)的培养基！ 中形成菌落，D错误。] 10.C[修复过程中，限制酶识别特定的双链DNA序列并使 DNA在特定位置断裂，DNA聚合酶以DNA链为模板合成新 链，A正确；填补缺口时，新链合成与DNA复制相似，以5'到 3'的方向进行，B正确：如果DNA有害损伤发生后，在细胞增1 殖后进行修复，可能有更多的细胞含有损伤的DNA,C错误： XP患者的核苷酸切除修复系统存在缺陷，不能修复紫外线引！ 发的DNA损伤，随年龄增长，XP患者细胞积累的损伤DNA, 增多，进而发生皮肤癌，这可用突变累积解释，D正确。」 11.B[由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子， 且由题千可知两基因能正常表达出相关登白质，A错误；由于： 启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gat3基因，i 再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的！ 5'→3'，因此翻译时先合成Gta3蛋白，再合成GFP蛋白，B 正确：由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段 不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3一GFP基！ 因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误：若用引物1和引物3进 行PCR,杂合子和Gata3一GFP基因纯合子均能扩出条带，仅1 有Gta3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子， D错误。] 12.A[木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶 具有专一性，不能水解DNA,过滤后在得到的滤液中加入特· 定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正！ 确；37~40℃的水浴箱中保温10一15分钟不能去除滤液中的} 杂质，应该放在6075℃的水浴箱中保温10~15分钟，使蛋1 白质变性析出，B错误：与滤液体积相等的、体积分数为95%· 的冷却的酒精是题千中的“特定试剂”，C错误：加入NaC1调节！ 浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaC1浓度至0.14mol/L, DNA在0.14mol/L的NaCI溶液中溶解度小，DNA析出，不1 会进入滤液中，D错误。] 13.C[据图可知，EcoR I的酶切位，点有6个碱基对，由于DNA分子{ 的碱基组成为A、T、G、C,则某一位点出现该序列的概率为1/4× 1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096,即4096≈4000个碱基对· 可能出现一个限制酶EcoR I的酶切位，点，故理论上得到DNA片！ 段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。] 14.D[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减· 少非特异性条带，A错误：延长热变性的时间和延长延伸的时！ 间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不 能有效减少反应中非特异性条带，B、C错误：非特异性产物增· 加的原因可能是复性的温度过低会造成引物与模板的结合位： ,点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条！ 带的产生，D正确。] 15.【命题点】基因工程及其应用 【解析】(1)Ti质粒含有复制原，点，使其在农杆菌细胞中能进！ 行自我复制。质粒上含有的酶切位点有XbaI、PstI、SmaI 和BamHI,BamHI酶切会破坏质粒上的终止子，故不能选i 择BamHI对质粒进行酶切。由于目的基因应插入在启动子： 和终止子之间，所以应选择XbaI和SmaI(或PstI和Sna! I)对Ti质粒进行完全酶切。由于抗除草剂基因X使用Sa I对其进行完全酶切，两端均为平末端，为构建基因表达载· 体，Ti质粒被XbaI或PstI酶切产生的黏性末端需要被补！ 平，如图表示XbI或PstI酶切产生的黏性末端： Pst I :5-CTGCA 3'-G : Xba I:5-T 3-AGATC 由上图可知，只有X加I酶切产生的黏性末端能被补平（关键！ 点：DNA链的延伸方向)，故应选择XbaI和SmaI对Ti质粒！ 进行完全酶切。DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA1 链的3'端，因此，将黏性末端补平时使用的酶是DNA聚合酶。 根据抗除草剂基因X的转录方向，构建基因表达载体的正向！ 连接和反向连接的示意图如下： 265 正向连接： SmaI 5LB 启动子 抗除草剂 终止子 3' 基因X 5 200bp 550bp Spe l 较短条带，其余部分为较长条带 反向连接： SmaI 5'LB" RB3' 启动子 抗除草剂 基因X 终止子 3' 5 550bp 200 bp Spe I 较短条带，其余部分为较长条带 由上图可推知，应选择限制酶SmaI和SpeI对重组质粒进 行酶切并电泳检测。若重组质粒为正向连接，则电泳结果呈 现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp(易错点： 若为反向连接，电泳结果也呈现一长一短2条带，但较短的条 带长度近似为200bp)。 (2)本实验目的为证明这两个突变体是由T一DNA插入小麦 基因组中同一基因导致的。实验步骤：提取基因组DNA,经 酶切后产生含有T一DNA的基因组片段，由于后续PCR难以 扩增大片段DNA,因此，在对基因组DNA酶切过程中，应使 用识别序列为4个碱基对的限制酶（且T一DNA不含该酶的 酶切位点)，因为识别序列越短，基因组DNA可能存在的限制 酶酶切位点越多，获得较短DNA片段的概率越大。分析图 乙，因为引物P1和P2向外侧延伸，利用引物P1和P2扩增未 知序列，应先将该DNA片段连成环状。PCR扩增出未知序 列后，可通过测序和序列比对来判断2条片段的未知序列是 否属于同一个基因，琼脂糖凝胶电泳只可判断2条片段未知 序列的大小，不能确定两者的碱基排列顺序。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转 入突变植株，如果能在突变植株内检测到野生型基因，但由于 不知道该突变是否为显性突变，故不能确定该植株的表型是 否为野生型。 【答案】(1)复制原点Xba I DNA聚合酶SnaI和 SpeI550(2)4连接（或环化）测序和序列比对 (3)不能 6.【命题点】基因工程及其应用 【解析】(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 (4种)脱氧核苷酸、含Mg2十的缓冲液和耐高温的DNA聚合 酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸，DNA聚合酶在 延伸步骤中起作用，即DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的 3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要在引物 的5'端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确 插入，应使用双酶切：载体中含有BamH I、EcoR I和XbaI 的酶切位，点，S基因上含有XbaI、NdeI、BamH I的酶切位 点，为保证S基因结构的完整性，不能在S基因两端添加Xba I、NdeI、BamH I的识别序列；分析表格数据，BglⅡ切割产 生的黏性末端和BamH I切割产生的黏性末端相同，结合S 基因的转录方向和载体上启动子的转录方向可知，应在S基 因上游添加BglⅡ的识别序列，即5一AGATCT-3,下游添 加EoRI的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限制酶 为BamHI和EcoR I。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，农杆 菌能将基因表达载体中的T-DNA转移到愈伤组织细胞的染 色体DNA上。分析载体，TDNA中含有抗性基因2，若 T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上，则该细胞 具有抗性基因2对应的抗性，因此，抗性基因2可用于筛选成 功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培 育可获得抗寒能力显著增加的马铃薯植株。 【答案】(1)脱氧核苷酸延伸(2)5端AGATCT BamHI与EcoR I(3)染色体DNA2再分化 7.