专题15 基因工程（7年汇编）（山东专用）2020-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程专题，整合2021-2026年山东高考真题及模拟题，覆盖工具酶、载体构建、PCR技术等核心考点，以经典实验与科研情境为载体，强化操作原理与应用分析。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|约15题|限制酶作用、DNA提取鉴定、PCR引物设计|以2024山东真题“DNA粗提取”考查操作细节，2026模拟题“易错PCR”关联酶活性改造| |非选择题|约15题|载体构建、农杆菌转化、基因编辑（CRISPR）|2025山东真题结合Ti质粒考查重组载体构建，2026模拟题“工程化外泌体”融合靶向递送技术，体现从基础实验到科研应用的梯度|

专题 15 基因工程 7年真题1年模拟 考点分类 考情示例 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2025山东（1题）、2024山东（1题）、2023山东（1题）、2022山东（1题）、2021山东（2题） · 情境设置：以重组质粒构建、农杆菌转化、DNA粗提取等经典实验为情境 · 考查重点：限制酶与载体选择、标记基因检测、DNA提取原理与操作细节 · 命题趋势：回归教材基础实验，强化操作原理与试剂作用分析，融合分子标记与表达调控考查 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026山东（1题）、2024山东（2题）、2022山东（1题） · 情境设置：以基因编辑、疾病治疗、作物育种等真实科研情境为载体，强调PCR技术的实际应用 · 考查重点：PCR反应体系组成（引物、酶、原料）、标记技术应用、产物检测与分析 · 命题趋势：与基因编辑技术（如CRISPR）、分子诊断深度融合，注重实验设计与结果分析能力 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 2.（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（       ） A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质 3.（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（       ） A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 4.（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是　　　　　　　，载体上与其能自我复制相关的结构是　　　　　　　。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为　　　　　　　　　　　。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，该过程中　　　　　　　　　　　（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 5.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　　bp，则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　　　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 6.（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。     （1）与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　　　　　　　。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　　　　　　　（答出2个结构即可）。 （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物　　　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　　　　　　　　　（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　　　　　，条带2所检出的蛋白　　　　　　　　　　　　　　（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 7.（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　　。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于　　　　　，理由是　　　。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·山东·高考真题）以4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和32P标记的dTTP）为原料，以一段单链DNA为模板进行PCR，获得大量双链DNA。酶W可切断DNA中5´碳与磷酸基团之间的化学键。用酶W对上述PCR产物充分酶切后获得3´-核苷酸，如图所示。所有带32P的3´-核苷酸中，碱基均为胞嘧啶。若用32P标记某种脱氧核苷酸，以相同单链DNA为模板进行PCR，产物经充分酶切后，带32P的3´-核苷酸的碱基均为腺嘌呤，则被标记的脱氧核苷酸为（　　） A. dATP B. dGTP C. dCTP或dGTP D. dATP或dCTP 2.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①                  5'-GCCGATCTTTATA-3'3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'            3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 3.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　　（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有　　　　　　种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　　　　-3'和5'-　　　　　　-3'。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　　　（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 4.（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是　　　　　　　，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　　　（填“3'端”或“5'端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是　　　　　　。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是　　　　　　。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是　　　　　　；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是　　　　　　。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是　　　　　　。 1.（2026·山东淄博·一模）科研人员将患镰状细胞贫血小鼠的成纤维细胞经原代培养和传代培养后，通过体外诱导，获得多能干细胞（iPS细胞），并对iPS细胞进行基因编辑修复突变位点后用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。下列说法错误的是（　　） A. 出现接触抑制前的原代培养的成纤维细胞，更适合用于诱导iPS细胞 B. 传代培养小鼠成纤维细胞时应定期更换培养液，以清除代谢废物并补充营养物质 C. 可借助病毒将关键转录因子基因导入小鼠成纤维细胞来诱导形成iPS细胞 D. 只需将基因编辑后的iPS细胞直接注射进小鼠骨髓即可治疗镰状细胞贫血 2.（2026·山东滨州·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳”的实验，下列说法正确的是（       ） A. 研磨液需经过4℃静置后才可离心获取上清液 B. 将获得的DNA直接加入二苯胺试剂后沸水浴加热呈现蓝色 C. 电泳时加入的核酸染料在紫外光照射下可发出荧光 D. 设置PCR循环程序的最后一次复性时间时，可与之前循环相同 3.（2026·山东烟台·一模）易错PCR是利用易发生碱基错误配对的Taq酶或改变PCR反应条件，降低DNA复制的准确性，使扩增产物出现较多突变位点的方法。易错PCR技术可用于改造催化效率较低的天然酶。下列说法错误的是（       ） A. 可通过改变PCR过程中复性温度来降低DNA复制的准确性 B. 易错PCR可定向改变天然酶基因的序列，使酶的催化效率提高 C. 改造后的基因某些突变位点对应的氨基酸序列不一定改变 D. 通过易错PCR技术改造后的天然酶在自然界原本不存在 4.（2026·山东济南·一模）下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的说法正确的是（　　） A. 在微量离心管中加入各组分后通常需要通过离心来混匀 B. PCR实验中的移液器、枪头、缓冲液等在使用前必须高压灭菌 C. 凝胶电泳中，带电分子的迁移速率受净电荷、电荷性质及分子大小共同影响 D. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA和纸层析法分离色素的原理相同，使用的介质不同 5.（2026·山东济南·一模）使用限制酶MboI（识别4核苷酸序列GATC）切割基因组DNA，将外源DNA片段与载体连接后导入大肠杆菌，成功构建了基因组文库，可以从基因组文库中筛选获取目的基因，下列相关叙述正确的是（　　） A. 使用限制酶MboI可以对基因组DNA有较高的切割频率 B. 非互补的黏性末端经E．coliDNA连接酶处理后均可以转变为平末端 C. 为获得有生物活性的目的蛋白，基因组文库的构建需要使用相应的动植物细胞作为受体 D. 使用PCR技术筛选目的基因的前提是目的基因的全部序列是已知的 6.（2026·山东济南·一模）某同学使用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术获取cDNA，结果未获得cDNA产物，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 逆转录酶失活，更换新的逆转录酶 B. 酶的用量不足，增加TaqDNA聚合酶的用量 C. RNA模板降解，使用新的RNA模板 D. 引物失效，换用新的引物 7.（2026·山东济南·一模）（多选）研究证实，Bld-1蛋白只能特异性地识别并结合到表达STn抗原的膀胱癌细胞表面。LAMP2B是外泌体（细胞的分泌囊泡）表面的膜蛋白，通过基因工程技术，构建融合表达LAMP2B/Bld-1的靶向膀胱癌工程化外泌体，可实现为膀胱癌细胞高效递送药物。用离心法提取细胞培养液中的工程化外泌体，采用电泳技术检测其表面Bld-1蛋白的表达水平。下列说法正确的是（　　） A. 可直接通过PCR、人工合成法等来获取目的蛋白Bld-1 B. 外泌体应在细胞培养液的上清液中收集 C. 抗体和抗原的特异性结合是检测工程化外泌体表面Bld-1蛋白的常用原理 D. 工程化外泌体可将药物送达膀胱癌细胞，减少药物对正常细胞的副作用 8.（2026·山东潍坊·一模）下列关于PCR技术的说法，错误的是（　　） A. PCR前需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B. 每一次循环都需要向离心管添加一次引物 C. 延伸的时长主要由模板链的长度决定 D. PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性 9.（2026·山东青岛·一模）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3'3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3'3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3'3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3'3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3'3' CAGCT↑G5' （1）可从　　　　　　中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。提取水稻细胞中的　　　　　　，经逆转录获得总cDNA，将其作为PCR反应的模板，在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要　　　　　　。 （2）为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5' 端和3' 端分别添加限制酶　　　　　　的酶切序列。若基因E11转录模板链的3' 端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是　　　　　　。 （3）使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有　　　　　　的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。