2027年高考一轮生物学总复习讲义--微专题15　CRISPRCas9基因编辑、单酶切导致的正接与反接的电泳检测和PCR检测

微专题十五　CRISPR/Cas9基因编辑、单酶切导致的正接与反接的电泳检测和PCR检测 专题一　CRISPR/Cas9基因编辑 专|题|整|合 CRISPR/Cas9是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA序列被Cas内切核酸酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA和tracrRNA组合成复合体形成向导RNA，可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤： (1)Cas内切核酸酶(Cas酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。 (2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。 (3)crRNA与tracrRNA共同形成sgRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 命题要点提醒： (1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA片段的特定区域和Cas9内切核酸酶基因。 (2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA分别与基因的两侧碱基配对。 (3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。 对|点|落|实 1．(经典高考)近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(如图)。下列相关叙述错误的是(　　) A．Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成 B．向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则 C．向导RNA可在逆转录酶催化下合成 D．若α链剪切点附近序列为……TCCACAATC……则相应的识别序列为……UCCACAAUC…… 2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 回答下列问题。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________。 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________________。 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________，基因敲除成功的判断依据是____________________。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：_______________________________________________。 3．(2024·九省联考广西卷)PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏、快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如图所示。回答： (1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似________酶和________酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是__________原则。 (2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入到LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是___________________ ____________________________________________________________________。 (3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是_______________________________________________________________。 (4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是__________________________；g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是____________________________ ___________________________________________________________________。 专题二　单酶切导致的正接与反接的电泳检测和PCR检测 专|题|整|合 1．利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体 2．单酶切法中正向连接与反向连接的检测 (1)利用PCR进行检测 方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增，二者得到的扩增产物长度不同。如图3中，选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 (2)利用电泳进行检测 方法：用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行电泳，二者得到的条带存在差异。如图中，用BglⅡ和HindⅠ进行双酶切，电泳后若出现1 100 bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp条带，则为反向连接。 对|点|落|实 4．(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　) A．图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 5．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 微专题十五　CRISPR/Cas9基因编辑、单酶切导致的正接与反接的电泳检测和PCR检测 专题一　CRISPR/Cas9基因编辑 专|题|整|合 CRISPR/Cas9是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA序列被Cas内切核酸酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA和tracrRNA组合成复合体形成向导RNA，可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤： (1)Cas内切核酸酶(Cas酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。 (2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。 (3)crRNA与tracrRNA共同形成sgRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。 命题要点提醒： (1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA片段的特定区域和Cas9内切核酸酶基因。 (2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA分别与基因的两侧碱基配对。 (3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。 对|点|落|实 1．(经典高考)近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(如图)。下列相关叙述错误的是(　　) A．Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成 B．向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则 C．向导RNA可在逆转录酶催化下合成 D．若α链剪切点附近序列为……TCCACAATC……则相应的识别序列为……UCCACAAUC…… 答案：C 解析：蛋白质由相应基因指导在核糖体中合成，A正确；向导RNA中双链区遵循碱基互补配对原则，B正确；向导RNA可通过转录形成，以RNA为模板合成DNA的过程中需要用到逆转录酶，C错误；由于α链与识别序列的互补序列互补，故两链碱基相同，只是其中T替换为U，D正确。 2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 回答下列问题。 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________。 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________________。 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________，基因敲除成功的判断依据是____________________。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：_______________________________________________。 答案：(1)DNA连接酶　(2)Ca2＋处理法 (3)碱基互补配对原则　目标DNA特定的核苷酸 (4)DNA分子杂交技术　不出现杂交带 (5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中 解析：(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。 (2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法。 (3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 (4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若未出现杂交带，则说明基因敲除成功。 (5)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。 3．(2024·九省联考广西卷)PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏、快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如图所示。回答： (1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似________酶和________酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是__________原则。 (2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入到LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是___________________ ____________________________________________________________________。 (3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是_______________________________________________________________。 (4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是__________________________；g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是____________________________ ___________________________________________________________________。 答案：(1)限制　解旋　碱基互补配对　(2)使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应　(3)Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同　(4)排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光　g－3和g－7在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用 解析：(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，可以切割靶标DNA，并能解开靶标DNA，使其与g－3和g－7结合，所以Cas12a具有类似限制酶和解旋酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是碱基互补配对原则。 (2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，而使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应。 (3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同。 (4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光；g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是g－3和g－7在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用。 专题二　单酶切导致的正接与反接的电泳检测和PCR检测 专|题|整|合 1．利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体 2．单酶切法中正向连接与反向连接的检测 (1)利用PCR进行检测 方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增，二者得到的扩增产物长度不同。如图3中，选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；如图4，选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 (2)利用电泳进行检测 方法：用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行电泳，二者得到的条带存在差异。如图中，用BglⅡ和HindⅠ进行双酶切，电泳后若出现1 100 bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp条带，则为反向连接。 对|点|落|实 4．(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　) A．图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 答案：D 解析：由题图可知，不能直接从酵母菌S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，若要获得目的基因，需进行PCR，A错误；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coli A构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coli B，E.coli A和E.coli B均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒显示含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶识别序列，因此可用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D正确。 5．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶　复制原点、标记基因、限制酶切割位点　(2)F1和R2或者F2和R1　a链　(3)J－V5融合蛋白　不是 解析：(1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。 (2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板链，而根据图中启动子和终止子的位置可知，转录方向是图中从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′。考虑到DNA复制时在引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的模板单链的方向是3′→5′。图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)据图乙可知，只有抗V5抗体时，出现条带1，抗V5抗体能与V5编码序列表达的标签短肽V5特异性结合，只有抗J蛋白抗体时，出现条带1和条带2，且条带1较宽，说明该物质能与抗J蛋白抗体特异性结合，因此出现条带1证明细胞内表达了J－V5融合蛋白，而条带2可能是杂质。 学科网（北京）股份有限公司 $