2027届高考生物人教版一轮复习讲义易错点4 基因测序及基因编辑技术

该高中生物学高考复习讲义围绕基因测序及基因编辑技术核心考点，涵盖Sanger法测序原理与结果分析、CRISPR/Cas9等技术背景知识，按“原理-方法-应用”逻辑组织，通过考点梳理、方法归纳、真题演练环节，帮助学生构建知识网络，突破易错点。 资料以科学思维为引领，如结合2024湖南卷例题分析测序电泳图培养推理能力，设计CRISPR/Cas9技术操作模拟活动强化探究实践。设置基础到综合应用题，配合解题方法指导，确保高效复习，助力教师精准把控节奏，提升学生应试能力。

易错点4 基因测序及基因编辑技术 相关背景知识 一 DNA测序结果分析 (1)Sanger法DNA测序的原理 将含有适量待测单链DNA模板、引物、四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶等混合物分别加到4支试管中，每支试管中再分别加入1种足量的放射性同位素标记双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，在子链合成过程中，ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。最终分离4支试管中的所有子链片段， 分泳道进行电泳，用放射自显影法显示后的结果为电泳图。 为了定位方便，可以在上述过程中，在ddNTP上加上4个不同颜色的荧光基团。最后通过凝胶电泳将合成的不同长度的DNA片段分开后，再通过激光照射，不同的荧光基团就会发出不同的颜色。 (2)DNA测序电泳图的结果分析 方法归纳　①沿着泳动远端→近端的顺序，依次读出电泳图谱的碱基序列，此为子链5′→3′方向的碱基序列；②按照碱基互补配对原则，写出模板序列(方向为3′→5′)。 (3)DNA测序峰图的结果分析 方法归纳　①确定四种形状(颜色)的曲线各自所代表的碱基种类；②依次写出子链的碱基序列(方向一般给定为5′→3′)；③按照碱基互补配对原则，写出模板序列(方向与子链相反)。 二 CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 三 Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 四 ．In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 例题1 (2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 答案　AC 解析　利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B错误；根据题图可知，对照个体PCR子链的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者的测序结果为5′-CTACCTGTGAT-3′，对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，C正确，D错误。 例题2 (2025·驻马店期末)ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键，能使DNA链的延伸终止，因此常被用于DNA测序。某实验室欲利用PCR技术对某DNA进行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等，且不同ddNTP参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是(　　) ddNTP类型 子链类型 ddATP ■—GATTCGAGCTGddATP ■—GATTCGddATP ■—GddATP ddCTP ■—GATTCGAGddCTP ■—GATTddCTP ddGTP ■—GATTCGAGCTddGTP ■—GATTCGAddGTP ■—GATTCddGTP ■—ddGTP ddTTP ■—GATTCGAGCddTTP ■—GATddTTP ■—GAddTTP A.题中相关酶包括解旋酶、DNA聚合酶等 B．若不考虑引物，则被测的DNA的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′ C．引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同 D．dNTP可为DNA复制提供原料和能量 答案　D 解析　PCR利用温度进行解旋，不需要解旋酶的参与，A错误；ddNTP的3号碳上没羟基，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，因此ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，因此可知第一个G所在位置为3′端(第一位)，依据图中碱基的排序可知，图中子代DNA的碱基序列是5′－GATTCGAGCTGA－3′，则被测的DNA的序列应为3′－CTAAGCTCGACT－5′，B错误；引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列是互补关系，C错误。 例题3 (2025·安徽卷，19)水稻籽粒外壳(颖壳)表型有黄色、黑色、紫色和棕红色等，种植颖壳表型不同的彩色稻，既可满足国家粮食安全需要，又可形成优美画卷，用于旅游开发。回答下列问题。 (1)研究发现，水稻颖壳的紫色、棕红色、黄绿色和浅绿色的形成与类黄酮化合物的代谢有关。假设显性基因C、R、A控制颖壳色素的形成，且独立遗传，相应的隐性等位基因不具有该效应。色素合成代谢途径如图1。 现有基因型为CcRrAa与CcRraa的两品种水稻杂交，F1中颖壳表型为紫色、棕红色、黄绿色和浅绿色的比例为________。 F1中，颖壳颜色在后代持续保持不变的个体所占比例为________。 (2)野生稻的颖壳为黑色，经过突变和驯化，目前栽培稻的颖壳多为黄色。黑色和黄色颖壳由一对等位基因控制，且黑色(Bh)对黄色(bh)为显性。科研小组对多个品种进行分析，发现有两个黄色颖壳突变类型(栽培稻1、2)，推测两者的突变可能是来自同一个基因。设计一个杂交实验，以验证该推测，并说明判断理由。_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)科研小组采用PCR技术，扩增出野生稻和栽培稻Bh/bh基因的片段，电泳结果见图2。 与野生稻相比，栽培稻2是由于Bh基因发生了________，颖壳表现为黄色。栽培稻1和野生稻的PCR扩增产物大小一致，科研小组进行了DNA测序，结果见图3(图中仅显示两者含有差异的部分序列，其余序列一致；A、T、G 、C表示4种碱基)。 比较两者DNA碱基序列，发现栽培稻1是由于Bh基因中的DNA序列发生________，导致__________________________________________________ _____________________________________________________________________， 颖壳表现为黄色。 说明：野生稻Bh基因的部分序列为5′－GATTCGCTCACA－3′，该链为非模板链，编码的肽链为天冬氨酸—丝氨酸—亮氨酸—苏氨酸。UAA、UAG为终止密码子。 答案　(1)9∶9∶6∶8　　(2)选取多株栽培稻1、2进行杂交，观察并统计子代颖壳颜色。预测实验结果：子代颖壳颜色均为黄色。