推测　　　　　　号菌落含有重组质粒，其他菌落的条带出现的原因可能是　　　　　　。 （4）将纯化得到的蛋白E11添加到含有　　　　　　（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 10.（2026·山东淄博·一模）人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是　　　　　　　。T7RNA聚合酶基因的启动子属于　　　　　　型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是　　　　　　　。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是　　　　　　（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入　　　　　。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的　　　　　　基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生　　　　　　（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为　　　　　　bp。 11.（2026·山东日照·一模）除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为　　　　　　　　。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的　　　　　　　　号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是　　　　　　　　（填序号）。 ①样品被污染       ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短       ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强       ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是　　　　　　　　（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链　　　　　　　　（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是　　　　　　　　。 12.（2026·山东济宁·一模）（多选）科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是　　　　。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶　　　　的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-　　　　-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色的X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加　　　　，从　　　　色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-　　　　-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行　　　　次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 13.（2026·山东聊城·一模）（多选）弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20。抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌　　　　　　，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到　　　　　　　的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明　　　　　　　。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物　　　　　　　。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据　　　　　　　的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含　　　　　　　的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入　　　　　　　等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有　　　　　　　。（答出两点即可） 14.（2026·山东德州·一模）（多选）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶　　　　　　　　　　　分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用　　　　　　　　　　　酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶　　　　　　　　　　　对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有　　　　　　　　　　　(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为　　　　　　　　　　　(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物　　　　　　　　　　　扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是　　　　　　　　　　　。 15.（2026·山东烟台·一模）在植物遗传转化过程中，除目的基因外，标记基因等序列也会随目的基因整合到作物基因组中，应予以剔除。科学家构建了可诱导剔除标记基因的载体，并将其导入拟南芥获得无标记基因的耐盐个体，相关过程如图所示。Cre-loxP系统由Cre酶和DNA上的特殊序列loxP组成，两个同向loxP间的DNA序列可被Cre酶识别并切除。 （1）基因工程的核心步骤是　　　　。将基因1插入质粒时，切割质粒需选用的限制酶是　　　　。基因1转录时的模板链是　　　　（填“α链”或“β链”）。 （2）基因2插入时使用了无缝克隆技术，其流程是先对质粒进行PCR获得线性化载体，再通过PCR在目的基因两端添加与线性化载体两端相同碱基序列，然后将线性化载体与目的基因混合，在酶的作用下，从线性化载体与目的基因3’端起始切除15个核苷酸，暴露出互补的单链区域，最终促使插入片段与载体能够借助这些互补区域实现连接。 ①通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是　　　　。（仅表示出5’→3’的10个碱基） A.5’ATCGCCTGAC3’       B.5’GACTCTAGAT3’       C.5’ATCTAGAGTC3’       D.5’TAGCGGACTG3’ ②与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有　　　　。 （3）将卡那霉素抗性基因和耐盐基因插入质粒获得重组质粒，其中基因1应是　　　　基因（填“卡那霉素抗性”或“耐盐”）。重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加　　　　的培养基中筛选并培养，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。 （4）投入生产的耐盐植物的纯合子占比需达95%以上。若某个体只导入一个耐盐基因，将该个体连续自交并不断淘汰不耐盐个体，至少需自交　　　　代才可满足生产需求。 16.（2026·山东东营·一模）（多选）小球藻产氢是一种清洁能源的生产途径，但光合作用生成的氧气会迅速抑制氢化酶活性，导致产氢仅持续数分钟。科研人员研发了一种仿生涂层技术，在小球藻细胞表面先后构建了PPy涂层（内含Fe3+和抗坏血酸，Fe3+催化抗坏血酸与氧气反应）和矿化外层，实现可持续产氢。下图为相关过程示意图，回答下列问题。 （1）PSⅡ是光合色素蛋白复合体，分布于　　　　　　　　　　上，光合作用中PSⅡ将水分解为H+和氧，H+在膜对侧与　　　　　　　　　　结合，形成的产物参与暗反应。 （2）自然状态下小球藻白天与黑夜产氢效率都较低，可能的原因分别是　　　　　　　　　　。 （3）PPy涂层是保证小球藻连续产氢的关键部分，从所含物质的角度分析，原理是　　　　　　　　　　。 （4）涂层中需要定期补充光敏剂（曙红Y）和电子供体T，以保证电子的连续供应。涂层小球藻细胞中，产氢所需的电子有两条供给路径：路径一为　　　　　　　　　　；路径二为曙红Y吸收光能后使电子供体T产生电子，经PPy涂层传输至氢化酶。为验证路径二的存在，可设置的实验组是：　　　　　　　　　　（填序号），若检测到仍能继续产氢，则证明路径二存在。 ①停止补充涂层中的电子供体T ②在涂层中添加耗氧剂抗坏血酸 ③在涂层小球藻细胞中添加PSII电子传递抑制剂 （5）目前该系统运行成本和操作复杂度较高。从改造藻类自身代谢途径的角度，提出一种提高产氢效率的思路：　　　　　　　　　　。 17.（2026·山东东营·一模）（多选）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循　　　　　　　　　　原则，Cas9蛋白作用的化学键是　　　　　　　　　　。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-　　　　　　　　　　-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有　　　　　　　　　　，最终表达载体还应具备的基本元件有　　　　　　　　　　（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含　　　　　　　　　　的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因　　　　　　　　　　（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：　　　　　　　　　　。 18.（2026·山东济南·一模）科研人员将来自矮缩病毒（WDV）的复制子WDV盒、向导DNA序列和Cas9-REP融合基因构建了靶向基因敲入载体，如图甲所示。在被转化的水稻细胞中，REP蛋白特异性识别、结合并切割LIR序列，从而使WDV盒环化并大量扩增。扩增的WDV盒与Cas9-REP融合蛋白和向导RNA共同形成复合物，该复合物与水稻染色体中的OsMPK5基因结合，并在特定位点对其进行切割。切割后通过Nanoluc基因（荧光素酶基因）和OsMPK5基因两侧的同源臂（L臂和R臂）以同源重组方式在OsMPK5基因中插入NanoLuc基因，结果如图乙所示。 （1）已知WDV盒中REP基因内部存在两个BasI限制酶识别序列，需通过定点突变将其消除。为此，在扩增REP基因的引物F2与R2中分别引入了突变。其中，R2引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'。对比其与模板的互补区域可知，该引物中通过　　　　　　（填“T变成A”或“A变成T”）完成了定点突变；为便于后续载体构建，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点位于限制酶识别序列的　　　　　　（填“3'端”或“5′端”）。 （2）本研究中Cas9-REP融合蛋白的作用是　　　　　　（写出两条）。 （3）为了检测WDV盒在水稻中能否正常环化，利用野生型和转基因水稻提取的DNA为模板，可选用图中的　　　　　　引物进行PCR并电泳检测，若电泳后所呈现的条带结果为　　　　　　　，说明WDV盒在水稻中能正常环化。 （4）使用OsMPK5蛋白抗体可以检测到转基因水稻中出现预期分子量大小的OsMPK5-NanoLuc融合蛋白，同时也检测到比预期蛋白分子量小的蛋白质，分析图丙，从同源重组的角度简要推测可能的原因是　　　　　　。 19.（2026·山东济南·一模）慢性乙型肝炎由乙肝病毒（HBV）感染引起的。 （1）根据国家免疫规划，新生儿在出生后24小时以内就要接种HBV疫苗的目的是　　　　　。目前使用的乙肝疫苗主要是通过基因工程表达．HBV表面抗原制成的，与减毒活疫苗相比，这种疫苗的优点是　　　　　　　　，需要多次接种的目的是　　　　　　。 （2）科研人员将HBV外壳蛋白E肽注入正常小鼠体内，小鼠体内的抗原呈递细胞将E肽作为抗原吞噬、处理、呈递给　　　　　细胞，该细胞在特异性免疫中的作用是　　　　　　。 （3）科研人员基于E肽对应的DNA．序列，设计了治疗性疫苗S。某兴趣小组为探究不同剂量疫苗S与固定量细胞因子IL-6联合接种的治疗效果，以产生抗E肽抗体的浆细胞数量为观测指标，设计了如下实验方案：对若干组HBV含量高的患病模型小鼠，分别注射不同（高、中、低）剂量疫苗S及等量IL-6，经一段时间干预后，检测各组小鼠体内产生抗E肽抗体的浆细胞数量并分析实验数据。 a．该兴趣小组的方案存在对照设置不完整的不足，可补充的对照组有　　　　　　。 b．该实验方案除了以“产生抗E肽抗体的浆细胞数量”为观测指标来评价治疗效果外，还应检测　　　　　　。 20.（2026·山东潍坊·一模）（多选）同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内　　　　　　的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的　　　　　　过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是　　　　　　。