专题20 基因工程、细胞工程和胚胎工程 题组4-【区块练】2021-2025年五年高考真题分类汇编生物

专题20　题组四 1.解析　由于MⅡ期卵母细胞的细胞更大，便于进行技术操作，细胞质中含有激发细胞核全能性的物质，因此体细胞核移植到去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚，A正确；移植前胚胎发育率低，细胞核来自已分化的体细胞，全能性容易受到影响，因此可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态，B正确；胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能成功在代孕母鼠子宫内着床，胚胎从透明带中出来称为孵化，C错误；胚胎细胞核全能性高于体细胞，因此为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植，D正确。 答案　C 2.解析　胰蛋白酶处理后直接培养的细胞为原代细胞，A错误；将特定基因或特定蛋白(特定的转录因子如Oct4、Sox2、Klf4和c­Myc)导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞，B正确；融合细胞有具有同种核的融合细胞和杂交瘤细胞，需筛选才能获得分泌特定抗体的杂交瘤细胞，C错误；囊胚期的细胞已经开始分化，D错误。 答案　B 3.解析　促性腺激素可促进供体超数排卵，从而获得更多卵子，A正确；为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致，受体与供体需同期发情处理以保证胚胎移植后生理环境同步，B正确；桑葚胚阶段的细胞通过卵裂增殖，细胞数量增加，但胚胎总体积不变，或略有减小，C错误；本实验的自变量是是否对绵羊受精卵进行基因编辑等，其余为无关变量，对照组与实验组的无关变量(如年龄、性别)需保持一致，以排除干扰，D正确。 答案　C 4.解析　耐高温的DNA聚合酶的本质是蛋白质，基本单位为氨基酸，A错误；耐高温DNA聚合酶在细胞内的DNA复制和体外的PCR反应中均能发挥作用，B正确；缺少引物和缓冲液时反应无法启动，C错误；高温保存会破坏酶活性，需低温保存，D错误。 答案　B 5.解析　在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。 答案　D 6.解析　促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ中期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。 答案　B 7.解析　步骤①添加纤维素酶和果胶酶以去除细胞壁，A错误；原生质体放入无菌水清洗会使其吸水涨破，B错误；据图观察，原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间，C正确；能被台盼蓝染色的细胞为死细胞，所以应选择未被染色的细胞继续培养，D错误。 答案　C 8.解析　胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A正确；由于蛋白S含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，单克隆抗体A和单克隆抗体B来自不同的杂交瘤细胞，因此制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B不一定是相同的单克隆抗体，B错误；用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可以冷冻保存，C错误；单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D正确。 答案　AD 9.解析　(1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。(2)E.coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。(4)据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。 答案　(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释　(2)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素　(4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 10.解析　(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从DNA序列数据库或基因序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5′端含有引物1序列，而编码链的5′端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5′端添加XbaⅠ、引物1 5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。(2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒pYL大小为7.2 kb，重组质粒大小约9.5 kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3 kb(2～2.3 kb)，结合图2电泳结果可知，实验组1的电泳条带大小约为2300 bp，说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，根据a引物5′端首位GCA为240位，则c引物5′端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。(4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案　(1)基因序列数据库或DNA序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶　(2)外源DNA(或外源基因、基因N)　1　基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值，约为2.3 kb，对应实验组1的电泳条带(或实验组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等于重组质粒大小)　(3)GCC　(4)香树脂醇 11.解析　(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为RU(500 bp)＋R基因(2000 bp)＋RD(500 bp)＝3000 bp。对应图2中的菌落①和③。在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为RU(500 bp)＋RD(500 bp)＝1000 bp。对应图2中的菌落②。菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3000 bp质粒骨架＋500 bp RU＋500 bp RD＝4000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000 bp)加上整个质粒的长度(4000 bp)，即3000＋4000＝7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。(3)设置两组培养实验：一组为对照组，在常规(或低铁)浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。预期结果与结论：如果实验组(高铁培养基)中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组(低铁培养基)中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 答案　(1)稀释涂布平板法　分离不同条件下生长的内生放线菌 (2)指数级扩增　②　重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测 12.解析　(1)据题中信息知，选择引物1和4扩增出来的片段不含SacB基因，故为去除筛选效率较低的SacB基因，应选择引物1和4。PCR时，引物与单链DNA结合后，从引物的3′端开始延伸，故应在引物的5′端引入Xho Ⅰ酶识别序列。(2)分析题图可知，利用载体2构建载体4时，只使用了Xho Ⅰ限制酶，故扩增出的RpsL基因片段应含Xho Ⅰ酶识别序列，所以PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物应包含Xho Ⅰ酶识别序列。(3)分析可知，受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感，而载体5上具有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因)，故为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那毒素的平板进行初步筛选。(4)据题意知，P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA时，载体5上其他DNA片段全部丢失，所以该菌的表型依然是受体菌的表型，即链霉素不敏感、卡那霉素敏感，B选项符合题意。(5)提取受体菌的DNA，以该DNA为模板，采用P1基因特异性引物进行PCR扩增，若获得大量P1基因，即可确定该菌株成功整合了P1基因。 答案　(1)1　4　5′　(2)Xho Ⅰ　(3)卡那霉素　(4)B (5)PCR(聚合酶链式反应，答案合理即可给分) 13.解析　(1)基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)，故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)。限制性核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。(3)由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。(4)先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。 答案　(1)限制性核酸内切酶(限制酶)　磷酸二酯键 (2)清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 (3)动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难　细胞体积小，细胞核大，核仁明显(任选两点作答)　发育的全能性 (4)B　取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 学科网（北京）股份有限公司 $ 一、选择题 1.(2025·黑吉辽蒙卷)研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是(　　) A.体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚 B.移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态 C.胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化 D.为提高胚胎成活率，可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植 2.(2025·安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是(　　) A.从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞 B.将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞 C.将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞 D.采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化 3.(2025·陕晋宁青卷)科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作，获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。下列叙述错误的是(　　) A.为获取足够的卵子，需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理 B.为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致，需进行同期发情处理 C.受精卵发育至桑葚胚阶段，细胞数量和胚胎总体积均增加 D.对照组绵羊的选择需考虑年龄、性别等无关变量的影响 4.(2025·黑吉辽蒙卷)下列关于耐高温的DNA聚合酶的叙述正确的是(　　) A.基本单位是脱氧核苷酸 B.在细胞内或细胞外均可发挥作用 C.当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应 D.为维持较高活性，适宜在70 ℃～75 ℃下保存 5.(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是(　　) A.①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块 B.②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组 C.3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1 D.百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体 6.(2024·甘肃卷)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是(　　) A.藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B.藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C.受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D.后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 7.(2024·江苏卷)图示植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列相关叙述正确的是(　　) A.步骤①添加盐酸以去除细胞壁 B.步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗 C.原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间 D.台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养 8.(2024·江西卷)(多选)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是(　　) A.利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞 B.制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体 C.用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，但不能冻存 D.单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白 二、非选择题 9.(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_________________________________ ________________________________________________________________________。 将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： 图1 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是____________________________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 图2 注：虚线长度代表氨基酸间的空间距离 10.(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题： (1)可从________________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是_________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3′ b：5′…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3′ c：5′…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3′ d：5′…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 11.(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题： (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________________________________________________________________________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段RU和下游片段RD；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________(填序号)，出现菌落④的可能原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 12.(2022·天津卷)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。 (1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物________和________，并在引物的________(5′/3′)端引入Xho Ⅰ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。 (2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物应包含________(EcoRⅠ/HindⅢ/XhoⅠ)酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。 (3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有________的平板进行初步筛选。 (4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为________。 A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感 C.卡那霉素和链霉素都敏感 D.卡那霉素和链霉素都不敏感 (5)可采用________技术鉴定成功整合P1基因的菌珠。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。 13.(2021·湖南卷)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是__________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的________断开。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为__________________________________________________(答出两点即可)，功能上具有__________。 (4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路：________________________________________________________________________ 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