基因工程和基因表达 【解析】(1)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需 提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱 氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复送行。扩增的过程是：目的基因DNA! 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列通过氢键结· 合。(2)用酶a单酶切，产生的黏性末端相同，目的基因和载！ 体容易发生自身环化以及目的基因的反向连接：用酶a和酶b 双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反向· 连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率。使用 酶C单酶切只能形成平末端，T4DNA连接酶可以“缝合”双链· DNA片段的平末端。(3)感受态细胞的特，点是能吸收周围环！ 境中DNA分子。欲验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可： 将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因· 的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此为探针，使探！ 针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠 杆菌中含有重组质粒。(4)依据DNA分子模板链和编码链的！ 碱基配对情况、转录过程的碱基配对情况，可推出转录形成的， mRNA上的碱基序列和编码链相近，只存在T和U的差别，： 即正常mRNA碱基序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,编I 码序列缺失第一个核苷酸G后，产生的异常RNA碱基序列· 为GGCCCAAGCUGAGAUGA,对应的密码子依次是GGC! (甘氨酸)、CCA(脯氨酸)、AGC(丝氨酸)、UGA(终止密码 子)，即突变后相应肽链的序列是甘酸一脯氨酸一丝氨酸。 【答案】(1)变性氢键(2)用酶a和酶b双酶切可防止载 体和目的基因自身环化以及目的基因的反向连接，保证目的· 基因和载体正确连接，从而提高重组率T4DNA连接酶 (3)能吸收周围环境中DNA分子将转化的大肠杆菌的基因： 组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性； 同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，！ 如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒（合： 理即可)(4)甘氨酸一脯氨酸一丝氨酸 18.【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互！ 补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两！ 种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合！ 酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的· 基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 (2)据图分析，P基因编码链起始序列“ATGTGCA”中的第一 个碱基A与EoRI识别序列最右侧的两个碱基在转录后编！ 码氨基酸时构成了一个密码子，导致P基因的密码子读取顺 序发生改变，从而导致P基因对应的氨基酸序列与P不同。： 扩增P基因时引物除含有EcoR I识别序列外再添加一个核！ 苷酸，可以使P基因转录形成的RNA正常翻译出正确的氨 基酸序列。 (3)由①②③组结果的差异可以看出，加入药物A后检测出的 UBC与其抗体结合的条带更宽，因此可以推测，药物A的作！ 用是促进UBC与P蛋白的结合：由②④组和③⑤组的比较可！ 以看出，P△不能与UBC结合，由此推测，P△中缺失的特定序 列的作用是与UBC相结合。 (4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAGP的结 合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【答案】(1)两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互 补配对5'端(2)EcoR I的插人导致转录形成的mRNA中 P基因的密码子读取顺序发生改变扩增P基因时引物除含！ 有EcoR I序列外再添加一个核苷酸(3)促进UBC与 FLAG-P的结合与UBC相结合(4)药物A促进UBC与： FLAG P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到： 治疗的目的。 19.【解析】(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据！ 目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结· 合后，Tq酶才能从引物的3'端延伸子链。 (2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于！ 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的！ 细胞筛选出来。 26 (3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用 下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌 的生长，所以会导致生长迟缓。 (4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以 高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了 废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看， 该技术生产丙酮的过程减少了碳排放，有利于减缓温室效应， 并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的 社会效益。 【答案】(1)引物(2)鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来终止转录，使转录在 需要的地方停下来(3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质 和能量(4)废物的资源化减少了碳排放 20.【解析】(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正 确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本 →②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA 片段→①分析PCR扩增结果。 (2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内 DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚 合酶)，PR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中 复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。 (3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用 的引物应该能与两条单链DNA特异性结合 (4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物 体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广 泛地应用于疾病诊断等方面。 【答案】(1)④②③①(2)Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸引物通过碱基互补配对与单链DNA结合(3)两条单 链DNA(4)一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合 成技术 1.【解析】(1)限制酶EcoR I和PstI切割形成的是黏性末 端，限制酶SnaI和EcoR V切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的 黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来 源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率 较低。