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-　　　　　　-3′和5′-　　　　　　-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入　　　　　　（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是　　　　　　。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是　　　　　　。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 7年真题1年模拟 考点分类 考情示例 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2025山东（1题）、2024山东（1题）、2023山东（1题）、2022山东（1题）、2021山东（2题） · 情境设置：以重组质粒构建、农杆菌转化、DNA粗提取等经典实验为情境 · 考查重点：限制酶与载体选择、标记基因检测、DNA提取原理与操作细节 · 命题趋势：回归教材基础实验，强化操作原理与试剂作用分析，融合分子标记与表达调控考查 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2026山东（1题）、2024山东（2题）、2022山东（1题） · 情境设置：以基因编辑、疾病治疗、作物育种等真实科研情境为载体，强调PCR技术的实际应用 · 考查重点：PCR反应体系组成（引物、酶、原料）、标记技术应用、产物检测与分析 · 命题趋势：与基因编辑技术（如CRISPR）、分子诊断深度融合，注重实验设计与结果分析能力 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【分析】 DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】 A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 2.（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（       ） A. 过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【分析】 DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】 A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 故选B。 3.（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（       ） A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【分析】 DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】 A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确； B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误； C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误； D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 故选A。 4.（2026·山东·高考真题）小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是　　　　　　　，载体上与其能自我复制相关的结构是　　　　　　　。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为　　　　　　　　　　　。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，该过程中　　　　　　　　　　　（填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 启动子    ② 复制原点     （2）Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ     （3）① DNA聚合酶、DNA连接酶    ② 不需要    ③ 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始     （4）抗原-抗体杂交      (1)小问详解： 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 (2)小问详解： 要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。 由图可知，基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ。 (3)小问详解： 由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 (4)小问详解： 检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 5.（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为　　　　　bp，则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为　　　　　（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，　　　　　（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】（1）① 复制原点    ② XbaI    ③ DNA聚合酶    ④ SmaI和SpeI    ⑤ 550bp     （2）① 4    ② 环化    ③ 测序和序列比对     （3）不能      【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1)小问详解： DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 (2)小问详解： 由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 (3)小问详解： 突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 6.（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。     （1）与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　　　　　　　。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　　　　　　　（答出2个结构即可）。 （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物　　　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　　　　　　　　　（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　　　　　，条带2所检出的蛋白　　　　　　　　　　　　　　（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】（1）① RNA聚合酶    ② 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等      （2）① F2和R1或F1与R2     ② a链     （3）① J-V5融合蛋白    ② 不是      【分析】 基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 (1)小问详解： 基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 (2)小问详解： 据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)小问详解： 据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 7.（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　　。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于　　　　　，理由是　　　。 【答案】① SalI    ② EcoRI    ③ 6    ④ F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达    ⑤ 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上    ⑥ 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【分析】 1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】 （1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶； （2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达； （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 【点睛】 对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2026·山东·高考真题）以4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和32P标记的dTTP）为原料，以一段单链DNA为模板进行PCR，获得大量双链DNA。酶W可切断DNA中5´碳与磷酸基团之间的化学键。用酶W对上述PCR产物充分酶切后获得3´-核苷酸，如图所示。所有带32P的3´-核苷酸中，碱基均为胞嘧啶。若用32P标记某种脱氧核苷酸，以相同单链DNA为模板进行PCR，产物经充分酶切后，带32P的3´-核苷酸的碱基均为腺嘌呤，则被标记的脱氧核苷酸为（　　） A. dATP B. dGTP C. dCTP或dGTP D. dATP或dCTP 【答案】B 【详解】 酶W可切断DNA中5´碳与磷酸基团之间的化学键，酶切后获得的3´-核苷酸的磷酸基团是下一个脱氧核苷酸的磷酸基团，32P标记的dTTP，酶切后，带32P的3´-核苷酸的碱基均为胞嘧啶，则一条链中碱基T和C交替连接，另一条链中A和G交替连接，要使产物经充分酶切后，带32P的3´-核苷酸的碱基均为腺嘌呤，则被标记的脱氧核苷酸为dGTP，B正确。 2.（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①                  5'-GCCGATCTTTATA-3'3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'            3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 【答案】D 【分析】 子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 【详解】 分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 故选D。 3.（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　　（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有　　　　　　种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　　　　-3'和5'-　　　　　　-3'。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　　　（填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】（1）① 低    ② 256    ③ 5'-CAAT-3'    ④ 5'-GTTT-3'      （2）① 卡那霉素    ② Sac Ⅰ    ③ ④     （3）1/4      【分析】 【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 (1)小问详解： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 (2)小问详解： 根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 (3)小问详解： 根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 4.（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是　　　　　　　，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　　　（填“3'端”或“5'端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是　　　　　　。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是　　　　　　。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是　　　　　　；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是　　　　　　。