福建省福清第一中学2025-2026学年高三上学期生物校本16练习

**基本信息** 以Cre/LoxP系统和In-Fusion技术为情境载体，整合基因工程核心知识，通过科研实例考查原理应用与技术分析，体现生命观念与科学思维的综合训练。 **综合设计** |模块|题量/典例|题型特征|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |Cre/LoxP重组酶系统|2道|情境化综合应用题，结合疫苗构建与基因敲除模型|从重组酶特性→位点方向影响→应用实例，体现结构决定功能的生命观念| |In-Fusion技术|2道|科研情境分析题，涉及无缝克隆原理与探针构建|从技术原理→优势对比→实践应用，展现科学思维的推导过程|

福清一中2025-2026高三上生物校本16 情境1：Cre/LoxP重组酶系统 (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。 (3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 ②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 1.Cre-Loxp系统是基因工程中常用的特异性重组酶系统，该系统中的Cre酶能根据两个Loxp的方向删除或倒置位于两个Loxp序列间的基因，如图1所示。现使用Cre-Loxp系统构建TK基因缺失的病毒毒株，为研发该病毒的疫苗提供候选毒株，构建过程如图2所示，下列分析错误的是（    ） A．图1中Gene两端需含有两个相同的碱基序列 B．位于RFP基因两端的Loxp序列方向相反 C．Cre酶处理之前，应初步筛选出有红色荧光基因的病毒 D．Cre酶在图2过程中的具有限制酶和DNA连接酶的功能 2．M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： floxM/＋ (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 情境2：In－Fusion技术 In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 3.在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列），然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（    ） A．推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键 B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化 C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基更容易互补配对 D．该技术对目的基因进行PCR，需要经历3次循环才能得到两端含引物1和引物2的目的基因 4．A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。请分析回答： (1)无缝克隆原理图中，过程①中T5核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。过程③所需的酶有 。 (2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。NEB官方的无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于75bp，并提示最好不低于110bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于50bp小片段的原因： (3)图中利用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1与 互补。 (4)图中利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，应选用的限制酶为 。扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列（5'→3'）的设计依据为 （填序号：①同源序列②限制酶的识别序列③P基因的部分序列④GUS基因的部分序列）。据图分析，引物R1和F2应分别为下列引物 。 ①5'-TAAGTTGTCT……-3'    ②5'-CTTGGATGAT……-3' ③5'-TCTGTTGAAT……-3'    ④5'-ATTCAACAGA……-3' (5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培。用 对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是 ，该激素的生理作用是 。 答案：1.B 2．(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 3.C 4．(1) 5'→3' 黏性末端 DNA聚合酶和DNA连接酶 (2)小片段的DNA黏性末端之间容易随机结合，导致连接效率低且错误率高 (3)R2引物5'端序列 (4) BclI和SmaI ②③ ②③ (5) 草甘膦 根 调节植物生长，使植物适应缺磷环境 学科网（北京）股份有限公司 $