因此图中EcoR I和PstI切割后的DNA片段（黏性 末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切 割的DNA片段，限制酶SnaI和EcoR V切割后的DNA片 段（平末端）可以用T,DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯锭。 (3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首 先质粒上含有复制原，点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。 质粒DNA分子上有一至多个限制性核酸内切酶的酶切位，点， 便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细 胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基 培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 (4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段 【答案】(1)EcoR I、Pst I EcoR I、PstI、SnaI和 EcoR V(2)磷酸二酯键(3)自我复制限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为 含有质粒载体的宿主细胞(4)RNA聚合酶识别、结合并启 动转录的DNA片段 2.【解析】(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接 酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建 CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的 DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质 粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原 核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感 受态细胞法。(3)根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑 技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA,准确引导 Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助 sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA 分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过 碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定 识别，送而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割！ 目标DNA特定的核苷酸序列。(4)可利用DNA分子杂交技！ 术判断基因敲除是否成功，若不出现杂交带，则说明基因敲除 成功。(5)根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞 内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA,表达的产物是 Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并 与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。 【答案】(1)DNA连接酶(2)感受态细胞法(3)碱基互补 配对原则目标DNA特定的核苷酸序列(4)DNA分子杂： 交技术不出现杂交带(5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体： 细胞内进行转录和表达，转录的产物是SERNA,表达的产物· 是Cs9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别： 并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中： 23.【解析】(1)酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质： 基质。(2)①设计引物1的5'端序列，应考虑将编码起始密码 子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的： ATG,以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双 酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamH I的识别序列。 ②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原· 点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性， 重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上 的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺 乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株 不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶！ 合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。(3)进一步 优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸： 产量，A正确：由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH 基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；敲除酿酒！ 酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸} 产量，C正确：对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现 乳酸菌的高产菌株，D正确。 【答案】(1)细胞质基质(2)①包含BamH I的识别序列 将GTG改为ATG②原核生物复制原点不能③缺失尿！ 嘧啶(3)B 24.【解析】(1)提取该动物肝脏组织的总RNA,可经反转录过！ 程得到cDNA。 (2)根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启！ 动子和终止子之间。从图中看出，两者之间存在三种限制酶： 切，点，但是由于KI在质粒上不止一个酶切位点，所以应： 该选择EcoR I和PⅡ两种不同限制酶的识别序列：根据！ PvⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，1 应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。 (3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收！ 周围环境中DNA分子的生理状态，以提高转化效率。 (4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青素的培养基中，！ 因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用· EcoR I和PuⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质！ 粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9kb,所以！ 对应电泳图是菌落3。 (5)比较图4中G1期和S期细胞减少，而G期细胞数目明显增： 多，说明了G1期和S期细胞可以进入G期，而G期的细胞没有！ 能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G/M期。 【答案】(1)反转录(2)EcoR I PvuⅡT4DNA连接酶 (3)一种能吸收周围环境中DNA分子(4)3(5)G2/M 25.