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是　　　　　　。 【答案】（1）① 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸     ② 5'端     （2）① P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。    ② 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基     （3）① 增强FLAG-P与UBC的结合    ② 参与P与UBC的结合     （4）药物A通过增强P与UBC结合促进P降解      【分析】 PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 (1)小问详解： 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 (2)小问详解： 融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 (3)小问详解： ①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 (4)小问详解： 根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【点睛】 本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。 模拟题精选 1.（2026·山东淄博·一模）科研人员将患镰状细胞贫血小鼠的成纤维细胞经原代培养和传代培养后，通过体外诱导，获得多能干细胞（iPS细胞），并对iPS细胞进行基因编辑修复突变位点后用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。下列说法错误的是（　　） A. 出现接触抑制前的原代培养的成纤维细胞，更适合用于诱导iPS细胞 B. 传代培养小鼠成纤维细胞时应定期更换培养液，以清除代谢废物并补充营养物质 C. 可借助病毒将关键转录因子基因导入小鼠成纤维细胞来诱导形成iPS细胞 D. 只需将基因编辑后的iPS细胞直接注射进小鼠骨髓即可治疗镰状细胞贫血 【答案】D 【详解】 A、出现接触抑制的原代培养的成纤维细胞，保留正常的二倍体核型，遗传物质未发生改变，更适合用于诱导形成iPS细胞，A正确； B、传代培养过程中细胞代谢会消耗营养、产生有害代谢废物，定期更换培养液可清除代谢废物并补充营养，避免代谢产物积累损伤细胞，B正确； C、诱导成纤维细胞形成iPS细胞需要将关键转录因子基因导入受体细胞，病毒可作为基因工程的载体，将目的基因导入动物细胞，因此可借助病毒完成该过程，C正确； D、iPS细胞为多能干细胞，直接注射进骨髓会出现不受控的分化，甚至可能引发肿瘤，还需要先将基因编辑后的iPS细胞诱导分化为正常造血干细胞，再移植入骨髓才能起到治疗作用，并非直接注射即可，D错误。 故选D。 2.（2026·山东滨州·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”和“琼脂糖凝胶电泳”的实验，下列说法正确的是（       ） A. 研磨液需经过4℃静置后才可离心获取上清液 B. 将获得的DNA直接加入二苯胺试剂后沸水浴加热呈现蓝色 C. 电泳时加入的核酸染料在紫外光照射下可发出荧光 D. 设置PCR循环程序的最后一次复性时间时，可与之前循环相同 【答案】D 【详解】 A、研磨液研磨后只需先过滤除去固体残渣，可无需4℃静置即可离心或直接静置取含DNA的上清液，A错误； B、二苯胺试剂鉴定DNA时，需先将DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂沸水浴加热才会呈现蓝色，直接加入未溶解的DNA，反应无法充分进行，B错误； C、在琼脂糖熔化稍冷却后加入适量核酸染料混匀，而不是电泳时加入核酸染料，C错误； D、在PCR循环程序中，设置PCR循环程序的最后一次复性时间时，可与之前循环相同，最后一次延伸时间通常会适当延长，以保证所有DNA片段都能充分完成延伸，D正确。 故选D。 3.（2026·山东烟台·一模）易错PCR是利用易发生碱基错误配对的Taq酶或改变PCR反应条件，降低DNA复制的准确性，使扩增产物出现较多突变位点的方法。易错PCR技术可用于改造催化效率较低的天然酶。下列说法错误的是（       ） A. 可通过改变PCR过程中复性温度来降低DNA复制的准确性 B. 易错PCR可定向改变天然酶基因的序列，使酶的催化效率提高 C. 改造后的基因某些突变位点对应的氨基酸序列不一定改变 D. 通过易错PCR技术改造后的天然酶在自然界原本不存在 【答案】B 【详解】 A、改变PCR复性温度可影响引物与模板的特异性结合，温度过低会增加非特异性配对，导致碱基错误配对率上升，从而降低DNA复制的准确性，A正确； B、易错PCR通过随机引入突变位点改变基因序列，属于随机诱变而非定向改造，无法确保突变后酶的催化效率一定提高，B错误； C、基因突变具有简并性（密码子简并），某些碱基突变可能编码相同氨基酸，因此突变位点对应的氨基酸序列不一定改变，C正确； D、易错PCR是人工诱导突变的技术，改造后的酶基因序列为人工创造，在自然界中不存在，D正确。 故选B。 4.（2026·山东济南·一模）下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的说法正确的是（　　） A. 在微量离心管中加入各组分后通常需要通过离心来混匀 B. PCR实验中的移液器、枪头、缓冲液等在使用前必须高压灭菌 C. 凝胶电泳中，带电分子的迁移速率受净电荷、电荷性质及分子大小共同影响 D. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA和纸层析法分离色素的原理相同，使用的介质不同 【答案】C 【详解】 A、在微量离心管中加入PCR各组分后，通常需短暂离心使液体沉降至管底，A错误； B、PCR实验要求无菌操作，枪头需灭菌，移液器消毒，B错误； C、凝胶电泳中，DNA片段迁移速率受其净电荷（负电荷）、电荷性质（均带负电）及分子大小（长度）共同影响，小分子迁移更快，C正确； D、琼脂糖凝胶电泳分离DNA基于电荷和分子筛效应，而纸层析分离色素基于溶解度差异（分配系数），原理不同，D错误。 故选C。 5.（2026·山东济南·一模）使用限制酶MboI（识别4核苷酸序列GATC）切割基因组DNA，将外源DNA片段与载体连接后导入大肠杆菌，成功构建了基因组文库，可以从基因组文库中筛选获取目的基因，下列相关叙述正确的是（　　） A. 使用限制酶MboI可以对基因组DNA有较高的切割频率 B. 非互补的黏性末端经E．coliDNA连接酶处理后均可以转变为平末端 C. 为获得有生物活性的目的蛋白，基因组文库的构建需要使用相应的动植物细胞作为受体 D. 使用PCR技术筛选目的基因的前提是目的基因的全部序列是已知的 【答案】A 【详解】 A、限制酶MboI识别4核苷酸序列GATC，识别序列越短，在基因组DNA中出现的频率越高，切割频率也越高，A正确； B、E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端，不能将非互补的黏性末端转变为平末端，该功能需依赖DNA聚合酶或核酸外切酶处理，B错误； C、从基因组文库中筛选出目的基因后，要获得有生物活性的蛋白，需要将其克隆到表达载体中，并在合适的宿主系统中进行表达，不一定需要使用动植物细胞作为受体，C错误； D、PCR技术需已知目的基因部分序列以设计引物，但筛选基因组文库中的目的基因通常采用核酸分子杂交（探针法），无需已知全部序列，D错误。 故选A。 6.（2026·山东济南·一模）某同学使用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术获取cDNA，结果未获得cDNA产物，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 逆转录酶失活，更换新的逆转录酶 B. 酶的用量不足，增加TaqDNA聚合酶的用量 C. RNA模板降解，使用新的RNA模板 D. 引物失效，换用新的引物 【答案】B 【详解】 A、逆转录酶是逆转录过程的关键酶，若失活则无法合成cDNA，更换新酶可解决，A正确； B、Taq DNA聚合酶用于PCR扩增阶段（需DNA模板），而cDNA未合成说明问题在逆转录阶段，增加Taq酶用量对逆转录无效，B错误； C、RNA模板是逆转录的原料，若降解则无法合成cDNA，更换新模板可解决，C正确； D、逆转录需引物与RNA模板结合以启动合成，引物失效会导致失败，换新引物可解决，D正确。 故选B。 7.（2026·山东济南·一模）（多选）研究证实，Bld-1蛋白只能特异性地识别并结合到表达STn抗原的膀胱癌细胞表面。LAMP2B是外泌体（细胞的分泌囊泡）表面的膜蛋白，通过基因工程技术，构建融合表达LAMP2B/Bld-1的靶向膀胱癌工程化外泌体，可实现为膀胱癌细胞高效递送药物。用离心法提取细胞培养液中的工程化外泌体，采用电泳技术检测其表面Bld-1蛋白的表达水平。下列说法正确的是（　　） A. 可直接通过PCR、人工合成法等来获取目的蛋白Bld-1 B. 外泌体应在细胞培养液的上清液中收集 C. 抗体和抗原的特异性结合是检测工程化外泌体表面Bld-1蛋白的常用原理 D. 工程化外泌体可将药物送达膀胱癌细胞，减少药物对正常细胞的副作用 【答案】BCD 【详解】 A、PCR、人工合成法是获取目的基因的方法，不是获得蛋白质的，A错误； B、外泌体由细胞分泌到细胞培养液的上清液中，因此提取时需从细胞培养液的上清液中收集，再通过离心法（如差速离心）分离纯化，B正确； C、抗原-抗体杂交技术是检测蛋白质的常用方法，故抗体和抗原的特异性结合是检测工程化外泌体表面Bld-1蛋白的常用原理，C正确； D、通过基因工程技术，构建融合表达LAMP2B/Bld-1的靶向膀胱癌工程化外泌体，可实现为膀胱癌细胞高效递送药物，减少对正常细胞的影响，D正确。 故选BCD。 8.（2026·山东潍坊·一模）下列关于PCR技术的说法，错误的是（　　） A. PCR前需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B. 每一次循环都需要向离心管添加一次引物 C. 延伸的时长主要由模板链的长度决定 D. PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性 【答案】B 【详解】 A、PCR反应前需短暂离心，使反应液聚集于离心管底部，避免液体挂壁影响反应效率，A正确； B、引物在PCR反应开始时一次性加入，后续循环中无需重复添加，B错误； C、延伸时长取决于待扩增DNA片段的长度，模板链越长，延伸所需时间越长，C正确； D、PCR循环的正确温度顺序为：变性（高温解链，约95℃）→ 复性（低温退火，约55℃）→ 延伸（中温合成，约72℃），即PCR步骤所需温度由高到低依次为变性、延伸、复性，D正确。 故选B。 9.（2026·山东青岛·一模）鲍迪苷D（RD）是来自甜叶菊的高品质低热量天然甜味剂，在自然界中含量很低。体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成RD，来源于水稻的葡萄糖基转移酶E11是体外制备RD的关键酶。研究人员通过基因工程技术制备能够表达E11的工程菌，为实现生物转化法合成RD奠定了基础，制备流程及限制酶酶切位点如图1。 限制酶 识别序列及切割位点 NsiⅠ 5' ATGCA↓T3'3' T↑ACGTA5' ApaⅠ 5' GGGCC↓C3'3' C↑CCGGG5' PstⅠ 5' CTGCA↓G3'3' G↑ACGTC5' PspOMⅠ 5' GGGCC↓C3'3' C↑CCGGG5' SalⅠ 5' G↓TCGAC3'3' CAGCT↑G5' （1）可从　　　　　　中查询基因E11的编码序列，设计特定引物。提取水稻细胞中的　　　　　　，经逆转录获得总cDNA，将其作为PCR反应的模板，在制备PCR反应体系时，用微量移液器吸取不同试剂前，除需要确认或调整刻度和量程外，还需要　　　　　　。 （2）为保证基因E11与pET质粒连接的准确性和效率，结合图1分析，应在基因E11转录模板链的5' 端和3' 端分别添加限制酶　　　　　　的酶切序列。若基因E11转录模板链的3' 端不添加限制酶酶切序列，要实现基因E11与质粒载体的定向连接，对pET质粒应进行的操作是　　　　　　。 （3）使用相关限制酶处理质粒和目的基因，连接后转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌接种到含有　　　　　　的培养基中培养。假设限制酶切割前后，pET质粒大小基本不变，为进一步筛选重组质粒，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取1～4号菌落中的质粒电泳，结果如图2。推测　　　　　　号菌落含有重组质粒，其他菌落的条带出现的原因可能是　　　　　　。 （4）将纯化得到的蛋白E11添加到含有　　　　　　（填物质）的反应体系中，通过检测RD的合成速率以验证蛋白E11的酶活性。 【答案】（1）① 序列数据库    ② （总）RNA    ③ 更换微量移液器的枪头     （2）① NsiⅠ，SalⅠ    ② 选择SalⅠ和PstⅠ对质粒进行完全酶切，利用DNA聚合酶将SalⅠ产生的黏性末端补平     （3）① 四环素    ② 1    ③ 2号、3号导入的重组载体是两个pET质粒环化形成，4号导入的是空白pET质粒     （4）U-DPG和RA      (1)小问详解： 基因的编码序列属于公开的核酸序列信息，可从序列数据库中查询获取，以此为依据设计扩增基因E11的特定PCR引物。逆转录法获取cDNA的原理是以RNA（主要是mRNA） 为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA链，因此需要先提取水稻细胞中的总RNA，再经逆转录获得总cDNA，作为PCR扩增基因E11的模板。