判断理由：当两者突变来自同一个基因，栽培稻1、2均为隐性纯合子(bhbh)，杂交子代基因型仍然为bhbh；若为不同基因突变， 则杂交后代会表现为黑色　(3)碱基的缺失　碱基C→A的替换　转录产生的mRNA上的终止密码子提前出现，表达的蛋白质结构发生改变而不能合成黑色素 解析　(1)基因型为CcRrAa与CcRraa的两品种水稻杂交，由于三对基因独立遗传，相应的隐性等位基因不具有该效应，可将其拆解为三个分离定律的问题，即Cc×Cc→C_∶cc＝3∶1，Rr×Rr→R_∶rr＝3∶1，Aa×aa→Aa∶aa＝1∶1，再自由组合。紫色∶棕红色∶黄绿色∶浅绿色＝C_R_Aa∶C_R_aa∶C_rr_ _∶cc_ _ _ _＝∶∶∶＝9∶9∶6∶8。若要求颖壳颜色在后代持续保持不变，即自交后代不发生性状分离现象，F1中紫色(C_R_Aa)一定为杂合子，不能稳定遗传；棕红色(C_R_aa)中基因型为CCRRaa的个体能稳定遗传，占比为××＝；黄绿色(C_rr_ _)中基因型为CCrr_ _的个体能稳定遗传，占比为××1＝；c基因纯合时，后代一定为浅绿色，占比为×1×1＝，故F1中颖壳颜色在后代持续保持不变的个体所占比例为＋＋＝。 (2)当栽培稻1、2的突变来自同一个基因时，栽培稻1、2均为隐性纯合子(bhbh)，杂交子代基因型仍然为bhbh；若为不同基因突变，则杂交后代会因为基因互补而表现为黑色，实验方案见答案。 (3)根据题图2电泳条带位置可知，栽培稻2的DNA分子比野生稻和栽培稻1的DNA分子片段短，故而推测栽培稻2是由于Bh基因发生了碱基的缺失，导致DNA分子片段变短。栽培稻1和野生稻的PCR扩增产物大小一致，但测序结果显示两者的部分碱基序列不同，已知野生稻Bh基因的部分序列为5′－GATTCGCTCACA－3′，该链为非模板链，结合题图3可知， 栽培稻1的bh基因对应序列为5′－GATTAGCTCACA－3′，即发生了碱基C→A的替换，导致转录产生的mRNA上的终止密码子提前出现(见下图)，表达的蛋白质结构发生改变而不能合成黑色素。 例题4 双脱氧核苷酸的结构与脱氧核苷酸相似，遵循碱基互补配对原则，能参与DNA的合成，子链延伸时若连接上的是双脱氧核苷酸(如图甲的*C),则延伸停止。对某DNA模板链进行PCR时，在四个正常反应体系中分别添加一种含不同碱基的双脱氧核苷酸，扩增后的DNA链电泳检测结果如图乙所示。该DNA模板链的序列 答案 ：A 【详解】双脱氧核苷酸会使子链延伸终止，电泳时分子量越小，条带越靠下，对应子链越短，终止位置越靠近子链的5’端;四个泳道分别对应终止于碱基*T、*A、*G、*C，因此从最下方(最短子链)向最上方(最长子链)依次读条带，可得到新合成子链5'一3"的碱基序列，从最下(分子量最小)到最上(分子量最大)，依次读取条带所在泳道，得到子链5'一3’序列为:5-TCGAAGTCAG-3'，DNA双链反向互补配对，子链为5'一3'，因此模板链3'-5方向与子链互补，得到模板3'一5’序列为3-AGCTTCAGTC-5’，转换为题目要求的5'3方向后，得到模板序列为5-CTGACTTCGA-3'，A正确，BCD错误 例题5 以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种，图1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4种，图2)。当以3′－CCATGCAC－5′为模板测定链中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP，则子链延伸终止；若与其配对的原料是dTTP，则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原理得到某DNA的电泳图谱。下列说法不正确的是(　　) A．每个反应体系中应加入相同的模板链、一种ddNTP和四种dNTP B．ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体系提供能量和原料 C．由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是5′—ATCGCATCAT－3′ D．ddNTP的脱氧核糖3′上脱氧导致其无法连接下一个核苷酸5′上的磷酸基团 答案　C 解析　双脱氧链终止法是在相同的模板DNA链中分别加入一种ddNTP和四种dNTP的反应体系中进行，由于模板链相同，复制时DNA子链在进行碱基互补配对到T时，用到了对应的ddATP、dATP，若随机配对上的是ddATP，则该链复制停止，若随机配对上的是dATP，则复制继续进行，直到下一个对应的碱基T又会重新出现上述配对的可能，这样在一个体系中就会因碱基T的配对而出现多条长短不同的DNA链；依此类推，分别可以测出模板链碱基是A、C、G每个体系下的短链，再进行凝胶电泳分离，最短的链跑得最快，最早合成，而子链的复制是从5′→3′的方向，所以由图3可以读出子链碱基序列从上到下为3′－ATCGCATCAT－5′，总共需要四个体系，分别测出四个碱基的顺序，A正确，C错误；ddNTP和dNTP同时带有特殊的化学键，且脱去两分子磷酸后可以为DNA复制提供原料，B正确；由图1和图2可知，ddNTP和dNTP的区别在于五碳糖的3号位是否脱氧，ddNTP 3号位为－H，无法与下一个脱氧核苷酸的磷酸基团连接，D正确。 例题6 (2025·湘豫名校联考)某成年女性因S基因发生突变，在3岁后患有遗传病——成骨发育不全，其典型症状为易发骨折、脊柱侧弯畸形等，该病在人群中的发病率为1/10 000。该患者(Ⅱ2)想通过辅助生殖技术生育1名健康后代，医生便对其部分家属进行家系分析(图1)，同时测定该患者及其丈夫S基因序列，测序结果如图2。回答下列问题： (1)该遗传病在人群中男性和女性的发病率________(填“相等”或“不相等”)，原因是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (2)据图2可知，Ⅱ2的S基因发生的基因突变是在哪个位点发生怎样的突变？_____________________________________________________________________， 判断的依据是_________________________________________________________。 (3)该患者(Ⅱ2)想通过辅助生殖技术生育1名健康后代，可采取产前诊断的辅助技术，该项技术包括________________________________(答出一种即可)。Ⅲ1的基因型与Ⅱ2相同的概率是________。Ⅱ4与一正常男性结婚，生育一个患该遗传病男孩的概率是________。 答案　(1)相等　图1中Ⅰ1和Ⅰ2均正常但生出患病女儿Ⅱ2，女患者的父亲正常，可排除伴性遗传，所以为常染色体隐性遗传病，常染色体遗传病在人群中男女发病率相等(只要推出该遗传病属于常染色体遗传病即可)　(2)在第786号碱基发生了G→A的替换　标准碱基序列中第786位为G，而Ⅱ2的测序峰图中该位点出现的曲线对应的碱基是A，说明Ⅱ2的S基因在第786号碱基发生了G→A的替换　(3)羊水检查(或B超检查、孕妇血细胞检查、基因检测等)　1/2　1/606 解析　(1)从图1家系图中，正常的Ⅰ1和Ⅰ2生出患病的Ⅱ2，符合“无中生有为隐性”，且Ⅱ2是女性患者，其父亲Ⅰ1正常，所以排除伴性遗传，确定为常染色体隐性遗传病。常染色体遗传病的致病基因位于常染色体上，因此男性和女性患病概率相等。 (2)对比标准碱基序列和Ⅱ2的测序峰图，标准碱基序列中第786位碱基是G，而Ⅱ2在该位点出现的曲线对应的碱基是A，由此能确定突变情况是在第786号碱基发生了G→A的替换。 (3)产前诊断技术有羊水检查、B超检查、孕妇血细胞检查、基因检测等，可以在胎儿出生前确定其是否患有某种遗传病或先天性疾病。设控制该病的基因为A、a，Ⅱ2患病，基因型为aa，据图2可知Ⅱ1的基因型是Aa，所以其与Ⅱ2的后代Ⅲ1基因型为aa的概率是1/2，即Ⅲ1的基因型与Ⅱ2相同(即都为aa)的概率是1/2。已知该病在人群中的发病率为1/10 000，aa的基因型频率为1/10 000，那么a的基因频率为1/100，A的基因频率为99/100。正常男性是携带者(Aa)的概率为2×(1/100)×(99/100)÷(1－1/10 000)＝2/101。由图1可知，Ⅱ4的基因型为Aa的概率是2/3。Ⅱ4(Aa概率为2/3)与正常男性(Aa概率为2/101)结婚，生育患病孩子(aa)的概率为(2/3)×(2/101)×(1/4)，生育男孩的概率为1/2，所以生育一个患该遗传病男孩的概率是(2/3)×(2/101)×(1/4)×(1/2)＝1/606。 例题7 .(2025·湖南雅礼中学联考)如图1为某家系关于原发性醛固酮增多症的遗传系谱图，对该家系部分成员细胞中该病致病基因进行碱基测序，部分碱基测序结果如图2所示。调查时另外发现只有Ⅱ－3患有色盲。下列分析正确的是(　　) A.Ⅰ－1和Ⅰ－2均为原发性醛固酮增多症致病基因携带者 B.Ⅱ－4和Ⅱ－6患原发性醛固酮增多症是因为基因发生了显性突变 C.Ⅲ－9与正常男性结婚，生出正常孩子的概率是1/8 D.Ⅱ－6和Ⅱ－7生出患病男孩的概率是1/2，若生二胎应该进行产前基因诊断 答案　B 解析　 由上述分析可知，A错误；该病致病基因是显性基因，Ⅱ－4和Ⅱ－6患原发性醛固酮增多症是因为基因发生了显性突变，B正确；假设原发性醛固酮增多症致病基因用A表示，色盲基因用b表示。 第一步：仅分析原发性醛固酮增多症 第二步：仅分析色盲 Ⅲ－9患病，结合该个体的碱基序列分析可知，其关于该病的基因型为杂合子，Ⅲ－9的基因型为Aa Ⅱ－3为色盲患者，其基因型为XbY，Ⅱ－3的色盲基因会传给女儿，但女儿不患色盲，即Ⅲ－9的基因型为XBXb 第三步：综合分析　Ⅲ－9基因型为AaXBXb，正常男性的基因型为aaXBY，所以Ⅲ－9与正常男性结婚，生出正常孩子的概率为1/2×3/4＝3/8，C错误 仅分析原发性醛固酮增多症，Ⅱ－6与Ⅱ－7有正常孩子Ⅲ－10，则Ⅱ－6的基因型为Aa, Ⅱ－7的基因型为aa，后代正常和患病的概率均为1/2，后代为男孩的概率是1/2，Ⅱ－6和Ⅱ－7生出患病男孩的概率为1/2×1/2＝1/4，若生二胎应该进行产前基因诊断，D错误。 例题8 .(2024·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是(　　) A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因 B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构 C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对 D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组 答案　D 解析　Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对目的基因序列的编辑，A、B正确；复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会定点插入、删除或替换部分碱基对，C正确；通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。 例题9.(2024·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染 B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割 C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植 D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因 答案　B 解析　培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。 例题10(2024·德州高三二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法正确的是(　　) A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关 B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱 C．两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达 D．据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好 答案　ABC 解析　CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关，即主要与sgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高了器官移植的成功率，B正确；转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于驱动基因的转录，科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；据图2可知，与对照组相比，用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。 例题11通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。回答下列问题： 限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Xma Ⅰ 识别序列和切割位点 ↓ 5′—GA ATTC—3′ ↓ 5′—GG ATCC—3′ ↓ 5′—AA GCTT—3′ ↓ 5′—CC CGGG—3′ (1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。 (3)图2过程⑦中，在含有____________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________。 答案　(1)无需使用限制酶和DNA连接酶 (2)EcoR Ⅰ　BamH Ⅰ　LacZ　(3)四环素和X－gal　蔗糖和X－gal 例题12 ．PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________。 (2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是___________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。 ①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列________________和________________，保证DNA片段定向插入。 ②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是________。 答案　(1)2　定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合　(2)既能专一性切除多余的PMP22基因，又能确保必要的PMP22基因不被破坏，比破坏PMP22基因结构更可靠　(3)①5′－GTCGAC－3′　5′－GGATCC－3′　②Cas9基因 解析　(3)为保证不破坏复制原点，DNA上游需添加Sal Ⅰ的识别序列；由于Xho Ⅰ与Sal Ⅰ为同尾酶，为避免目的基因与载体任意连接，DNA下游需添加BamH Ⅰ的识别序列。 例题13 (不定项)(2024·永州高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是(　　) A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键 B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色 C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色 D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随机出现两种颜色 答案　ACD 解析　DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能随机出现两种颜色，D正确。 例题14 我国科学家于2026年1月首次提出长基因递送治疗性策略AAVLINK,该方法先将长基因分成Ⅰ、Ⅱ两段，分别装进两个腺相关病毒(AAV)中，一个AAV携带基因I片段和LoxP位点，另一个AAV除携带基因Ⅱ片段、LoxP位点外，还携带Cre重组酶基因及调控该基因表达的Poly(A)。两个装载着长基因片段的AAV载体进入细胞后，Cre重组酶会精准识别并切割LoxP位点，并再将拆分的两个基因片段实现精准重组(如图甲)。图乙为LoxP序列的结构示意图 （1） 该技术中的Cre酶，其功能兼有DNA重组技术中两种常见技术的作用。这两种工具是__ 。Cre酶切开一个LoxP的间隔序列后形成的末端形式是_____末端。LoxP位点具有方向性，推测其方向性是由图乙中的_____序列决定的。 （2） 根据图示信息，按照从左往右的顺序，依次写出图甲中第二步重组完成后问号区域DNA片段的组成：_____。重组发生后，Cre重组酶基因的表达会被迅速关闭，以免破坏已拼接好的长基因。从AAV载体的相关结构分析，Cre重组酶基因表达关闭的原因可能是____。 （3） Cre-LoxP是一种广泛应用的基因编辑工具。研究者想要敲除某个目的基因，需要在目的基因两端分别插人LoxP位点，如图丙所示，方式1在目的基因两端插入同向的LoxP位点，方式2在目的基因两端插入反向的LoxP位点。 其中方式_____(填“1”或“2”)才能实现目的基因的敲除；若选择另一种方式，Cre酶切割下来的目的基因能翻转180°再连接回去，原因是_____。 答案 (1)限制酶、DNA连接酶 黏性 间隔 (2)启动子-cre-LoxP位点 没有Poly(A)，Cre基因无法表达(或Cre基因的启动子为诱导型启动子) (3)1 目的基因两端反向LoxP位点经Cre酶切割后，形成的黏性末端相同 解:(1)DNA重组技术中两种常见工具有限制酶:DNA连接酶以及质粒等载体，分析题意可知，Cre酶能识别并切割LoxP位点，其作用类似于限制酶;它还能:将两个基因片段实现重组，其作用类似于DNA连接酶。Cre酶切开一个LoxP的间隔序列后形成黏性末端。分析图乙，两侧的反向重复序列碱基排列顺序一致，无法确定方向，因此能决定方向的只有中间的间 隔序列。(2)两个AAV载体经Cre重组后发生片段交换，其中AAV1的LoxP位点下游连接上II片段和Poly(A)，AAV2原来位于LoxP下游的II-Poly(A)发生交换后，剩余部分从左到右为启动子-Cre-LoxP位点。重组前Cre重组酶基因的下游带有Poly(A)，重组后Poly(A)随I片段转移到另一个重组DNA上，Cre基因因 缺少Poly(A)无法表达，或者Cre基因的启动子为诱导型启动子，导致Cre重组酶基因表达关闭。(3)方式1中，当两个LoxP位点同向时，Cre酶切割后会切除两个位点之间的目的基因，实现目的基因敲除。方式2中，当两个LoxP反向时，由于DNA分子的两条核苷酸链反向平行，目的基因被切下后形成的黏性末端相同，两端黏性末端仍然可以互补配对，因此会翻转后重新连接回原位置 例题15 (2024·潍坊高三二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，某科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示，回答下列问题： 注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因；TetR为四环素抗性基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ为限制酶。 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有________________________。用无缝克隆技术构建GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与________________________互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为______________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。 ①5′-…CTTGGATGAT-3′　②5′-…TAAGTTGTCT-3′　③5′-…ATTCAACAGA-3′　④5′-…TCTGTTGAAT-3′ (3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是______________________________________________________________。 (4)β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X－Gluc进行鉴定，结果如表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 分析表明，该激素最主要的合成部位是________，通过实验结果分析该激素的生理作用是________________________________________________________________________。 答案　(1)DNA聚合酶和DNA连接酶　引物F1 3′端序列　(2)BclⅠ和SmaⅠ　①④　(3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞　(4)根　促进植物对磷元素的吸收 解析　(1)在复性过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于T5核酸外切酶作用后形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此存在缺口，需用DNA聚合酶将缺口补齐，再用DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与引物F1 3′端序列互补。