【解析】(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相 尔城基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基 因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，1 故选择引物1和引物4。 (2)①为得到平末端，可用EoRV酶将载体P切开；由于； E.coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶 可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，1 故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重 组载体P'。②载体P'是重组质粒，故不含有表达MT基因的！ 启动子和终止子：为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶： 26 切割两种栽体，据图可知，载体P和载体E均含有Xh0I和 PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切：将目的基因 导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。 (3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属 的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较 高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的 MT工程菌。 【答案】(1)引物1和引物4(2)①EcoR V T4DNA ②启动子终止子XhoI和PsI钙(3)尚未在个体生物学 水平上对T工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 6.【解析】(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指 导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子P的扩增后的产物读 取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中 的R端与荧光登白基因中限制酶MunI识别序列端结合，才 能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。 要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列， 且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩 增后的产物中可能含有Mu1I和XhoI的识别位点，故在引 物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mu1I和XhoI 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR I和限制酶SalI识别 序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MI识别并切割 后的黏性末端与限制酶EoRI识别并切割后的黏性末端相 同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRI,在F1一 F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalI；荧光蛋白基因 中含有限制酶EcoR I的识别位点，故对载体使用限制酶 MunI和XhoI切割。综上所述，对载体使用限制酶MmI 和XhoI切割，对扩增后的产物用限制酶EoRI和限制酶 SlI识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成 重组载体；产物扩增中需要使用Tag酶催化，合成更多的产 物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶， 分别是Tag酶、限制酶EcoRI、限制酶SalI、限制酶MuiI、 限制酶XhoI、DNA连接酶。 (2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的 BCL11A蛋白结合位，点，不会抑制荧光蛋白基因的表达：基因的 表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因 的转录过程：含F1一F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受 体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能 是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的 BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与 BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制：含 F1一F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序 列上：含F5F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此 结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调 控序列上所对应序列之间的区段上。 【答案】(1)Sal I EcoR I6(2)F7与R扩增产物不含 完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)引物F4与F5在调 控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判 断，F1一F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位 于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5~F6与R扩增产物 上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上 游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所 对应序列之间的区段上 7,【解析】(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞 中提取基因n转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒 上看，lag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物 RNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就 断开，则不会对tg序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上 就不含tg标签。③从题千信息可知，“80℃以上再混入酶， 然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范 国为94℃左右，A错误：PCR反应的最初加热过程中，样品温 度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模 板形成非特异性结合，并在Tag DNA聚合酶的作用下延伸，！ 结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性； 热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异： 性，B正确：DNA分子复制具有方向性，都是从5'端向3'端延！ 伸，C正确：Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，} Tag酶更时高温，D错误 (2)①从图上看，载体A只有一个SI的酶切位，点，故被· SaI切开后，载体由环状变为链状DNA,将SaI切开的！ 载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成 黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的的黏 性末端碱基互补配对。将An结合体导入大肠杆菌，利用大· 肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。： ②重组质粒中，载体A被SaI切开的位置已经与基因m相 连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A-: 仍能被SnaI切开，则SnaI的酶切位，点可能在基因n的】 连接处或基因m内部。 (3)①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒Am的目的菌株由于 含有RA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因· 缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原一抗体杂交实验检测到！ 酵母蛋白中含1ag标签，位于ag标签上游的基因m应该正常表； 达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。 【答案】(l)①mRNA②蛋白M上不含tag标签③BC (2)①黏性末端碱基配对DNA连接②基因m的连接处、· 基因的内部(3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生 长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 ②融合基因表达（或融合基因正确解码） 考向二 1.【命题点】植物生命活动的调节 C[与WT相比，Y2叶片数较少，相对叶表面积较小，因此Y2 光合总面积减小，A错误。Y1和Y2转入的是不同的细胞分裂： 素氧化酶基因，该基因表达的产物会使植株内的细胞分裂素的： 含量低于WT,但由于无法确定Y1和Y2的细胞分裂素氧化酶 的活性等情况，故无法比较Y1和Y2的细胞分裂素含量，B错1 误。据表可知，细胞分裂素可抑制主根生长、侧根和不定根分 化，促送叶片数目增多，故若对Y1施加细胞分裂素类似物，其！ 不受细胞分裂素氧化酶的影响，可以促进叶片数增加，C正确。： Y2的侧根和不定根数量均高于WT,因此对Y2施加细胞分裂： 素类似物后，其侧根和不定根数量将减少，D错误。] 2.【命题点】基因工程的基本操作、微生物的选择培养 思路分析 将质粒导入大肠杆菌，可能会出现3种情况：①无任何质粒导 入大肠杆菌：②人源千扰素基因成功插入的重组质粒导入大肠· 杆菌；③目的基因未成功插入的质粒K导入大肠杆菌。这三种 大肠杆菌用含卡那霉素和X一gal的平板培养，②③两种大肠！ 杆菌均含卡那霉素抗性基因，故能存活，①不能存活，③由于B 半乳糖苷酶基因完整，菌落呈蓝色，而②由于插入的人源千扰 素基因破坏了B半乳糖苷酶基因，导致菌落呈白色故含目的！ 基因的菌落为白色。 C[提高大肠杆菌转化效率的常用方法是使用氯化钙（或！ Ca+)处理细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子： 的生理状态，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由 思路分析可知，若筛选平板中仅含卡那舞素，目的基因成功插 入的重组质粒导入的大肠杆菌以及目的基因未插入成功的质， 粒K导入的大肠杆菌在平板上均为白色菌落，故无法判断哪个： 是含目的基因的菌株，B正确：因质粒K中含两个标记基因，筛！ 选平板中长出的白色菌落应为含目的基因的菌株，能否表达相 应蛋白，需进一步检测，C错误：如果筛选平板上蓝色菌落明显！ 偏多，说明大量没有插入目的基因的质粒K导入了大肠杆菌， 推测原因可能是酶切后的载体发生自身环化并导入了大肠杆 菌，D正确。] 3.B[低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱 中进行是为了防止DNA降解，A正确；第一次离心研磨液是为 了使细胞碎片沉淀，B错误：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺} 试剂呈现蓝色，C正确：细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精， 26 可能有些蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块 儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。] L.D[在N。的α和B亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定 的融合型腈水合酶(N1),则N1与N。氨基酸序列有所不同，这 可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确：蛋白质工程的作 用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确： N1为登白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程， C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环 境，再与底物充分混合，D错误。] 5.【命题点】基因工程 题图解读 (2)为了防止目的基因出现自身环化和反向连接，目的基因的 两端不能添加同尾酶的识别序列。 二者酶切后的黏性末端相同，为同尾酶，其识别序 列不能添加在同一个目的基因的两端 载体示意图： NheT SmaI EcoR V 启动子儿SP7小 终止子 Xba l EooR I heI或aI 拟构建载体的部分结构示意图： 启动子SP7 CADR GPI YFP终止子 Sma I EcoR I EcoRV 【解析】(1)PCR过程中，每进行一轮的扩增，都需要消耗引物 和作为原料的脱氧核苷酸，所以随着PCR反应进行，引物和脱 氧核苷酸的数量逐浙减少，可作为模板的DNA会越来越多， DNA聚合酶的数量基本保持不变。PCR的过程包括变性（温 度超过90℃，双链DNA解聚为单链)、复性（温度下降到50℃ 左右，引物和模板结合)、延伸（温度上升到72℃左右，耐高温 的DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸)。由于 PCR反应中，变性过程温度较高，DNA聚合酶的化学本质为蛋 白质，为防止高温导致蛋白质变性失活，所以PCR过程中需要 用耐高温的DNA聚合酶。 (2)由题图解读可知，GP1基因两端应分别添加SmaI和 EcoR I的识别序列。DNA连接酶催化DNA片段之间磷酸二 酯键的形成，完成DNA片段的连接。 (3)结合题干信息可知，该转基因体系构建了SP7、CADR GP1、YFP融合蛋白表达栽体，其中黄色荧光蛋白(YFP)基因 可看作标记基因。若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出 黄色荧光，说明YFP表达成功，即融合蛋白表达成功。将两种 衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻 细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻，则说明融合蛋白可结合 镉离子。 (4)结合题图2可知，在不同镉离子浓度的培养液中培养6天 后统计细胞密度，镉离子浓度为0时，两组的细胞密度相对值 差异不大，镉离子浓度增大后，两组的衣藻数量均出现不同程 度的减少，但转基因衣藻的细胞密度相对值均大于野生型衣 藻，可能是转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中的 镉离子，减小了镉离子对细胞的毒害。当外界镉离子浓度为 240mol·L1时，转基因衣藻的生长也被明显抑制，原因可能 是培养液中的镉离子浓度过高，融合蛋白的吸附能力有限，镉 离子对转基因衣藻也造成了较强的毒害。 (5)与施加化学药物相比，转基因衣藻在环境治理上的优势有 衣藻作为生物材料在水体中可进行自我繁殖，免去了反复施加 药物的危害和麻烦：同时衣藻可吸收水体中的N、P等元素，在 一定程度上减轻了水体富营养化。衣藻生长速率受镉离子浓 度影响和衣藻吸附的镉可沿食物链传递不是其在环境治理上 的优势。 【答案】(1)引物脱氧核苷酸复性变性过程中温度较高 (2)SnaI和EcoR I磷酸二酯(3)发出黄色荧光高 (4)转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中的镉离 子，减小了辐离子对细胞的毒害培养液中的辐离子浓度过 高，融合蛋白的吸附能力有限，辐离子对转基因衣藻和野生型 衣藻均造成了较强的毒害(5)①③ 回归教材人教版选择性必修3P77PCR技术 含义聚合酶链式反应的缩写，是一种体外 迅速扩增DNA片段的技术 原理DNA半保留复制 条件模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、耐 PCR 高温的DNA聚合酶等 技术 扩增DNA的合成方向总是从子链的5'端 方向向3'端延伸 ]物是一小段能与DNA母链的一段碱基 序列互补配对的短单链核酸 目的短时间内大量扩增目的基因 6.【解析】植物激素调节(1)青蒿素的合成需要特定酶的催化！ (如DBR2基因表达的酶)，这些酶的基因会在腺毛细胞中特异： 性表达。(2)据图可知，miR160基因过表达对应的青高素含量} 低，而miR160基因敲除对应的青蒿素含量高，说明miR160的 表达量与青蒿素含量间呈现负相关性。据图可知，与对照组相「 比，MeJA处理组miR160的表达量较低，可推测外源MeJA通 过抑制iR160的表达，从而降低其对青蒿素合成的抑制作用，！ 使青蒿素含量提高。(3)miR160的一种靶mRNA编码ARF1 蛋白，该蛋白影响青蒿素合成关键酶基因DBR2的表达，而 miR160能与靶mRNA(如ARF1mRNA)结合并导致其降解， 从而减少ARF1蛋白的含量，因此miR160通过直接影响 ARF1蛋白的含量，调控青蒿素的合成。(4)SA抑制miR1601 的表达，miR160可降解ARF1mRNA,即miR160抑制ARF1i 蛋白的合成：ARF1基因过表达对应DBR2相对表达量较高，说 明ARF1对DBR2是促进作用：DBR2是青蒿素合成关键酶基 因，可促进青蒿素合成。调控关系见答案。(5)培育青蒿素含 量高的黄花高新品种的思路有：分子水平上，抑制miR160,可！ 以利用CRISPR-Cas9敲除miR160基因，或转入miR160的抑！ 制因子。传统育种上，筛选miR160低表达或ARF1过表达突 变体。 【答案】(1)青蒿素合成相关基因只在腺毛细胞中特异性表达 (2)负外源MeJA处理可提高青蒿素含量(3)ARF1蛋白的 含量(4)SA4miR1604ARF1→DBR2→青蒿素合成 (5)通过基因工程降低mR160的表达（如敲除miR160基因） 7.【命题点】基因表达载体的构建、PCR及电泳鉴定 题图解读 据图1分析： (I)为保证目的基因N与质粒pYL正确连接，需要把基因N: 插入启动子和终止子之间，便于基因N的转录。因为a链为转 录的模板链，RNA聚合酶识别和结合启动子之后，会从模板链！ a链的3'端向5'端转录，所以a链的3'端需要连接到启动子右 侧，故在引物2的5'端引入SpI限制酶识别序列：a链的5'端 需要连接到终止子左侧，故需要在引物1的5'端引入Xh0I限 制酶识别序列。 (2)因为a链上有SpeI限制酶识别序列，用SpeI限制酶识！ 别切割基因V时会破坏基因N,所以需要在引物2的5'端引入 与SpeI限制酶识别序列具有相同黏性末端(5'一CTAG一3')· 的限制酶识别序列，即在引物2的5'端引入XbI限制酶识别！ 序列。结果如图： 5 3'a链 识别序列45引物1 3' 5'+XaI识别序列 3 引物2 -5'b链 【解析】(1)可从基因序列数据库中查询基因N的编码序列，， 设计特定引物。由题图解读可知，为保证基因N与质粒pYL 正确连接，需在引物1和引物2的5端分别引入XhoI和XbaI: 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后，利用DNA 连接酶连接DNA片段。 (2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板！ DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒I pYL大小为7.2kb,重组质粒大小约9.5kb,假设构建重组质： 26 粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者 的差值，约为2.3kb(2一2.3kb),结合图2电泳结果可知，实验 组1的电泳条带大小约为2300bp,说明实验组1的质粒中成 功插入了基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列 的引物(GCA为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同)，b、c、 d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编 码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同，据此分析，除 编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列，与 丙氨酸的密码子序列相同，其后的编码序列应该与相同，为 TGG/CTG/TTT…,所以该引物是c,其中GCC为第243位 诱变序列，故丙氨酸的密码子还可以是GCC。 (4)本题旨在通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因V 并进行改造，提高香树脂醇合酶的催化效率，高效生产香树脂 醇，所以检测转基因酵母菌发酵产物香树脂醇的含量并进行比 较，可以选出香树脂醇合酶催化效率较高的香树脂醇合酶基因 改造方案。 【答案】(l)基因序列数据库（或GenBank或DNA序列数据 库)Xho I Xba I DNA连接酶(2)外源DNA(或外源基 因、基因N)1基因N大小为重组质粒大小和质粒YL大 小的差值，约为2.3kb,对应实验组1的电泳条带（或实验组1 电泳条带大小加质粒YL大小约等于重组质粒大小) (3)GCC(4)香树脂醇 8.【命题点】微生物的培养、PCR技术、实验设计 【解析】(1)可采用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选 择培养基，并分别置于不同温度下培养的目的是探究内生放线 菌最适的营养条件和温度。 (2)PCR的实质是体外的DNA复制，所以PCR可以实现基因 片段的快速扩增。由图1可知，未发生同源重组前，在引物1、2 的作用下可扩增出的片段为3000bp,故菌落①③未发生同源 重组。若R一U和R一D都发生同源重组，则会减少R基因中 间的2000bp的序列，从而使扩增的片段减小到1000bP,故菌 落②为发生同源重组后的R基因敲除株。根据题干信息，R基 因敲除过程中可发生多种形式的同源区段交换，菌落④的大小 约为7000bp,则可以推测在同源重组过程中，只发生了R-U 或R一D一处同源重组，导致整个质粒片段接入。 (3)若要验证内生放线菌通过与稻瘟病致病菌竞争性利用铁离 子抑制稻瘟病致病菌的生长，则实验的自变量应为内生放线菌 是否能利用培养液中的铁离子，即R基因的有无，因变量应该 为稻瘟病致病菌的生长情况，最后可观测两种菌的数量和培养 液中的铁离子含量变化情况来验证实验结论。所以实验可分 为两组，甲组：将适量的含R基因的内生放线菌和稻瘟病致病 菌混合培养在含铁的培养液中培养：乙组：将等量的R基因敲 除内生放线菌与稻瘟病致病菌混合培养在相同的含铁培养液 中培养：将两组培养液放在适宜的条件下，间隔合适时间记录 每组培养液中铁离子含量变化和两种菌的数量变化。 【答案】(1)稀释涂布平板法探究内生放线菌最适的营养条 件和温度(2)快速扩增②只有R一U或R一D一处发生 了同源重组(3)将野生型内生放线菌、R基因敲除内生放线 菌分别与稻瘟病致病菌混合培养在含铁培养液中，统计培养液 中铁离子含量及两种菌的数量变化。 9.基因工程 【解析】(1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在 胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端 有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。 r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限 制酶KpnI的识别序列，而SacI的一个识别序列位于终止子 之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和 EcoR I对r2HN和载体进行切割。(2)通常采用农杆菌转化 法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测2HN是否表达，可 以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA,通过抗原 抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白。(3)设2HN为基因 N,则单一位，点插入目的基因的植株的基因型为N,其自交后 代的基因型及比例为NN:Nn:nn=1:2:1,r2HV纯合体 植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此！ 选择纯合体进行后续研究。(4)抗体参与体液免疫，CD8+T细 胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析图形，实验组的抗 体水平及CD8+T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得 的2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)水 稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得 疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中大量获得 疫苗 【答案】(1)在胚乳中特异性表达的基因使转录在所需要的 地方停下来Hi1dⅢEcoR I(2)农杆菌转化是否转录 出mRNA抗原一抗体杂交(3)1/4纯合体自交后代不发： 生性状分离(4)体液细胞(5)水稻易于种植，容易获得疫 苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗（合理即可）》 10.基因工程 【解析】(1)引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合 能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可 能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导！ 致非特异性产物的形成，影响P℃R的特异性和准确性。 结合Bsa1识别序列可 Bsa I 5-GGTCTCN3 知.BsaI酶切后产生 3'-CCAGAGNNNNN 5' 的黏性末端含有4个碱 基.故若用BsaI酶切 注：N代表任一贼基 大豆基因组DNA,理论 上可产生的黏性末端最 多有4×4×4×44（种） 图甲：载体信息 Bsa I Bsa I 十启动子 核酸基因一KanHAmp RB ATTGTGAGACCTGAATTCAGGTCTCAGTTT-3 -TAACACTCTGGACTTAAGTCCAGAGTCAAA-5 LBRB:平=NA的边界序列：Ka 卡那置素拉牲基因： Amp:氨苄青霉素抗性基因 分析图甲可知，BsaI的酶切位点如图所示」 则经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端 序列应为5GTTT-3和5-CAAT-3'。 (2)分析载体信息可知，卡那筹素抗性基因位于T-DNA上， 故重组载体中含有卡那舞素抗性基因，重组载体通过农杆菌： 导入大豆细胞，使用抗生素卡那舞素可筛选到具有该抗生素！ 抗性的植株。 图乙：目标基因L部分序列 目标序列5'-AGTCGACTCTGGATCCGAATICTTCTCCGAGGGCCAGGCG-3' 突变序列/-AGTCGACTCTGGATCCGAATICTTCTCCGAGCTCCAGGCG-3 图丙：恨制酶识别序列，切到住点及电泳结采 BomH I 5'-GGATCC-3'EcoR I 5'-GAATTC-3' 3-CCTAGG-5' 3'-CTTAAG-5' Sae I 5'-GAGCTC-3'BsuI 5'-GGTCTCN-3' 3'-CTCGAG-5' 3-CCAGAGNNNNN-5' 注：N代表任一碱基 分析图乙利内可知.目标序列中含有限BamH和FRI的识别序 列，突变序列中含有限制BmHI、RI和ScI的识别序列，再钻合 电泳结果分析可知，选用的是限制隆Sa心I切断CR产物，根据电泳结果图可 知，①和③表示杂合子，②表示纯合抗生植林。④表示纯合的突变植株。 (3)设基因L突变为基因L,则该株基因L成功突变的纯合 植株的基因型为L'L',由题中信息知，一条染色体插入了T一 DNA,若其插入了L'所在染色体，其所在染色体记为L'1,则： 其自交子代的基因型及比例为L'1L'1:L'1L':L'L'=1:日 2：1。若用抗生素筛进这个植株的自交子代，筛选出来的子 代中突变位，点纯合且对抗生素敏感的植株(L'L)所占的比例！ 为1/4。若其插入了其他染色体，所得结果相同。 【答案】(1)低44 GTTT CAAT(2)卡那霉素 Sac I ④(3)1/4 11.基因工程、蛋白质工程 【解析】(I)提取DNA时，要加入蛋白酶水解DNA酶以防止 提取的DNA被DNA酶水解，同时水解其他的蛋白质以去除！ 杂质：提取过程中加入预冷的酒精的目的是利用DNA不溶于！ 酒精的特，点来析出DNA分子。(2)根据题干信息可知，本操 作中获取目的基因的方法有PCR和人工合成。(3)启动子位！ 于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的位，点，可以驱 动目的基因转录出mRNA。插入两个启动子有利于目的基因， 27 的稳定高效表达，提高转录的效率。(4)根据图中穿梭质粒上 的KanR和Hyg BR两个标记基因的位置分析可知，潮寡素B 抗性基因位于T-DNA左右边界之间，可随着T一DNA一同 转化进入受体细胞，故用HygBR基因对应的抗生素可初步筛 选转化的棉花愈伤组织。(5)根据图中信息知，目的基因是人 工合成的1一1362基因序列与天然的1363一1848基因序列 结合体，应该选择引物F1(或F3)和R2进行P℃R检测棉花植 株是否导入目的基因。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质， 属于蛋白质工程。 【答案】(1)水解DNA酶以防止提取的DNA被DNA酶水 解，同时水解其他的蛋白质以去除杂质利用DNA不溶于酒 精的特点来析出DNA分子(2)PCR人工合成(3)识别 和结合RNA聚合酶保证目的基因的稳定高效表达，提高转 录的效率(4)HygBR(5)F1(或F3)R2(6)D 2.微生物的培养、基因工程、电泳 【解析】(1)由题千信息“锌转运蛋白在某种植物根部细胞特 异性表达并定位于细胞质膜”可知，应以该植物的根为材料提 取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。热变性处理的目的是 使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效采。进行琼脂糖 凝胶电泳时，DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，凝胶 点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同相 对分子质量的DNA分子在凝胶中的距离逐渐变长。 (2)DNA连接酶可将限制酶处理后的质粒和目的基因连接。 由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可 用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证转化是否成功。 (3)取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌，直接在固体培养基进行划 线培养，活化后转至液体培养基中增殖，培养过程中需进行振 荡，有利于增加培养液的溶氧量并使酵母菌和培养液充分接 触。(4)由题意可知，菌液经逐级稀释后OD00为0.06,0.006 和0.0006，说明对菌液进行了梯度稀释。由图可知，锌吸收 缺陷型酵母十空载体组不会吸收锌，为阴性对照组。由图可 知，转入N基因的这组酵母菌数量较多，说明转运蛋白N转 运Zn2+能力更强。 【答案】(1)根解旋酶磷酸基团变长(2)DNA连接 酶热变性使大肠杆菌细胞破裂，DNA流出(3)划线振 荡培养(4)梯度稀释锌吸收缺陷型酵母十空载体转运 蛋白N转人N基因的这组酵母菌数量较多 3.基因工程、遗传规律的应用 【解析】(1)据题中信息知，在F基因的编码区插入一个 DNA片段P,引起F基因产生编码序列错位，从而导致mR NA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变 短，蛋白质结构发生改变，导致合成的蛋白质丧失活性。除此 之外，还可以敲除或者替换基因中的特定碱基，从而达到相同 目的。(2)由图甲可知，野生型基因和「基因都含有2个限制 酶HidⅢ的识别序列，但「基因中含有P片段，因此用限制酶 HidⅢ切割野生型基因和∫基因后，所得能与探针结合的片 段大小不一致，基因经酶切后得到的能与探针结合的片段较 长（相对分子质量较大），在电泳时迁移速度较慢，已知野生型 基因型用十十表示，f杂合子基因型用十「表示，综合分析知，「 小鼠和「杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳 道。(3)据题意可知，野生型基因型用十十表示，g小鼠是长毛 隐性突变体，基因型用gg表示，「杂合子小鼠基因型用十f表 示，「基因和g基因位于同一条常染色体上。如果g和f是非 等位基因，则「杂合子小鼠（十/十十）与g小鼠（十十/gg)杂 交，后代的基因型为十十/十g和十/十g,全是野生型；如果g 和「是等位基因，「杂合子小鼠（十f)与g小鼠(gg)杂交，后代 中十g：fg=1:1,即野生型与突变型的比例为1：1。(4)据 图丙可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随一部分 DNA片段丢失，g基因无法转录出mRNA,不能得到相应 cDNA,故PCR扩增时缺少模板，不能扩增出相应DNA片段， 因此g小鼠样品泳道没有条带。g小鼠表型与「小鼠相同，表 现出毛茸茸的样子，野生型和g杂合子均表达F蛋白，g小鼠 不表达F蛋白，即不表达F蛋白的小鼠表现出长毛，说明F蛋 白在毛发生长中起抑制作用。 【答案】(1)编码序列错位/基因突变氨基酸序列替换 敲除/缺失(2)32(3)子代全为野生型（短毛）野生型 :突变型（短毛：长毛）=1：1(4)野生型基因发生突变，导 致g基因丢失了启动子，无法转录出RNA:反转录没有相应！ 产物，检测不出结果抑制毛发生长 14.限制酶的作用、碱基互补配对、实验分析 【解析】(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序 列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建 片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的I和Ⅱ、Ⅲ和V· 酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，从而使N! 基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，！ 含有碱基A、U、C、G:B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含 有碱基A、T,C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对 可形成的碱基对有G-C、A-U、A-T。(3)由题中信息“利用 CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组， 得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插 入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。! 结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计！ 的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物 进行PCR,不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸秆会污染环境，利用！ 高效降解纤雏素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境： 污染。 【答案】(1)磷酸二酯键片段甲含有启动子和终止子 (2)A-U、A-T(3)菌株B2的基因组DNA无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染（合理即可给分） 15.【解析】(1)据题千信息可知，突变体是由野生型DA1基因 发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型DA1基因！ 转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入： 的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植 株的种子大小相近。(2)构建基因表达载体时，需要用限制性： 核酸内切酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为运载体的Ti 质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达，DA11 基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。(3)①卡 那纸素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细： 胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛 选出来。用农杆菌转化T。代植株并自交，将T1代种子播种 在含有卡那舞素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即 表示其基因组中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。！ ②假设DA1基因用A表示，结合题中信息知，T1代中能在含】 有卡那霉素的培养基上生长的植株的基因型为Aa或AA或： 多位点插入，T1代阳性植株自交所得T2代种子按单株收种 并稀种于含有卡那舞素的培养基上，T1代阳性植株基因型为 Aa时，该植株上所结种子有75%能够萌发并长成幼苗，因此， 应选择阳性率约为75%的培养基中幼苗继续培养。③T2代！ 阳性植株的基因型为1/3AA、2/3Aa,将②中选出的T2代阳 性植株自交，所得的T3代种子按单株收种并播种于含有卡那 霉素的培养基上，基因型为AA的植株自交，其后代不会发生 性状分离，在含有卡那骞素的培养基上，所有种子都能够萌发！ 并生长，而基因型为A的植株自交，其后代会发生性状分离，： 在含有卡那露素的培养基上部分种子不能萌发，因此阳性率 达到100%的培养基中的幼苗为纯合子(AA),即目标转基因！ 植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性核酸内 切酶X的识别序列，不能被该酶切割，已知DA1基因的长度 为150bp,因此，野生型相关基因被限制性核酸内切酶X切割： 并电泳后得到的条带为150bp。突变型相关基因中含有限制： 性核酸内切酶X的识别序列，用该酶切割后，突变基因被切割 成100bp,50bp两种DNA片段，经电泳后得到的条带为100 bp和50bp。突变型和野生型相关基因经限制性核酸内切酶 X切割并电泳后得到的结果如图所示。 标准参照物野生型突变型 150bp 100 bp 50 bp (bp指核苷酸对) 27 【答案】(1)野生型(2)T1质粒启动子和终止子 (3)①DA1/基因（和卡那霉素抗性基因）②75③自交 100如图所示 标谁参照物野生型突变型 150bp 100bp 50 bp ■(bp指核苷酸对) 16.【解析】(1)在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前应检验 两种植物的原生质体是否具备形成再生植株的能力。为了便 于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融 合，若甲植物原生质体来自幼苗的根，则乙植物原生质体应来 自幼苗的叶片（注：叶片细胞中含有叶绿体，叶片细胞的原生 质体呈绿色)。(2)植物细胞壁的主要成分是纤雏素和果胶。 由于甲原生质体提供的是核基因，因此需使其细胞质失活：乙 原生质体提供的是细胞质基因，因此需使其细胞核失活。可 采用血细胞计数板对原生质体进行计数。加入过量的培养基 可降低PEG浓度，使原生质体融合终止。(3)由于将融合原 生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合后，在凝固前倒入培养基， 融合原生质体分散固定在平板中，可独立生长、分裂形成愈伤 组织，因此同一块愈伤组织所有细胞来源于一个融合原生质 体。综合分析可知，甲原生质体的细胞质失活，乙原生质体的 细胞核失活，因此，未发生融合的甲原生质体、未发生融合的 乙原生质体，以及同种融合（甲原生质体与甲原生质体融合、 乙原生质体与乙原生质体融合)的原生质体无法生长、分裂， A、B项符合题意：杂种细胞的结构和功能完整，能够进行生 长、分裂形成愈伤组织，D项符合题意。（4)愈伤组织经再分 化能形成胚状体或芽。胚状体能长出根、芽，直接发育成再生 植株。(5)提取纯化再生植株的总DNA,可作为PCR扩增的 模板。扩增序列a时所用的特异性引物是M1和M2。PCR 的扩增产物常用凝胶电泳进行鉴定。若在2个PCR扩增体 系中能分别扩增出a序列和b序列，则将2个PCR扩增体系 扩增的产物进行凝胶电泳后，可观察到1个凝胶中含a序列 对应的1个条带，1个凝胶中含b序列对应的1个条带。 【答案】(1)再生植株叶片(2)纤维素细胞质、细胞核 血细胞计数板终止原生质体融合(3)一个融合原生质体 ABD(4)再分化根和芽(5)模板M1、M2电泳1 专题十九细胞工程 考向一 1.B[植物细胞工程的应用根据表格数据分析，随着细胞千重 增加，黄酮产量也增加：随着细胞干重减少，黄酮产量也降低， 说明黄酮产量与细胞千重呈正相关，A正确。氧气的供给有利 于细胞呼吸为生命活动提供能量，对水母雪莲细胞生长、分裂和 代谢是必需的，C正确。根据表格数据分析，转速为75r/min 时，细胞的相对生长速率(0.26)最大，黄酮产量(0.32g/L)最 高，D正确。] 错误项分析黄酮属于次生代谢产物，次生代谢产物不是细胞 生存和生长所必需的，B错误。 2.【命题点】植物组织培养的过程 C[过程①是由组织块形成愈伤组织，属于脱分化过程，脱分 化过程中细胞通过有丝分裂增殖，A正确：过程②是愈伤组织 形成胚状体，属于再分化过程，再分化会形成不同种类的细胞， 进而发育成不同组织、器官，B正确：过程②（再分化形成胚状 体)和过程③（胚状体发育成试管苗）所用培养基成分、浓度不 完全相同，C错误：培养基中糖类可作为碳源，为植物细胞提供 碳元素用于合成有机物等，同时糖类能影响培养基渗透压，雏 持细胞正常形态，D正确。] 回归教材人教版选择性必修3P35菊花的组织培养 植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再 分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发 育方向。将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以 诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。 3.【命题点】植物的快速繁殖 B[流程①是对外植体腋芽消毒，消毒的效果取决于消毒剂的 种类、浓度和处理时间等，A错误；由于腋芽中含有分生组织， 可以不经过脱分化形成愈伤组织的阶段，直接萌生成幼苗，B 正确：分析比较表格数据可知，与流程②相比，流程③培养基中