微量移液器的枪头为一次性使用耗材，吸取不同试剂前更换枪头，可避免不同试剂之间的交叉污染，保证PCR反应体系的纯度和实验结果的准确性。 (2)小问详解： 质粒的转录方向为从启动子到终止子，目的基因E11需与质粒转录方向一致，才能正常表达；质粒上可用于插入目的基因的酶切位点需位于启动子和终止子之间，且不破坏氯霉素/四环素抗性基因、复制原点等关键元件，可选位点为PstⅠ、SalⅠ。由限制酶识别序列可知：NsiⅠ的切割位点为5'ATGCA↓T3'，PstⅠ的切割位点为 5'CTGCA↓G3'，二者切割后可产生互补的黏性末端（均含-TGCA-序列），能实现连接；SalⅠ的酶切位点唯一且位于启动子/终止子之间，可与NsiⅠ 配合实现定向酶切。基因E11转录模板链的5'端对应编码链的3'端，需添加NsiⅠ 酶切序列（与质粒PstⅠ 互补），3'端添加SalⅠ 酶切序列，使目的基因与酶切后的质粒定向连接，避免反向连接。若基因E113'端不添加酶切序列，需通过改造质粒实现定向连接，避免目的基因随机连接或质粒自连：先用SalⅠ和PstⅠ对质粒完全酶切，产生两个不同的末端（SalⅠ黏性末端、PstⅠ黏性末端）； 用DNA聚合酶将SalⅠ切割产生的黏性末端补平，使质粒形成一个平末端（SalⅠ处）+ 一个黏性末端（PstⅠ处）； 目的基因仅5'端有与PstⅠ互补的黏性末端，3'端为天然平末端，只能与质粒的黏性末端、平末端分别配对，从而实现定向连接。 (3)小问详解： 质粒上含氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，目的基因插入位点位于氯霉素抗性基因内部：当目的基因与质粒连接形成重组质粒时，氯霉素抗性基因被破坏，失去抗性；而四环素抗性基因保持完整，仍具有抗性。因此需将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的培养基中培养，筛选出成功导入质粒（空白质粒或重组质粒）的大肠杆菌。结合电泳结果和质粒/目的基因长度分析： 空白pET质粒长度为5369bp（约 5000bp），重组质粒为质粒+基因E11，总长度为5369+1369=6738bp（约6000bp）； M1为链状DNA分子 Marker（6000bp、5000bp、3000bp、1500bp），M2为环状DNA分子Marker；环状DNA分子电泳迁移速率快于同长度的链状DNA分子；1号菌落的质粒条带位置对应M2的 6000bp左右，与重组质粒（约6738bp）的电泳位置相符，因此1号菌落含有重组质粒。2号、3号：条带位置比1号更靠近点样孔（分子量更大），原因是两个空白pET质粒经酶切后自身环化形成二聚体质粒，分子量远大于重组质粒，电泳迁移速率更慢； 4号：条带位置对应M2的5000bp左右，与空白pET质粒（5369bp）的电泳位置相符，说明导入的是未插入目的基因的空白pET质粒。 (4)小问详解： 题干明确：体外可利用生物转化法将一个葡萄糖基U—DPG转入到鲍迪苷A（RA）的特定侧链上合成 RD，葡萄糖基转移酶E11是该过程的关键酶。酶的活性验证需在底物存在的条件下进行，因此反应体系中需加入该酶的两种底物（U—DPG和RA），通过检测产物RD的合成速率，即可验证蛋白E11的葡萄糖基转移酶活性。 10.（2026·山东淄博·一模）人源干扰素IFNα-2b是一种具有抗病毒活性的真核蛋白，可通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产。BL21（DE3）的质粒上有T7RNA聚合酶基因和lacI基因。T7RNA聚合酶具有极高的启动子特异性和转录效率，其表达受lacI基因编码的lac阻遏蛋白的调控，当培养基中无诱导物IPTG时，lac阻遏蛋白结合到T7RNA聚合酶基因的启动子上抑制其表达。 （1）BL21（DE3）去除了蛋白酶编码基因，目的是　　　　　　　。T7RNA聚合酶基因的启动子属于　　　　　　型启动子。 （2）构建重组载体时，选用了两种启动子PBAD（被大肠杆菌自身RNA聚合酶识别）和PT7（仅被T7RNA聚合酶识别），重组载体的部分结构如图1。构建基因表达载体的目的是　　　　　　　。为实现目的基因在特定时期表达，图1的4个基因的启动子中为PBAD的是　　　　　　（填序号）。为筛选出含重组质粒的大肠杆菌并使其大量表达IFNa-2b，培养基中需要加入　　　　　。 （3）编码同一氨基酸的不同密码子，在不同生物体中的使用频率并不相同，即存在密码子偏好性。如果使用大肠杆菌表达一种真核蛋白，可能因密码子偏好性不同，导致目标蛋白翻译过程受阻。IFNa-2b基因的mRNA中存在一种大肠杆菌中不常见的密码子AGG，导致IFNa-2b产量极低。可利用同源重组（图2）向大肠杆菌基因组中导入密码子AGG对应的　　　　　　基因提高IFNα-2b产量。图2中的同源区段可不发生交换，也可发生单交换或双交换。对大肠杆菌进行改造后，利用高温处理使质粒丢失，在培养基中加入四环素，能够生长的是发生　　　　　　（填“单交换”或“双交换”）的大肠杆菌。利用引物1和引物2进行PCR扩增（引物大小忽略不计），如果插入了目的基因，PCR产物大小为　　　　　　bp。 【答案】（1）① 防止/抑制IFN Nα-2b/人源干扰素/目的蛋白/外源蛋白的降解    ② 诱导型     （2）① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用    ② ①②④    ③ 卡那霉素和 IPTG     （3）① tRNA（或“转运RNA”）    ② 单交换    ③ 1100或5000      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1)小问详解： 防止蛋白酶降解外源基因表达的人源干扰素 IFNα-2b，提高目标蛋白的产量和稳定性。因为其表达受 lacI 基因编码的 lac 阻遏蛋白调控，需 IPTG 诱导才能解除抑制。 (2)小问详解： 构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用。启动子③是控制IFNα-2b（目的蛋白）的表达，需要在合适时机稳定表达，应该被T7RNA聚合酶识别（受IPTG调控）。 而T7RNA聚合酶基因和lac基因是调控元件，需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，维持菌株的调控体系，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达体系大规模生产IFNα-2b，也需要大肠杆菌自身RNA聚合酶来基础表达，所以它们的启动子①②④是 PBAD。用于筛选导入了重组质粒（携带卡那霉素抗性基因）的大肠杆菌，不含重组质粒的大肠杆菌无法在含卡那霉素的培养基存活。 IPTG作为诱导物，解除lac阻遏蛋白对T7RNA聚合酶基因启动子的抑制，让T7RNA聚合酶表达，进而启动目的基因IFNα-2b的转录和翻译，实现大量表达。 (3)小问详解： tRNA（或识别密码子 AGG 的 tRNA），通过补充对应 tRNA 来克服密码子偏好性，提高翻译效率。单交换会使完整四环素抗性基因（Tet^r）保留，高温处理后仍含四环素抗性基因；双交换会丢失四环素抗性基因，只有成功插入目的基因的菌株（四环素敏感）才能在含四环素的培养基中存活（未插入的菌株因四环素抗性基因完整而被四环素杀死）。若发生了双交换，M1 和 M2 片段各 500 bp，目的基因 100 bp，总长度 = 500 + 100 + 500 = 1100 bp。若发生了单交换，PCR产物大小为4000+500+500=5000。 11.（2026·山东日照·一模）除草剂氟草啶（FCD）能抑制植物细胞中原卟啉原IX氧化酶的活性以达到除草效果，科研人员利用基因编辑技术使水稻2号染色体上的PPO1基因（编码原卟啉原IX氧化酶）与CP12基因结构改变（如图1），从而赋予水稻对FCD的耐受性，并利用PCR技术结合电泳对转基因水稻进行鉴定，结果如图2所示。 （1）据图1分析，利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为　　　　　　　　。若基因编辑成功，PCR扩增产物的电泳结果应为图2中的　　　　　　　　号泳道。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是　　　　　　　　（填序号）。 ①样品被污染       ②复性过程温度过低 ③预变性时间较短       ④延伸过程中引物3'端被封闭 ⑤引物特异性不强       ⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接 （2）基因编辑成功后，PPO1的转录模板链是　　　　　　　　（填“A”或“B”）链，基因编辑前后，CP12的转录模板链　　　　　　　　（填“是”或“否”）改变。 （3）综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是　　　　　　　　。 【答案】（1）① F1和R2（或F2和R1）    ② 3    ③ ①②⑤     （2）① A    ② 否     （3）强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平和个体水平上的鉴定。 (1)小问详解： 结合图示可知，与原来的染色体相比发生了倒位，若使用F1F2或R1R2则无法进行PCR扩增，若使用F1R1或F2R2，则无论是否基因编辑成功都可以扩增出产物，因此利用PCR技术鉴定基因编辑是否成功时，应选择的引物组合为F1和R2（或F2和R1）。根据扩增引物可知，PCR扩增产物的碱基对数量为300+911=1211，应为图2中的3号条带。若电泳结果中5号泳道内出现两条电泳条带，原因可能是①样品被污染，扩增出非目的基因；②复性过程温度过低导致引物与非目的基因结合扩增出非目的基因序列；③预变性目的是使DNA充分解旋，时间较短会使扩增产物减少，不会产生非目的片段； ④延伸过程中引物3'端被封闭，不能得到扩增产物；⑤引物特异性不强，扩增出非目的基因；⑥图1中的两个切割位点之间被切割后原位连接，则PCR扩增没有对应的产物，故选①②⑤。 (2)小问详解： 基因转录时，是以DNA的一条链为模板，转录的方向是启动子到终止子，沿模板的3'端到5'端。根据图中信息，基因编辑成功的PPO1基因转录的模板是A链。根据图示可知，基因编辑前后，CP12的转录模板链没有发生改变，均为B链。 (3)小问详解： 综合上述信息，分析上述基因编辑成功的水稻对FCD耐受性增强的原因是强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加。 12.（2026·山东济宁·一模）（多选）科学家通过基因工程改造大肠杆菌，实现规模化生产人胰岛素；利用蛋白质工程优化胰岛素结构，通过将胰岛素B链的第28位氨基酸-脯氨酸（密码子为CCU）替换为天冬氨酸（密码子为GAU），有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。图1是运用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，图2是利用大引物PCR技术引入特定位点突变的流程。回答下列问题。 （1）图1中质粒作为载体时未标出的必需结构是　　　　。为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5’端应添加限制酶　　　　的识别序列，下游引物5’端的15个碱基序列为5’-　　　　-3’。 （2）β-半乳糖苷酶可以将无色的X-gal分解产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，培养基中需添加　　　　，从　　　　色菌落中选择。 （3）图2中，为了得到可表达出速效胰岛素类似物的改良基因，进行第一次PCR时，上游引物对应突变位点的碱基序列是5’-　　　　-3’。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR时，至少要进行　　　　次循环，才能获得完成定点突变、双链等长的改良基因。 【答案】（1）① 终止子    ② XhoI    ③ CAATTGGTAGTCGAA     （2）① 氨苄青霉素和X-gal    ② 白     （3）① GAT    ② 2      【分析】 一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 (1)小问详解： 载体需具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等，图1质粒未标出的必需结构是终止子。为保证目的基因与载体正向连接且不破坏目的基因和标记基因，限制酶Sal I会破坏两个标记基因，NheⅠ会破坏目的基因，所以选择MunⅠ和XhoⅠ进行双酶切，因此为保证目的基因与载体正向连接，扩增目的基因时，上游引物的5'端应添加限制酶XhoⅠ的识别序列，下游引物的5'端应添加限制酶MunⅠ的识别序列，所以下游引物5'端的15个碱基序列为5'-CAATTGGTAGTCGAA-3'。 (2)小问详解： 已知β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出的白色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 (3)小问详解： 根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸—脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸 (密码子为GAU)，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，第一轮得到两个DNA分子，其中一个DNA分子一条链含大引物②（含突变位点）另一条链为模板链（不含突变位点），两条链不等长；另一个DNA分子和模板DNA一样（无突变位点）。第二次循环中，以含有大引物②的DNA单链为模板，以常规引物复制得到的DNA分子即为完成定点突变、双链等长的改良基因。 13.（2026·山东聊城·一模）（多选）弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20。抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示： （1）从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌　　　　　　，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到　　　　　　　的双信号刺激才能进行。 （2）CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明　　　　　　　。 （3）图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。 ①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物　　　　　　　。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据　　　　　　　的末端序列设计。 ②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含　　　　　　　的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入　　　　　　　等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。 ③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有　　　　　　　。（答出两点即可） 【答案】（1）① 细胞因子    ② 肿瘤细胞表面抗原和辅助性 T 细胞（Th）释放的细胞因子     （2） 方案一：载体中出现元件组合1和元件组合2， 根据需要服用四环诱导CAR基因表达： 方案二：载体中出现元件组合1和元件组合2，治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡：      （3）① 引物2和引物3    ② CAR基因（目的基因）和线性化质粒    ③ 氨苄青霉素    ④ Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、特异性引物（F和R）    ⑤ 不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切和连接，简化实验流程等      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 辅助性 T 细胞（Th）受抗原刺激后，会分泌细胞因子，这些细胞因子可以促进 B 细胞的增殖分化，形成浆细胞和记忆细胞。细胞毒性 T 细胞（Tc）的活化需要双信号刺激，第一信号来自肿瘤细胞表面抗原与之接触，第二信号来自辅助性 T 细胞（Th）释放的细胞因子。 (2)小问详解： 为了降低 CD19CAR-T 细胞长期激活导致正常 B 细胞耗竭的风险，我们可以设计一个控制细胞凋亡的机制，在需要时清除过度激活的 CAR-T 细胞。降低CD19CAR—T细胞长期激活导致正常B细胞耗竭的风险，元件排列顺序如图： 方案一：载体中出现元件组合1和元件组合2， 根据需要服用四环诱导CAR基因表达： 方案二：载体中出现元件组合1和元件组合2，治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡： (3)小问详解： ①引物选择与设计：应选择引物2和 3，扩增产物在图示位点断开。PCR 扩增时，引物需要与模板链的 3' 端互补，从而保证扩增产物是图中所示的线性化质粒。扩增 CAR 基因时，引物 F 和 R 序列要依据线性化质粒和目的基因的末端序列设计，这样才能保证扩增出的 CAR 基因两端与线性化质粒的末端序列相同，以便 In-Fusion 酶进行无缝连接。 ②筛选与鉴定： 菌液应涂布到含氨苄青霉素 的培养基中。因为重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有成功导入质粒的大肠杆菌才能在该培养基上生长。 挑取菌落并加入TaqDNA聚合 酶、dNTP、特异性引物 、Mg2+等进行菌落 PCR，通过电泳鉴定 PCR 产物的大小，判断 CAR 基因是否成功插入。 ③ In—Fusion 技术的优点：不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切 和连接，简化实验流程等。 14.（2026·山东德州·一模）（多选）S蛋白能够特异性识别癌细胞表面抗原，L蛋白是一种可被低氧环境激活的菌体裂解酶，科研人员将S蛋白基因和L蛋白基因连接为S-L融合基因，利用腺病毒AAV构建基因表达载体，再利用AAV和大肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，将S-L融合基因导入大肠杆菌基因组中，构建出能够精准递送抗癌药物的工程菌。 图1：S-L融合基因的构建过程 图2：同源重组替换基因的过程 （1）已知S蛋白基因转录时以b链为模板，L基因转录时以a链为模板。在构建S-L融合基因时，最好使用限制酶　　　　　　　　　　　分别切割S蛋白基因和L蛋白基因，再用　　　　　　　　　　　酶连接。将S-L融合基因连接至AAV载体时，需利用限制酶　　　　　　　　　　　对S-L融合基因进行切割。 （2）AAV作为载体应具备的条件有　　　　　　　　　　　(答出两点)。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌后，获得甲、乙两种大肠杆菌，分别提取其DNA，加入引物1、2、3扩增并电泳，结果如图3所示。其中成功导入S-L融合基因的大肠杆菌为　　　　　　　　　　　(填“甲”或“乙”)；条带③为用引物　　　　　　　　　　　扩增的产物。 （4）已知癌细胞周围为低氧环境。把抗癌药物注入含S-L融合基因的工程菌中，该工程菌可实现抗癌药物的精准递送，分析其机理是　　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① XbaⅠ、SpeⅠ    ② DNA连接    ③ PstⅠ、BglⅡ     （2）有多个限制酶酶切位点、基因能够在受体细胞内自我复制或整合到受体细胞DNA中，随着宿主细胞DNA复制而复制、有标记基因、对宿主细胞无害     （3）① 乙    ② 引物1和引物2     （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1)小问详解： 构建S-L融合基因需保证两个基因转录方向一致（S基因以b链为模板、L基因以a链为模板），XbaⅠ和 SpeⅠ切割后可使S、L基因产生互补黏性末端，实现定向连接，避免反向连接导致基因表达异常。限制酶切割基因后产生的DNA片段，需通过DNA连接酶恢复脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，才能将S、L基因连接为S-L融合基因。这两种限制酶的酶切位点位于S-L融合基因的两端，切割后可使融合基因产生特异性末端，能定向插入AAV载体的对应酶切位点，同时保证融合基因的完整，避免自身环化或载体自连。 (2)小问详解： 基因工程载体需满足目的基因的装载、传递、稳定遗传和筛选等核心需求，必备条件为：有多个限制酶酶切位点，便于根据目的基因选择合适酶切位点，插入目的基因且不破坏载体自身结构；能在受体细胞内自我复制（或整合到受体细胞DNA 中，随宿主细胞DNA同步复制），保证目的基因在受体细胞中稳定遗传并扩增； 有标记基因（如抗性基因），便于通过选择培养基筛选出成功导入目的基因的受体细胞； 对宿主细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动，确保受体细胞能正常增殖、表达目的基因。 (3)小问详解： 甲种大肠杆菌提取DNA加入引物进行PCR只有一条条带，说明应该是未导入S-L融合基因（此时引物1和引物3可以发挥作用）；乙种大肠杆菌提取DNA加入引物进行PCR有两条条带，说明应导入了S-L融合基因（此时引物1和2，引物1和3均可以发挥作用扩增区间DNA片段）。PCR扩增产物的长度由引物结合的模板位置决定，引物1和引物3扩增的DNA片段长度最长；电泳中DNA片段越长，迁移速率越慢；最短的扩增产物对应条带③（条带③为引物1和引物2扩增的短片段，迁移速率更快）。 (4)小问详解： 该过程依托S蛋白和L蛋白的特异性功能，实现抗癌药物的靶向定位和定向释放，两步完成精准递送： 靶向定位：工程菌中S-L融合基因表达出S蛋白，S蛋白能特异性识别并结合癌细胞表面的抗原，使携带抗癌药物的工程菌被精准引导至癌细胞周围，避免药物作用于正常细胞； 定向释放：癌细胞周围为低氧环境，可激活工程菌表达的L蛋白（菌体裂解酶），L蛋白发挥裂解作用使工程菌的菌体破裂，内部装载的抗癌药物随即释放，精准作用于癌细胞，实现药物的靶向递送。 15.（2026·山东烟台·一模）在植物遗传转化过程中，除目的基因外，标记基因等序列也会随目的基因整合到作物基因组中，应予以剔除。科学家构建了可诱导剔除标记基因的载体，并将其导入拟南芥获得无标记基因的耐盐个体，相关过程如图所示。Cre-loxP系统由Cre酶和DNA上的特殊序列loxP组成，两个同向loxP间的DNA序列可被Cre酶识别并切除。 （1）基因工程的核心步骤是　　　　。将基因1插入质粒时，切割质粒需选用的限制酶是　　　　。基因1转录时的模板链是　　　　（填“α链”或“β链”）。 （2）基因2插入时使用了无缝克隆技术，其流程是先对质粒进行PCR获得线性化载体，再通过PCR在目的基因两端添加与线性化载体两端相同碱基序列，然后将线性化载体与目的基因混合，在酶的作用下，从线性化载体与目的基因3’端起始切除15个核苷酸，暴露出互补的单链区域，最终促使插入片段与载体能够借助这些互补区域实现连接。 ①通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是　　　　。（仅表示出5’→3’的10个碱基） A.5’ATCGCCTGAC3’       B.5’GACTCTAGAT3’       C.5’ATCTAGAGTC3’       D.5’TAGCGGACTG3’ ②与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有　　　　。 （3）将卡那霉素抗性基因和耐盐基因插入质粒获得重组质粒，其中基因1应是　　　　基因（填“卡那霉素抗性”或“耐盐”）。重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加　　　　的培养基中筛选并培养，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。 （4）投入生产的耐盐植物的纯合子占比需达95%以上。若某个体只导入一个耐盐基因，将该个体连续自交并不断淘汰不耐盐个体，至少需自交　　　　代才可满足生产需求。 【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② EcoRⅠ和SalⅠ    ③ β链     （2）① AC       ② 可在任何位点插入目的基因，避免载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接     （3）① 卡那霉素抗性    ② 卡那霉素和地塞米松     （4）6      【分析】 PCR技术：(1) 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。(2) 原理：DNA双链复制。(3) 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。(4) 条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。(5) 过程：高温变性：DNA解旋过程(PCR扩 增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件。 (1)小问详解： 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。结合目的基因可知，需要用限制酶MfeI和SalⅠ进行酶切，为了获得相同的黏性末端，理论上质粒也需要使用限制酶MfeI和SalⅠ进行酶切，但限制酶MfeI会破坏质粒上的Cre酶基因，结合限制酶识别序列，EcoRⅠ和MfeI酶切形成的黏性末端是相同的，因此切割质粒需选用的限制酶是EcoRI和SalI。结合质粒上启动子和终止子的位置，以及目的基因插入的位置，基因1转录时的模板链是β链。 (2)小问详解： ①结合图示质粒切口的放大部分，由于模板链的碱基序列为3'TAGCGGACTG5'和3'TAGATCTCAG5'，引物应该与复制起始端互补配对，因此通过PCR对质粒进行线性化时，应选用的引物序列是5’ATCGCCTGAC3’ 和5’ATCTAGAGTC3’ ，故选AC。 ②限制酶具有专一性，需要在特定的位点切割形成黏性末端，且单酶切目的基因、质粒两端的黏性末端相同，会导致载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接，因此与单酶切后用DNA连接酶连接相比，这种无缝克隆技术的优点有可在任何位点插入目的基因，避免载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接。 (3)小问详解： 结合图示质粒和基因进行分析，将卡那霉素抗性基因和耐盐基因插入质粒获得重组质粒，其中基因1应是卡那霉素抗性基因。重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，因此重组质粒导入作物受体细胞后，应先后在分别添加卡那霉素和地塞米松的培养基中筛选并培养，最后进行耐盐鉴定获得无标记基因的耐盐个体。地塞米松作为诱导物，诱导Cre酶基因表达。 (4)小问详解： 假定耐盐基因为A，不含A基因的染色体用a表示，只导入一个耐盐基因的个体基因型可表示为Aa，Aa自交一代，耐盐个体的纯合子比例为1/3，子一代AA：Aa=1:2，再自交一代，AA=1/3+2/3×1/4=3/6，Aa=2/6，aa=1/6，耐盐植物的纯合子占比3/5；子二代AA：Aa=3:2，再自交一代，AA=3/5+2/5×1/4=7/10，Aa=2/10，aa=1/10，耐盐植物的纯合子占比7/9；依次类推，至少需自交6代才可满足生产需求。 