(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T－DNA区，如果使用BamHⅠ，会破坏Ti质粒上的TetR和AmpR，故选择BclⅠ和SmaⅠ。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，融合基因的3′端序列可以与④5′-…TCTGTTGAAT-3′配对，5′端序列的互补链可以与①5′-…CTTGGATGAT-3′配对，因此扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用的组合为①④。(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。(4)β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，根据表格信息可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收。 例题16.(2024·湖南长郡中学调研)IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点突变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点突变获得突变基因的过程。 (1)在定点突变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有________，PCR2中使用的引物有____________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是 ___________________________________________________________________。 (2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，其目的是________________________________________________________ __________________________________________________________________。 由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是 ____________________________________________________________________。 (3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是_________________________________________________ ___________________________________________________________________。 研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是 _________________________________________________________________。 答案　(1)引物A、引物C　引物B、大引物b　引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程　(2)增加大分子模板DNA彻底变性的概率　适当提高复性温度　(3)防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接　IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化 解析　(1)在图1获取突变基因过程中，分析题图可知，在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，需要在基因的左侧用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ来切割，因此在该基因的左端应有限制酶HindⅢ识别的序列，在基因的右端应有限制酶SacⅠ识别的序列，因此在PCR1中结合到基因右端的引物序列从5′端到3′端的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C，从题图中看，另一个引物从5′端到3′端的序列中开始部位应含有突变碱基C，所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′端到3′端的序列的开始部位应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物b。由于PCR1和PCR2过程使用的引物之间能结合，因而会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程，因此PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，需要分开进行。(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，这样可以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，为后续的PCR过程创造条件。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高复性温度，便于引物与模板链的结合。(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切能保证质粒和目的基因的正确连接，避免自身环化及反向连接。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果显示HO小鼠体内不含IKKβ或含量很少，因而可推测IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化，进而导致SCID患者表现为免疫缺陷。 例题17 (2025·南阳模拟)胰岛素的单体具有生物功能，二代胰岛素制剂由于易形成二聚体或六聚体而功能降低。如果将胰岛素B链28位脯氨酸与29位的赖氨酸交换位置，能有效抑制胰岛素聚合。已知基因上相应转录非模板链(a链)序列为5′—CCCAAG—3′，脯氨酸密码子为CC(A、U、C、G)，赖氨酸的密码子为AA(A、G)，科研人员希望通过PCR实现对目的基因的改造(过程如图1)，再通过农杆菌将改造后的基因导入番茄中，利用番茄果实生产三代胰岛素，该过程所用Ti质粒部分结构如图2所示，其中潮霉素抗性基因在真、原核细胞中均可表达，卡那霉素抗性基因在原核细胞中表达。回答下列问题： (1)若改变最少碱基数量，则图1中引物C中不能与模板链配对的碱基序列为________，该设计利用了密码子的________特点，除具有与模板链不配对的序列外，引物B、C与普通引物的主要区别是________________________。 (2)PCR3过程所用的模板链是____________，扩增时是否需要添加引物？________(填“是”或“否”)，原因是________________________________________________________。 (3)PCR4选用的引物为________，若保证改造后的目的基因能正确拼接到Ti质粒上，这两种引物需要分别添加限制酶____________的识别序列。图2中连接目的基因的启动子需要改造为________________________的启动子。 (4)在农杆菌和番茄细胞的培养基中分别加入_______、_______可以筛选出发生转化的细胞。 答案　(1)AAACC(或AAGCC)　简并性　引物B、C之间有碱基互补配对序列　(2)b链和c链　否　b链为模板时c链承担引物作用，c链为模板时b链承担引物作用　(3)A、D　XbaⅠ、SacⅠ　番茄果实中特异性表达的基因　(4)卡那霉素(或潮霉素)　潮霉素 解析　(1)应该将非模板链的5′－CCCAAG－3′顺序改为5′－AAA(G)CCG(A、T、C)－3′，若改变最少碱基数量，则最后一个碱基G不变，所以图1中引物C中不能与模板链配对的碱基序列为AAACC或AAGCC。该设计利用了密码子的简并性特点，除具有与模板链不配对的序列外，引物B、C与普通引物的主要区别是B、C引物之间有碱基互补配对序列，通过碱基互补配对序列将PCR1和PCR2的产物拼接在一起。(2)因为子链只能从引物5′端向3′端方向延伸，所以PCR3时b链为模板时c链承担引物作用，c链为模板时b链承担引物作用，扩增时不需单独添加引物。(3)PCR4选用的引物为A、D，这样才能扩增出完整的新基因片段。图2中箭头方向为基因转录的方向，目的基因a链为非模板链，所以引物A的5′端为转录起始端，又因为目的基因需要插入T－DNA序列，所以若保证改造后的目的基因能正确拼接到Ti质粒上，这两种引物需要依次添加限制酶XbaⅠ、SacⅠ的识别序列。图2中目的基因应连接番茄果实中特异性表达的基因的启动子才能在番茄果实中表达。 1 学科网（北京）股份有限公司 $ 易错点4 基因测序及基因编辑技术 相关背景知识 一 DNA测序结果分析 (1)Sanger法DNA测序的原理 将含有适量待测单链DNA模板、引物、四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶等混合物分别加到4支试管中，每支试管中再分别加入1种足量的放射性同位素标记双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，在子链合成过程中，ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。最终分离4支试管中的所有子链片段， 分泳道进行电泳，用放射自显影法显示后的结果为电泳图。 为了定位方便，可以在上述过程中，在ddNTP上加上4个不同颜色的荧光基团。最后通过凝胶电泳将合成的不同长度的DNA片段分开后，再通过激光照射，不同的荧光基团就会发出不同的颜色。 (2)DNA测序电泳图的结果分析 方法归纳　①沿着泳动远端→近端的顺序，依次读出电泳图谱的碱基序列，此为子链5′→3′方向的碱基序列；②按照碱基互补配对原则，写出模板序列(方向为3′→5′)。 (3)DNA测序峰图的结果分析 方法归纳　①确定四种形状(颜色)的曲线各自所代表的碱基种类；②依次写出子链的碱基序列(方向一般给定为5′→3′)；③按照碱基互补配对原则，写出模板序列(方向与子链相反)。 二 CRISPR/Cas9基因编辑 CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 三 Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 四 ．In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 例题1 (2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 例题2 (2025·驻马店期末)ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)缺少3′羟基，无法形成新的磷酸二酯键，能使DNA链的延伸终止，因此常被用于DNA测序。某实验室欲利用PCR技术对某DNA进行测序，已知参与反应的物质有被测序的DNA、dNTP(脱氧核苷三磷酸)、引物、相关酶等，且不同ddNTP参与反应的结果如表所示，其中“■”代表引物。下列叙述正确的是(　　) ddNTP类型 子链类型 ddATP ■—GATTCGAGCTGddATP ■—GATTCGddATP ■—GddATP ddCTP ■—GATTCGAGddCTP ■—GATTddCTP ddGTP ■—GATTCGAGCTddGTP ■—GATTCGAddGTP ■—GATTCddGTP ■—ddGTP ddTTP ■—GATTCGAGCddTTP ■—GATddTTP ■—GAddTTP A.题中相关酶包括解旋酶、DNA聚合酶等 B．若不考虑引物，则被测的DNA的序列应为5′－CTAAGCTCGACT－3′ C．引物的碱基序列与模板链的3′端的一段碱基序列相同 D．dNTP可为DNA复制提供原料和能量 例题3 (2025·安徽卷，19)水稻籽粒外壳(颖壳)表型有黄色、黑色、紫色和棕红色等，种植颖壳表型不同的彩色稻，既可满足国家粮食安全需要，又可形成优美画卷，用于旅游开发。回答下列问题。 (1)研究发现，水稻颖壳的紫色、棕红色、黄绿色和浅绿色的形成与类黄酮化合物的代谢有关。假设显性基因C、R、A控制颖壳色素的形成，且独立遗传，相应的隐性等位基因不具有该效应。色素合成代谢途径如图1。 现有基因型为CcRrAa与CcRraa的两品种水稻杂交，F1中颖壳表型为紫色、棕红色、黄绿色和浅绿色的比例为________。 F1中，颖壳颜色在后代持续保持不变的个体所占比例为________。 (2)野生稻的颖壳为黑色，经过突变和驯化，目前栽培稻的颖壳多为黄色。黑色和黄色颖壳由一对等位基因控制，且黑色(Bh)对黄色(bh)为显性。科研小组对多个品种进行分析，发现有两个黄色颖壳突变类型(栽培稻1、2)，推测两者的突变可能是来自同一个基因。设计一个杂交实验，以验证该推测，并说明判断理由。_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (3)科研小组采用PCR技术，扩增出野生稻和栽培稻Bh/bh基因的片段，电泳结果见图2。 与野生稻相比，栽培稻2是由于Bh基因发生了________，颖壳表现为黄色。栽培稻1和野生稻的PCR扩增产物大小一致，科研小组进行了DNA测序，结果见图3(图中仅显示两者含有差异的部分序列，其余序列一致；A、T、G 、C表示4种碱基)。 比较两者DNA碱基序列，发现栽培稻1是由于Bh基因中的DNA序列发生________，导致__________________________________________________ _____________________________________________________________________， 颖壳表现为黄色。 说明：野生稻Bh基因的部分序列为5′－GATTCGCTCACA－3′，该链为非模板链，编码的肽链为天冬氨酸—丝氨酸—亮氨酸—苏氨酸。UAA、UAG为终止密码子。 例题4 双脱氧核苷酸的结构与脱氧核苷酸相似，遵循碱基互补配对原则，能参与DNA的合成，子链延伸时若连接上的是双脱氧核苷酸(如图甲的*C),则延伸停止。对某DNA模板链进行PCR时，在四个正常反应体系中分别添加一种含不同碱基的双脱氧核苷酸，扩增后的DNA链电泳检测结果如图乙所示。该DNA模板链的序列 例题5 以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP 4种，图1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP 4种，图2)。