专题15 基因工程（6年汇编）（河北专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，整合2021-2026年河北高考真题及模拟题，以微生物发酵、环境治理等真实科研情境为载体，突出工具酶应用与PCR技术操作逻辑。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |非选择题|9道|基因工程工具（限制酶选择、载体构建）、操作程序（PCR引物设计、转化检测）、应用（作物抗虫育种、水体镉污染治理）|真实情境（如黑曲霉淀粉酶R基因工程改造）；能力梯度（基础操作到综合分析，如转基因衣藻镉吸附机制探究）；贴合真题趋势（工具选择科学性分析，如CreA蛋白抑制与信号肽定位融合）| |选择题|5道|基因工程原理（定点突变、载体构建）、技术应用（荧光蛋白标记、工程菌培养）|选项设计聚焦易错点（如直接导入目的基因与表达载体构建的区别）；融合前沿技术（如单引物PCR与ecDNA研究）|

专题15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】（1）固体      （2）① 碱基互补配对    ② 5′    ③ Sac Ⅰ      （3）① 标记    ② 选择     （4）①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力     （5）①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高      2.【答案】（1）① 脱氧核苷酸    ② 引物    ③ 复性    ④ PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。     （2）① SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ    ② 磷酸二酯键     （3）① 细胞表面发出黄色荧光    ② 高     （4）① 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用    ② 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用     （5）① ①    ② ③      3.【答案】（1）① 胚乳特异表达基因的     ② 终止转录    ③ HindIII    ④ EcoRI     （2）① 农杆菌转化    ② r2HN是否转录    ③ 抗原抗体杂交     （3）① 1/4    ② 纯合体自交后代不发生性状分离     （4）① 体液    ② 细胞     （5）生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）      4.【答案】（1）溶解度     （2）① 启动子    ② 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序）    ③ 苹果酸酶基因（或“ME基因”）     （3）① 碱基互补配对    ② 对照    ③ 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”）     （4）① 增加    ② 细胞数量     （5）有氧呼吸生成的ATP增多     （6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”）      5.【答案】① 基因组文库    ② 限制酶和DNA连接酶    ③ 便于目的基因的筛选和鉴定    ④ 农杆菌转化法    ⑤ 避免目的基因在自然界中的扩散    ⑥ 耐性    ⑦ 茎叶    ⑧ YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水    ⑨ 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】（1）调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的     （2）基因表达载体的构建##表达载体的构建     （3）① T-DNA    ② 该方法不适用于单子叶植物     （4）基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术     （5）① 接种实验    ② NaPI＋StPinlA    ③ 两种抑制剂共同作用能够有效抑制棉铃虫的消化功能     （6）① 定向改变    ② ①某些害虫胰蛋白酶基因发生突变，使酶空间结构发生变化，抑制剂无法发挥作用；②某些害虫基因突变形成的新基因，能指导合成催化抑制剂水解的酶，使抑制剂失效      1.【答案】C 2.【答案】D 3.【答案】AB 4.【答案】CD 5.【答案】BD 6.【答案】（1）① 激活DNA聚合酶    ② 相同的（互补的）    ③ ClyA     （2）① 标记基因    ② 质粒或目的基因自身环化；目的基因的反向连接    ③ 低     （3）① RNA聚合酶    ② 增加     （4）① TRB+L    ② 热诱导（激光照射肿瘤部位，通过光热转化效应）能触发Noxa基因的表达，Noxa蛋白可提升小鼠体内肿瘤杀伤的效果     （5）检测TRB有无引起宿主毒性；评估TRB治疗的安全性      7.【答案】（1）① 胰蛋白酶（胶原蛋白酶）    ② 95%空气和5%CO2     （2）① 显微注射     ② 潮霉素和嘌呤霉素    ③ ①④⑥③     （3）① 着丝粒     ② 仅发出红色荧光    ③ MDM2基因过量表达    ④ 潮霉素      8.【答案】（1）① 序列数据库（或GenBank）    ② 5'    ③ 黏性末端    ④ DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的DNA链上，形成磷酸二酯键，而DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要模板     （2）① 琼脂糖凝胶电泳    ② 1、2、4     （3）① 抗原—抗体杂交    ② 目的基因的表达量    ③ 血细胞计数板    ④ 扩大培养      9.【答案】（1）① EcoR Ⅰ    ② Hind Ⅲ     （2）① 添加氨苄青霉素、不加色氨酸    ② 生长素和细胞分裂素     （3）① 使(两种)引物(分别)与两条单链DNA结合(从而使子链进行延伸)    ② 利用花药离体培养技术，将该植株的花粉培育至单倍体幼苗植株，淘汰不抗病植株，再将抗病幼苗植株进行低温诱导或用秋水仙素处理，获得正常抗病植株（合理即可）      10.【答案】（1）① 血清    ② 接触抑制    ③ 维持培养液的pH     （2）① 蛋白质    ② 5'-GCC-3'     （3）① 2和3    ② DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连    ③ DNA连接酶    ④ 抗原—抗体杂交     （4）与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用      11.【答案】（1）① DNA半保留复制    ② 变性、复性和延伸    ③ 6    ④ 4     （2）① 易发生质粒或目的基因的自身环化；易发生质粒与目的基因间的反向连接；连接效率低    ② 不能    ③ Pst Ⅰ切割DNA形成的黏性末端为 ，DNA聚合酶催化子链延伸的方向为5ʼ→3ʼ，无法从3ʼ→5ʼ延伸     （3）①②     （4）解药R蛋白不能完全中和毒素T蛋白      12.【答案】（1）① Ⅱ    ② 基因B的转录方向为从PamCⅠ到XbaⅠ，高表达启动子必须位于质粒2的PamCⅠ处（即Ⅱ处），才能驱动基因B的转录；若位于Ⅰ处（XbaⅠ处），则无法启动转录。    ③ DNA聚合酶    ④ T4DNA连接酶     （2）① 壮观霉素    ② 特异性结合目的基因的引物    ③ 实验思路：提取转化体总RNA进行RT一PCR检测mRNA，或提取蛋白质用抗原抗体杂交技术检测目的蛋白     （3）类胡萝卜素产量更高(或含量更高)      13.【答案】（1）诱导型     （2）① 保证基因表达盒定向整合到染色体X位点（避免表达盒反向插入）    ② 磷酸二酯键    ③ 尿嘧啶缺陷型     （3）P2和P3     （4）避免受体基因组中的DR序列与目的片段上的DR发生错误同源重组，保证仅URA3基因被精准敲除      （5）① 淀粉    ② 高      14.【答案】（1）① AC    ② FE    ③ XbaⅠ     （2）① EcoRⅠ和HindⅢ    ② 氨苄青霉素    ③ X-gal    ④ 长出白色菌落     （3）① 液体    ② 抗原-抗体杂交     （4）注射该融合蛋白的鲤鱼感染KHV后，存活率显著高于对照组（或发病率显著低于对照组）      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年真题1年模拟 考点分类 河北考情 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2026河北（1题）、2025河北（1题）、2024河北（1题）、2023河北（1题）、2021河北（1题） · 情境设置：以微生物发酵、环境治理、作物改良、生物能源等真实科研情境为载体，强调工具酶的实际应用 · 考查重点：限制酶选择、载体构建、标记基因功能等核心工具的原理与操作逻辑 · 命题趋势：与基因表达调控（如CreA蛋白抑制）、信号肽定位等前沿技术融合，突出工具选择的科学性分析 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2022河北（1题） · 情境设置：以作物抗虫育种等农业生产实际问题为背景，体现PCR在基因克隆中的关键作用 · 考查重点：引物设计原则、扩增条件优化、产物鉴定及与后续酶切、连接步骤的衔接 · 命题趋势：PCR与基因编辑、多基因叠加转化技术结合，强调引物特异性设计与扩增效率的定量分析 考点1 基因工程的基本工具 1.（2026·河北·高考真题）（多选）黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用　　　　　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照　　　　　　　　　原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的　　　　　　　　　端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是　　　　　　　　　。 A （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有　　　　　　　　　基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用　　　　　　　　　培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） 【答案】（1）固体      （2）① 碱基互补配对    ② 5′    ③ Sac Ⅰ      （3）① 标记    ② 选择     （4）①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力     （5）①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高      (1)小问详解： 微生物的分离纯化需要获得单菌落，只有固体培养基上才能形成单菌落，因此选用固体培养基。 (2)小问详解： 核酸折叠形成双链遵循碱基互补配对原则；PCR扩增时，引物与模板3'端互补，引物延伸的方向是5'端→3'端，额外的限制酶识别序列需要添加在引物的5′端；根据图1载体的酶切位点顺序：启动子-KpnⅠ-A-SpeⅠ-B-NcoⅠ-C-SacⅠ-终止子可知，A位点两侧是KpnⅠ和SpeⅠ，C位点两侧是Nco Ⅰ和Sac Ⅰ，结合题意可知，该过程需要使含片段A和C的转录产物自身折叠形成双链，图1可知，PCR扩增CreA基因D片段时，分别在5'端添加了A片段和C片段对应的限制酶，要使A片段和C片段插入的D片段转录产物互补，则需要将C位点插入的D片段与A位点插入的D片段反向，结合图中载体上的限制酶对应关系可知，限制酶①应为Sac Ⅰ。 (3)小问详解： 基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因，还需具有标记基因，标记基因的作用是筛选成功转入载体的受体细胞；在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基是选择培养基，可利用选择培养基筛选出转基因菌株。 (4)小问详解： 分析图2曲线，G（原菌株）和G1（抑制CreA表达的菌株）的生物量曲线几乎重合，说明CreA表达抑制对黑曲霉生长无显著影响；G1的淀粉酶活力远高于G，说明抑制CreA表达可以显著提高淀粉酶活力。 (5)小问详解： 传统工艺需要高温处理淀粉，而淀粉酶R可直接降解生淀粉，因此优势为：①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和。副产物少，产物纯度更高 2.（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是　　　　　和　　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为　　　　　。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加　　　　　（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是　　　　　。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是　　　　　。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】（1）① 脱氧核苷酸    ② 引物    ③ 复性    ④ PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。     （2）① SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ    ② 磷酸二酯键     （3）① 细胞表面发出黄色荧光    ② 高     （4）① 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用    ② 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用     （5）① ①    ② ③      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2)小问详解： 观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 (3)小问详解： 若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 (4)小问详解： 转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 (5)小问详解： 转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 3.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用　　　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　，通过　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为　　　　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　　　　免疫和　　　　　　　　免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点即可） 【答案】（1）① 胚乳特异表达基因的     ② 终止转录    ③ HindIII    ④ EcoRI     （2）① 农杆菌转化    ② r2HN是否转录    ③ 抗原抗体杂交     （3）① 1/4    ② 纯合体自交后代不发生性状分离     （4）① 体液    ② 细胞     （5）生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）      【分析】 【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的类型的判断 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动转录 载体中可人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 将r2HN基因导入水稻愈伤组织的方法 可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞 水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；可利用显微注射技术将目的基因导入动物细胞 病毒进入体内发生的免疫 特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫 根据图示，抗体和T细胞的数量都增加了，说明病毒进入体内既引发了体液免疫又引发了细胞免疫 （2）逻辑推理与论证： (1)小问详解： 利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳特异表达基因的的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 (2)小问详解： 获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HN是否转录，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)小问详解： 获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。 (4)小问详解： 据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 (5)小问详解： 通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）等优点。 4.（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： （1）根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　　　差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 （2）超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　　　和　　　等。本研究中目的基因为　　　。 （3）PCR扩增时引物通过　　　原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的　　　组，样品2有特异性扩增产物，结果表明　　　。     （4）利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显　　　。同时，还需测定　　　以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。     （5）胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，　　　，最终促进胞内脂质合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　　　。（答出两点即可） 【答案】（1）溶解度     （2）① 启动子    ② 终止子（答案“启动子”和“终止子”不分顺序）    ③ 苹果酸酶基因（或“ME基因”）     （3）① 碱基互补配对    ② 对照    ③ 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”）     （4）① 增加    ② 细胞数量     （5）有氧呼吸生成的ATP增多     （6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”）      【分析】 1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、PCR原理：DNA半保留复制。 3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。 (1)小问详解： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。 (2)小问详解： 基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。 (3)小问详解： PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。 (4)小问详解： 硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。 (5)小问详解： 细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。 (6)小问详解： 相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。 5.（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为　　　　　　　　　　。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是　　　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是　　　　　　　　　　。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的　　　　　　　　　　（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的　　　　　　　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　　　　　（写出两点即可）。 【答案】① 基因组文库    ② 限制酶和DNA连接酶    ③ 便于目的基因的筛选和鉴定    ④ 农杆菌转化法    ⑤ 避免目的基因在自然界中的扩散    ⑥ 耐性    ⑦ 茎叶    ⑧ YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水    ⑨ 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 【分析】 1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。 2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。 【详解】 （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。 （3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。 （4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。 【点睛】 本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2022·河北·高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： （1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是　　　　　　　　。 （2）　　　　　　　　是实施基因工程的核心。 （3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的　　　　　　　　上，此方法的不足之处是　　　　　　　　。 （4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有　　　　　　　　（写出两点即可）。 （5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的　　　　　　　　以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析　　　　　　　　（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是　　　　　　　　。 （6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生　　　　　　　　。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是　　　　　　　　（写出两点即可）。 【答案】（1）调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的     （2）基因表达载体的构建##表达载体的构建     （3）① T-DNA    ② 该方法不适用于单子叶植物     （4）基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术     （5）① 接种实验    ② NaPI＋StPinlA    ③ 两种抑制剂共同作用能够有效抑制棉铃虫的消化功能     （6）① 定向改变    ② ①某些害虫胰蛋白酶基因发生突变，使酶空间结构发生变化，抑制剂无法发挥作用；②某些害虫基因突变形成的新基因，能指导合成催化抑制剂水解的酶，使抑制剂失效      【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1)小问详解： 蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。 (2)小问详解： 基因工程的核心是基因表达载体的构建。 (3)小问详解： 农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用于单子叶植物。 (4)小问详解： 目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。 (5)小问详解： 抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的接种实验以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI＋StPinlA转基因棉花的抗虫效果最佳，因为两种抑制剂共同作用能够有效抑制棉铃虫的消化功能。 (6)小问详解： 在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是①某些害虫胰蛋白酶基因发生突变，使酶空间结构发生变化，抑制剂无法发挥作用；②某些害虫基因突变形成的新基因，能指导合成催化抑制剂水解的酶，使抑制剂失效。 1.（2026·河北承德·一模）葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，科研人员将其第138位甘氨酸（GGU）以脯氨酸（CCU）替代，其最适反应温度提高10～12℃，从而提高了该酶的热稳定性。下列叙述错误的是（　　） A. 可通过PCR技术实现GI基因定点突变 B. 改造后的基因嘧啶碱基比例与改造前相同 C. 可将改造后的GI基因直接导入大肠杆菌中生产GI D. 改造后的GI的空间结构可能发生了改变 【答案】C 【详解】 A、可以通过设计特定的引物，利用PCR技术实现GI基因的定点突变，A正确； B、基因中嘧啶碱基与嘌呤碱基相等，B正确； C、应先构建GI基因的表达载体再导入大肠杆菌中，C错误； D、由于将第138位甘氨酸（GGU）以脯氨酸（CCU）替代，氨基酸种类改变，其空间结构可能发生了改变，D正确。 2.（2026·河北承德·一模）某水母体内含有的绿色荧光蛋白（GFP）能发出绿色荧光。但荧光中有5/6为不可见光，所以绿光很微弱。有科学家采用PCR定点突变的方法，将GFP第65位的丝氨酸替换为苏氨酸得到绿光荧光强度增强的eGFP。关于该技术，下列说法错误的是（　　） A. 该技术是以GFP结构和荧光强度增加的关系为基础 B. 该设计改造GFP结构的实质是改造GFP基因的结构 C. 将eGFP与某蛋白连接，可追踪该蛋白在细胞中的分布与含量 D. 将eGFP基因直接导入酵母菌，而非大肠杆菌，以获得正确折叠的eGFP 【答案】D 【详解】 A、蛋白质工程以蛋白质的结构和功能的关系为基础，要改造GFP获得荧光增强的eGFP，需要先明确GFP结构和荧光强度增加的关系，A正确； B、蛋白质的结构由对应的基因决定，改造蛋白质结构的实质是改造编码该蛋白质的基因的结构，B正确； C、eGFP可以发出绿色荧光，将其与目标蛋白连接后，可通过检测荧光的位置和强度，追踪该蛋白在细胞中的分布与含量，C正确； D、首先目的基因不能直接导入受体细胞，需要先构建基因表达载体才能导入；其次eGFP结构简单，大肠杆菌（原核生物）也可对其进行正确折叠，并非必须导入酵母菌才能获得正确折叠的eGFP，D错误。 3.（2026·河北唐山·一模）（多选）基因A促进番茄细胞内类黄酮的分解。将基因A反向插入载体，使其在番茄细胞内转录生成与内源基因A的mRNA互补的反义RNA，可抑制内源基因A的表达，进而提高类黄酮的含量，实验部分流程如图所示。下列叙述正确的是（　　） Ti质粒局部结构 A. Ti质粒中还应含有的结构是复制原点 B. 扩增基因A所用引物1的5＇端应添加HindIII限制酶的识别序列 C. 农杆菌转化后的叶肉细胞应在含潮霉素或卡那霉素的培养基中培养 D. 番茄叶肉细胞脱分化期间通常需给予适当光照 【答案】AB 【详解】 A、质粒作为基因工程的运载体，必须能够自主复制，因此必然含有复制原点；题图仅展示了Ti质粒的局部结构，因此Ti质粒还应含有复制原点，A正确； B、题图中插入目的基因的酶切位点是XbaⅠ和HindⅢ，且结合反向插入的需求（将基因A反向插入载体，使其在番茄细胞内转录生成与内源基因A的mRNA互补的反义RNA），要将基因A反向插入启动子下游，则引物1（基因A左端的5'端）需要添加HindⅢ位点，B正确； C、由图可知，卡那霉素抗性基因位于T-DNA区域外，农杆菌转化时，只有T-DNA携带目的基因和潮霉素抗性基因整合到植物细胞染色体，卡那霉素抗性基因不会进入番茄细胞，因此只能用含潮霉素的培养基筛选，不能用卡那霉素，C错误； D、番茄叶肉细胞脱分化形成愈伤组织的阶段，通常需要避光处理，再分化阶段才需要光照，D错误。 故选AB。 4.（2026·河北唐山·二模）（多选）下图为单引物PCR的基本流程，其中DpnI酶可以使甲基化的DNA水解；DH5α为大肠杆菌，其可以完成DNA双链修复并扩增相应DNA．下列说法正确的是（       ） A. 单引物PCR的模板是环状DNA的两条单链 B. 单引物PCR经过3个循环才可以得到完整突变DNA C. 单引物PCR之前，模板DNA需要进行甲基化处理 D. 单引物PCR可以定向改变DNA序列实现定点突变 【答案】CD 【详解】 A、单引物PCR的模板是环状质粒DNA，不是两条分开的单链。PCR的模板是完整的双链，引物结合到单链模板上进行延伸，A错误。 B、单引物PCR的原理：第1次循环：以环状质粒为模板，突变引物延伸，得到只含一条突变链、一条原链的线性DNA；多次循环后，会得到大量以突变链为模板延伸的DNA片段，但完整的双链突变DNA不是在3个循环内形成的，最终的双链修复是在大肠杆菌DH5α体内完成的，B错误； C、DpnI酶可以水解甲基化的DNA，而PCR扩增的产物是未甲基化的，不会被水解。因此在单引物PCR前，需要对模板DNA进行甲基化处理，这样后续用DpnI消化时，只会降解原始模板，保留突变的PCR产物，C正确； D、单引物PCR使用突变引物，可以在特定位点引入突变，定向改变DNA序列，实现定点突变，D正确。 5.（2026·河北邯郸·二模）（多选）白化病是由于酪氨酸酶基因异常，使黑色素细胞无法合成黑色素而引起的单基因遗传病。科研人员尝试通过基因修复、细胞诱导等技术治疗白化病，下列相关叙述正确的有（       ） A. 白化病患者的黑色素细胞因无法合成黑色素而发生细胞坏死，并引发机体炎症反应 B. 对异常细胞进行基因修复使其恢复功能，该过程改变了细胞的遗传信息 C. 诱导患者干细胞分化为正常黑色素细胞，体现了动物细胞的全能性 D. 癌细胞与黑色素合成异常细胞相比，前者细胞周期变短、膜上糖蛋白减少 【答案】BD 【详解】 A、白化病患者仅因酪氨酸酶基因异常无法合成黑色素，黑色素细胞本身并未坏死，也不会引发机体炎症反应，A错误； B、基因修复通过编辑基因序列，直接改变了细胞的遗传信息，使其恢复正常功能，B正确； C、细胞全能性的定义是已分化的细胞发育为完整个体或分化形成各种细胞，该过程仅诱导干细胞分化为黑色素细胞这一种细胞，未发育为完整个体或各种细胞，不能体现动物细胞的全能性，C错误； D、癌细胞具有细胞周期缩短、增殖加快，且膜上糖蛋白减少导致易转移的特征，与正常黑色素细胞相比差异显著，D正确。 6.（2026·河北保定·一模）随着合成生物学的发展，利用工程菌表达具有治疗功效的分子可提高细菌的抗肿瘤能力。已知ClyA基因的表达产物是一种定位于细菌外膜的蛋白，而Noxa基因表达产物可激活小鼠体内的抗肿瘤免疫反应。科研人员将ClyA与Noxa的融合基因插入到温度敏感质粒pBV220中构建了重组质粒，并将其转化至非致病性的大肠杆菌MG1655，从而获得工程菌TRB，构建的过程如图1所示。给小鼠注射大肠杆菌后该菌会靶向肿瘤处聚集，导致肿瘤部位颜色变暗而容易被发现。回答下列问题： 注：ori表示复制原点；Tc1表示一种基因；PR―PL表示一种启动子；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 （1）通过PCR分别扩增ClyA和Noxa基因时，缓冲液中添加Mg2+的目的是　　　　　　　。利用PCR构建ClyA-Noxa融合基因时两种基因在融合处需具有　　　　　　黏性末端，同时剔除　　　　　　基因中的编码终止密码的序列。 （2）在质粒pBV220中AmpR的功能是作为　　　　　。质粒线性化时，选用EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ进行双酶切以防止　　　　　　　（答出1点）。