16.（2026·山东东营·一模）（多选）小球藻产氢是一种清洁能源的生产途径，但光合作用生成的氧气会迅速抑制氢化酶活性，导致产氢仅持续数分钟。科研人员研发了一种仿生涂层技术，在小球藻细胞表面先后构建了PPy涂层（内含Fe3+和抗坏血酸，Fe3+催化抗坏血酸与氧气反应）和矿化外层，实现可持续产氢。下图为相关过程示意图，回答下列问题。 （1）PSⅡ是光合色素蛋白复合体，分布于　　　　　　　　　　上，光合作用中PSⅡ将水分解为H+和氧，H+在膜对侧与　　　　　　　　　　结合，形成的产物参与暗反应。 （2）自然状态下小球藻白天与黑夜产氢效率都较低，可能的原因分别是　　　　　　　　　　。 （3）PPy涂层是保证小球藻连续产氢的关键部分，从所含物质的角度分析，原理是　　　　　　　　　　。 （4）涂层中需要定期补充光敏剂（曙红Y）和电子供体T，以保证电子的连续供应。涂层小球藻细胞中，产氢所需的电子有两条供给路径：路径一为　　　　　　　　　　；路径二为曙红Y吸收光能后使电子供体T产生电子，经PPy涂层传输至氢化酶。为验证路径二的存在，可设置的实验组是：　　　　　　　　　　（填序号），若检测到仍能继续产氢，则证明路径二存在。 ①停止补充涂层中的电子供体T ②在涂层中添加耗氧剂抗坏血酸 ③在涂层小球藻细胞中添加PSII电子传递抑制剂 （5）目前该系统运行成本和操作复杂度较高。从改造藻类自身代谢途径的角度，提出一种提高产氢效率的思路：　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 类囊体薄膜    ② NADP+     （2）白天光合作用产生的氧气迅速抑制氢化酶活性；黑夜没有光照，无法进行光反应为产氢提供必要条件     （3）PPy涂层中的Fe3+催化抗坏血酸与氧气反应，消耗氧气，避免氧气抑制氢化酶活性     （4）① 水在PSⅡ作用下分解产生电子，经电子传递链传递至氢化酶    ② ③     （5）通过基因工程增强氢化酶的耐氧性或敲除与氧气生成相关的基因或提高光反应电子传递效率      【分析】 光合作用，通常是指绿色植物（包括藻类）吸收光能，把二氧化碳和水合成有机物，同时释放氧气的过程。光合作用分为光反应阶段和暗反应阶段。光反应阶段发生水光解产生NADPH和氧气，ADP和Pi结合形成ATP。暗反应阶段发生二氧化碳和五碳化合物结合形成三碳化合物，三碳化合物在ATP和NADPH的作用下，还原成五碳化合物，同时ATP水解成ADP和Pi。 (1)小问详解： 光合作用的光反应阶段发生在类囊体薄膜上，PSⅡ是光合色素蛋白复合体，分布于类囊体薄膜上；光反应中PSⅡ将水分解为H+和氧，H+在膜对侧与NADP+结合形成NADPH，NADPH参与暗反应。 (2)小问详解： 白天小球藻进行光合作用产生氧气，氧气会迅速抑制氢化酶活性，所以产氢效率低；黑夜没有光照，无法进行光反应为产氢提供必要条件（如电子和H+等），所以产氢效率也低。 (3)小问详解： PPy涂层内含Fe3+和抗坏血酸，Fe3+催化抗坏血酸与氧气反应，从而消耗氧气，避免氧气抑制氢化酶活性，保证小球藻连续产氢。 (4)小问详解： 据图可知，涂层小球藻细胞中产氢所需电子的路径一为水在PSⅡ作用下分解产生电子，经电子传递链传递至氢化酶。为验证路径二存在，可以通过抑制路径一看产氢情况来判断，所以可设置实验组：③在涂层小球藻细胞中添加PSⅡ电子传递抑制剂，若检测到仍能继续产氢，则证明路径二存在。 (5)小问详解： 从改造藻类自身代谢途径的角度，可通过基因工程敲除或抑制与氧气生成相关的基因，减少氧气产生；或增强氢化酶的耐氧性，使其在有氧条件下仍能保持活性；也可提高光反应中电子传递效率，为产氢提供更多电子，从而提高产氢效率。 17.（2026·山东东营·一模）（多选）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切。复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除。相关过程如图1所示。 （1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循　　　　　　　　　　原则，Cas9蛋白作用的化学键是　　　　　　　　　　。 （2）为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-　　　　　　　　　　-3'（写出12个碱基）。 （3）利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有　　　　　　　　　　，最终表达载体还应具备的基本元件有　　　　　　　　　　（写出两点）。表达载体导入农杆菌后，利用含　　　　　　　　　　的培养基筛选出阳性菌落。 （4）对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测，若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因　　　　　　　　　　（填“敲除”或“未敲除”）的植株。后续还需对小麦进行白粉病抗性鉴定，请简述实验思路：　　　　　　　　　　。 【答案】（1）① 碱基互补配对    ② 磷酸二酯键     （2）GGUCCUGCGUGA     （3）① SpeI和NheI    ② 复制原点、终止子    ③ 潮霉素或卡那霉素或潮霉素和卡那霉素     （4）① 敲除    ② 用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功         【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1)小问详解： gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循碱基互补配对原则。 gRNA能够识别DNA特定序列，引导Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用，二者的作用类似基因工程中的限制酶。 (2)小问详解： 复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链（3′端-5′端）互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除；可见gRNA靶向序列的应该与目标DNA序列（5′端-3′端）序列基本一致，但需要将DNA序列上的T换成U，又在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则应切除限制酶AvaⅡ识别序列，gRNA上的靶向序列应设计为5'-GGUCCUGCGUGA-3'。 (3)小问详解： 通过限制酶SpeⅠ和NheⅠ将载体1启动子a和gRNA基因剪切，该片段两端的黏性末端相同，因此再用SpeⅠ将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段连接到载体2即可成为最终载体。基因表达载体除了图中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。表达载体导入农杆菌后，由于载体中含有潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，所以可用含潮霉素或卡那霉素或潮霉素和卡那霉素的培养基筛选出阳性菌落。 (4)小问详解： AvaⅡ酶切位点存在于M基因中，若M基因未被敲除，AvaⅡ酶切后会产生两个条带；若M基因被敲除，M基因序列改变，AvaⅡ酶切位点消失，酶切后会出现1个条带，所以检测结果出现1个条带时，该植株为M基因敲除的植株。 白粉病抗性鉴定可通过将白粉病菌接种到小麦植株上，观察植株是否感染白粉病来判断。具体思路为：用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功  。 18.（2026·山东济南·一模）科研人员将来自矮缩病毒（WDV）的复制子WDV盒、向导DNA序列和Cas9-REP融合基因构建了靶向基因敲入载体，如图甲所示。在被转化的水稻细胞中，REP蛋白特异性识别、结合并切割LIR序列，从而使WDV盒环化并大量扩增。扩增的WDV盒与Cas9-REP融合蛋白和向导RNA共同形成复合物，该复合物与水稻染色体中的OsMPK5基因结合，并在特定位点对其进行切割。切割后通过Nanoluc基因（荧光素酶基因）和OsMPK5基因两侧的同源臂（L臂和R臂）以同源重组方式在OsMPK5基因中插入NanoLuc基因，结果如图乙所示。 （1）已知WDV盒中REP基因内部存在两个BasI限制酶识别序列，需通过定点突变将其消除。为此，在扩增REP基因的引物F2与R2中分别引入了突变。其中，R2引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'。对比其与模板的互补区域可知，该引物中通过　　　　　　（填“T变成A”或“A变成T”）完成了定点突变；为便于后续载体构建，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点位于限制酶识别序列的　　　　　　（填“3'端”或“5′端”）。 （2）本研究中Cas9-REP融合蛋白的作用是　　　　　　（写出两条）。 （3）为了检测WDV盒在水稻中能否正常环化，利用野生型和转基因水稻提取的DNA为模板，可选用图中的　　　　　　引物进行PCR并电泳检测，若电泳后所呈现的条带结果为　　　　　　　，说明WDV盒在水稻中能正常环化。 （4）使用OsMPK5蛋白抗体可以检测到转基因水稻中出现预期分子量大小的OsMPK5-NanoLuc融合蛋白，同时也检测到比预期蛋白分子量小的蛋白质，分析图丙，从同源重组的角度简要推测可能的原因是　　　　　　。 【答案】（1）① A 变成 T    ② 3′     （2）REP 蛋白功能：特异性识别并切割 WDV 盒上的 LIR 序列，使 WDV 盒环化并大量扩增。 Cas9 蛋白功能：在向导 RNA 的引导下，特异性识别并切割水稻 OsMPK5 基因的特定位点，为同源重组提供条件。     （3）① F2和R1    ② 转基因水稻出现相应条带，野生型水稻无条带     （4）NanoLuc和L臂有CATTGAC同源序列，发生了基因重组      【分析】 基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 (1)小问详解： BsaI 的识别序列是 5'-GGTCTC-3'，它的互补链是 5'-GAGACC-3'。 R2 引物的序列为5′-ATAATTGTGTGTCCCTAGTGACCTTGCCCAGGAAGTC-3'，其中包含原模板互补序列中的 GAGACC 区域。 为了消除该限制酶识别序列，需要将 A 突变成 T，使 GAGACC 变为 GAGTCC，从而不再被 BsaI 识别。 所以，该引物中通过A 变成 T完成了定点突变。限制酶切割后，黏性末端需要与载体连接，而引物的5' 端是后续酶切和连接的关键位置。 因此，若在引物上添加限制酶识别序列，该突变位点应位于限制酶识别序列的3' 端，避免被限制酶切除。 (2)小问详解： REP 蛋白功能：特异性识别并切割 WDV 盒上的 LIR 序列，使 WDV 盒环化并大量扩增。 Cas9 蛋白功能：在向导 RNA 的引导下，特异性识别并切割水稻 OsMPK5 基因的特定位点，为同源重组提供条件。 (3)小问详解： 为了检测 WDV 盒是否环化，可选择能扩增环化后 WDV 盒片段的引物，例如图中的F2和R1 。若 WDV 盒能正常环化，在转基因水稻的 DNA 模板中会出现与阳性对照（或预期大小）一致的条带，而野生型水稻无此条带。 所以，若电泳后呈现的条带结果为转基因水稻出现相应条带，野生型水稻无条带，说明 WDV 盒在水稻中能正常环化。 (4)小问详解： 从同源重组的角度看，可能发生了错误同源重组，NanoLuc和L臂有CATTGAC同源序列，发生了基因重组，导致 NanoLuc 基因插入不完整。 这会使翻译出的融合蛋白分子量比预期小。 19.（2026·山东济南·一模）慢性乙型肝炎由乙肝病毒（HBV）感染引起的。 （1）根据国家免疫规划，新生儿在出生后24小时以内就要接种HBV疫苗的目的是　　　　　。目前使用的乙肝疫苗主要是通过基因工程表达．HBV表面抗原制成的，与减毒活疫苗相比，这种疫苗的优点是　　　　　　　　，需要多次接种的目的是　　　　　　。 （2）科研人员将HBV外壳蛋白E肽注入正常小鼠体内，小鼠体内的抗原呈递细胞将E肽作为抗原吞噬、处理、呈递给　　　　　细胞，该细胞在特异性免疫中的作用是　　　　　　。 （3）科研人员基于E肽对应的DNA．序列，设计了治疗性疫苗S。某兴趣小组为探究不同剂量疫苗S与固定量细胞因子IL-6联合接种的治疗效果，以产生抗E肽抗体的浆细胞数量为观测指标，设计了如下实验方案：对若干组HBV含量高的患病模型小鼠，分别注射不同（高、中、低）剂量疫苗S及等量IL-6，经一段时间干预后，检测各组小鼠体内产生抗E肽抗体的浆细胞数量并分析实验数据。 a．该兴趣小组的方案存在对照设置不完整的不足，可补充的对照组有　　　　　　。 b．该实验方案除了以“产生抗E肽抗体的浆细胞数量”为观测指标来评价治疗效果外，还应检测　　　　　　。 【答案】（1）① 尽早激活新生儿的免疫系统产生保护性抗体和记忆细胞，从而建立有效的免疫屏障    ② 安全性高，不具备感染性    ③ 产生更多的记忆细胞和抗体     （2）① 辅助性T    ② 激活B细胞、促进细胞毒性T细胞活化     （3）① 正常小鼠注射生理盐水的空白对照组、患病模型小鼠单独注射IL-6的对照组、患病模型小鼠单独注射疫苗对照组    ② 小鼠血清中HBV含量/乙肝表面抗原水平/抗E肽抗体浓度/小鼠肝脏的炎症水平（答对其他一项即可）      【分析】 1、体液免疫的过程为，当病原体侵入机体时，一些病原体可以和B细胞接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。一些病原体被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞。辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞的第二个信号；辅助性T细胞开始分裂、分化。