专题十三 考点三 基因工程(题组二)-【创新教程】2022-2026五年高考生物真题分类特训试卷

考点三基因工程（题组二） 1.(不定项)(2025·河北卷，15)X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为 1 3500。 某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间 的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩 增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是 ( ) 引物组合 引物组合 正常X染色体及引物示意图： S1和R1 S2和R2 S1断裂点 R1断裂点 母亲患儿母亲患儿 A·DMH☑ 52 R2 注：引物组合S1和S2、R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 郑 A,该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为3500 1 B.用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C.与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D.利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 2.(2025·安徽卷，15)质粒K中含有3-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码 的酶可分解X-gl,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载 留 体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 ( 杯 启动子 BamH I 蓝色 表达活性B-半乳糖苷酶 菌落 质粒K 导入 半乳糖苷酶基因 大肠杆菌 筛选平板 卡那霉素 (含X-gal和 抗性基因 卡那霉素) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 拟 C,因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 阳 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 3.(2024·山东卷，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大 肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光 标记的dATP)的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链 DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双 链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 () 反应管 加入的单链DNA 5-GCCGATCTTTATA-3 ① 3-GACCGGCTAGAAA-5 ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3 ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3 3-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5-TTCACTGGCCAGT-3 A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 157 4.(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是() A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 5.(2023·广东，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离沉淀→鉴定。下列 叙述错误的是 () A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 二、非选择题 6.(2026·广东卷，21)玉米籽粒胚乳的粉质与硬质是具有重要农艺价值的一对相对性状。我国 科学家在对玉米粉质品系A和硬质品系W两个纯合品系的研究中，发现等位基因V和V" 可能参与该性状的调控。进一步研究发现，这对基因的序列长度存在差异（图），且在胚乳发 育过程中VA的表达量显著低于VW的表达量。为明确这对基因参与性状调控的机制，开展如 下研究。 00-缺失片段-→350 100196 1054350 引物1引物2 引物3 注：数字示碱基对p)数量 图a 回答下列问题： (1)将两个品系进行正反交，获得的F,籽粒胚乳均表现为硬质，可知硬质为 性状。 (2)根据这对基因的序列设计了3种引物（图），便于通过PCR技术进行区分。PCR反应体系 中包括这3种引物、Tag DNA聚合酶（延伸速度约为1000bp/min)、缓冲液（含Mg2+)、水、4 种脱氧核苷酸和 ,反应参数见图b。预测品系W植株PCR产物电泳结果符合①~ ⑤（图c)中泳道 的带型。 温度时间循环数 标准 参照物 ①②③④⑤ 94℃ 5min 1 2000bp 94℃ 30s 1000bp 55℃ 30s 30 72℃ 30s 500bp 72℃10min 1 300bp 图b 图c (3)基于品系W构建了针对Vw基因的RNAi(可通过切割靶基因mRNA显著降低其表达)转 基因植株。鉴定转基因植株中V"基因表达是否受到影响，应提取植株 进行 PCR检测。若VW基因参与调控玉米胚乳性状，预测可得到下列结果（胚乳由极核和精子结合 后发育而成，极核和卵细胞携带的基因相同)： ①纯合转基因植株的籽粒胚乳性状为 ②杂合转基因植株自交产生的籽粒胚乳性状及比例为 (4)已知VW基因编码一种酶，在胚乳发育过程中催化非极性胡萝卜素转化为下游产物。研究 人员据此对胚乳性状的产生提出了一个假设，并设计研究思路：对品系A植株进行诱变，筛选 胚乳变为硬质的突变体，进而分析其中是否有非极性胡萝卜素合成途径的基因发生突变。推 测研究人员提出的假设。最合理的是： 是产生品系 A粉质胚乳的原因。 158 7.(2026·湖南卷，21)阿尔茨海默病患者大脑中3一淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集，损伤神经元。为 了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体(CAR)基因，使其在星形胶质 细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解A3聚集体 的能力。回答下列问题： (I)CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 BamH I EcoR I HindⅢ 非特异性启动子 GFP终止子 Kpn I EcoR I 入hoI BamH I HindⅢ Xho I 工特异性启动子>胞外识别区跨膜区胞内吞噬信号区」工 CAR基因编码序列 病毒载体 图a 图b ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的 (填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是 同时，为 使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细 胞，应选用的两种限制酶是 (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解AB聚集体，可用含A3聚集体的培养基培养CAR-A细 胞，一段时间后更换不含A3聚集体的培养基继续培养， (单选)的AB聚集体含量。 A.24h检测细胞内 B.24h检测细胞外 C.0h和24h检测细胞内 D.0h和24h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑A3聚集体减 少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射 该实验结论是 8.(2025·陕晋青宁卷，21)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区 域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽 培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切制位点 BamH I EcoR I Xba I BglII 5-AG A T C T -3' 3-T C T A GAA-5' 5' 13' 限制酶 5终止子启动子 Nde I 5-C AT A T G-3' 、切割位点 3-G T A TA C-5 抗性基因2 启动子 T-DNA 5'-C'T C G A G-3' 终止子 Xho I 3-GA GC TC-5 载体 EcoR I 5'-GYA A TT C-3' 3-C TTA AG-5 抗性基因1 BamH I 5-GG A T C C-3 3-C C T A GAG-5' 复制原点 Sal I 5'-GYT C G A C-3 S基因转录方向 3-C A G C TAG-5' Xba I Nde I BamH I 5'-TC TA G A -3' 5' S基因 3 Xba I 3'-A G AT GT-5' (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 159 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时 需在引物的 (填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱 基序列是5一 一3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ,PCR扩增产物和载体分 别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组 织细胞，将S基因整合到 ,抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈 伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 9.(2025·1月浙江卷，24)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假 丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gp)。采用的方案 是先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两 侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题。 Sal I 第2次PCR 引物P1序列引物P2序列 引物P3序列引物P4序列 第1次PCR Pst 第2次PCR (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应 的 ,确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次 PCR,利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备 PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需 要 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原 因是 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstI和SalI单酶切基因组DNA后， 各自用DNA连接酶连接形成环形DNA,再用苯酚一氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉 淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模 板进行第二次PCR,最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 (A.P1和P2B.P3和P4C.P1和P4D.P2和P3)。根据测序结果拼接获得完 整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行 比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导 入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 160性末端；③不能破坏质粒上所需要的结构，比如标记基 因、启动子等等。A.E.coli DNA连接酶不能连接平末 端，A错误；B.末端不相同，不能连接，B错误；C.用两种 酶切割，可以防止反向连接，是效率比较高的选择，C正 确：D.酶4会破坏抗生素抗性基因也就是破坏了标记基 因，不能使用，D错误。 8.解析：(1)恒温培养箱内的CO2用于维持培养液的pH, 若CO2不足，培养液pH会异常；乳腺癌细胞为癌细胞， 失去了接触抑制现象：胰蛋白酶可分解细胞间的蛋白 质，使贴壁细胞分散，处理时间过长会分解细胞膜上的 蛋白质，导致细胞损伤或死亡。 (2)构建重组质粒时，结合P基因转录方向与质粒酶切 位，点，上游、下游引物依次选择③和④：探究P基因的作 用时，对照组应将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细 胞，排除质粒载体本身对实验的干扰。 (3)S基因可抑制肿瘤增殖，P蛋白能诱导S基因的启动 子甲基化，基因启动子甲基化会抑制基因的转录，因此P 基因抑制S基因的转录，解除S基因对肿瘤增殖的抑制 作用，进而促进肿瘤耐药。 答案：(1)pH;不会；胰蛋白酶会分解细胞膜上的蛋白质，处 理时间过长会导致细胞损伤或死亡 (2)③和④；将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞（或 不导人质粒的乳腺癌细胞) (3)抑制：促进 9.解析：(1)PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原 理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件， 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR 每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)构建基因表达载体时，用两种限制酶切割，能使目的 基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防 止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目 的基因与质粒反向连接。 (3)在基因工程中，对转基因生物的安全性要进行严格 控制，在UW4-2菌林构建中使用质粒不复制策略，此类 设计的主要目的是防止工程菌（或重组质粒）扩散到环 境中，造成基因污染。 (4)据图a可知，质粒上含有庆大霉素抗性基因，所以第 一次在培养基中添加庆大霉素，由于pEX质粒上含有庆 大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含 庆大霉素的培养基上生长，即可筛选出UW4-1菌株；第 二次筛选要利用DNA同源区段可发生交换的原理，应 在培养基中添加蔗糖，原因是pEX质粒上带有蔗糖致死 基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在 含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌 株会丢失蔗糖致死基因，能在含蔗糖的培养基上存活； 筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是 UW4-2,另一种菌株的拟核DNA结构是②，图示中给出 的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该 是切前端重组；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增 相应序列并测序来鉴定。 答案：(1)延伸(2)防止目的基因自身环化、防止质粒 自身环化、防止目的基因与质粒反向连接 (3)防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因 污染 (4)庆大霉素pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导 入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上 生长蔗糖②测序 10.解析：(1)固体培养基能实现单菌落分离，是微生物纯 化的关键，故黑曲霉菌种的分离纯化应选用固体培 养基。 (2)根据题图1所示，片段A和片段C的转录产物可以 进行碱基互补配对形成链内双链结构，最终造成CreA 22 mRNA降解，使其不能翻译出CreA蛋白。在引物上添 加限制酶识别序列时，应添加到引物的5′端。根据题 千信息，CreA基因D片段PCR扩增的部分产物酶切后 连接到载体中A所在的位置时，选用的限制酶为 KpnI和SpeI;另一部分PCR扩增的产物应反向构 建到载体中C的所在位置，这样两个片段的转录产物 才可以互补配对，形成RNA链内双链结构，所以限制酶 ①应该是SacI。 (3)基因表达载体包括启动子、终止子、复制原点、目的 基因和标记基因等。标记基因一般是抗生素抗性基 因，故进行筛选时需要在培养基中添加相应的抗生素， 利用选择培养基筛选出转基因成功的菌株。 (4)根据题图2，G1淀粉酶活力远远高于G淀粉酶活 力，但G1生物量和G生物量比较接近。 (5)传统工艺将淀粉变成葡萄糖需要一系列步骤，而基 因工程获得的菌株G1淀粉酶活性高，可以简化操作流 程，同时可以在较温和的条件下快速获得更多葡萄糖。 答案：(1)固体 (2)碱基互补配对5'SacI (3)标记选择 (4)G1淀粉酶活力远远高于G淀粉酶活力；G1生物量 与G生物量比较接近 (5)不需要复杂的工艺化处理，简化了步骤；作用条件 较温和且产量高 考点三基因工程（题组二） 1.AB某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染 色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男 性中发病率为1/3500，则该致病基因d频率为1/3500， 正常基因D基因频率为3499/3500，女性中携带者的占 比为2×1/3500×3499/3500，A错误；该男孩的母亲 为携带者，基因型为X”X,该男孩基因型为XY,该男 孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母 亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行 PCR检测的结果不同，B错误；该男孩的染色体倒位，故 与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序 发生改变，C正确；利用S1和S2进行PCR检测，有产物 则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊 断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 2.C使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高 转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的 是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未 重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白 色和蓝色菌落数，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉 素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可 能是导入了重组质粒（含目的基因），也可能是其他情况 导致B一半乳糖苷酶基因不能正常表达而呈现白色，所 以不可判定为含目的基因的菌株，B正确；筛选平板中长 出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因）， 但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达 目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标 蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因 可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因 为自身环化的质粒K中B一半乳糖苷酶基因完整，能表 达活性B一半乳糖苷酶，分解X一gl形成蓝色菌落， D正确。 3.D制备DNA探针时需要模板和引物，所以加入的单链 DNA要做为模板和引物。①组将两段DNA移动，使其 碱基互补配对，得到5'一GCCGATCTTTATA一3,3 CACCGGCTAGAAA-5′，由于DNA只能由5'→3'延 长，所以上述片断是得不到扩增产物的。同理②也不 行；③反应管经多轮扩增后可得到3'一AGGGCTAG GCATA一5，两端带有A,能产生被荧光标记的DNA探 针，③正确；④反应管中可得到5'一ACTGGCCAGT- GAA一3'，两端带有A,能产生被荧光标记的DNA探 针，④正确。综上可知，③④正确。 4.A琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁 移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离 的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比 如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂 糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于 较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要 选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辩率和分 离效果，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜 色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚 蓝到凝胶2/3处时（可看蓝色条带），则停止电泳，B错 误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际 上是向正极迁移的，而不是向负极迁移，同时，DNA片段 的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速 率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后， 才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 5.DDNA粗提取和鉴定的原理：1.DNA的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不 同(DNA在0.14mol/L的氣化钠溶液中溶解度最低)； DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒 精。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。3.DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝 色。A.裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A正确；B.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解 度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可 将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确； C.DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复 多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度，C正确；D.将 DNA溶解于NaCI,加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待 冷却后，能呈现蓝色，D错误。 6.解析：(1)粉质品系A、硬质品系W为纯合品系，正反交 F籽粒胚乳全为硬质，说明硬质性状能完全掩盖粉质， 硬质为显性性状。 (2)PCR反应体系除引物、TagDNA聚合酶、缓冲液、脱 氧核苷酸、水外，还需要模板DNA作为扩增的模板。品 系W是纯合VwV":引物1与引物2可扩增出100+196 =296bp(约300bp)的片段，引物1与引物3可扩增出 100+196+1054+350=1700bp(接近2000bp)的片 段，共两个条带，对应图c的泳道⑤。 (3)要检测V"的表达是否受影响，需要检测转录产物， 因此提取胚乳的RNA,通过逆转录进行PCR检测。已 知V"高表达对应硬质，低表达对应粉质。 ①纯合转基因植株的V"表达被RNAi显著降低，因此 胚乳性状为粉质。 ②杂合转基因植株(VV,V+为正常V",V为表达 被敲低的V")自交，胚乳由两个基因型相同的极核十 个精子发育而来，仅当三个等位基因全为V厂时才表现 为粉质，其余均满足V"表达量足够，表现为硬质，因此 性状比例为硬质：粉质=3：1。 (4)据题干信息可知，V”编码的酶催化非极性胡萝卜素 转化为下游产物，品系A的VA表达量低，酶量不足，因 此推测：非极性胡萝卜素积累是产生品系A粉质胚乳的 原因，若诱变后非极性胡萝卜素合成途径基因突变，非 极性胡萝卜素合成减少不再积累，胚乳会变为硬质。 答案：(I)显性(2)模板DNA(或玉米基因组DNA) ⑤ (3)(胚乳的)RNA粉质硬质：粉质=3：1 (4)非极性胡萝卜素积累 22 7.解析：(1)①CAR-A细胞能特异性识别、吞噬和降解AB (B-淀粉样蛋白)聚集体，据此可推知，图a中CAR基因 编码序列中胞外识别区表达产物能特异性识别AB聚集 体，此时AB聚集体作为抗原，所以胞外识别区应选用 AB聚集体的抗体特定片段编码序列，这样细胞才能识 别AB聚集体。 ②分析图a,特异性启动子能启动CAR基因编码序列表 达，使用特异性启动子能确保CAR基因编码序列只在 星形胶质细胞内表达，避免CAR基因在其他类型细胞 中表达，减少非特异性损伤。为使CAR基因正确插入 病毒载体，应使用双酶切，可避免自身环化，同时需要通 过绿色荧光蛋白示踪CAR基因成功导入星形胶质细胞，故 病毒载体禽保留GFP基因，因此不能选择HindⅢ切割 病毒载体；为保证CAR基因在星形胶质细胞中特异性 表达，需将特异性启动子和CAR基因编码序列同时插 入病毒载体，并且破坏病毒载体上的非特异性启动子， 则应选择限制酶KpnI和BamH I构建基因表达 载体。 (2)用含AB聚集体的培养基培养CAR-A细胞，让细胞 吞噬并降解AB聚集体，一段时间后更换不含AB聚集体 的培养基继续培养，为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解 A3聚集体，应检测0h和24h细胞内的A3聚集体含 量，检测Oh细胞内AB聚集体含量的目的是确认CAR-A 细胞是否吞噬了A3聚集体并提供初始对照数据，检测 24h细胞内AB聚集体含量，与0h的对照，以确定细胞 是否降解Aβ聚集体，C正确。 (3)该实验组的处理为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠 注射携带CAR基因的病毒，为遵循单一变量原则，对照 组的处理应为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射没 有携带CAR基因的病毒；该实验结果为实验组模型小 鼠大脑AB聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白相对表 达量下降，说明携带CAR基因的病毒可减少阿尔茨海 默病模型小鼠大脑内A3聚集体，减轻神经元损伤，对阿 尔茨海默病具有治疗效果。 答案：(1)①抗体②使CAR基因编码序列在星形胶质 细胞中特异性表达KpnI、BamH I (2)C (3)没有携带CAR基因的病毒携带CAR基因的病毒 能减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑的A3聚集体，减轻 神经元损伤 8.解析：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 (4种)脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸，DNA 聚合酶在延伸步骤中起作用，即DNA聚合酶将脱氧核 苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要 在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。为保证目 的基因的正确插入，应使用双酶切；载体中含有BamH I、 EcoR I和XbaI的酶切位点，S基因上含有XbaI、NdeI、 BamH I的酶切位点，为保证S基因结构的完整性，不能 在S基因两端添加XbaI、NdeI、BamH I的识别序 列；分析表格数据，BglⅡ切割产生的黏性末端和BamH I切割产生的黏性末端相同，结合S基因的转录方向和 载体上启动子的转录方向可知，应在S基因上游添加 BglⅡ的识别序列，即5'一AGATCT一3'，下游添加 EcoR I的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限制 酶为BamH I和EcoR I。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织 时，农杆菌能将基因表达戴体中的T-DNA转移到愈伤 组织细胞的染色体DNA上。分析载体，T-DNA中含有 抗性基因2，若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体 DNA上，则该细胞具有抗性基因2对应的抗性，因此，抗 性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织 经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增 加的马铃薯植株。 答案：(1)脱氧核苷酸延伸(2)5'端AGATCT BamH I与EcoR I(3)染色体DNA2再分化 9.解析：(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上 相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子， 根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引 物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片 段。在制备PC反应体系时，每次用微量移液器吸取不 同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污 染。(2)A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污 染，可能扩增出其他DNA,从而出现另外一条条带，A错 误；B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从 而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B 错误；C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的 DNA是相同DNA,电泳时只会出现一个条带，C正确； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其 他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一 条条带，D错误。(3)DNA在冷的95%乙醇中溶解度较 低，可通过将酶切后的DNA经苯酚一氯仿抽提除去杂 质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR 过程中，子链的延伸方向为5→3'，结合图示可知，应选 择P2和P3引物进行第二次扩增。启动子可启动转录， 终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的 基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相 同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的 编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒 导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵 母高效合成甘油的目的。 答案：(1)密码子（或遗传密码）琼脂糖更换微量移 液器的枪头(2)C(3)冷的95%乙醇D调控 (4)基因数据库（或序列数据库）表达载体 考点三基因工程（题组三） 1.C题千中X十Y融合蛋白由两个独立基因表达后经自 我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合基 因，故不存在碱基序列相互影响问题，A错误；从图中可 以看到，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内，而 是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋白功能 结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误；从图中过 程可以看出，内含肽的IntA与IntA、IntB与IntB通 过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切除和连接 作用，C正确；由图可知，内含肽在反应后被完全切除，得 到的X十Y融合蛋白不含内含肽结合部位，所以再为X 十Y融合蛋白提供“内含肽十某蛋白”，也不能实现自我 切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X十Y融合蛋白新 的结构，D错误。 2.解析：(1)载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制 原点(DNA复制的起始位点)。基因表达过程中，启动子 启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存 目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比 克隆载体多了启动子和终止子。 (2)结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分 析：目的基因一端黏性末端为TCGA,与X0I切割产生 的黏性末端匹配，因此限制酶1为Xh0I;另一端黏性末 端为CATG,与NcoI切割产生的黏性末端匹配，因此限 制酶2为NcoI。 (3)根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越 小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总 长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和 1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于戟体长度， 因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 22 (4)工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应 环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增 殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 答案：(1)复制原点终止子终止目的基因的转录 (2)Xho I Nco I (3)b重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到 3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA 分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远， 因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大 量增加，合成的4aGT总量升高 3.解析：(1)已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基 因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoR V 切割产生平末端，T4DNA连接酶可以连接平末端，连接 效率高于E.coliDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶。 卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重 组质粒外，还可能存在未插入目的基因的PK2空质粒。 原质粒5.0kb,目的基因总长度0.7十1.1=1.8kb,重组 质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamH I/ EcoR I酶切得到0.7kb+6.1kb(6.8一0.7=6.1)； HindⅢ/EcoR I酶切得到1.1kb+5.7kb(6.8-1.1= 5.7),因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。 PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方 向为5'端→3'端。转录模板链为5'一ATGTCGTTCC… AATTGGCTCC-3′，左侧引物序列为5'一ATGTC· 3',右侧引物与模板右侧的序列5'…GCTCC一3′反向互 补，序列为5'-GGAGC…一3'，因此选B。 (2)根据题千和表格数据，转入Ts基因后工程菌引诱 能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着 量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快， LT50更短，最终第7天死亡率更高。 (3)转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性 评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 答案：(1)人工合成法（化学合成法）T4未插入目的 基因的pPK2空质粒AD染色体DNAB (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时 间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡 速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT0缩短，第7 天死亡率更高 (3)安全性 4.解析：(1)由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由 多种密码子编码，所以可设计与内源J基因序列不同但 编码氨基酸序列相同的外源】基因(J),这样能避免转 入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同而抑制J基 因表达的问题。要确定获得的J*基因是否与设计相符， 需要对其进行测序并序列比对，所以选③。 (2)因为构建的是仅在棉铃虫啃食后才表达J蛋白的抗 虫棉，所以在该載体中，启动子P属于诱导型启动子。 启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，棉铃虫啃食 后，棉花细胞中的RNA聚合酶与启动子P结合，启动融 合基因SJ·表达。之后检测到J·蛋白在细胞外积累， 说明SJ'融合蛋白中信号肽S的作用是引导SJ“融合 蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花 不育。 (3)已合成的J“基因两端仅含有对应的限制酶识别序 列，无额外碱基序列。为使丁"基因插入戟体并正确表达 SJ“融合蛋白，需要用两种限制酶对载体进行酶切，且 这两种限制酶切割后产生的黏性末端不同，这样可以避 免自身环化和反向连接，可选择的限制酶组合是