2027届高中生物一轮复习讲义 第51讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

第51讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

考点一　重组DNA技术的基本工具

1.基因工程的概念

2.基因工程的工具

(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。

②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。　　　

(2)DNA连接酶——“分子缝合针”

①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的核酸片段上。

②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。　　　

(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

[创新拓展]　基因工程中限制酶的选择、标记基因与重组表达载体的筛选

1.限制酶的选择原则

(1)根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类

①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。

②不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择Sma Ⅰ。

③善用“双酶切”，注意方向性。“双酶切法”可防止载体和目的基因环化，避免目的基因与载体反向连接。目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。

④巧用“同尾酶”。同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

提醒　同尾酶要慎用，多数同尾酶虽然切割形成的黏性末端对应序列相同，但黏性末端两侧的识别序列并不相同，连接后的序列无法再被识别和酶切，除非使用仅识别黏性末端序列的限制酶进行切割，如下图所示。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

提醒　保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则。如图乙中不选择Sma Ⅰ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。

(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶

图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：

[例1] 利用图1中目的基因和图2中P1噬菌体载体构建图3中的重组DNA，限制酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。请回答问题。