当以3′－CCATGCAC－5′为模板测定链中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP，则子链延伸终止；若与其配对的原料是dTTP，则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原理得到某DNA的电泳图谱。下列说法不正确的是(　　) A．每个反应体系中应加入相同的模板链、一种ddNTP和四种dNTP B．ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体系提供能量和原料 C．由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是5′—ATCGCATCAT－3′ D．ddNTP的脱氧核糖3′上脱氧导致其无法连接下一个核苷酸5′上的磷酸基团 例题6 (2025·湘豫名校联考)某成年女性因S基因发生突变，在3岁后患有遗传病——成骨发育不全，其典型症状为易发骨折、脊柱侧弯畸形等，该病在人群中的发病率为1/10 000。该患者(Ⅱ2)想通过辅助生殖技术生育1名健康后代，医生便对其部分家属进行家系分析(图1)，同时测定该患者及其丈夫S基因序列，测序结果如图2。回答下列问题： (1)该遗传病在人群中男性和女性的发病率________(填“相等”或“不相等”)，原因是_______________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 (2)据图2可知，Ⅱ2的S基因发生的基因突变是在哪个位点发生怎样的突变？_____________________________________________________________________， 判断的依据是_________________________________________________________。 (3)该患者(Ⅱ2)想通过辅助生殖技术生育1名健康后代，可采取产前诊断的辅助技术，该项技术包括________________________________(答出一种即可)。Ⅲ1的基因型与Ⅱ2相同的概率是________。Ⅱ4与一正常男性结婚，生育一个患该遗传病男孩的概率是________。 例题7 .(2025·湖南雅礼中学联考)如图1为某家系关于原发性醛固酮增多症的遗传系谱图，对该家系部分成员细胞中该病致病基因进行碱基测序，部分碱基测序结果如图2所示。调查时另外发现只有Ⅱ－3患有色盲。下列分析正确的是(　　) A.Ⅰ－1和Ⅰ－2均为原发性醛固酮增多症致病基因携带者 B.Ⅱ－4和Ⅱ－6患原发性醛固酮增多症是因为基因发生了显性突变 C.Ⅲ－9与正常男性结婚，生出正常孩子的概率是1/8 D.Ⅱ－6和Ⅱ－7生出患病男孩的概率是1/2，若生二胎应该进行产前基因诊断 例题8 .(2024·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是(　　) A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因 B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构 C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对 D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组 例题9.(2024·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染 B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割 C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植 D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因 例题10(2024·德州高三二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法正确的是(　　) A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关 B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱 C．两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达 D．据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好 例题11通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。回答下列问题： 限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Xma Ⅰ 识别序列和切割位点 ↓ 5′—GA ATTC—3′ ↓ 5′—GG ATCC—3′ ↓ 5′—AA GCTT—3′ ↓ 5′—CC CGGG—3′ (1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。 (3)图2过程⑦中，在含有____________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________。 例题12 ．PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________。 (2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是___________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。 ①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列________________和________________，保证DNA片段定向插入。 ②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是________。 例题13 (不定项)(2024·永州高三一模)Cre/LoxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是(　　) A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键 B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色 C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色 D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其一个脑组织细胞内可能随机出现两种颜色 例题14 我国科学家于2026年1月首次提出长基因递送治疗性策略AAVLINK,该方法先将长基因分成Ⅰ、Ⅱ两段，分别装进两个腺相关病毒(AAV)中，一个AAV携带基因I片段和LoxP位点，另一个AAV除携带基因Ⅱ片段、LoxP位点外，还携带Cre重组酶基因及调控该基因表达的Poly(A)。两个装载着长基因片段的AAV载体进入细胞后，Cre重组酶会精准识别并切割LoxP位点，并再将拆分的两个基因片段实现精准重组(如图甲)。图乙为LoxP序列的结构示意图 （1） 该技术中的Cre酶，其功能兼有DNA重组技术中两种常见技术的作用。这两种工具是__ 。Cre酶切开一个LoxP的间隔序列后形成的末端形式是_____末端。LoxP位点具有方向性，推测其方向性是由图乙中的_____序列决定的。 （2） 根据图示信息，按照从左往右的顺序，依次写出图甲中第二步重组完成后问号区域DNA片段的组成：_____。重组发生后，Cre重组酶基因的表达会被迅速关闭，以免破坏已拼接好的长基因。从AAV载体的相关结构分析，Cre重组酶基因表达关闭的原因可能是____。 （3） Cre-LoxP是一种广泛应用的基因编辑工具。研究者想要敲除某个目的基因，需要在目的基因两端分别插人LoxP位点，如图丙所示，方式1在目的基因两端插入同向的LoxP位点，方式2在目的基因两端插入反向的LoxP位点。 其中方式_____(填“1”或“2”)才能实现目的基因的敲除；若选择另一种方式，Cre酶切割下来的目的基因能翻转180°再连接回去，原因是_____。 例题15 (2024·潍坊高三二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，某科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示，回答下列问题： 注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因；TetR为四环素抗性基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ为限制酶。 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有________________________。用无缝克隆技术构建GUS－P融合基因的关键是引物R2 5′端序列与________________________互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为______________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。 ①5′-…CTTGGATGAT-3′　②5′-…TAAGTTGTCT-3′　③5′-…ATTCAACAGA-3′　④5′-…TCTGTTGAAT-3′ (3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是______________________________________________________________。 (4)β-葡萄糖苷酸酶可以水解X－Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X－Gluc进行鉴定，结果如表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 分析表明，该激素最主要的合成部位是________，通过实验结果分析该激素的生理作用是________________________________________________________________________。 例题16.(2024·湖南长郡中学调研)IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点突变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点突变获得突变基因的过程。 (1)在定点突变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有________，PCR2中使用的引物有____________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是 ___________________________________________________________________。 (2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，其目的是________________________________________________________ __________________________________________________________________。 由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是 ____________________________________________________________________。 (3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶SacⅠ、HindⅢ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是_________________________________________________ ___________________________________________________________________。 研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是 _________________________________________________________________。 例题17 (2025·南阳模拟)胰岛素的单体具有生物功能，二代胰岛素制剂由于易形成二聚体或六聚体而功能降低。如果将胰岛素B链28位脯氨酸与29位的赖氨酸交换位置，能有效抑制胰岛素聚合。已知基因上相应转录非模板链(a链)序列为5′—CCCAAG—3′，脯氨酸密码子为CC(A、U、C、G)，赖氨酸的密码子为AA(A、G)，科研人员希望通过PCR实现对目的基因的改造(过程如图1)，再通过农杆菌将改造后的基因导入番茄中，利用番茄果实生产三代胰岛素，该过程所用Ti质粒部分结构如图2所示，其中潮霉素抗性基因在真、原核细胞中均可表达，卡那霉素抗性基因在原核细胞中表达。回答下列问题： (1)若改变最少碱基数量，则图1中引物C中不能与模板链配对的碱基序列为________，该设计利用了密码子的________特点，除具有与模板链不配对的序列外，引物B、C与普通引物的主要区别是________________________。 (2)PCR3过程所用的模板链是____________，扩增时是否需要添加引物？________(填“是”或“否”)，原因是________________________________________________________。 (3)PCR4选用的引物为________，若保证改造后的目的基因能正确拼接到Ti质粒上，这两种引物需要分别添加限制酶____________的识别序列。图2中连接目的基因的启动子需要改造为________________________的启动子。 (4)在农杆菌和番茄细胞的培养基中分别加入_______、_______可以筛选出发生转化的细胞。 1 学科网（北京）股份有限公司 $