将大肠杆菌MG1655置于　　　　（填“高”或“低”）浓度的CaCl2溶液中，可使细胞体积膨胀增加膜的通透性，有利于重组质粒的转入。 （3）已知Tc1基因的表达产物可结合到PR―PL启动子上阻止　　　　　识别和结合从而影响转录过程。研究发现，当温度较高时，Tc1蛋白构象会被破坏，ClyA-Noxa融合基因的表达量将　　　　　　　　　。 （4）将荷瘤小鼠分为5组，分别处理如下：只注入磷酸盐缓冲液（PBS）、注入MG1655、注入MG1655并用激光照射（MG1655+L）、注入TRB、注入TRB并用激光照射（TRB+L），已知用激光照射肿瘤部位时可引发光能转化为热能。处理后监测小鼠肿瘤体积随时间的变化情况，实验结果（如图2）表明，五组实验中，　　　　　　　组的肿瘤治疗效果最明显，分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （5）用最优方案治疗后，继续检查小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官有无明显病理改变，这些检查的目的是　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 激活DNA聚合酶    ② 相同的（互补的）    ③ ClyA     （2）① 标记基因    ② 质粒或目的基因自身环化；目的基因的反向连接    ③ 低     （3）① RNA聚合酶    ② 增加     （4）① TRB+L    ② 热诱导（激光照射肿瘤部位，通过光热转化效应）能触发Noxa基因的表达，Noxa蛋白可提升小鼠体内肿瘤杀伤的效果     （5）检测TRB有无引起宿主毒性；评估TRB治疗的安全性      (1)小问详解： PCR体系中Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶，维持酶活性；构建融合基因时，两个基因需要产生相同的黏性末端才能连接；融合基因表达完整融合蛋白，需要去除上游基因（本题中ClyA在Noxa上游）的终止密码编码序列，避免翻译提前终止。 (2)小问详解： 抗性基因AmpR是标记基因，用于筛选成功导入重组质粒的受体菌；双酶切可以产生不同的黏性末端，有效避免质粒或目的基因自身环化以及目的基因反向连接；制备感受态大肠杆菌时，低浓度CaCl2（低渗溶液）使细胞吸水膨胀，增加细胞膜通透性，利于重组质粒进入细胞。 (3)小问详解： 启动子是RNA聚合酶识别结合的位点，Tc1蛋白结合启动子后会阻断RNA聚合酶的结合，抑制转录；高温使Tc1构象破坏，抑制作用解除，因此融合基因的表达量增加。 (4)小问详解： 从图2可知，TRB+L组肿瘤体积最小，治疗效果最好；原因是工程菌TRB可靶向肿瘤，热诱导（激光照射肿瘤部位，通过光热转化效应）能触发Noxa基因的表达，Noxa蛋白可提升小鼠体内肿瘤杀伤的效果。 (5)小问详解： 治疗后检查正常器官，目的是检测该治疗方案是否存在毒副作用，对治疗的安全性进行评估。所以这些检查的目的是检测TRB有无引起宿主毒性；评估TRB治疗的安全性。 7.（2026·河北石家庄·一模）临床调查发现部分癌症患者的癌细胞中存在着携带原癌基因的ecDNA（由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子）。Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化，作用原理如图1所示。为构建与癌细胞中类似的ecDNA用于研究。研究者将片段1和片段2（两段均为含loxP位点和标记基因的外源DNA）插入小鼠细胞的12号染色体，再用Cre酶处理，构建了含原癌基因MDM2的ecDNA的细胞模型，过程如图2所示。 （1）常用　　　　　处理培养小鼠细胞使其分散成单个细胞进行培养，培养这些细胞的气体环境为　　　　　。 （2）将片段1和片段2导入小鼠细胞最常用的方法是　　　　　，若想筛选出同时导入片段1和片段2的细胞可在培养基中添加　　　　　。图2中插入小鼠细胞12号染色体上的片段2的组成元件从左向右依次为　　　　　。 ①潮霉素抗性基因 ②嘌呤霉素抗性基因 ③红色荧光蛋白基因 ④绿色荧光蛋白基因上游序列 ⑤绿色荧光蛋白基因下游序列 ⑥loxP位点 （3）ec细胞分裂时，复制后的ecDNA随机分配给两个子细胞，ecDNA不能像染色体DNA一样平均分配的原因可能是自身缺少　　　　　（结构）。用荧光显微镜观察分裂产生的子细胞，观察到　　　　　（现象）的为丢失ecDNA的子细胞。子代ec细胞中ecDNA拷贝数增加可能会导致　　　　　，从而使细胞癌变。培养过程中，为使子代中ec细胞比例增加，可在培养液中加入　　　　　。 【答案】（1）① 胰蛋白酶（胶原蛋白酶）    ② 95%空气和5%CO2     （2）① 显微注射     ② 潮霉素和嘌呤霉素    ③ ①④⑥③     （3）① 着丝粒     ② 仅发出红色荧光    ③ MDM2基因过量表达    ④ 潮霉素      (1)小问详解： 动物细胞培养过程中，常用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理组织，使细胞分散成单个细胞，动物细胞培养的气体环境为95%空气+5%CO2，其中空气满足细胞有氧呼吸需求，CO2的作用是维持培养液的pH。 (2)小问详解： 将外源DNA导入动物细胞，最常用的方法是显微注射法，片段1含潮霉素抗性基因，片段2含嘌呤霉素抗性基因，因此培养基中同时添加两种抗生素，只有同时导入两个片段的细胞才能存活，完成筛选。根据Cre酶切后的产物反向推导，插入12号染色体的片段2（位于MDM2右侧，以靠近MDM2为左）元件顺序为①潮霉素抗性基因（位于MDM2左侧），④绿色荧光蛋白基因上游序列（loxP位点左侧），⑥loxP位点，③红色荧光蛋白基因（loxP位点右侧），而②嘌呤霉素抗性基因和⑤绿色荧光蛋白基因下游序列位于MDM2右侧。 (3)小问详解： 真核细胞分裂时，纺锤丝需要附着在着丝粒上牵引染色体平均分配，ecDNA是游离的环状DNA，缺少着丝粒，无法被纺锤丝牵引，因此不能平均分配。ecDNA携带绿色荧光蛋白的相关序列，红色荧光蛋白基因位于染色体上，因此丢失ecDNA的子细胞只能观察到红色荧光，无绿色荧光。ecDNA携带原癌基因MDM2，拷贝数增加会导致原癌基因过量表达，最终导致细胞癌变。ecDNA携带潮霉素抗性基因，不含ecDNA的细胞没有该抗性，因此培养液中加入潮霉素可以筛选保留ecDNA的细胞，使含ecDNA的细胞比例增加。 8.（2026·河北承德·一模）（多选）虾青素属于类胡萝卜素，具有抗衰老、增强免疫等功能，可由胡萝卜素在酮化酶（BKT）和羟化酶（CRTR-B）的作用下转化形成。研究人员将BKT基因和CRTR-B基因导入某种能大量合成胡萝卜素的绿藻细胞，实现了虾青素的工厂化生产。回答下列问题： （1）研究人员采用了无缝克隆In-Fusion技术，即利用同源的DNA序列之间能将任意DNA片段无缝连接在一起，同时将BKT基因和CRTR-B基因导入了质粒中，基本流程见图1，图2为该过程的局部放大。 ①在采用无缝克隆In-Fusion前，需先将BKT基因和CRTR-B基因进行PCR扩增。可从　　　　　　　　　中检索BKT基因和CRTR-B基因的序列信息，以设计出特定引物，同时要在相应引物的　　　　　　　　　（填“3′”或“5′”）端添加特定的同源序列。 ②将BKT基因、CRTR-B基因和质粒置于同一装置，利用T5核酸外切酶沿“5′→3′”的方向水解DNA片段的一条链的部分序列，其目的是形成　　　　　　　　　。 ③将T5核酸外切酶处理后的片段通过DNA聚合酶和DNA连接酶处理，构成重组DNA．DNA聚合酶和DNA连接酶在发挥作用时的区别是　　　　　　　　　（写出两点）。 （2）将上述重组质粒导入大肠杆菌，在培养基培养一段时间后，利用特定的引物分别对单菌落进行PCR，产物采用　　　　　　　　　技术鉴定，结果如图3所示，　　　　　　　　　号条带长度符合预期，即为成功导入外源BKT基因和CRTR-B基因的目的菌。 （3）从上述符合要求的大肠杆菌中选取重组质粒导入能大量合成胡萝卜素的绿藻细胞的叶绿体中，可利用　　　　　　　　　技术筛选出高表达BKT蛋白和CRTR-B蛋白的绿藻细胞。导入叶绿体的优点有叶绿体具有自我复制功能，使得一个细胞中可含有多个叶绿体，从而大大提高　　　　　　　　　。将生长良好的转基因绿藻细胞在液体培养基中培养，并定期利用　　　　　　　　　（填装置）在显微镜下进行计数，当数量达到一定规模后接入工业发酵罐中培养，上述在发酵罐前进行的操作称为　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 序列数据库（或GenBank）    ② 5'    ③ 黏性末端    ④ DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的DNA链上，形成磷酸二酯键，而DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要模板     （2）① 琼脂糖凝胶电泳    ② 1、2、4     （3）① 抗原—抗体杂交    ② 目的基因的表达量    ③ 血细胞计数板    ④ 扩大培养      (1)小问详解： ①可在序列数据库中检索、查询相关基因的序列信息，以便设计相关引物。因为要保证PCR扩增的目的基因两侧有相关的同源序列，所以要先在特定引物的5′端添加特定的同源序列。 ②③据图2可知，T5核酸外切酶水解DNA片段产生的黏性末端通过碱基互补配对发生结合，在DNA聚合酶的催化下补全被水解的部分，再在DNA连接酶的催化下各片段连接成完整的重组DNA，由此可见DNA聚合酶催化单个核苷酸添加到已有的DNA链上，形成磷酸二酯键，而DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶发挥作用时需要模板，DNA连接酶不需要模板。 (2)小问详解： 将（1）中重组质粒导入大肠杆菌，在培养基培养一段时间后，利用特定的引物分别对单菌落进行PCR，产物采用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定。由于BKT基因和CRTR-B基因分别为400bp和550bp，所以1、2、4号条带符合预期，3号仅具BKT基因，5号不具目的基因。 (3)小问详解： 可利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达出相关蛋白质。由于细胞中的叶绿体数量多，当将目的基因导入叶绿体后，可提高目的基因的表达量。在接入发酵罐前，需进行扩大培养，因绿藻体积较大，应使用血细胞计数板进行数量检测。 9.（2026·河北邯郸·一模）小麦条锈病是由条形柄锈菌侵染小麦引起的一种严重的真菌病害，严重影响小麦的产量和品质。某实验室欲利用基因工程技术、植物细胞培养等培育抗病小麦品种，相关结构如图所示，已知AmpR为氨苄青霉素抗性基因，ASA1/B1为色氨酸合成酶基因。不同限制酶的切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列和切割位点 BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ MfeⅠ 5′-C↓AATTG-3′ KpnⅠ 5′-GGTAC↓C-3′ HindⅢ 5′-A↓AGCTT-3′ （1）已知乙链为模板链，则构建重组质粒时，最好使用限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对目的基因进行切割。 （2）为初步筛选导入重组质粒的小麦细胞，在培养基成分设置上可采取　　　　　　　　两项措施。培养过程中，可通过调整　　　　　　　　（写出具体名称）的比例使细胞分化朝着预定方向进行。 （3）若利用PCR对目的基因进行扩增，则PCR中复性时降温的目的主要是　　　　　　　　。已知某抗病植株由通过农杆菌转化法转入一个抗病基因并成功表达的转化细胞培育而来，现欲通过生物育种方法利用该植株在短期内获得大量能稳定遗传的抗病植株，请对该方法进行简述：　　　　　　　　。 【答案】（1）① EcoR Ⅰ    ② Hind Ⅲ     （2）① 添加氨苄青霉素、不加色氨酸    ② 生长素和细胞分裂素     （3）① 使(两种)引物(分别)与两条单链DNA结合(从而使子链进行延伸)    ② 利用花药离体培养技术，将该植株的花粉培育至单倍体幼苗植株，淘汰不抗病植株，再将抗病幼苗植株进行低温诱导或用秋水仙素处理，获得正常抗病植株（合理即可）      (1)小问详解： 乙链为模板链，构建重组质粒时，需要将其3´端连接在启动子一侧，根据质粒上限制酶识别切割序列，右侧只能选择HindⅢ切割，BamHⅠ会破坏启动子，MfeⅠ会破坏目的基因，因此应使用限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对目的基因进行切割。 (2)小问详解： 重组质粒含有AmpR和ASA1/B1，因此可通过采取向培养基添加氨苄青霉素、不加色氨酸等措施对转化后的小麦细胞进行初步筛选。培养过程中，生长素比例高促进根的分化，细胞分裂素比例高促进芽的分化，因此需调整生长素和细胞分裂素的比例，使细胞分化朝着预定方向进行。 (3)小问详解： PCR 的复性阶段降温，主要是为了使引物与模板两条单链DNA 的互补序列结合（即引物与模板链退火结合），为后续 Taq 酶催化子链合成做好准备。可利用单倍体育种在短期内获得大量纯合植株，具体操作利用花药离体培养技术，将该植株的花粉培育至单倍体幼苗植株，淘汰不抗病植株，再将抗病幼苗植株进行低温诱导或用秋水仙素处理幼苗，获得正常抗病植株，优点是能明显缩短育种年限，获得纯合子，这种育种属于单倍体育种。 10.（2026·河北唐山·一模）（多选）乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： （1）使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入　　　　　　　　　等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去　　　　　　　　　特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是　　　　　　　　　 （2）天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过　　　　　　　　　工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'　　　　　　　　　3'。 （3）为实现单碱基对的定点突变，应选用引物　　　　　　　　　（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是　　　　　　　　　。在去除模板质粒的PCR产物中加入　　　　　　　　　以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用　　　法检测目的基因是否表达成功。 （4）图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 血清    ② 接触抑制    ③ 维持培养液的pH     （2）① 蛋白质    ② 5'-GCC-3'     （3）① 2和3    ② DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连    ③ DNA连接酶    ④ 抗原—抗体杂交     （4）与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用      【分析】 基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 由于人们对动物细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入血清等天然成分。癌细胞具有无限增殖的能力，培养癌细胞的过程中不会发生接触抑制现象。可见，与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去接触抑制的特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是维持培养液的pH。 (2)小问详解： 天冬酰胺酶的化学本质为蛋白质，可通过蛋白质工程改造其结构。编码第50位的天冬氨酸模板链中对应的碱基序列为5'-GTC-3'，则mRNA中对应的天冬氨酸密码子为5'-GAC-3'。若通过单个碱基对的替换将第50位的天冬氨酸替换为甘氨酸，则甘氨酸密码子应为5'-GGC-3'，因此需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'-GCC-3'。 (3)小问详解： PCR的子链延伸方向是5′→3′，引物必须与模板链的3′端结合，才能保证子链从引物的3′端（-OH）开始延伸，所以为实现单碱基对的定点突变，应选用引物2和引物3对质粒1进行全质粒扩增。由于DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端，不能将线性DNA相连，所以全质粒扩增产物为线性DNA。在去除模板质粒的PCR产物中加入DNA连接酶，能够将产物的两端连接形成闭环，以便得到质粒2。若目的基因在受体细胞内控制合成了相应的蛋白质，则表明目的基因表达成功，可采用抗原—抗体杂交法进行检测。 (4)小问详解： 由图2可知改造后的酶作为候选药物的优势为：与改造前相比，改造后的天冬酰胺酶水解天冬酰胺的酶活性显著提高、水解谷氨酰胺的酶活性明显降低，说明改造后的天冬酰胺酶显著提高了对癌细胞增殖的抑制作用，降低了长期使用对正常细胞造成损伤的副作用。 11.（2026·河北石家庄·二模）科研团队利用毒素（毒素T蛋白）-解毒（解药R蛋白）机制精准筛选转入目的基因的受体细胞，原理是T基因表达的毒素T蛋白毒害细胞，R基因表达的解药R蛋白能特异性结合毒素T蛋白，且仅R基因与T基因先后依次表达时，解药R蛋白才能完全中和毒素T蛋白。回答下列问题： 限制酶 酶切位点 Sma Ⅰ Pst Ⅰ 注：①空质粒上无R基因和T基因；②细胞内无任何天然解毒物质；③不含T基因的菌体，会在筛选平板上出现小菌落；只含有“启动子-R-X-T-终止子”的菌体才长出大菌落。 （1）融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。PCR是一项依据　　　　　原理对目的基因大量扩增的技术，每次循环一般可以分为　　　　　三步。图中引物2、引物3的加入使得第二阶段中两DNA能成功“搭桥”连接起来。若通过融合PCR技术依次将R基因、目的基因X、T基因拼接起来形成融合基因，需要设计　　　　　种引物，其中起“搭桥”作用的引物有　　　　　种。 （2）表为空质粒上的几种限制酶的酶切位点，若将扩增后的融合基因与经Sma Ⅰ酶切后的质粒直接构建重组质粒，这种做法的缺点为　　　　　（答出2点）。若选用Pst Ⅰ切割质粒后再用DNA聚合酶　　　　　（填“能”或“不能”）补齐黏性末端成为平末端，理由是　　　　　。 （3）进行将目的基因导入受体菌的操作后，将受体菌涂布在筛选平板上培养，观察到有大小两种菌落，其中小菌落的导入情况有　　　　　（填写序号）①未导入质粒、②导入空质粒、③导入重组质粒”。 （4）若重组质粒中相关序列为“启动子-T-X-R-终止子”，会导致菌体提前死亡，原因是　　　　　。 【答案】（1）① DNA半保留复制    ② 变性、复性和延伸    ③ 6    ④ 4     （2）① 易发生质粒或目的基因的自身环化；易发生质粒与目的基因间的反向连接；连接效率低    ② 不能    ③ Pst Ⅰ切割DNA形成的黏性末端为 ，DNA聚合酶催化子链延伸的方向为5ʼ→3ʼ，无法从3ʼ→5ʼ延伸     （3）①②     （4）解药R蛋白不能完全中和毒素T蛋白      (1)小问详解： PCR的原理是DNA的半保留复制，每次循环一般分为变性（高温使双链DNA解旋）、复性（低温使引物与单链模板结合）、延伸（耐高温的DNA聚合酶催化子链合成）三步。融合PCR拼接3个独立基因时，每个基因需要2条特异性引物，共6条引物；其中相邻两个基因之间的互补配对引物（共4条），可使相邻片段在第二阶段PCR中完成“搭桥”连接。 (2)小问详解： 平末端连接无碱基互补的方向性，因此易发生质粒或目的基因的自身环化；易发生质粒与目的基因间的反向连接；连接效率低。Pst Ⅰ切割DNA形成的黏性末端为 ，DNA聚合酶催化子链延伸的方向为5ʼ→3ʼ，无法从3ʼ→5ʼ延伸，不能对3'突出的末端进行补平操作。 (3)小问详解： 题干明确“不含T基因的菌体，会在筛选平板上出现小菌落；只有含启动子-R-X-T-终止子的菌体才长出大菌落”。①未导入质粒的菌体，不含T基因，形成小菌落；②导入空质粒的菌体，空质粒无R、T基因，不含T基因，形成小菌落；③导入重组质粒的菌体，若质粒结构正确会形成大菌落，若质粒含T基因但结构错误，会因毒素毒害死亡，无法形成菌落，因此小菌落的导入情况仅为①②。 (4)小问详解： 题干明确“仅R基因与T基因先后依次表达时，解药R蛋白才能完全中和毒素T蛋白”，即必须R先表达产生解药，T后表达产生毒素，才能避免菌体被毒害。若序列为“启动子-T-X-R-终止子”，T基因先表达、R基因后表达，解药R蛋白不能完全中和毒素T蛋白，导致菌体提前死亡。 12.（2026·河北唐山·二模）研究者将雨生红球藻中两种合成类胡萝卜素的关键酶基因B及基因C导入衣藻，使其成为生产类胡萝卜素的“细胞工厂”。 回答下列问题： （1）基因表达载体构建(图1) 选用限制酶分别对质粒1和质粒2进行酶切，并将基因B插入到具有高表达启动子的质粒2中构建重组质粒。质粒2中高表达启动子位于　　　　　　　　　　　(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)处，理由是　　　　　　　　　　　。 用EcoRⅤ处理质粒3产生平末端；用EcoRI处理重组质粒获得具有黏性末端且含基因B的DNA片段；为使含基因B的DNA片段与质粒3相连，可利用　　　　　　　　　　　酶补平黏性末端，使之成为平末端，再利用　　　　　　　　　　　酶使两者高效连成为基因表达载体。 （2）目的基因的检测与鉴定 将基因表达载体导入衣藻后，初步在含　　　　　　　　　　　的培养基上培养，得到衣藻转化体1、2，研究者依据目的基因的序列设计引物，利用PCR技术进一步确定目的基因导入情况，电泳结果如下图所示： 为了确保图2结果的准确性，设计的引物是　　　　　　　　　　　。为检测两种基因的表达情况，写出一个简要的实验思路。 （3）研究者对比了转化体和野生型衣藻的类胡萝卜素含量，结果如图4所示。与野生型衣藻相比，该转化体生产类胡萝卜素的优点是　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① Ⅱ    ② 基因B的转录方向为从PamCⅠ到XbaⅠ，高表达启动子必须位于质粒2的PamCⅠ处（即Ⅱ处），才能驱动基因B的转录；若位于Ⅰ处（XbaⅠ处），则无法启动转录。    ③ DNA聚合酶    ④ T4DNA连接酶     （2）① 壮观霉素    ② 特异性结合目的基因的引物    ③ 实验思路：提取转化体总RNA进行RT一PCR检测mRNA，或提取蛋白质用抗原抗体杂交技术检测目的蛋白     （3）类胡萝卜素产量更高(或含量更高)      (1)小问详解： 由图1可知，基因B的转录方向为从PamCⅠ位点指向XbaⅠ位点（即从右至左）。 启动子必须位于目的基因的上游（首端），才能启动转录。   质粒1用XbaⅠ和PamCⅠ双酶切获取基因B，基因B插入到质粒2，根据双酶切，PamCⅠ在Ⅱ处上游，所以高表达启动子位于Ⅱ处，才能保证基因B转录方向和启动子到终止子的方向是一致的。 (2)小问详解： 基因表达载体通常含标记基因(如抗性基因)，转化后需在含对应筛选物质壮观霉素的培养基上培养，以初步筛选转化体。PCR引物设计：为确保PCR结果准确性，引物应特异性结合目的基因序列，避免非特异性扩增需设计能扩增目的基因片段的引物。基因表达检测实验思路：提取转化体的总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)检测目的基因的mRNA表达；或提取蛋白质，用抗原抗体杂交的原理来检测目的基因编码的蛋白质，以确定基因是否表达。 (3)小问详解： 对比野生型与转化体：图4结果显示转化体的类胡萝卜素含量高于野生型，故优点是类胡萝卜素产量更高(或含量更高)。 13.（2026·河北张家口·二模）淀粉是自然界最丰富的可再生碳源之一，但酿酒酵母因缺乏分泌淀粉酶的能力而不能直接利用淀粉，也无法将淀粉分解后的麦芽糖高效转运至细胞内。某科研团队拟通过基因工程手段，构建能够利用淀粉发酵生产乙醇的“解淀粉酵母”。回答下列问题： （1）若α-淀粉酶表达量过高，可能会抑制酵母菌生长，因此应选用　　　　　（填“持续表达型”或“诱导型”）启动子来控制相关基因的表达。 （2）酵母菌具有高效的同源重组（当酵母菌自身基因两侧的小段碱基序列与基因表达载体上的碱基序列相同时，就可以发生切割并交换两段序列之间的结构）能力。研究人员计划将α-淀粉酶基因（AMY）和标记基因（URA3，编码尿嘧啶合成必需的酶）构建成一个基因表达盒，两侧加上一段与酵母菌染色体X位点两侧同源的序列（L1和L2），如下图1所示，此过程中L1和L2的序列不同，其目的是　　　　。通过同源重组将基因表达盒整合到酵母菌染色体上时，需要DNA酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的参与，三种酶均作用于　　　　　（填化学键的名称），且应选择　　　　　（填“尿嘧啶缺陷型”或“野生型”）酵母菌作为受体细胞，再利用选择培养基筛选转化成功的酵母菌。 （3）为验证AMY基因是否已正确整合到染色体X位点，研究人员设计了三组PCR引物，其结合位置如图2所示，若AMY基因已正确整合，应能通过引物对　　　　　（选填P1～P6）扩增出预期大小的条带。 （4）为使同一标记基因可以重复用于下一轮麦芽糖酶基因（MAL）的导入，应从（2）中转化成功的酵母菌中将URA3基因敲除。为此，研究人员在URA3基因两侧添加了一对同向重复序列（DR）用于同源重组，受体酵母菌中不能含有DR的原因是　　　　　。 （5）成功构建的“解淀粉酵母”在5L发酵罐中进行乙醇发酵实验，发酵液中应以　　　　　为唯一碳源，在发酵初期（0～12h）应维持　　　　　（填“高”或“低”）溶氧条件以增加酵母菌数量。 【答案】（1）诱导型     （2）① 保证基因表达盒定向整合到染色体X位点（避免表达盒反向插入）    ② 磷酸二酯键    ③ 尿嘧啶缺陷型     （3）P2和P3     （4）避免受体基因组中的DR序列与目的片段上的DR发生错误同源重组，保证仅URA3基因被精准敲除      （5）① 淀粉    ② 高      (1)小问详解： 分析题意，α-淀粉酶表达量过高会抑制酵母菌生长，诱导型启动子可以人为控制基因表达的时机与表达量，避免基因持续高表达抑制酵母生长，因此选择诱导型启动子。 (2)小问详解： L1、L2分别对应染色体X位点两侧的同源序列，序列不同可保证目的基因表达盒按正确方向整合，避免反向插入错误；DNA酶切割磷酸二酯键、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键、DNA连接酶连接DNA片段形成磷酸二酯键，三种酶均作用于磷酸二酯键；标记基因URA3的作用是让细胞合成尿嘧啶，因此需要选择自身不能合成尿嘧啶的尿嘧啶缺陷型酵母作为受体，才能在不含尿嘧啶的选择培养基中筛选出成功转化的酵母。 (3)小问详解： PCR扩增需要一对引物分别结合DNA双链，延伸方向相反才能扩增出目的片段，引物需要与模板的3'端结合，结合图示可知，若AMY正确整合，P2（上游反链）向右延伸、P3（下游正链）向左延伸，可扩增出预期大小的条带。引物2、5只能确定接上了目的基因，无法确定是否为反接等异常现象。 (4)小问详解： 若受体酵母菌本身含有DR序列，会和导入的DR发生非特异性同源重组，导致错误切割重组，无法精准只敲除URA3，因此受体酵母不能含有DR序列。 (5)小问详解： 本实验目标是筛选能直接利用淀粉的解淀粉酵母，因此发酵液需要以淀粉作为唯一碳源，在该培养基上只有能分解淀粉的微生物才能存活；酵母菌为兼性厌氧菌，有氧呼吸才能大量增殖，因此发酵初期需要维持高溶氧，促进酵母菌有氧呼吸大量繁殖增加菌体数量。 14.（2026·河北邯郸·二模）（多选）锦鲤疱疹病毒（KHV）可导致病鱼出现肾炎、鳃坏死等问题，影响生产。开发锦鲤疱疹病毒疫苗或可有效预防KHV感染。研究发现，该病毒囊膜蛋白由ORF126基因和ORF27基因等编码。现获得ORF126-ORF27融合蛋白作为疫苗的有效成分，并检测免疫效果。根据以下资料和图示，回答问题： 已知：ORF126基因编码链上下游序列：5′-CCGGAATTCATG……GCTTCTAGAGCA-3′；ORF27基因编码链上下游序列：5′-TGCTCTAGAATG……GGCAAGCTTGGG-3′；LacZ基因表达产物可使白色底物X-gal变蓝；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。 （1）从病鱼体内扩增上述两基因以构建融合基因，可选用　　　　　　　　（填字母）引物对扩增ORF126基因，选用　　　　　　　　（填字母）引物对扩增ORF27基因。扩增后的产物使用　　　　　　　　（填图中限制酶）和DNA连接酶可构建融合基因。 A．5′-CCGGAATTCATG-3′ B．5′-GGCCTTAAGTAC-3′ C．5′-TGCTCTAGAAGC-3′ D．5′-TCACGGCTTCTA-3′ E．5′-CCCAAGCTTGCC-3′ F．5′-TGCTCTAGAATG-3′ （2）利用融合基因构建表达载体时，可选用限制酶　　　　　　（填图中限制酶名称）。将构建的基因表达载体导入工程菌后通过在选择培养基中加入　　　　　　和　　　　　　筛选，判断表达载体成功构建并导入的依据是　　　　　　。 （3）选取目标菌落在　　　　　　（填“液体”或“固体”）培养基中进行扩大培养，裂解菌体获得蛋白后，可使用　　　　　　方法检测是否存在ORF126-ORF27融合蛋白。 （4）提纯该融合蛋白溶解于生理盐水，对健康鲤鱼进行腹腔注射，支持该蛋白能作为疫苗有效成分的实验现象为　　　　　　。 【答案】（1）① AC    ② FE    ③ XbaⅠ     （2）① EcoRⅠ和HindⅢ    ② 氨苄青霉素    ③ X-gal    ④ 长出白色菌落     （3）① 液体    ② 抗原-抗体杂交     （4）注射该融合蛋白的鲤鱼感染KHV后，存活率显著高于对照组（或发病率显著低于对照组）      (1)小问详解： PCR扩增目的基因时，正向引物与目的基因编码链的上游序列一致，反向引物与目的基因编码链的下游序列互补。ORF126编码链上游为5′−CCGGAATTCATG，匹配引物A，下游为GCTTCTAGAGCA−3′，反向互补后匹配引物C，因此选AC；ORF27编码链上游为5′−TGCTCTAGAATG，匹配引物F，下游为GGCAAGCTTGGG−3′，反向互补后匹配引物E，因此选FE。ORF126下游和ORF27上游都带有XbaⅠ酶切位点，因此用XbaⅠ酶切后可连接获得融合基因。 (2)小问详解： 融合基因上游带EcoRⅠ酶切位点、下游带HindⅢ酶切位点，载体中LacZ基因位于EcoRⅠ和HindⅢ之间，因此选用EcoRⅠ和HindⅢ构建表达载体。AmpR为氨苄青霉素抗性基因，可筛选出成功导入载体的工程菌；目的基因插入后会破坏LacZ基因，而LacZ表达产物可使X−gal变蓝，因此培养基加入氨苄青霉素和X−gal，成功构建表达载体并导入的工程菌能抗氨苄青霉素（可生长），且LacZ失活，长出白色菌落。 (3)小问详解： 工程菌扩大培养选用液体培养基；检测目的基因是否表达出蛋白质，常用抗原-抗体杂交的方法。 (4)小问详解： 疫苗可诱导机体产生特异性免疫，若该融合蛋白是疫苗的有效成分，注射该融合蛋白的鲤鱼感染KHV后，存活率显著高于对照组（或发病率显著低于对照组）。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年真题1年模拟 考点分类 河北考情 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2026河北（1题）、2025河北（1题）、2024河北（1题）、2023河北（1题）、2021河北（1题） · 情境设置：以微生物发酵、环境治理、作物改良、生物能源等真实科研情境为载体，强调工具酶的实际应用 · 考查重点：限制酶选择、载体构建、标记基因功能等核心工具的原理与操作逻辑 · 命题趋势：与基因表达调控（如CreA蛋白抑制）、信号肽定位等前沿技术融合，突出工具选择的科学性分析 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2022河北（1题） · 情境设置：以作物抗虫育种等农业生产实际问题为背景，体现PCR在基因克隆中的关键作用 · 考查重点：引物设计原则、扩增条件优化、产物鉴定及与后续酶切、连接步骤的衔接 · 命题趋势：PCR与基因编辑、多基因叠加转化技术结合，强调引物特异性设计与扩增效率的定量分析 考点1 基因工程的基本工具 1.（2026·河北·高考真题）（多选）黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用　　　　　　　　　（填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照　　　　　　　　　原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的　　　　　　　　　端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是　　　　　　　　　。 A （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有　　　　　　　　　基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用　　　　　　　　　培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点） 2.（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是　　　　　和　　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为　　　　　。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加　　　　　（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是　　　　　。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是　　　　　。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 3.（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用　　　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　，通过　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为　　　　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　　　　免疫和　　　　　　　　免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。（答出两点即可） 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的类型的判断 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动转录 载体中可人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 将r2HN基因导入水稻愈伤组织的方法 可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞 水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；可利用显微注射技术将目的基因导入动物细胞 病毒进入体内发生的免疫 特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫 根据图示，抗体和T细胞的数量都增加了，说明病毒进入体内既引发了体液免疫又引发了细胞免疫 4.（2023·河北·高考真题）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： （1）根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　　　差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 （2）超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　　　和　　　等。本研究中目的基因为　　　。 （3）PCR扩增时引物通过　　　原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的　　　组，样品2有特异性扩增产物，结果表明　　　。     （4）利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显　　　。同时，还需测定　　　以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。     （5）胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，　　　，最终促进胞内脂质合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　　　。（答出两点即可） 5.（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为　　　　　　　　　　。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是　　　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是　　　　　　　　　　。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的　　　　　　　　　　（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的　　　　　　　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　　　　　（写出两点即可）。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2022·河北·高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： （1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是　　　　　　　　。 （2）　　　　　　　　是实施基因工程的核心。 （3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的　　　　　　　　上，此方法的不足之处是　　　　　　　　。 （4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有　　　　　　　　（写出两点即可）。 （5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的　　　　　　　　以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析　　　　　　　　（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是　　　　　　　　。 （6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生　　　　　　　　。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是　　　　　　　　（写出两点即可）。 1.（2026·河北承德·一模）葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，科研人员将其第138位甘氨酸（GGU）以脯氨酸（CCU）替代，其最适反应温度提高10～12℃，从而提高了该酶的热稳定性。下列叙述错误的是（　　） A. 可通过PCR技术实现GI基因定点突变 B. 改造后的基因嘧啶碱基比例与改造前相同 C. 可将改造后的GI基因直接导入大肠杆菌中生产GI D. 改造后的GI的空间结构可能发生了改变 2.（2026·河北承德·一模）某水母体内含有的绿色荧光蛋白（GFP）能发出绿色荧光。但荧光中有5/6为不可见光，所以绿光很微弱。有科学家采用PCR定点突变的方法，将GFP第65位的丝氨酸替换为苏氨酸得到绿光荧光强度增强的eGFP。关于该技术，下列说法错误的是（　　） A. 该技术是以GFP结构和荧光强度增加的关系为基础 B. 该设计改造GFP结构的实质是改造GFP基因的结构 C. 将eGFP与某蛋白连接，可追踪该蛋白在细胞中的分布与含量 D. 将eGFP基因直接导入酵母菌，而非大肠杆菌，以获得正确折叠的eGFP 3.（2026·河北唐山·一模）（多选）基因A促进番茄细胞内类黄酮的分解。将基因A反向插入载体，使其在番茄细胞内转录生成与内源基因A的mRNA互补的反义RNA，可抑制内源基因A的表达，进而提高类黄酮的含量，实验部分流程如图所示。下列叙述正确的是（　　） Ti质粒局部结构 A. Ti质粒中还应含有的结构是复制原点 B. 扩增基因A所用引物1的5＇端应添加HindIII限制酶的识别序列 C. 农杆菌转化后的叶肉细胞应在含潮霉素或卡那霉素的培养基中培养 D. 番茄叶肉细胞脱分化期间通常需给予适当光照 4.（2026·河北唐山·二模）（多选）下图为单引物PCR的基本流程，其中DpnI酶可以使甲基化的DNA水解；DH5α为大肠杆菌，其可以完成DNA双链修复并扩增相应DNA．下列说法正确的是（       ） A. 单引物PCR的模板是环状DNA的两条单链 B. 单引物PCR经过3个循环才可以得到完整突变DNA C. 单引物PCR之前，模板DNA需要进行甲基化处理 D. 单引物PCR可以定向改变DNA序列实现定点突变 5.（2026·河北邯郸·二模）（多选）白化病是由于酪氨酸酶基因异常，使黑色素细胞无法合成黑色素而引起的单基因遗传病。科研人员尝试通过基因修复、细胞诱导等技术治疗白化病，下列相关叙述正确的有（       ） A. 白化病患者的黑色素细胞因无法合成黑色素而发生细胞坏死，并引发机体炎症反应 B. 对异常细胞进行基因修复使其恢复功能，该过程改变了细胞的遗传信息 C. 诱导患者干细胞分化为正常黑色素细胞，体现了动物细胞的全能性 D. 癌细胞与黑色素合成异常细胞相比，前者细胞周期变短、膜上糖蛋白减少 6.（2026·河北保定·一模）随着合成生物学的发展，利用工程菌表达具有治疗功效的分子可提高细菌的抗肿瘤能力。已知ClyA基因的表达产物是一种定位于细菌外膜的蛋白，而Noxa基因表达产物可激活小鼠体内的抗肿瘤免疫反应。科研人员将ClyA与Noxa的融合基因插入到温度敏感质粒pBV220中构建了重组质粒，并将其转化至非致病性的大肠杆菌MG1655，从而获得工程菌TRB，构建的过程如图1所示。给小鼠注射大肠杆菌后该菌会靶向肿瘤处聚集，导致肿瘤部位颜色变暗而容易被发现。回答下列问题： 注：ori表示复制原点；Tc1表示一种基因；PR―PL表示一种启动子；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。 （1）通过PCR分别扩增ClyA和Noxa基因时，缓冲液中添加Mg2+的目的是　　　　　　　。利用PCR构建ClyA-Noxa融合基因时两种基因在融合处需具有　　　　　　黏性末端，同时剔除　　　　　　基因中的编码终止密码的序列。 （2）在质粒pBV220中AmpR的功能是作为　　　　　。质粒线性化时，选用EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ进行双酶切以防止　　　　　　　（答出1点）。将大肠杆菌MG1655置于　　　　（填“高”或“低”）浓度的CaCl2溶液中，可使细胞体积膨胀增加膜的通透性，有利于重组质粒的转入。 （3）已知Tc1基因的表达产物可结合到PR―PL启动子上阻止　　　　　识别和结合从而影响转录过程。研究发现，当温度较高时，Tc1蛋白构象会被破坏，ClyA-Noxa融合基因的表达量将　　　　　　　　　。 （4）将荷瘤小鼠分为5组，分别处理如下：只注入磷酸盐缓冲液（PBS）、注入MG1655、注入MG1655并用激光照射（MG1655+L）、注入TRB、注入TRB并用激光照射（TRB+L），已知用激光照射肿瘤部位时可引发光能转化为热能。处理后监测小鼠肿瘤体积随时间的变化情况，实验结果（如图2）表明，五组实验中，　　　　　　　组的肿瘤治疗效果最明显，分析其原因是　　　　　　　　　　　。 （5）用最优方案治疗后，继续检查小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官有无明显病理改变，这些检查的目的是　　　　　　　　　　　。 7.（2026·河北石家庄·一模）临床调查发现部分癌症患者的癌细胞中存在着携带原癌基因的ecDNA（由于染色体断裂和重新连接，形成游离于染色体外的环状DNA分子）。Cre酶可以将DNA上两个相同loxP位点之间的片段切割后环化，作用原理如图1所示。为构建与癌细胞中类似的ecDNA用于研究。研究者将片段1和片段2（两段均为含loxP位点和标记基因的外源DNA）插入小鼠细胞的12号染色体，再用Cre酶处理，构建了含原癌基因MDM2的ecDNA的细胞模型，过程如图2所示。 （1）常用　　　　　处理培养小鼠细胞使其分散成单个细胞进行培养，培养这些细胞的气体环境为　　　　　。 （2）将片段1和片段2导入小鼠细胞最常用的方法是　　　　　，若想筛选出同时导入片段1和片段2的细胞可在培养基中添加　　　　　。图2中插入小鼠细胞12号染色体上的片段2的组成元件从左向右依次为　　　　　。 ①潮霉素抗性基因 ②嘌呤霉素抗性基因 ③红色荧光蛋白基因 ④绿色荧光蛋白基因上游序列 ⑤绿色荧光蛋白基因下游序列 ⑥loxP位点 （3）ec细胞分裂时，复制后的ecDNA随机分配给两个子细胞，ecDNA不能像染色体DNA一样平均分配的原因可能是自身缺少　　　　　（结构）。用荧光显微镜观察分裂产生的子细胞，观察到　　　　　（现象）的为丢失ecDNA的子细胞。子代ec细胞中ecDNA拷贝数增加可能会导致　　　　　，从而使细胞癌变。培养过程中，为使子代中ec细胞比例增加，可在培养液中加入　　　　　。 8.（2026·河北承德·一模）（多选）虾青素属于类胡萝卜素，具有抗衰老、增强免疫等功能，可由胡萝卜素在酮化酶（BKT）和羟化酶（CRTR-B）的作用下转化形成。研究人员将BKT基因和CRTR-B基因导入某种能大量合成胡萝卜素的绿藻细胞，实现了虾青素的工厂化生产。回答下列问题： （1）研究人员采用了无缝克隆In-Fusion技术，即利用同源的DNA序列之间能将任意DNA片段无缝连接在一起，同时将BKT基因和CRTR-B基因导入了质粒中，基本流程见图1，图2为该过程的局部放大。 ①在采用无缝克隆In-Fusion前，需先将BKT基因和CRTR-B基因进行PCR扩增。可从　　　　　　　　　中检索BKT基因和CRTR-B基因的序列信息，以设计出特定引物，同时要在相应引物的　　　　　　　　　（填“3′”或“5′”）端添加特定的同源序列。 ②将BKT基因、CRTR-B基因和质粒置于同一装置，利用T5核酸外切酶沿“5′→3′”的方向水解DNA片段的一条链的部分序列，其目的是形成　　　　　　　　　。 ③将T5核酸外切酶处理后的片段通过DNA聚合酶和DNA连接酶处理，构成重组DNA．DNA聚合酶和DNA连接酶在发挥作用时的区别是　　　　　　　　　（写出两点）。 （2）将上述重组质粒导入大肠杆菌，在培养基培养一段时间后，利用特定的引物分别对单菌落进行PCR，产物采用　　　　　　　　　技术鉴定，结果如图3所示，　　　　　　　　　号条带长度符合预期，即为成功导入外源BKT基因和CRTR-B基因的目的菌。 （3）从上述符合要求的大肠杆菌中选取重组质粒导入能大量合成胡萝卜素的绿藻细胞的叶绿体中，可利用　　　　　　　　　技术筛选出高表达BKT蛋白和CRTR-B蛋白的绿藻细胞。导入叶绿体的优点有叶绿体具有自我复制功能，使得一个细胞中可含有多个叶绿体，从而大大提高　　　　　　　　　。将生长良好的转基因绿藻细胞在液体培养基中培养，并定期利用　　　　　　　　　（填装置）在显微镜下进行计数，当数量达到一定规模后接入工业发酵罐中培养，上述在发酵罐前进行的操作称为　　　　　　　　　。 9.（2026·河北邯郸·一模）小麦条锈病是由条形柄锈菌侵染小麦引起的一种严重的真菌病害，严重影响小麦的产量和品质。某实验室欲利用基因工程技术、植物细胞培养等培育抗病小麦品种，相关结构如图所示，已知AmpR为氨苄青霉素抗性基因，ASA1/B1为色氨酸合成酶基因。不同限制酶的切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 识别序列和切割位点 BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ MfeⅠ 5′-C↓AATTG-3′ KpnⅠ 5′-GGTAC↓C-3′ HindⅢ 5′-A↓AGCTT-3′ （1）已知乙链为模板链，则构建重组质粒时，最好使用限制酶　　　　　　　　和　　　　　　　　对目的基因进行切割。 （2）为初步筛选导入重组质粒的小麦细胞，在培养基成分设置上可采取　　　　　　　　两项措施。培养过程中，可通过调整　　　　　　　　（写出具体名称）的比例使细胞分化朝着预定方向进行。 （3）若利用PCR对目的基因进行扩增，则PCR中复性时降温的目的主要是　　　　　　　　。已知某抗病植株由通过农杆菌转化法转入一个抗病基因并成功表达的转化细胞培育而来，现欲通过生物育种方法利用该植株在短期内获得大量能稳定遗传的抗病植株，请对该方法进行简述：　　　　　　　　。 10.（2026·河北唐山·一模）（多选）乳腺癌严重威胁着人类的健康。癌细胞需要从内环境吸收天冬酰胺，使用外源天冬酰胺酶降解内环境中的天冬酰胺可抑制癌细胞增殖，正常细胞能合成天冬酰胺，受影响较小。回答下列问题： （1）使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要加入　　　　　　　　　等天然成分。与正常组织细胞不同，乳腺癌细胞因失去　　　　　　　　　特性，可在培养瓶中堆叠生长。培养箱中通入CO2的主要作用是　　　　　　　　　 （2）天冬酰胺酶具有一定水解谷氨酰胺的酶活性，长期使用会对正常细胞造成损伤。为降低天冬酰胺酶的副作用，可通过　　　　　　　　　工程改造其结构。已知天冬氨酸密码子为GAU/GAC，甘氨酸密码子为GGU/GGC/GGA/GGG，若通过单个碱基对的替换将天冬酰胺酶中第50位的天冬氨酸（见图1）替换为甘氨酸，需将模板链中5'-GTC-3＇序列突变为5'　　　　　　　　　3'。 （3）为实现单碱基对的定点突变，应选用引物　　　　　　　　　（填编号）对质粒1进行全质粒扩增。全质粒扩增产物为线性DNA，从DNA聚合酶作用角度分析，原因是　　　　　　　　　。在去除模板质粒的PCR产物中加入　　　　　　　　　以得到质粒2.将质粒1和质粒2分别导入大肠杆菌后，可用　　　法检测目的基因是否表达成功。 （4）图2显示了改造前后的天冬酰胺酶对两种氨基酸的水解活性，据图分析改造后的酶作为候选药物的优势为　　　　　　　　　。 11.（2026·河北石家庄·二模）科研团队利用毒素（毒素T蛋白）-解毒（解药R蛋白）机制精准筛选转入目的基因的受体细胞，原理是T基因表达的毒素T蛋白毒害细胞，R基因表达的解药R蛋白能特异性结合毒素T蛋白，且仅R基因与T基因先后依次表达时，解药R蛋白才能完全中和毒素T蛋白。回答下列问题： 限制酶 酶切位点 Sma Ⅰ Pst Ⅰ 注：①空质粒上无R基因和T基因；②细胞内无任何天然解毒物质；③不含T基因的菌体，会在筛选平板上出现小菌落；只含有“启动子-R-X-T-终止子”的菌体才长出大菌落。 （1）融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图所示。PCR是一项依据　　　　　原理对目的基因大量扩增的技术，每次循环一般可以分为　　　　　三步。图中引物2、引物3的加入使得第二阶段中两DNA能成功“搭桥”连接起来。若通过融合PCR技术依次将R基因、目的基因X、T基因拼接起来形成融合基因，需要设计　　　　　种引物，其中起“搭桥”作用的引物有　　　　　种。 （2）表为空质粒上的几种限制酶的酶切位点，若将扩增后的融合基因与经Sma Ⅰ酶切后的质粒直接构建重组质粒，这种做法的缺点为　　　　　（答出2点）。若选用Pst Ⅰ切割质粒后再用DNA聚合酶　　　　　（填“能”或“不能”）补齐黏性末端成为平末端，理由是　　　　　。 （3）进行将目的基因导入受体菌的操作后，将受体菌涂布在筛选平板上培养，观察到有大小两种菌落，其中小菌落的导入情况有　　　　　（填写序号）①未导入质粒、②导入空质粒、③导入重组质粒”。 （4）若重组质粒中相关序列为“启动子-T-X-R-终止子”，会导致菌体提前死亡，原因是　　　　　。 12.（2026·河北唐山·二模）研究者将雨生红球藻中两种合成类胡萝卜素的关键酶基因B及基因C导入衣藻，使其成为生产类胡萝卜素的“细胞工厂”。 回答下列问题： （1）基因表达载体构建(图1) 选用限制酶分别对质粒1和质粒2进行酶切，并将基因B插入到具有高表达启动子的质粒2中构建重组质粒。质粒2中高表达启动子位于　　　　　　　　　　　(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)处，理由是　　　　　　　　　　　。 用EcoRⅤ处理质粒3产生平末端；用EcoRI处理重组质粒获得具有黏性末端且含基因B的DNA片段；为使含基因B的DNA片段与质粒3相连，可利用　　　　　　　　　　　酶补平黏性末端，使之成为平末端，再利用　　　　　　　　　　　酶使两者高效连成为基因表达载体。 （2）目的基因的检测与鉴定 将基因表达载体导入衣藻后，初步在含　　　　　　　　　　　的培养基上培养，得到衣藻转化体1、2，研究者依据目的基因的序列设计引物，利用PCR技术进一步确定目的基因导入情况，电泳结果如下图所示： 为了确保图2结果的准确性，设计的引物是　　　　　　　　　　　。为检测两种基因的表达情况，写出一个简要的实验思路。 （3）研究者对比了转化体和野生型衣藻的类胡萝卜素含量，结果如图4所示。与野生型衣藻相比，该转化体生产类胡萝卜素的优点是　　　　　　　　　　　。 13.（2026·河北张家口·二模）淀粉是自然界最丰富的可再生碳源之一，但酿酒酵母因缺乏分泌淀粉酶的能力而不能直接利用淀粉，也无法将淀粉分解后的麦芽糖高效转运至细胞内。某科研团队拟通过基因工程手段，构建能够利用淀粉发酵生产乙醇的“解淀粉酵母”。回答下列问题： （1）若α-淀粉酶表达量过高，可能会抑制酵母菌生长，因此应选用　　　　　（填“持续表达型”或“诱导型”）启动子来控制相关基因的表达。 （2）酵母菌具有高效的同源重组（当酵母菌自身基因两侧的小段碱基序列与基因表达载体上的碱基序列相同时，就可以发生切割并交换两段序列之间的结构）能力。研究人员计划将α-淀粉酶基因（AMY）和标记基因（URA3，编码尿嘧啶合成必需的酶）构建成一个基因表达盒，两侧加上一段与酵母菌染色体X位点两侧同源的序列（L1和L2），如下图1所示，此过程中L1和L2的序列不同，其目的是　　　　。通过同源重组将基因表达盒整合到酵母菌染色体上时，需要DNA酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的参与，三种酶均作用于　　　　　（填化学键的名称），且应选择　　　　　（填“尿嘧啶缺陷型”或“野生型”）酵母菌作为受体细胞，再利用选择培养基筛选转化成功的酵母菌。 （3）为验证AMY基因是否已正确整合到染色体X位点，研究人员设计了三组PCR引物，其结合位置如图2所示，若AMY基因已正确整合，应能通过引物对　　　　　（选填P1～P6）扩增出预期大小的条带。 （4）为使同一标记基因可以重复用于下一轮麦芽糖酶基因（MAL）的导入，应从（2）中转化成功的酵母菌中将URA3基因敲除。为此，研究人员在URA3基因两侧添加了一对同向重复序列（DR）用于同源重组，受体酵母菌中不能含有DR的原因是　　　　　。 （5）成功构建的“解淀粉酵母”在5L发酵罐中进行乙醇发酵实验，发酵液中应以　　　　　为唯一碳源，在发酵初期（0～12h）应维持　　　　　（填“高”或“低”）溶氧条件以增加酵母菌数量。 14.（2026·河北邯郸·二模）（多选）锦鲤疱疹病毒（KHV）可导致病鱼出现肾炎、鳃坏死等问题，影响生产。开发锦鲤疱疹病毒疫苗或可有效预防KHV感染。研究发现，该病毒囊膜蛋白由ORF126基因和ORF27基因等编码。现获得ORF126-ORF27融合蛋白作为疫苗的有效成分，并检测免疫效果。根据以下资料和图示，回答问题： 已知：ORF126基因编码链上下游序列：5′-CCGGAATTCATG……GCTTCTAGAGCA-3′；ORF27基因编码链上下游序列：5′-TGCTCTAGAATG……GGCAAGCTTGGG-3′；LacZ基因表达产物可使白色底物X-gal变蓝；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。 （1）从病鱼体内扩增上述两基因以构建融合基因，可选用　　　　　　　　（填字母）引物对扩增ORF126基因，选用　　　　　　　　（填字母）引物对扩增ORF27基因。扩增后的产物使用　　　　　　　　（填图中限制酶）和DNA连接酶可构建融合基因。 A．5′-CCGGAATTCATG-3′ B．5′-GGCCTTAAGTAC-3′ C．5′-TGCTCTAGAAGC-3′ D．5′-TCACGGCTTCTA-3′ E．5′-CCCAAGCTTGCC-3′ F．5′-TGCTCTAGAATG-3′ （2）利用融合基因构建表达载体时，可选用限制酶　　　　　　（填图中限制酶名称）。将构建的基因表达载体导入工程菌后通过在选择培养基中加入　　　　　　和　　　　　　筛选，判断表达载体成功构建并导入的依据是　　　　　　。 （3）选取目标菌落在　　　　　　（填“液体”或“固体”）培养基中进行扩大培养，裂解菌体获得蛋白后，可使用　　　　　　方法检测是否存在ORF126-ORF27融合蛋白。 （4）提纯该融合蛋白溶解于生理盐水，对健康鲤鱼进行腹腔注射，支持该蛋白能作为疫苗有效成分的实验现象为　　　　　　。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $