专题15 基因工程（6年汇编）（广东专用）2021-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，汇编2023-2025年广东高考真题及2026年模拟题，以Solexa测序、工业菌株代谢调控等真实科研情境为载体，考查工具功能辨析、PCR技术应用及基因编辑实践。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|7题|基因工程工具（限制酶/DNA连接酶）、PCR原理（3'-羟基作用）、DNA粗提取|以2025广东真题考查Solexa测序中DNA聚合酶催化机制，体现技术前沿性| |非选择题|5题|质粒构建、代谢途径改造（如莽草酸积累）、基因编辑（Cas12a系统）|2026汕头一模通过敲除argG等基因优化大肠杆菌代谢，考查工程思维与系统优化能力，契合真题从工具识记到方案设计的趋势|

专题15 基因工程 6年真题1年模拟 考点分类 考情示例 命题规律 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2025广东（1题）、2023广东（1题） · 情境设置：以高通量测序技术（Solexa测序）、作物育种等真实科研情境为载体，体现技术前沿性 · 考查重点：聚焦PCR原理深化应用，如荧光检测与酶催化机制的结合，强调技术细节与实验逻辑 · 命题趋势：从单一PCR操作向"PCR+"融合技术拓展，注重与基因编辑、分子标记辅助选择等交叉综合 考点1 基因工程的基本工具 2025广东（1题）、2023广东（1题） · 情境设置：以工业菌株代谢调控、基础实验（DNA粗提取）等实践情境切入，贴近生产生活 · 考查重点：限制酶、DNA连接酶等工具的功能辨析，及实验操作步骤的正误判断 · 命题趋势：从工具识记转向工具选择逻辑与实验方案设计，强调工程思维与系统优化能力 考点1 基因工程的基本工具 1.（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（       ） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 2.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及　　　　　　检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有　　　　　　（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是　　　　　　　　。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是　　　　　　　　。 （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为　　　　　　　　。 （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：　　　　　　。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（       ） A. 1'-碱基 B. 2'-氢 C. 3'-羟基 D. 5'-磷酸基团 2.（2023·广东·高考真题）（多选）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与　　　　　　　　　植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和　　　　　　　　　进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备　　　　　　　　　。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。     ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　　。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约　　　　　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　　（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到　　　　　　　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑　　　　　　　　　。         1.（2026·广东湛江·一模）下列关于PCR的叙述正确的是（　　） A. 该技术的核心原理是高温提高了DNA聚合酶的活性 B. 在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C. 扩增目的基因时，子链从引物的3'端向5'端延伸 D. 为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的3'端添加识别序列 2.（2026·广东深圳·二调）我国科学家将流感病毒的神经氨酸酶（NA）基因与哺乳动物细胞中的标记蛋白（LC3B）基因融合构成重组DNA疫苗。该疫苗与灭活流感疫苗的作用机制如图。下列分析错误的是（　　） A. 图中重组DNA疫苗进入的细胞很可能是抗原呈递细胞 B. NA和LC3B都可以激活细胞毒性T细胞和辅助性T细胞 C. 重组DNA疫苗可以进一步激活B细胞进行分裂和分化 D. 重组DNA疫苗整合了NA基因疫苗和灭活流感疫苗的功能 3.（2026·广东深圳·二调）短链DNA化学合成的原理是直接将游离脱氧核苷酸（N）与固体介质硅基（Si）结合形成Si-N1，根据目标序列依次添加其他游离核苷酸，形成Si-N1-N2-N3……（图）。该合成方法的特点是（　　） A. 在DNA聚合酶作用下从合成链的3′端进行延伸 B. 在DNA聚合酶作用下从合成链的5′端进行延伸 C. 不需要DNA聚合酶，从合成链的3′端进行延伸 D. 不需要DNA聚合酶，从合成链的5′端进行延伸 4.（2026·广东深圳·二调）研究人员将r28M基因导入山羊成纤维细胞，构建了可生产黑色素瘤抗体的乳腺生物反应器。该过程中不涉及的操作是（　　） A. 利用显微操作技术将山羊成纤维细胞注入去核卵母细胞 B. 诱导山羊B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞 C. 用PCR技术对转化后的山羊成纤维细胞进行检测与鉴定 D. 重构胚体外培养一段时间后移植入同期发情的受体母羊 5.（2026·广东韶关·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验原理及操作步骤。下列叙述错误的是（       ） A. DNA溶于酒精，加入冷酒精析出的白色丝状物即为蛋白质杂质 B. DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂显蓝色，此时DNA的双螺旋结构已解开 C. DNA片段在电泳时的迁移速率与DNA分子量的大小和构象有关 D. 指示剂不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳 6.（2026·广东佛山·二模）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A. Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B. 选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C. 根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D. 筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 7.（2026·广东东莞·一模）瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，因具有显著健康功效，全球市场需求持续增长。大肠杆菌BL21产生瓜氨酸的代谢过程如图a所示，研究人员以该菌株为基础通过基因工程技术逐步构建了一株高效、无质粒、无需诱导的瓜氨酸生产菌株。 注：酶后面的英文表示控制该酶合成的基因的缩写；脯氨酸、谷氨酸和精氨酸是组成蛋白质的氨基酸，缺乏这些氨基酸会影响大肠杆菌的生命活动。 回答下列问题： （1）基因工程的核心步骤是　　　　　　　　　。研究人员把大肠杆菌BL21拟核DNA上的argG基因敲除，构建出CTL1菌株。配制含不同浓度精氨酸的培养液，发酵结果见下表，实验结果说明精氨酸对瓜氨酸的合成起　　　　　　　　　作用。据图表分析，BL21菌株中未检测到瓜氨酸的两个主要原因分别是　　　　　　　　　　　　。 检测指标 BL21 CTL1+精氨酸（g/L） CTL1+0 CTL1+0.1 CTL1+0.3 CTL1+0.5 CTL1+1.0 瓜氨酸（g/L） 0 0.32 0.31 0.17 0.12 0.10 （2）研究人员将CTL1菌株的proB基因敲除，构建出CTL2菌株，发酵48h后检测发现CTL2菌株的瓜氨酸产量显著下降。推测出现此结果的原因是　　　　　。据此，为减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，请提出一种改造菌株的新策略　　　　　　。 （3）为进一步提高瓜氨酸产量，研究人员分别敲除CTL1菌株的speC和speE基因，构建出CTL3和CTL4菌株。根据下图b的发酵结果，正确的策略是保留　　　　基因，敲除　　　　基因。 （4）相比目的基因在受体菌的质粒上，目的基因位于拟核DNA上有什么优势：　　　　　　　　　（答出1点即可）。 8.（2026·广东汕头·一模）多囊肾病是一种常染色体遗传病，可由17号染色体上的Pkd1基因（P）突变引起。科研人员培育多囊肾模型小鼠（简称“模型鼠”），试图通过诱变和遗传筛选，找到能减缓肾囊肿生长的突变基因位点，为基因治疗提供新靶点。 回答下列问题： （1）小鼠A从亲本一方获得一个Pkd1突变基因（P-），其在肾脏体细胞中表达后会使细胞中另一个正常的等位基因也突变为P-，这种“二次打击”可使细胞过度增殖，引起肾囊肿。据此推测多囊肾病属于常染色体　　　　　　性（填“显”或“隐”）遗传病。“二次打击”可发生在发育的任何时间、任何一个肾脏细胞，说明基因突变具有　　　　　性。 （2）将噬菌体的C基因导入正常小鼠的17号染色体获得小鼠B，C基因能在小鼠肾脏体细胞中特异性表达并删除P基因，被敲除成对P基因的细胞也会过度增殖。小鼠B与小鼠A杂交得到F1，若F1中多囊肾小鼠占　　　　　，说明C基因仅插在一条染色体上；若F1中多囊肾小鼠占　　　　　，则小鼠B可作为多囊肾模型鼠（图6a）。 （3）利用EMU（一种化学诱变剂）诱导模型鼠G0发生随机突变，筛选获得一只含突变基因m的潜在突变体G1，将其按照图6b过程进行遗传筛选，获得肾生长正常的突变体G5. ①图中G1与G2进行杂交的目的是获得一只　　　　的G3，从而培育出G5. ②为确定突变基因m的位置，选用15、17号染色体上高度保守的DNA序列作为分子标记，对G1和G3杂交产生的20只肾正常小鼠进行遗传分析，结果见下表。据表推测突变基因最可能位于　　　　位置附近。 分子标记 15号染色体 17号染色体 M5 M65 M246 M46 M113 M143 + 12 10 9 20 18 16 +/- 8 10 11 0 2 4 注：“+”表示分子标记均来自G1；“+/-”表示分子标记来自G1和G2； M5、M65、M246为对应染色体上分子标记的名称；数字为小鼠个体数。 （4）科研人员利用基因工程技术对肾囊肿小鼠A进行病后干预，将其肾脏中的基因M替换成突变基因m，培育6周后囊肿“逆转”，肾脏结构和功能恢复正常。从调控细胞生命历程的角度分析，m基因的作用是　　　　。 9.（2026·广东·二模）四环素（Tet）诱导表达系统分为激活型（Tet-on）和抑制型（Tet-off），是源于大肠杆菌Tet抗药机制设计的可调控基因表达工具，如图1为该系统的模式图。 注：tTA/rtTA表示Tet阻遏蛋白复合物，TRE表示tTA/rtTA结合位点。 回答下列问题： （1）据图分析，当　　　　　　　　与　　　　　　　　结合时，大肠杆菌表现出Tet抗药性，两者脱落表现出Tet敏感。Tet可以改变　　　　　　　　的结构，从而开启下游基因表达。 （2）若要用Tet调控某目的基因M表达，需要构建含M的表达载体，只需要将上述系统中的　　　　　　　　进行替换，并将构建完成的表达载体与用　　　　　　　　处理后的大肠杆菌细胞混合，将表达载体导入其中。 （3）研究人员利用蓝光光敏二聚体蛋白（CRY-CIB1）特性（图2），对Tet-On诱导表达系统进行光控化改造。 ①简要阐述改造思路：　　　　　　　　。 ②光控Tet-On可以实现在　　　　　　　　条件下，开启下游基因表达。与Tet诱导比较，光控表达系统的优势有　　　　　　　　（答出一点即可）。 10.（2026·年汕头·二模）OTOF基因编码耳畸蛋白，该蛋白主要在内毛细胞的突触小体中发挥作用。OTOF基因多个位点单独突变都将导致神经信号传递障碍，从而引发先天性重度听力损失。研究人员尝试借助腺相关病毒（AAV）输送正常的OTOF基因进行治疗（如图）。 回答下列问题： （1）AAV是基因工程“分子工具”中的　　　　　　。提取细胞RNA经过　　　　　　和PCR可获取大量OTOF基因片段。 （2）由于目的基因的长度超过了AAV包装容量限制，将OTOF基因分为两段分别包装进入不同AAV中同时递送至内毛细胞，据图a可知，在构建质粒时需要选择的限制酶为　　　　　　；图b为AAV进入细胞之后基因重组修复和表达过程，在步骤②获得第一个双链DNA分子的过程中，需要用到　　　　　　。 A.Taq酶 B.引物 C.四种脱氧核苷酸 D.四种核糖核苷酸 （3）为保证目的基因仅在目标细胞中高效转录，研究人员基于现有启动子进行改造，设计出启动子P1-P5，以绿色荧光蛋白作为目的基因，检测不同细胞中的荧光强度，结果见下图。据下图分析，应选择　　　　　　启动子，依据是　　　　　　。 （4）有研究者认为本案例中的正常OTOF基因以环状形式独立存在于细胞核中，易发生丢失，应通过基因编辑，将内毛细胞的细胞核基因突变位点更正，使其表达出正确蛋白质以达到治疗效果。请从安全性或有效性的角度，分析本案例相较于基因编辑的优点　　　　　　（答出1点即可）。 11.（2026·广东茂名·二模）（多选）细菌肿瘤治疗是利用细菌作为药物载体的免疫疗法。ClyA是一种细菌外膜蛋白，能促进细菌对肿瘤细胞的黏附与侵入，从而实现靶向递送。Noxa蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡。研究人员在ClyA基因与Noxa基因的一端设计互补序列实现无缝连接，通过重叠延伸PCR技术将两者进行融合（如左图），并将其与温控元件相连构建热诱导表达载体（部分结构如右图），导入非致病性大肠杆菌中用于靶向治疗肿瘤。 注：pR-pL为启动子；Tc1为温控调节元件，可抑制下游基因表达，热诱导可解除其抑制作用。 回答下列问题： （1）左图中PCR1与PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是引物2和引物3的碱基序列　　　　　　　　，上述4种引物中能作为PCR3过程的引物是　　　　　　　　。 （2）研究人员将重组的ClyA-Noxa基因分别插入带有温控元件a和b的不同载体中，通过　　　　　　　　法导入大肠杆菌中构建了工程菌a和b，分别在37℃和42℃条件下培养，检测Noxa蛋白的表达情况，结果如图所示，其中WT表示未导入重组质粒的大肠杆菌。应选择工程菌　　　　　　　　进行后续的实验，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）研究人员将筛选的工程菌通过尾静脉注射到肿瘤小鼠体内，检测不同器官及肿瘤组织中工程菌的分布情况，下表的结果能否说明成功构建了工程菌，请作出判断并说明原因。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 小鼠组织 注射后12小时 注射后72小时 心 肝 脾 肺 肿瘤 心 肝 脾 肺 肿瘤 工程菌数量（“+”越多，数量越多） +++ +++++ ++++ +++ ++++ + ++ + ++ ++++++ （4）近红外光热疗法利用光敏感材料的光热转换能力高热杀伤肿瘤细胞，但多数材料肿瘤靶向性差、疗效不佳。结合上述实验结果提出一种新的肿瘤治疗思路：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 12.（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 （1）研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的　　　　　　　（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用　　　　　　　技术获取目的基因。 （2）研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是　　　　　　　，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是　　　　　　　。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与　　　　　　　的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：　　　　　　　。 （3）脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入　　　　　　　，目的是在工程菌的快速增长期实现　　　　　　　，而在数量稳定期实现　　　　　　　。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 6年真题1年模拟 考点分类 考情示例 命题规律 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2025广东（1题）、2023广东（1题） · 情境设置：以高通量测序技术（Solexa测序）、作物育种等真实科研情境为载体，体现技术前沿性 · 考查重点：聚焦PCR原理深化应用，如荧光检测与酶催化机制的结合，强调技术细节与实验逻辑 · 命题趋势：从单一PCR操作向"PCR+"融合技术拓展，注重与基因编辑、分子标记辅助选择等交叉综合 考点1 基因工程的基本工具 2025广东（1题）、2023广东（1题） · 情境设置：以工业菌株代谢调控、基础实验（DNA粗提取）等实践情境切入，贴近生产生活 · 考查重点：限制酶、DNA连接酶等工具的功能辨析，及实验操作步骤的正误判断 · 命题趋势：从工具识记转向工具选择逻辑与实验方案设计，强调工程思维与系统优化能力 考点1 基因工程的基本工具 1.（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（       ） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【答案】D 【分析】 DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】 A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确； B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确； C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确； D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。 故选D。 2.（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及　　　　　　检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有　　　　　　（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是　　　　　　　　。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是　　　　　　　　。 （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为　　　　　　　　。 （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：　　　　　　。 【答案】（1）mKate2蛋白或荧光     （2）① 细菌计数板计数法    ② 作为mKate2蛋白的荧光对照    ③ PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解     （3）快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强     （4）先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中      【分析】 1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 (1)小问详解： 在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)小问详解： 检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 (3)小问详解： 在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。 (4)小问详解： 为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，快速生长期合成的阻遏蛋白XC-末端带SsrA短肽，会被降解，在启动子Px的作用下合成酶A，催化莽草酸形成；将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后B基因停止转录，酶B合成停止，减少对莽草酸的转化，将两种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株，保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2025·广东·高考真题）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（       ） A. 1'-碱基 B. 2'-氢 C. 3'-羟基 D. 5'-磷酸基团 【答案】C 【分析】 在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。 【详解】 已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。 故选C。 2.（2023·广东·高考真题）（多选）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与　　　　　　　　　植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和　　　　　　　　　进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备　　　　　　　　　。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。     ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　　。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约　　　　　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　　（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到　　　　　　　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑　　　　　　　　　。         【答案】（1）野生型     （2）① 载体（基因表达载体）    ② 启动子和终止子     （3）① DAI基因和卡那霉素抗性基因    ② 75    ③ 自交    ④ 100    ⑤          【分析】 1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (1)小问详解： 根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。 (2)小问详解： 利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。 (3)小问详解： ①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。 ③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：      。 1.（2026·广东湛江·一模）下列关于PCR的叙述正确的是（　　） A. 该技术的核心原理是高温提高了DNA聚合酶的活性 B. 在PCR反应过程中，两条单链DNA与引物在复性阶段结合 C. 扩增目的基因时，子链从引物的3'端向5'端延伸 D. 为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的3'端添加识别序列 【答案】B 【详解】 A、PCR技术的核心原理是高温变性使DNA双链解开，而非提高酶活性。使用的Taq DNA聚合酶耐高温，但高温本身会降低大多数酶活性，A错误； B、 在复性（退火）阶段，温度降低使引物与模板DNA的特定区域通过碱基互补配对结合，形成局部双链，B正确； C、DNA聚合酶只能从引物的3'端向5'端方向延伸子链（即子链合成方向为5'→3'）。选项表述"从3'端向5'端延伸"易误解为延伸方向，实际延伸方向是5'→3'，C错误； D、为使PCR产物含限制酶识别序列，需在引物的5'端（非3'端）添加序列。因DNA聚合酶从引物3'端延伸，若加在3'端会被复制而失去酶切位点，D错误。 故选B。 2.（2026·广东深圳·二调）我国科学家将流感病毒的神经氨酸酶（NA）基因与哺乳动物细胞中的标记蛋白（LC3B）基因融合构成重组DNA疫苗。该疫苗与灭活流感疫苗的作用机制如图。下列分析错误的是（　　） A. 图中重组DNA疫苗进入的细胞很可能是抗原呈递细胞 B. NA和LC3B都可以激活细胞毒性T细胞和辅助性T细胞 C. 重组DNA疫苗可以进一步激活B细胞进行分裂和分化 D. 重组DNA疫苗整合了NA基因疫苗和灭活流感疫苗的功能 【答案】B 【详解】 A、重组DNA疫苗进入细胞后，需要表达抗原、处理抗原并将抗原呈递给T细胞，该功能由抗原呈递细胞承担，因此该细胞很可能是抗原呈递细胞，A正确； B、LC3B是哺乳动物自身的正常蛋白，不属于抗原，无法激活T细胞；只有流感病毒的NA是外来抗原，才能激活T细胞，B错误； C、重组DNA疫苗激活T细胞后，活化的T细胞可分泌细胞因子，能够进一步刺激B细胞分裂、分化为浆细胞和记忆细胞，C正确； D、从图中作用机制可知，重组DNA疫苗既保留了NA基因疫苗诱导细胞免疫的功能，又可以实现类似灭活流感疫苗激活辅助性T细胞的作用，整合了两种疫苗的功能，D正确。 3.（2026·广东深圳·二调）短链DNA化学合成的原理是直接将游离脱氧核苷酸（N）与固体介质硅基（Si）结合形成Si-N1，根据目标序列依次添加其他游离核苷酸，形成Si-N1-N2-N3……（图）。该合成方法的特点是（　　） A. 在DNA聚合酶作用下从合成链的3′端进行延伸 B. 在DNA聚合酶作用下从合成链的5′端进行延伸 C. 不需要DNA聚合酶，从合成链的3′端进行延伸 D. 不需要DNA聚合酶，从合成链的5′端进行延伸 【答案】D 【详解】 A、化学合成不需要 DNA 聚合酶，且不是从 3' 端延伸，A错误； B、既不需要 DNA 聚合酶，酶促反应也不能从 5' 端延伸，B错误； C、化学合成不需要酶，但延伸是从 5' 端进行，不是 3' 端，C错误； D、如图可知，短链DNA化学合成不需要 DNA 聚合酶，从合成链的 5' 端进行延伸，符合化学合成的原理和方向，D正确。 4.（2026·广东深圳·二调）研究人员将r28M基因导入山羊成纤维细胞，构建了可生产黑色素瘤抗体的乳腺生物反应器。该过程中不涉及的操作是（　　） A. 利用显微操作技术将山羊成纤维细胞注入去核卵母细胞 B. 诱导山羊B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞 C. 用PCR技术对转化后的山羊成纤维细胞进行检测与鉴定 D. 重构胚体外培养一段时间后移植入同期发情的受体母羊 【答案】B 【详解】 A、构建转基因乳腺生物反应器时，导入目的基因的成纤维细胞可作为核供体，需利用显微操作技术将其注入去核卵母细胞中完成核移植，构建重构胚，A不符合题意； B、诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞是单克隆抗体制备的特有操作，本题是通过培育转基因山羊的乳腺生物反应器生产抗体，不需要该操作，B符合题意； C、PCR技术可用于检测转化后的成纤维细胞中是否成功插入目的基因，属于目的基因的检测与鉴定环节，C不符合题意； D、重构胚需体外培养至桑葚胚或囊胚阶段，再移植入同期发情的受体母羊子宫内完成后续发育，属于胚胎移植的必要操作，D不符合题意。 5.（2026·广东韶关·二模）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验原理及操作步骤。下列叙述错误的是（       ） A. DNA溶于酒精，加入冷酒精析出的白色丝状物即为蛋白质杂质 B. DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂显蓝色，此时DNA的双螺旋结构已解开 C. DNA片段在电泳时的迁移速率与DNA分子量的大小和构象有关 D. 指示剂不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时停止电泳 【答案】A 【详解】 A、DNA不溶于酒精，蛋白质等杂质可溶于酒精，加入冷酒精后析出的白色丝状物是粗提取的DNA，A错误； B、用二苯胺试剂鉴定DNA时需沸水浴加热，高温会破坏DNA的双螺旋结构使其解旋，此时DNA遇二苯胺显蓝色，B正确； C、DNA电泳时，迁移速率受DNA分子的分子量大小、构象、凝胶浓度等因素影响，分子量越小、构象越紧凑的DNA迁移速率越快，C正确； D、电泳时加入的指示剂仅用于指示核酸的迁移进度，不会使DNA着色，待指示剂前沿接近凝胶边缘时即可停止电泳，后续再用专门的染色剂对DNA进行染色观察，D正确。 6.（2026·广东佛山·二模）BUF1基因是稻瘟病菌的关键基因，其功能正常时病菌为深色。Cas12a系统包含向导RNA和Cas12a蛋白，向导RNA识别特定DNA位点（靶点）后，Cas12a蛋白可对该位点进行剪切。为获得弱致病性的稻瘟病菌突变体，研究者利用Cas12a系统对BUF1基因进行编辑，如图a。将转化后的稻瘟病菌进行选择培养，并进行PCR和电泳检测，结果如图b。下列分析错误的是（　　） A. Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用 B. 选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株 C. 根据电泳结果，可确定菌株2为编辑成功的目标菌株 D. 筛选得到的目标菌株可用于培育抗稻瘟病水稻的研究 【答案】C 【详解】 A、Cas12a蛋白可对DNA位点进行剪切，而限制酶也是通过水解DNA上的磷酸二酯键来切割DNA分子的，所以Cas12a蛋白通过水解DNA上的磷酸二酯键发挥作用，A正确； B、由图a可知，导入了含有潮霉素抗性基因的重组质粒的稻瘟病菌能在含有潮霉素的培养基上存活，而BUF1基因功能正常时病菌为深色，功能不正常时为浅色，所以浅色菌落对应BUF1基因被编辑的目标菌株，因此选择培养基上需添加潮霉素，浅色菌落对应目标菌株，B正确； C、编辑成功的菌株，PCR产物因插入潮霉素抗性基因而片段更长，电泳条带迁移距离更短（更靠上）。由图b可知，菌株1、3 的条带位置靠上，说明片段长，是插入了抗性基因的编辑成功产物；菌株 2 的条带位置靠下，说明片段更短，是未编辑的原始BUF1基因，C错误； D、目标菌株是致病性减弱的稻瘟病菌突变体，可用于培育抗稻瘟病水稻的研究，D正确。 7.（2026·广东东莞·一模）瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，因具有显著健康功效，全球市场需求持续增长。大肠杆菌BL21产生瓜氨酸的代谢过程如图a所示，研究人员以该菌株为基础通过基因工程技术逐步构建了一株高效、无质粒、无需诱导的瓜氨酸生产菌株。 注：酶后面的英文表示控制该酶合成的基因的缩写；脯氨酸、谷氨酸和精氨酸是组成蛋白质的氨基酸，缺乏这些氨基酸会影响大肠杆菌的生命活动。 回答下列问题： （1）基因工程的核心步骤是　　　　　　　　　。研究人员把大肠杆菌BL21拟核DNA上的argG基因敲除，构建出CTL1菌株。配制含不同浓度精氨酸的培养液，发酵结果见下表，实验结果说明精氨酸对瓜氨酸的合成起　　　　　　　　　作用。据图表分析，BL21菌株中未检测到瓜氨酸的两个主要原因分别是　　　　　　　　　　　　。 检测指标 BL21 CTL1+精氨酸（g/L） CTL1+0 CTL1+0.1 CTL1+0.3 CTL1+0.5 CTL1+1.0 瓜氨酸（g/L） 0 0.32 0.31 0.17 0.12 0.10 （2）研究人员将CTL1菌株的proB基因敲除，构建出CTL2菌株，发酵48h后检测发现CTL2菌株的瓜氨酸产量显著下降。推测出现此结果的原因是　　　　　。据此，为减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，请提出一种改造菌株的新策略　　　　　　。 （3）为进一步提高瓜氨酸产量，研究人员分别敲除CTL1菌株的speC和speE基因，构建出CTL3和CTL4菌株。根据下图b的发酵结果，正确的策略是保留　　　　基因，敲除　　　　基因。 （4）相比目的基因在受体菌的质粒上，目的基因位于拟核DNA上有什么优势：　　　　　　　　　（答出1点即可）。 【答案】（1）① 构建基因表达载体    ② 抑制    ③ 精氨酸的合成以瓜氨酸为底物，导致瓜氨酸无法积累；精氨酸会抑制瓜氨酸的合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强     （2）① CTL2菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成    ② 将PutP基因敲除     （3）① speC    ② speE     （4）能稳定遗传，传代过程中不易丢失      (1)小问详解： 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤；根据表格结果，敲除argG后，添加的精氨酸浓度越高，瓜氨酸产量越低，说明精氨酸对瓜氨酸合成起抑制作用；BL21有完整的argG基因，其表达的酶会催化瓜氨酸转化为精氨酸，瓜氨酸无法积累；同时细胞内合成的精氨酸进一步抑制瓜氨酸合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强，因此BL21检测不到瓜氨酸。 (2)小问详解： proB编码谷氨酸激酶，催化谷氨酸合成脯氨酸，而脯氨酸是大肠杆菌必需的氨基酸，敲除proB后大肠杆菌CTL2菌株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成，因此瓜氨酸产量下降；若要减少CTL1菌株中脯氨酸对瓜氨酸产量的影响，可将PutP基因敲除，既满足大肠杆菌对脯氨酸的需求，又能让更多谷氨酸流向瓜氨酸合成途径。 (3)小问详解： 根据题意：敲除speC得到CTL3，敲除speE得到CTL4。从柱状图可知，敲除speE的CTL4瓜氨酸产量最高，敲除speC的CTL3瓜氨酸产量降低，因此正确策略是保留speC，敲除speE。 (4)小问详解： 质粒是游离在拟核外的DNA，细胞分裂时容易丢失，而目的基因整合到拟核DNA后，可以随拟核DNA同步复制，能稳定遗传，传代过程中不易丢失。 8.（2026·广东汕头·一模）多囊肾病是一种常染色体遗传病，可由17号染色体上的Pkd1基因（P）突变引起。科研人员培育多囊肾模型小鼠（简称“模型鼠”），试图通过诱变和遗传筛选，找到能减缓肾囊肿生长的突变基因位点，为基因治疗提供新靶点。 回答下列问题： （1）小鼠A从亲本一方获得一个Pkd1突变基因（P-），其在肾脏体细胞中表达后会使细胞中另一个正常的等位基因也突变为P-，这种“二次打击”可使细胞过度增殖，引起肾囊肿。据此推测多囊肾病属于常染色体　　　　　　性（填“显”或“隐”）遗传病。“二次打击”可发生在发育的任何时间、任何一个肾脏细胞，说明基因突变具有　　　　　性。 （2）将噬菌体的C基因导入正常小鼠的17号染色体获得小鼠B，C基因能在小鼠肾脏体细胞中特异性表达并删除P基因，被敲除成对P基因的细胞也会过度增殖。小鼠B与小鼠A杂交得到F1，若F1中多囊肾小鼠占　　　　　，说明C基因仅插在一条染色体上；若F1中多囊肾小鼠占　　　　　，则小鼠B可作为多囊肾模型鼠（图6a）。 （3）利用EMU（一种化学诱变剂）诱导模型鼠G0发生随机突变，筛选获得一只含突变基因m的潜在突变体G1，将其按照图6b过程进行遗传筛选，获得肾生长正常的突变体G5. ①图中G1与G2进行杂交的目的是获得一只　　　　的G3，从而培育出G5. ②为确定突变基因m的位置，选用15、17号染色体上高度保守的DNA序列作为分子标记，对G1和G3杂交产生的20只肾正常小鼠进行遗传分析，结果见下表。据表推测突变基因最可能位于　　　　位置附近。 分子标记 15号染色体 17号染色体 M5 M65 M246 M46 M113 M143 + 12 10 9 20 18 16 +/- 8 10 11 0 2 4 注：“+”表示分子标记均来自G1；“+/-”表示分子标记来自G1和G2； M5、M65、M246为对应染色体上分子标记的名称；数字为小鼠个体数。 （4）科研人员利用基因工程技术对肾囊肿小鼠A进行病后干预，将其肾脏中的基因M替换成突变基因m，培育6周后囊肿“逆转”，肾脏结构和功能恢复正常。从调控细胞生命历程的角度分析，m基因的作用是　　　　。 【答案】（1）① 显    ② 随机     （2）①     ② 1     （3）① 雌性且携带突变基因m    ② 17号染色体被M46标记处     （4）调控肾脏细胞增殖的速度，促进异常增殖细胞的凋亡      【分析】 基因突变特点：①普遍性：基因突变是普遍存在的；②随机性：基因突变是随机发生的，可以发生在个体发育的任何时期；③不定向性：基因突变是不定向的；④低频性：对于一个基因来说，在自然状态下，基因突变的频率是很低的；⑤多害少益性：大多数突变是有害的；⑥可逆性：基因突变可以自我回复（频率低）。 (1)小问详解： 根据题干描述，小鼠A从亲本一方获得一个Pkd1突变基因（P-），在肾脏体细胞中表达后，会使细胞中另一个正常的等位基因也突变为P-，这种“二次打击”导致细胞过度增殖，引起肾囊肿。即单个突变基因的携带即可导致疾病发生，因此多囊肾病属于常染色体显性遗传病。基因突变的随机性，表现为基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期；可以发生在细胞内不同的DNA分子上，以及同一个DNA分子的不同部位，所以“二次打击”可发生在发育的任何时间、任何一个肾脏细胞，说明基因突变具有随机性。 (2)小问详解： 根据题意可知小鼠A基因型为P-P，若C基因仅插在一条染色体上则小鼠B的基因型为C+P,小鼠B与小鼠A杂交得到F1中只有PP正常，其余均患病，所以F1中多囊肾小鼠占。若C基因插在2条染色体上，则小鼠B的基因型为C+C+PP（C与P连锁）,因为C基因能在小鼠肾脏体细胞中特异性表达并删除P基因，被敲除成对P基因的细胞也会过度增殖，所以小鼠B与小鼠A杂交得到F1中的小鼠都会含C,故小鼠都会患多囊肾病。 (3)小问详解： ① G₁是含突变基因m的潜在突变体，G₂是未经EMU处理的模型鼠。G₁与G₂杂交的目的是获得一只同时携带Pkd1突变基因（P-）和突变基因m（或同时携带突变基因m和多囊肾病致病基因）的G₃，作为种鼠有繁殖下一代的作用，所以G₃是携带突变基因m的雌鼠。 ② 分子标记与突变基因m的连锁关系越紧密，在减数分裂时发生重组的概率就越低。在20只肾正常小鼠中： 17号染色体上的分子标记M46，所有个体的标记均来自G₁（“+”个体数为20，“+/-”个体数为0），说明M46与突变基因m几乎完全连锁，没有发生重组。 其他分子标记（如M5、M65、M246、M113、M143）均有“+/-”个体，说明与m存在一定程度的重组。 因此，突变基因m最可能位于17号染色体的M46标记处。 (4)小问详解： 根据题意可知基因M替换成突变基因m后小鼠A的囊肿“逆转”，肾脏结构和功能恢复正常这说明m基因可以调控肾脏细胞增殖的速度，促进异常增殖细胞的凋亡。 9.（2026·广东·二模）四环素（Tet）诱导表达系统分为激活型（Tet-on）和抑制型（Tet-off），是源于大肠杆菌Tet抗药机制设计的可调控基因表达工具，如图1为该系统的模式图。 注：tTA/rtTA表示Tet阻遏蛋白复合物，TRE表示tTA/rtTA结合位点。 回答下列问题： （1）据图分析，当　　　　　　　　与　　　　　　　　结合时，大肠杆菌表现出Tet抗药性，两者脱落表现出Tet敏感。Tet可以改变　　　　　　　　的结构，从而开启下游基因表达。 （2）若要用Tet调控某目的基因M表达，需要构建含M的表达载体，只需要将上述系统中的　　　　　　　　进行替换，并将构建完成的表达载体与用　　　　　　　　处理后的大肠杆菌细胞混合，将表达载体导入其中。 （3）研究人员利用蓝光光敏二聚体蛋白（CRY-CIB1）特性（图2），对Tet-On诱导表达系统进行光控化改造。 ①简要阐述改造思路：　　　　　　　　。 ②光控Tet-On可以实现在　　　　　　　　条件下，开启下游基因表达。与Tet诱导比较，光控表达系统的优势有　　　　　　　　（答出一点即可）。 【答案】（1）① tTA/rtTA    ② TRE    ③ rtTA     （2）① Tet抗性基因用M基因    ②      （3）① 将rtTA蛋白拆分成两部分结构，分别与CRY、CIB1结合    ② 蓝光和Tet    ③ 时间和空间上更加精准，时间空间调控更加灵活，调控速度更快      (1)小问详解： 当 tTA（或tTA/rtTA，二者均为阻遏蛋白复合物） 与 TRE（结合位点） 结合时，下游抗性基因表达，细菌抗 Tet；两者脱落时，抗性基因关闭，细菌敏感。Tet（四环素）的作用是改变阻遏蛋白复合物的结构，让它和 TRE 的结合状态改变。在 Tet-on 系统中，Tet 结合rtTA后，会改变rtTA的空间结构，让它能结合 TRE，从而开启下游基因表达。 (2)小问详解： 原系统的 “报告基因” 是四环素抗性基因，现在要换成目的基因 M，所以只需要将系统中的Tet抗性基因替换为目的基因 M，保留tTA/rtTA和TRE的调控元件，就能实现用 Tet 调控 M 的表达。将重组载体导入大肠杆菌，常用的方法是感受态细胞转化法：用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其处于感受态，更容易吸收外源质粒（表达载体）。 (3)小问详解： ①改造思路是：将 rtTA 蛋白拆分成两部分结构，分别与 CRY、CIB1 结合；在蓝光照射下，CRY 与 CIB1 二聚化，使 rtTA 的两部分重新组装为有功能的完整蛋白，从而恢复其与 TRE 结合、开启下游基因的能力。 ②开启条件：改造后的光控 Tet-on 系统，既保留了原系统的 Tet 依赖，又增加了蓝光调控，所以需要蓝光和 Tet 同时存在时，才能开启下游基因表达。光控系统的优势：和化学诱导（Tet）相比，光控的优势非常明显：   时间、空间调控更精准：可以通过局部照射蓝光，实现特定细胞 / 组织、特定时间点的基因表达调控，而化学诱导是全身性的，无法精准控制。 调控速度更快：光的响应速度比药物扩散、代谢快得多，诱导和关闭的时滞更短。 可逆性强：可以通过开 / 关蓝光快速切换基因的表达状态，而药物诱导的可逆性较差，需要等待药物代谢。 10.（2026·年汕头·二模）OTOF基因编码耳畸蛋白，该蛋白主要在内毛细胞的突触小体中发挥作用。OTOF基因多个位点单独突变都将导致神经信号传递障碍，从而引发先天性重度听力损失。研究人员尝试借助腺相关病毒（AAV）输送正常的OTOF基因进行治疗（如图）。 回答下列问题： （1）AAV是基因工程“分子工具”中的　　　　　　。提取细胞RNA经过　　　　　　和PCR可获取大量OTOF基因片段。 （2）由于目的基因的长度超过了AAV包装容量限制，将OTOF基因分为两段分别包装进入不同AAV中同时递送至内毛细胞，据图a可知，在构建质粒时需要选择的限制酶为　　　　　　；图b为AAV进入细胞之后基因重组修复和表达过程，在步骤②获得第一个双链DNA分子的过程中，需要用到　　　　　　。 A.Taq酶 B.引物 C.四种脱氧核苷酸 D.四种核糖核苷酸 （3）为保证目的基因仅在目标细胞中高效转录，研究人员基于现有启动子进行改造，设计出启动子P1-P5，以绿色荧光蛋白作为目的基因，检测不同细胞中的荧光强度，结果见下图。据下图分析，应选择　　　　　　启动子，依据是　　　　　　。 （4）有研究者认为本案例中的正常OTOF基因以环状形式独立存在于细胞核中，易发生丢失，应通过基因编辑，将内毛细胞的细胞核基因突变位点更正，使其表达出正确蛋白质以达到治疗效果。请从安全性或有效性的角度，分析本案例相较于基因编辑的优点　　　　　　（答出1点即可）。 【答案】（1）① 分子运输车（载体）    ② 逆转录     （2）① HindⅢ、SacⅠ、BamHⅠ    ② C     （3）① P4    ② P4组内毛细胞荧光强度（最）高、支持细胞荧光强度（最）低     （4）目的基因不会整合到宿主基因组中，不改变受体细胞原有基因序列，安全性更高；输送正常基因全长序列，可应对OTOF基因不同的突变位点，均可发挥作用。      (1)小问详解： 题意显示，研究人员尝试借助腺相关病毒（AAV）输送正常的OTOF基因进行治疗，可见AAV是基因工程“分子工具”中的分子运输车（载体）。提取细胞RNA经过逆转录和PCR可获取大量OTOF基因片段，进而为后续目的基因的转入做准备。 (2)小问详解： 由于目的基因的长度超过了AAV包装容量限制，因而可将OTOF基因分为两段分别包装进入不同AAV中同时递送至内毛细胞，OTOF分为两段后需要分别插入两个AAV转移质粒的ITR区域，据图a可知，在构建质粒时需要选择的限制酶为HindⅢ、SacⅠ切割得到上游目的片段并构建第一个重组质粒，用SacⅠ、BamHⅠ切割得到下游目的片段并构建第二个重组质粒，不选择KpnⅠ的原因是由于质粒中有两个该酶切割位点，因此需要三种限制酶：HindⅢ、SacⅠ、BamHⅠ实现切割；图b为AAV进入细胞之后基因重组修复和表达过程，在步骤②获得第一个双链DNA分子的过程中，不需要添加引物和DNA聚合酶（Taq酶），但需要原料四种脱氧核苷酸，因此选C。因为图示AP区段已经发生了碱基互补配对，且互为模板和引物，且不需要高温解旋，因而只需要添加四种脱氧核苷酸作为原料即可。 (3)小问详解： 本实验目的是获得仅在内毛细胞驱动目的基因高效转录的启动子，要求启动子在内毛细胞中转录活性高（荧光强）、在非目标支持细胞中转录活性低（荧光弱）。从柱状图结果可知，P4组内毛细胞荧光强度（最）高、支持细胞荧光强度（最）低，因而P4符合该要求。 (4)小问详解： 本案例中的正常OTOF基因以环状形式独立存在于细胞核中，不改变受体细胞原有基因序列，安全性更高；该操作中输送正常基因全长序列，可应对OTOF基因不同的突变位点，均可发挥作用，对所有突变类型都有效，适用性更强。 11.（2026·广东茂名·二模）（多选）细菌肿瘤治疗是利用细菌作为药物载体的免疫疗法。ClyA是一种细菌外膜蛋白，能促进细菌对肿瘤细胞的黏附与侵入，从而实现靶向递送。Noxa蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡。研究人员在ClyA基因与Noxa基因的一端设计互补序列实现无缝连接，通过重叠延伸PCR技术将两者进行融合（如左图），并将其与温控元件相连构建热诱导表达载体（部分结构如右图），导入非致病性大肠杆菌中用于靶向治疗肿瘤。 注：pR-pL为启动子；Tc1为温控调节元件，可抑制下游基因表达，热诱导可解除其抑制作用。 回答下列问题： （1）左图中PCR1与PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是引物2和引物3的碱基序列　　　　　　　　，上述4种引物中能作为PCR3过程的引物是　　　　　　　　。 （2）研究人员将重组的ClyA-Noxa基因分别插入带有温控元件a和b的不同载体中，通过　　　　　　　　法导入大肠杆菌中构建了工程菌a和b，分别在37℃和42℃条件下培养，检测Noxa蛋白的表达情况，结果如图所示，其中WT表示未导入重组质粒的大肠杆菌。应选择工程菌　　　　　　　　进行后续的实验，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （3）研究人员将筛选的工程菌通过尾静脉注射到肿瘤小鼠体内，检测不同器官及肿瘤组织中工程菌的分布情况，下表的结果能否说明成功构建了工程菌，请作出判断并说明原因。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 小鼠组织 注射后12小时 注射后72小时 心 肝 脾 肺 肿瘤 心 肝 脾 肺 肿瘤 工程菌数量（“+”越多，数量越多） +++ +++++ ++++ +++ ++++ + ++ + ++ ++++++ （4）近红外光热疗法利用光敏感材料的光热转换能力高热杀伤肿瘤细胞，但多数材料肿瘤靶向性差、疗效不佳。结合上述实验结果提出一种新的肿瘤治疗思路：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 具有互补的碱基片段    ② 引物1和引物4     （2）① Ca2+处理法    ② b    ③ 工程菌b的Noxa蛋白在37℃不表达，仅在42℃热诱导条件下表达     （3）成功，该工程菌能够靶向小鼠体内的肿瘤组织     （4）将工程菌介导的细菌肿瘤疗法与近红外光照射的光热治疗结合进行联合治疗      (1)小问详解： 引物2是ClyA基因的下游引物，引物3是Noxa基因的上游引物，由左图第三排可知，二者含有碱基序列互补配对片段，如果PCR1和PCR2在同一个反应体系中进行，引物2和引物3会直接发生碱基互补配对，无法与模板DNA结合，导致PCR扩增失败，因此不能在同一体系中进行；PCR3的作用是扩增完整的ClyA-Noxa融合基因，需要结合在融合基因的两端外侧，因此选择最外侧的引物1（结合ClyA基因上游5'端）和引物4（结合Noxa基因下游3'端），作为PCR3的引物完成全长扩增。 (2)小问详解： 将重组质粒导入大肠杆菌（原核细胞）的常用方法是Ca2+处理法（感受态细胞法）：用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态），从而将重组质粒导入细胞；结合题干信息，Tc1是温控元件，37℃时抑制下游基因表达，42℃热诱导可解除抑制，结合图的结果，工程菌a在37℃就有Noxa蛋白表达，会在正常体温下损伤正常组织，不符合靶向治疗要求，工程菌b在37℃（小鼠正常体温）几乎不表达Noxa蛋白，避免对正常组织的毒副作用，42℃（热诱导条件）下可高效表达Noxa蛋白，实现肿瘤部位的靶向诱导凋亡，因此选择工程菌b进行后续实验。 (3)小问详解： ClyA蛋白的功能是促进细菌对肿瘤细胞的黏附与侵入，实现靶向递送，表格结果显示：注射后12小时，工程菌在各器官和肿瘤组织均有分布，注射后72小时，正常器官（心、肝、脾、肺）的工程菌数量显著减少，而肿瘤组织中的工程菌数量大幅增加，说明工程菌能够特异性靶向并富集在肿瘤组织中，符合ClyA蛋白的靶向功能，因此可说明成功构建了工程菌。 (4)小问详解： 题干提到近红外光热疗法的光热转换能力可高热杀伤肿瘤细胞，本实验构建的工程菌可通过ClyA蛋白实现肿瘤靶向，同时热诱导可激活Noxa蛋白的凋亡作用，因此最优治疗思路是：将工程菌介导的细菌肿瘤疗法与近红外光照射的光热治疗结合进行联合治疗，利用工程菌的肿瘤靶向性，让工程菌特异性富集在肿瘤组织，通过近红外光照射肿瘤部位，一方面利用光热效应高热杀伤肿瘤细胞，另一方面热诱导解除Tc1的抑制，使Noxa蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡，同时解决光热材料靶向性差的问题，实现双重靶向治疗，提升疗效。 12.（2026·广东韶关·二模）近年来，利用光合微生物将二氧化碳转化为有机物产品，成为解决能源与环境问题的新兴策略。我国科研团队成功构建了一种能利用CO2高效合成生物可降解塑料——聚乳酸（PLA）的工程蓝细菌（图1）。 （1）研究者构建的PLA的合成途径包含三步酶促反应（图1），LDH、PCT、PHA三种外源酶分别由来自三种不同细菌的ldhD、pct、pha基因编码。根据目的基因的　　　　　　　（填3′或5′）端碱基序列设计引物，并利用　　　　　　　技术获取目的基因。 （2）研究者首先构建了质粒A和B（图2），分别将目的基因导入两组蓝细菌，并全程添加等量IPTG，以PLA产量反映质粒功能。 ①质粒A中，多个基因共用一个启动子转录出一条mRNA，再分别翻译出不同蛋白质。这种结构在DNA较短的原核生物中普遍存在，其意义是　　　　　　　，但该结构存在缺陷，即距离启动子越远的基因表达量逐渐衰减。 ②最终测得质粒B的PLA产量远高于质粒A，其原因是　　　　　　　。 ③研究者构建质粒C，通过敲低脂肪酸合成酶基因的表达（不删基因，只是抑制其转录或翻译）来提高PLA产量。推测靶向序列转录的sRNA应与　　　　　　　的mRNA互补，从而抑制其翻译，该过程需在hfq基因编码的伴侣蛋白HFQ协助下进行。hfq基因的翻译受茶碱诱导的核糖开关调控，据图3说明茶碱诱导HFQ翻译开启的机制：　　　　　　　。 （3）脂肪酸是合成蓝细菌细胞膜的关键原料，缺少脂肪酸将无法生长和分裂；而持续大量表达外源酶也会给细胞造成代谢负担，不利于细胞增殖。因此，在利用工程蓝细菌（含质粒B和C）发酵生产时，应该在即将达到K值时加入　　　　　　　，目的是在工程菌的快速增长期实现　　　　　　　，而在数量稳定期实现　　　　　　　。 【答案】（1）① 3'    ② PCR（聚合酶链式反应）     （2）① 节约遗传物质，（以最少调控元件或最短的序列）实现多基因协同表达    ② 质粒B基因无表达衰减，酶量充足；质粒A反之    ③ 脂肪酸合成酶基因    ④ 茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启动翻译     （3）① IPTG、茶碱    ② 正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA    ③ 减少脂肪酸合成，大量合成PLA      (1)小问详解： PCR扩增目的基因时，引物延伸方向为5′→3′，引物需要与模板链的3′端互补配对，因此需要根据目的基因的3′端序列设计引物；获取已知序列的目的基因常用PCR技术。 (2)小问详解： ①原核生物DNA总长度较短，多个基因共用一个启动子转录，可充分利用有限的DNA序列，提高遗传物质的利用率，以最少调控元件或最短的序列实现多基因协同表达，适应原核生物的基因组特点。 ②质粒A仅一个启动子，且存在“距离启动子越远基因表达量衰减”的缺陷，远端的目的基因表达量低；质粒B中每个目的基因都有独立的诱导型启动子，无表达衰减，三个基因都能被IPTG诱导高效表达，三种酶合成量充足，因此PLA产量更高。 ③该实验要敲低脂肪酸合成酶基因的表达，因此sRNA需要与脂肪酸合成酶的mRNA互补配对，从而抑制其翻译；根据图3的机制：无茶碱时，核糖体结合位点RBS被封闭在mRNA的结构中，核糖体无法结合，翻译不能起始；茶碱结合后改变mRNA的空间结构，使RBS暴露，核糖体可结合RBS，从而开启HFQ的翻译。 (3)小问详解： 快速增殖期的工程菌需要合成脂肪酸构建细胞膜，因此不需要提前抑制脂肪酸合成；当菌体数量即将达到K值（稳定期）时，加入IPTG和茶碱，同时开启HFQ和LDH、PCT、PHA三种外源酶的表达，进而抑制脂肪酸合成促进PLA合成，既保证了快速增长期工程菌正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA，积累足够的菌体，在稳定期又能减少脂肪酸合成，使更多丙酮酸（代谢前体）流向PLA合成，提高PLA产量。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $函学科网 www.zxxk.com 让教与学更高效 专题15基因工程 考点1基因工程的基本工具 1.【答案】D 2.【答案】(1)mKate2蛋白或荧光 (2)①细菌计数板计数法 ②作为mKate2蛋白 的荧光对照 ③Pr。在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降 解 (3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生菌株中的酶 B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate.2基因替换为酶A基因，并将两 种质粒导入敲除酶B基因的野生菌株中 考点2基因工程的基本操作程序(PCR技术及其应用) 1.【答案】C 2.【答案】(1)野生型 (2)①载体（基因表达载体） ②启动子和终止 子 (3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 ④ 核酸电泳图 标准参照物野生型 突变型 150bp 100bp 三三 100 ⑤ 50bp (bp指核苷酸对) 1.【答案】B 2.【答案】B 3.【答案】D 4【答案】B 5.【答案】A 6.【答案】C 7.【答案】(1)①构建基因表达载体 ②抑制 ③精氨酸的合成以瓜氨酸为底物，导致 瓜氨酸无法积累；精氨酸会抑制瓜氨酸的合成，精氨酸浓度越高抑制作用越强 (2)①CTL2菌 株因无法合成脯氨酸而生长增殖受到抑制，削弱了瓜氨酸的合成 ②将PutP基因敲 除 (3)①speC ②speE (4)能稳定遗传，传代过程中不易丢 112 函学科网 www.zxxk.com 让教与学更高效 失 8.【答案】(1)①显 ②随机 (2)① 3 ②1 (3)①雌性且 携带突变基因m ②17号染色体被M46标记处 (4)调控肾脏细胞增殖的速度，促进异 常增殖细胞的调亡 9.【答案】(1)①tTA/rtTA ②TRE ③rtTA (2)①Tet抗性基因用M基 因 ②Ca2+ (3)①将rtTA蛋白拆分成两部分结构，分别与CRY、CIB1结 合 ②蓝光和Tet ③时间和空间上更加精准，时间空间调控更加灵活，调控速度更 快 10.【答案】(1)①分子运输车（载体） ②逆转录 (2)①HindlⅢ、SacI、 BamH I ②C (3)①P4 ②P4组内毛细胞荧光强度（最）高、支持细胞荧光 强度（最）低 (4)目的基因不会整合到宿主基因组中，不改变受体细胞原有基因序列，安全 性更高：输送正常基因全长序列，可应对OTOF基因不同的突变位点，均可发挥作用。 11.【答案】(1)①具有互补的碱基片段 ②引物1和引物4 (2)①Ca+处理 法 ②b ③工程菌b的Noxa蛋白在37℃不表达，仅在42℃热诱导条件下表 达 (3)成功，该工程菌能够靶向小鼠体内的肿瘤组织 (4)将工程菌介导的细菌肿 瘤疗法与近红外光照射的光热治疗结合进行联合治疗 12.【答案】(1)①3 ②PCR(聚合酶链式反应) (2)①节约遗传物质，（以最 少调控元件或最短的序列)实现多基因协同表达 ②质粒B基因无表达衰减，酶量充足：质粒A反 之 ③脂肪酸合成酶基因 ④茶碱与mRNA结合后使RBS暴露，核糖体与暴露的RBS结合启 动翻译 (3)①IPTG、茶碱 ②正常合成脂肪酸、增殖且不合成PLA ③减少 脂肪酸合成，大量合成PLA 2/2