并分泌细胞因子。在细胞因子的作用下，B细胞接受两个信号的刺激后增殖、分化，大部分分化为浆细胞，小部分分化为记忆B细胞。随后浆细胞产生并分泌抗体。在多数情况下，抗体与病原体结合后会发生进一步的变化，如形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。记忆细胞可以在抗原消失后存活，当再接触这种抗原时，能迅速增殖分化，分化后快速产生大量抗体。 2、细胞免疫的过程：被病毒感染的靶细胞膜表面的某些分子发生变化，细胞毒性T细胞识别变化的信号，开始分裂并分化，形成新的细胞毒性T细胞和记忆T细胞。同时辅助性T细胞分泌细胞因子加速细胞毒性T细胞的分裂、分化。新形成的细胞毒性T细胞在体液中循环，识别并接触、裂解被同样病原体感染的靶细胞，靶细胞裂解、死亡后，病原体暴露出来，抗体可以与之结合，或被其他细胞吞噬掉。 (1)小问详解： 疫苗具有免疫防御功能，新生儿在出生后24小时以内就要接种HBV疫苗，目的是为了尽早激活新生儿的免疫系统，产生保护性抗体和记忆细胞，从而建立有效的免疫屏障。与减毒活疫苗相比，这种疫苗的优点是：安全性高，不具备感染性。多次接种可以产生更多的记忆细胞和抗体，增强机体的免疫力。 (2)小问详解： 小鼠体内的抗原呈递细胞将E肽作为抗原吞噬、处理，将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞具有激活B细胞、促进细胞毒性T细胞活化，分泌细胞因子的作用。 (3)小问详解： 某兴趣小组为探究不同剂量疫苗S与固定量细胞因子IL-6联合接种的治疗效果，以产生抗E肽抗体的浆细胞数量为观测指标。实验组是：对HBV含量高的患病模型小鼠，分别注射不同（高、中、低）剂量疫苗S及等量IL-6；空白对照组是正常小鼠注射生理盐水；以及还需要设计对HBV含量高的患病模型小鼠单独注射IL-6；对HBV含量高的患病模型小鼠单独注射疫苗。该实验方案除了以“产生抗E肽抗体的浆细胞数量”为观测指标来评价治疗效果外，还需要检测小鼠血清中HBV含量/乙肝表面抗原水平/抗E肽抗体浓度/小鼠肝脏的炎症水平来反映评价治疗效果（答对其他一项即可）。 20.（2026·山东潍坊·一模）（多选）同源重组技术是指利用目的基因与插入位点两端的同源序列实现目的基因的定向插入。为研究马铃薯抗马铃薯早疫病菌（As）感染的能力是否与S基因表达有关，研究人员用PCR技术扩增S基因反义片段，通过同源重组技术将反义片段插入Ti质粒，并将该质粒导入抗As马铃薯植株中，过程如图1所示。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因的表达。 （1）农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内　　　　　　的过程。反义片段转录形成的RNA抑制了S基因表达的　　　　　　过程。 （2）用限制酶切割图1中质粒会产生黏性末端，需用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平，该过程应选用的限制酶是　　　　　　。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-　　　　　　-3′和5′-　　　　　　-3′（两空只写出与扩增的S基因片段末端序列相连的3个碱基）。 （3）将反义片段转入抗As马铃薯细胞后，需在培养基中加入　　　　　　（填“卡那霉素”“氨苄青霉素”或“卡那霉素和氨苄青霉素”）进行筛选。 （4）将三种植株分别接种致病菌，菌斑大小和未接种致病菌植株各个生长指标的相对值如图2所示。 据图2分析，S基因对马铃薯植株的作用是　　　　　　。成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是　　　　　　。 【答案】（1）① 维持稳定和表达    ② 翻译     （2）① BbvCⅠ    ② TCA    ③ TGA     （3）卡那霉素     （4）① 提高植株抗As感染的能力    ② S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达      【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 农杆菌转化法中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。反义片段转录形成的RNA可与S基因的mRNA互补结合，从而抑制S基因表达的翻译过程，因为翻译是基于mRNA进行的，互补结合会阻碍翻译的进行。 (2)小问详解： 由图中碱基序列及其互补序列可知，质粒切割位点存在ScaⅠ、Sma Ⅰ、Xma Ⅰ和BbvCⅠ识别序列；Sma Ⅰ和Xma Ⅰ识别的序列相同，只是切割位点不同，且sma Ⅰ在质粒上还有切割位点，选择sma Ⅰ和Xma Ⅰ会破坏质粒的结构，不能选用限制酶sma Ⅰ和Xma Ⅰ；限制酶ScaⅠ切割后DNA聚合酶无法从5'端添加脱氧核苷酸，质粒上有限制酶BbvC I的识别序列，可选用BbvC I。利用同源重组技术获得重组质粒，需要引物在片段末端加入与切割位点末端相同的同源序列，因需反向插入，引物F对应质粒切割后的右切口，引物R对应质粒切割后的左切口，根据BbvC I切割位点及补平后的序列，引物F和R所含的同源序列分别为5′-TCA-3'和5′-TGA-3'。 (3)小问详解： Ti质粒中，卡那霉素抗性基因位于T-DNA区域内，随T-DNA整合入植物基因组；而氨苄青霉素抗性基因位于T-DNA外，不会转入植物细胞。因此，筛选成功转化的植株应使用卡那霉素培养基。 (4)小问详解： 据图2分析，三种植株接种致病菌后，含S基因的植株（野生型）形成的菌斑小，由此可知S基因对马铃薯植株的作用是提高植株抗As感染的能力。根据未接种致病菌植株各个生长指标的相对值可知，成功转入S基因反义片段植株与敲除S基因的植株生长指标有明显差异，推测原因是S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题 15 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】A 2.【答案】B 3.【答案】A 4.【答案】（1）① 启动子    ② 复制原点     （2）Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ     （3）① DNA聚合酶、DNA连接酶    ② 不需要    ③ 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始     （4）抗原-抗体杂交 5.【答案】（1）① 复制原点    ② XbaI    ③ DNA聚合酶    ④ SmaI和SpeI    ⑤ 550bp     （2）① 4    ② 环化    ③ 测序和序列比对     （3）不能      6.【答案】（1）① RNA聚合酶    ② 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等      （2）① F2和R1或F1与R2     ② a链     （3）① J-V5融合蛋白    ② 不是      7.【答案】① SalI    ② EcoRI    ③ 6    ④ F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达    ⑤ 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上    ⑥ 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】B 2.【答案】D 3.【答案】（1）① 低    ② 256    ③ 5'-CAAT-3'    ④ 5'-GTTT-3'      （2）① 卡那霉素    ② Sac Ⅰ    ③ ④     （3）1/4      4.【答案】（1）① 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸     ② 5'端     （2）① P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。    ② 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基     （3）① 增强FLAG-P与UBC的结合    ② 参与P与UBC的结合     （4）药物A通过增强P与UBC结合促进P降解      1.【答案】D 2.【答案】D 3.【答案】B 4.【答案】C 5.【答案】A 6.【答案】B 7.【答案】BCD 8.【答案】B 9.【答案】（1）① 序列数据库    ② （总）RNA    ③ 更换微量移液器的枪头     （2）① NsiⅠ，SalⅠ    ② 选择SalⅠ和PstⅠ对质粒进行完全酶切，利用DNA聚合酶将SalⅠ产生的黏性末端补平     （3）① 四环素    ② 1    ③ 2号、3号导入的重组载体是两个pET质粒环化形成，4号导入的是空白pET质粒     （4）U-DPG和RA      10.【答案】（1）① 防止/抑制IFN Nα-2b/人源干扰素/目的蛋白/外源蛋白的降解    ② 诱导型     （2）① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时能够在受体细胞内表达和发挥作用    ② ①②④    ③ 卡那霉素和 IPTG     （3）① tRNA（或“转运RNA”）    ② 单交换    ③ 1100或5000      11.【答案】（1）① F1和R2（或F2和R1）    ② 3    ③ ①②⑤     （2）① A    ② 否     （3）强启动子提高了PPO1基因的转录水平，使原卟啉原IX氧化酶的表达量增加      12.【答案】（1）① 终止子    ② XhoI    ③ CAATTGGTAGTCGAA     （2）① 氨苄青霉素和X-gal    ② 白     （3）① GAT    ② 2      13.【答案】（1）① 细胞因子    ② 肿瘤细胞表面抗原和辅助性 T 细胞（Th）释放的细胞因子     （2） 方案一：载体中出现元件组合1和元件组合2， 根据需要服用四环诱导CAR基因表达： 方案二：载体中出现元件组合1和元件组合2，治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡：      （3）① 引物2和引物3    ② CAR基因（目的基因）和线性化质粒    ③ 氨苄青霉素    ④ Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、特异性引物（F和R）    ⑤ 不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切和连接，简化实验流程等      14.【答案】（1）① XbaⅠ、SpeⅠ    ② DNA连接    ③ PstⅠ、BglⅡ     （2）有多个限制酶酶切位点、基因能够在受体细胞内自我复制或整合到受体细胞DNA中，随着宿主细胞DNA复制而复制、有标记基因、对宿主细胞无害     （3）① 乙    ② 引物1和引物2     （4）工程菌中表达的S蛋白可特异性结合癌细胞抗原，将工程菌引至癌细胞，癌细胞周围的低氧环境激活L蛋白导致工程菌破裂，抗癌药物释放      15.【答案】（1）① 基因表达载体的构建    ② EcoRⅠ和SalⅠ    ③ β链     （2）① AC       ② 可在任何位点插入目的基因，避免载体和目的基因自身环化及目的基因的反向连接     （3）① 卡那霉素抗性    ② 卡那霉素和地塞米松     （4）6      16.【答案】（1）① 类囊体薄膜    ② NADP+     （2）白天光合作用产生的氧气迅速抑制氢化酶活性；黑夜没有光照，无法进行光反应为产氢提供必要条件     （3）PPy涂层中的Fe3+催化抗坏血酸与氧气反应，消耗氧气，避免氧气抑制氢化酶活性     （4）① 水在PSⅡ作用下分解产生电子，经电子传递链传递至氢化酶    ② ③     （5）通过基因工程增强氢化酶的耐氧性或敲除与氧气生成相关的基因或提高光反应电子传递效率      17.【答案】（1）① 碱基互补配对    ② 磷酸二酯键     （2）GGUCCUGCGUGA     （3）① SpeI和NheI    ② 复制原点、终止子    ③ 潮霉素或卡那霉素或潮霉素和卡那霉素     （4）① 敲除    ② 用布氏白粉菌感染基因改造的小麦和没有经过基因改造的小麦，如果基因改造的小麦产量高，没有改造的小麦产量低，则说明改造成功         18.【答案】（1）① A 变成 T    ② 3′     （2）REP 蛋白功能：特异性识别并切割 WDV 盒上的 LIR 序列，使 WDV 盒环化并大量扩增。 Cas9 蛋白功能：在向导 RNA 的引导下，特异性识别并切割水稻 OsMPK5 基因的特定位点，为同源重组提供条件。     （3）① F2和R1    ② 转基因水稻出现相应条带，野生型水稻无条带     （4）NanoLuc和L臂有CATTGAC同源序列，发生了基因重组      19.【答案】（1）① 尽早激活新生儿的免疫系统产生保护性抗体和记忆细胞，从而建立有效的免疫屏障    ② 安全性高，不具备感染性    ③ 产生更多的记忆细胞和抗体     （2）① 辅助性T    ② 激活B细胞、促进细胞毒性T细胞活化     （3）① 正常小鼠注射生理盐水的空白对照组、患病模型小鼠单独注射IL-6的对照组、患病模型小鼠单独注射疫苗对照组    ② 小鼠血清中HBV含量/乙肝表面抗原水平/抗E肽抗体浓度/小鼠肝脏的炎症水平（答对其他一项即可）      20.【答案】（1）① 维持稳定和表达    ② 翻译     （2）① BbvCⅠ    ② TCA    ③ TGA     （3）卡那霉素     （4）① 提高植株抗As感染的能力    ② S基因反义片段转录形成的RNA降低了生长素合成相关基因的表达      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $