专题14 基因工程（3年汇编）（安徽专用）2024-2026年高考生物真题分类汇编

**基本信息** 聚焦基因工程专题，整合安徽近3年高考真题及模拟题，以工具酶、PCR技术等核心考点为载体，融合农业育种、疾病治疗等真实情境，突出技术整合与实验探究。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|约10题|基因工程工具（限制酶功能）、PCR原理（引物设计）、载体筛选（标记基因）|结合DNA粗提取实验辨析基础原理，融入AI逆折叠模型等科技前沿| |非选择题|约10题|基因表达载体构建、目的基因检测、CRISPR-Cas9应用|以水稻抗稻瘟病育种、肿瘤耐药机制为情境，设计实验思路与结果分析题|

专题14 基因工程 3年真题1年模拟 考点分类 安徽考情 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2024安徽（1题） · 情境设置：依托教材基础实验"DNA粗提取与鉴定"设置辨析情境。 · 考查重点：限制酶、DNA连接酶功能及DNA理化性质（溶解度、鉴定原理）。 · 命题趋势：单独命题频次降低，多渗透于完整基因工程流程中考查，注重实验原理与操作细节辨析。 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2025安徽（2题）、2024安徽（1题） · 情境设置：以农业育种（水稻抗稻瘟病）和微生物筛选为真实情境，融合基因工程与微生物培养技术。 · 考查重点：PCR引物设计、扩增条件优化、产物鉴定及与遗传育种综合应用。 · 命题趋势：趋向多技术整合考查，强调PCR在实际问题解决中的工具性作用，安徽卷连续两年聚焦该考点。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（       ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【分析】 DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】 A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（       ） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】 A、使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒（可能形成白色菌落）还是未重组的质粒K（形成蓝色菌落），都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确； B、由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确； C、筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒（含目的基因），但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β - 半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β - 半乳糖苷酶，分解X - gal形成蓝色菌落，D正确。  故选C。 2.（2024·安徽·高考真题）甲是具有许多优良性状的纯合品种水稻，但不抗稻瘟病(rr)，乙品种水稻抗稻瘟病(RR)。育种工作者欲将甲培育成抗稻瘟病并保留自身优良性状的纯合新品种，设计了下列育种方案，合理的是（       ） ①将甲与乙杂交，再自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 ②将甲与乙杂交，F1与甲回交，选F2中的抗稻瘟病植株与甲再次回交，依次重复多代；再将选取的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 ③将甲与乙杂交，取F1的花药离体培养获得单倍体，再诱导染色体数目加倍为二倍体，从中选取抗稻瘟病植株 ④向甲转入抗稻瘟病基因，筛选转入成功的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 A. ①② B. ①③ C. ②④ D. ③④ 【答案】C 【分析】 1、诱变育种： 原理：基因突变； 优点：能提高变异频率，加速育种过程，可大幅度改良某些性状；变异范围广。 2、杂交育种： 原理：基因重组； 优点：操作简单。 3、基因工程育种 原理：基因重组； 优点：目的性强；可克服远缘杂交不亲和障碍。 4、单倍体育种： 原理：染色体数目变异； 优点：可明显缩短育种年限。 【详解】 ①甲是具有许多优良性状的纯合品种水稻，但不抗稻瘟病(rr)，乙品种水稻抗稻瘟病(RR)，两者杂交，子代为优良性状的杂合子，以及抗稻瘟病(Rr)，若让其不断自交，每代均选取抗稻瘟病植株，则得到的子代为抗稻瘟病植株，但其他性状不一定是优良性状的纯合子，①错误； ②将甲与乙杂交，F1与甲回交，F2中的抗稻瘟病植株与甲再次回交，依次重复多代，可得到其他许多优良性状的纯合品种水稻，但抗稻瘟病植株可能为纯合子或杂合子，再将选取的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株，可得到抗稻瘟病并保留自身优良性状的纯合新品种，②正确； ③将甲与乙杂交，取F1的花药离体培养获得单倍体，再诱导染色体数目加倍为纯合二倍体，从中选取抗稻瘟病且其他许多优良性状的纯合植物，为所需新品种，只选取抗稻瘟病植株，不能保证其他性状优良纯合，③错误； ④甲是具有许多优良性状的纯合品种水稻，向甲转入抗稻瘟病基因，则抗稻瘟病性状相当于杂合，对转入成功的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株，可获得所需新品种，④正确。 综上所述，②④正确，即C正确，ABD错误。 故选C。 3.（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用　　　　　　　　（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是　　　　　　　　。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的　　　　　　　　。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落　　　　　　　　（填序号），出现菌落④的可能原因是　　　　　　　　。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路　　　　　　　　。 【答案】（1）① 稀释涂布平板法    ② 探究内生放线菌最适的营养条件和温度     （2）① 指数级扩增    ② ②    ③ 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中     （3） 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测      【分析】 基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 (1)小问详解： 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了探究内生放线菌最适的营养条件和温度。 (2)小问详解： PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。 (3)小问详解： 设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 4.（2026·安徽·高考真题）肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 （1）培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液　　　　　　异常；乳腺癌细胞培养时　　　　　　（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是　　　　　　。 （2）P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为　　　　　　（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是　　　　　　。 （3）S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因　　　　　　S基因的转录，　　　　　　（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 【答案】（1）① pH    ② 不会    ③ 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞     （2）① ③④    ② 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞     （3）① 抑制    ② 促进      (1)小问详解： 动物细胞培养中，CO₂的作用是维持培养液正常的pH，若CO₂不足会导致培养液pH异常；乳腺癌细胞是癌细胞，细胞膜上糖蛋白减少，失去了接触抑制特性，因此培养时不会出现接触抑制；胰蛋白酶处理贴壁细胞分散细胞时，处理时间过长会过度分解细胞蛋白、损伤细胞，因此需要控制处理时间。 (2)小问详解： 构建重组质粒时，需要保证目的基因插入方向正确：质粒启动子在插入位点左侧，转录方向从左到右，而P基因自身转录方向向左，因此需要将P基因的右端（转录起点侧）连接靠近启动子的Bgl II位点，左端连接靠近终止子的Hind III位点，但因质粒的复制原点有Hind III的酶切位点，在启动子和复制原点之间还有BamH I的酶切位点，故只能选择Bgl II作为靠近启动子的酶切位点、Spe I作为靠近终止子的酶切位点。根据碱基互补配对，Bgl II识别序列为AGATCT，P基因右端序列匹配引物③（5'-AGATCTAGGCAT-3'）；Spe I识别序列为ACTAGT，P基因左端序列匹配引物④（5'-ACTAGTCCGTGT-3'），因此选引物③④。本实验探究P基因的作用，实验组导入含P基因的重组质粒，对照组需要排除质粒本身的影响，因此对照组为转入不含P基因的空质粒的乳腺癌细胞，其余条件与实验组一致。 (3)小问详解： 启动子甲基化会阻碍RNA聚合酶与启动子结合，因此P蛋白诱导S基因启动子甲基化，会抑制S基因的转录；S基因的作用是抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖，S基因表达被抑制后，DNA损伤修复可以正常进行，因此会促进肿瘤耐药。 模拟题精选 1.（2026·安徽铜陵·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A. 生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B. 从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C. 氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D. 该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 【答案】C 【详解】 A、该模型依据“序列-结构”对应关系生成氨基酸序列，而非肽键结构或氨基酸数目。肽键是氨基酸间的基本连接方式，但模型的核心是学习序列与空间构象的关联，A错误； B、从蛋白质的三维结构推测氨基酸序列，AI模型依据的原理是结构与功能相适应的原理，与中心法则无关，B错误； C、氨基酸替换可能发生在非关键位点，若替换后氨基酸性质相似，蛋白质的空间构象和功能可保持不变，C正确； D、蛋白质工程需通过改造基因来实现蛋白质设计，该模型仅提供序列预测，最终仍需基因操作（如定点突变）表达目标蛋白，D错误。 故选C。 2.（2026·安徽宿州·质量检测）大肠杆菌具有繁殖迅速、培养简单、遗传稳定等特点，是基因工程研究中的重要生物。图1是大肠杆菌基因表达过程，图2是图1中部分结构的放大，下列相关叙述正确的是（　　） A. RNA聚合酶沿模板链的5’→3’方向移动 B. 图1中mRNA的5’端最先从模板链中脱离 C. 图2中mRNA的左侧为5’端右侧为3’端 D. 图2中的tRNA②正处于核糖体的位点1 【答案】B 【详解】 AB、转录时，RNA聚合酶与模板链结合沿模板链的3’→5’方向移动，mRNA的合成方向为5’→3’，mRNA的5’端最先从模板链脱离出来，A错误，B正确； C、图2为翻译，tRNA中3’-OH端连接着氨基酸或多肽链，依据碱基互补配对原则可以推知mRNA的右侧为5’端，左侧为3’端，C错误； D、翻译时，核糖体沿着mRNA的5’→3’移动，②为一个新的携带氨基酸的tRNA进入核糖体的位点2，D错误。 故选B。 3.（2026·安徽滁州·一模）实验过程中的变化因素称为变量，变量有自变量、因变量和无关变量之分。下列关于课本中的实验，叙述正确的是（　　） A. 比较过氧化氢在不同条件下分解的探究实验，自变量为催化剂的种类 B. 探究土壤微生物对落叶的分解作用实验，60℃处理土壤1h组为实验组 C. 探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验，需选用碘液对因变量进行检测 D. 探究酵母菌细胞呼吸的方式实验，两组培养液中的溶氧量是无关变量 【答案】B 【详解】 A、比较过氧化氢在不同条件下分解的探究实验，自变量是反应条件（如加热、FeCl3、肝脏研磨液），而不仅仅是催化剂的种类，A错误； B、探究土壤微生物对落叶分解作用实验中，60℃处理土壤1h（灭菌）组消除了微生物，与未处理土壤组形成对照，故60℃组为实验组，B正确； C．探究淀粉酶对淀粉和蔗糖水解作用实验中，因变量为还原糖生成情况，需用斐林试剂检测还原糖，碘液仅能检测淀粉剩余量，无法检测蔗糖是否水解，C错误； D、探究酵母菌细胞呼吸方式实验中，有氧组与无氧组的溶氧量差异是导致呼吸方式不同的关键因素，属于自变量而非无关变量，D错误。 故选B。 4.（2026·安徽芜湖·一模）下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（       ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A. 图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B. DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C. 大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D. 启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 【答案】A 【详解】 A、图中?处应为“-”（T蛋白对启动子2的作用是抑制），但四环素并非直接解除对启动子2的抑制，而是通过抑制T蛋白的活性，间接解除T蛋白对启动子2的抑制，使绿色荧光蛋白基因表达。因此“四环素直接解除对启动子2的抑制”表述错误，A错误； B、DNA的双螺旋结构是不同生物DNA能够重组的结构基础，也是外源基因整合到大肠杆菌DNA（如质粒）上的结构基础，B正确； C、大肠杆菌能否发出绿色荧光，既受T基因（表达的T蛋白抑制绿色荧光基因的启动子2）的调控，也受绿色荧光基因（表达荧光蛋白）的直接控制，因此性状受二者共同影响，C正确； D、启动子是基因上游的特殊DNA序列，能够与RNA聚合酶特异性结合，驱动基因转录，这是启动子的核心功能，D正确。 故选A。 5.（2026·安徽皖北协作区·一模）水杨酸是一种常见的水体污染物。科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1所示），为环境污染治理提供新方法。水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因（图2），则工程菌可同时实现对水杨酸的动态监测和清除。下列相关说法错误的是（　　） A. 启动子是mRNA上一段特殊的序列，是转录的起始位点 B. 当环境中存在水杨酸时，水杨酸—调控蛋白激活Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度 C. 可在基因前插入水杨酸诱导型强启动子，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度 D. 欲通过PCR判断融合基因是否准确连接，应选择图2中的引物组合1和3 【答案】A 【详解】 A、基因工程中启动子与基因转录有关，位于DNA（基因）上，是RNA聚合酶识别结合位点，启动转录，A错误； B、由图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度，B正确； C、选择表达效率更高的启动子替代Ps，在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列，使启动子能更高效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度，C正确； D、PCR技术要求引物与模板链的3'端互补配对，且DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物1和引物3可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的3'端和mrfp基因的3'端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3，D正确。 6.（2026·安徽巢湖·一模）HIV病毒是一种致病性强的逆转录病毒，其遗传物质是单链RNA。科学家利用基因编辑技术CRISPR-Cas9，精准识别并切割整合到宿主细胞基因组中的HIV病毒DNA，阻止其复制和表达。下列叙述正确的是（       ） A. HIV病毒通过DNA聚合酶将RNA转化为DNA，并整合到宿主细胞基因组中，形成潜伏感染 B. CRISPR-Cas9基因编辑技术能够精准切割宿主细胞DNA，阻止其复制和表达，可治疗艾滋病 C. 利用CRISPR-Cas9治疗艾滋病应针对患者的辅助性T细胞进行基因编辑 D. 与HIV感染者握手、拥抱、共用牙刷和剃须刀、纹眉器械不会使人感染HIV 【答案】C 【分析】 病毒同所有生物一样，具有遗传、变异、进化，是一种体积非常微小，结构极其简单的生命形式。病毒没有细胞结构，主要由内部的核酸和外部的蛋白质外壳组成，不能独立生存，只有寄生在其他生物的活细胞里才能进行生命活动。一旦离开就会变成结晶体。只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质成分；以核酸和蛋白质等元件的装配实现其大量繁殖。 【详解】 A、HIV病毒通过逆转录酶将RNA转化为DNA，而不是DNA聚合酶，DNA聚合酶是用于DNA复制过程中合成DNA子链的，A错误； B、CRISPR-Cas9基因编辑技术能够精准切割的是整合到宿主细胞基因组中的HIV病毒DNA，而不是宿主细胞DNA，B错误； C、HIV主要攻击辅助性T细胞，所以利用CRISPR-Cas9治疗艾滋病应针对患者的辅助性T细胞进行基因编辑，这样可以有效阻止HIV在辅助性T细胞内的复制和表达，C正确； D、与HIV感染者握手、拥抱一般不会使人感染HIV，但共用牙刷和剃须刀、纹眉器械可能会因接触到感染者的血液等体液而感染HIV，D错误。 故选C。 7.（2026·安徽巢湖·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（       ） A. 目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 B. 含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C. 限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D. T-DNA插入水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 【答案】D 【分析】 基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】 A、目的基因（而不是其产物）整合到叶绿体中，避免了目的基因通过花粉（有细胞核，不含叶绿体）转移到近缘植物，A错误； B、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，据图可知卡那霉素抗性基因在载体的非T-DNA区域，即使T-DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，B错误； C、酶都具有专一性，DNA连接酶只能连接两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，因此具有专一性，C错误； D、T-DNA插入水稻染色体DNA中的位置是随机的，可能会破坏原有基因结构，影响该基因表达，D正确。 故选D。 8.（2026·安徽铜陵·一模）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： （1）现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是　　　　　　　　。采用SacI和SalI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　　　　　条电泳条带。 （2）将重组质粒导入农杆菌后仍需用PCR验证融合基因的有无，应选择图甲中的引物组合是　　　　　　　　；现有以下培养基成分。①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加　　　　　　　　（填序号）。 （3）研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的基因并回补pyrG基因，来探究msn2基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图乙中A、B基因分别为　　　　　　　　基因。 （4）已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次级代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表， 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 2 2 — — 3 — — 3 6.5 1 1 9.5 130 2.2 4 7.5 — — 16 — — 6 10.5 3.5 3.8 25.5 100 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期　　　　　　　　。 【答案】（1）① 激活TaqDNA聚合酶    ② 2##二##两     （2）① 引物2和引物4    ② ①②③④     （3）pyrG基因和msn2基因     （4）促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生      【分析】 1、基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：提取目的基因、目的基因与载体连接、将与目的基因连接的载体导入受体细胞、目的基因的表达与检测。 2、基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 (1)小问详解： PCR反应中，Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶的活性（Taq 酶的催化依赖Mg2+）。重组质粒含kojR-pyrG基因和kanr标记基因，用Sac I和Sal I完全酶切后，会产生2个片段（kojR-pyrG片段、含kanr的质粒片段），因此电泳检测应产生2条电泳条带。 (2)小问详解： PCR技术要求两种引物分别与目的基因两条链的3'端结合，从而使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。根据图甲中引物的位置，应选择的引物组合是引物2和引物4。筛选g-58 菌株的培养基需添加①碳源、②氮源、③无机盐、④水。理由是g-58 菌株含pyrG基因（可自主合成尿嘧啶，无需添加⑥尿嘧啶）。 (3)小问详解： 根据图甲过程及原理，要敲除米曲霉g-1菌株中的msn2基因并回补pyrG基因，图乙中A基因应为pyrG基因，B基因应为msn2基因，这样通过同源重组可以实现对msn2基因的敲除和pyrG基因的回补。 (4)小问详解： 由表格可知，g-58菌株含有kojR基因，其kojR基因相对表达量、LaeA基因相对表达量均比g-1菌株高，且曲酸产量也更高。 因为已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次生代谢产物合成酶基因的转录，所以可推测kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期通过促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生。 9.（2026·安徽合肥·一模）人胰岛素是由A链和B链构成的蛋白质分子，是治疗糖尿病的重要药物。科研人员设计了一个含有“B链基因-F2A序列-A链基因”的目的基因（cDNA），并将其导入大肠杆菌中，获取了能同时高效表达人胰岛素A链和B链的工程菌，以大量制备有活性的胰岛素。回答下列问题。 （1）利用大肠杆菌得到的肽链还需要在体外进行加工才能形成有活性的人胰岛素分子，其原因是　　　　　　　　　　　。 （2）采用PCR技术构建“B链基因-F2A序列-A链基因”目的基因的过程如图1.在扩增B链基因时，设计的引物2的5’端需添加　　　　　　　　序列。分别扩增完B链基因和A链基因后，进行一系列过程，最后选取　　　　　　　　（填引物种类）进行扩增，可得到完整的目的基因。 （3）科研人员选用限制酶SpeⅠ和XbaⅠ切割的质粒，构建基因表达载体后导入大肠杆菌（卡那霉素敏感型），再将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基上培养。在该培养基上生长的大肠杆菌不一定含有目的基因，理由是　　　　　　　　。 （4）为进一步筛选出含有正向连接表达载体的大肠杆菌，科研人员从部分大肠杆菌中提取重组质粒，应选择限制酶　　　　　　　　切割重组质粒，并进行电泳检测。在图3中绘出正向连接的表达载体在酶切后的电泳结果　　　　　　　　。 【答案】（1）大肠杆菌无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工形成特定的空间结构     （2）① F2A    ② 引物1和引物4     （3）导入不含目的基因的pET-28a质粒的大肠杆菌也具有卡那霉素抗性，可在该培养基上生长繁殖     （4）① Spe Ⅰ和Hind Ⅲ    ②       【分析】 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对胰岛素进行加工形成特定的空间结构，因此需要在体外进一步加工。 (2)小问详解： 在扩增B链基因时，引物2的5'端需添加F2A序列，以便后续拼接，最后选取引物1和引物4进行扩增，可得到完整的 “B 链基因-F2A序列-A 链基因”。 (3)小问详解： 在该培养基上生长的大肠杆菌不一定含有目的基因，理由导入不含目的基因的pET-28a质粒的大肠杆菌也具有卡那霉素抗性，可在该培养基上生长繁殖。 (4)小问详解： 为进一步筛选出含有正向连接表达载体的大肠杆菌，从部分大肠杆菌中提取重组质粒，应选择限制酶Spe Ⅰ和Hind Ⅲ切割重组质粒，并进行电泳检测。理由是重组质粒上有Spe Ⅰ的酶切位点，且Hind Ⅲ在目的基因内部有唯一识别位点（距a链5'端300bp处），而质粒骨架无该酶切位点。重组质粒大小为5000-100+400=53000，正向连接时，Hind Ⅲ切割产生两个片段：片段1=5000bp，片段2=300bp；反向连接时，切割产物为100bp和5200bp，与正向连接可明确区分。电泳结果示意图为。 10.（2026·安徽宿州·质量检测）研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将绿色荧光蛋白（GFP）基因与Gata3基因融合，如图甲所示，构建基因表达载体后转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，每个受精卵仅导入一个目的基因，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。荧光蛋白成像系统显示这两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。回答下列问题： （1）为获取GFP基因，可以从　　　　　　中查询基因GFP的编码序列，设计特定引物进行PCR扩增获取，其引物的作用是　　　　　　。 （2）据图甲分析，Gata3-GFP基因翻译时，先合成的蛋白质为　　　　　　，因此构建融合基因时，应将　　　　　　基因中编码　　　　　　的序列删除。 （3）科研人员将培育出的上述两只杂合小鼠进行交配来获得Gata3—GFP基因纯合的小鼠。为了鉴定交配获得的5只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。图中个体　　　　　　（填数字）是Gata3—GFP基因纯合的小鼠。若用引物1和3进行PCR扩增，　　　　　　（填“能”或“不能”）区分GFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是　　　　　　。 （4）相较于传统的物质提取、体外测量方式，对转基因小鼠用荧光蛋白成像系统测量荧光蛋白的优点是　　　　　　。 【答案】（1）① 基因文库    ② 使DNA聚合酶（Taq 酶）能够从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸（或定位目的基因的扩增区域，提供DNA复制的起始位点）     （2）① Gata3    ② Gata3    ③ 终止密码子     （3）① 1、5    ② 不能    ③ 杂合子还是纯合子都含有Gata3-GFP融合基因，用引物1和3扩增均能获PCR产物     （4）无需提取组织或细胞，可在活体状态下实时观察；能在细胞、组织甚至个体水平上动态监测蛋白表达与定位；对细胞或个体无损伤等      【分析】 1、基因工程的基本程序： （1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增、人工化学合成； （2）基因表达载体的构建（核心步骤） ：组成为目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞： 植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；动物：显微注射法；微生物：Ca²⁺处理法（感受态细胞） （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平：DNA 分子杂交、核酸分子杂交、抗原-抗体杂交；个体水平：抗虫、抗病、性状表达鉴定。 2、PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 (1)小问详解： 为获取GFP基因，可从基因文库中查询基因GFP的编码序列，设计特定引物进行PCR扩增获取。在PCR技术里，引物的作用是使DNA聚合酶（Taq 酶）能够从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸（或定位目的基因的扩增区域，提供DNA复制的起始位点），从而特异性地扩增目的基因。 (2)小问详解： Gata3-GFP基因翻译时，先合成的蛋白质为Gata3蛋白（因为Gata3编码区在GFP编码区的上游，翻译时先读取Gata3编码区），为确保Gata3与GFP连续翻译形成融合蛋白，应删除Gata3基因 中编码终止密码子的序列，使翻译可继续延伸至GFP编码区。 (3)小问详解： 由题意可知，引物1位于Gata3基因编码区（插入前）的下游，插入后仍可结合。引物2位于GFP基因的非编码区，仅在插入GFP基因后才能扩增出片段。因此引物1+2只能扩增出“大片段”(含GFP基因)或“小片段”(未插入GFP基因)。根据题意，两只亲本均为杂合子(+/-)，子代基因型可能为：纯合子(+/+)为两条染色体均含Gata3-GFP融合基因，电泳显示一条带(大片段)。杂合子(+/-)为一条染色体含Gata3-GFP，另一条不含，电泳显示两条带(大片段+小片段)；隐性纯合子(-/-):两条染色体均不含Gata3-GFP，电泳仅显示小片段。根据图乙可以看出，个体1和5只含大片段，为Gata3—GFP基因纯合的小鼠。若用引物1和3进行PCR扩增，不能区分GFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是引物1和引物3均位于Gata3-GFP融合基因内部，无论杂合子还是纯合子都含有Gata3-GFP融合基因，用引物1和3扩增均能获得PCR产物，无法通过电泳条带区分。 (4)小问详解： 相较于传统的物质提取、体外测量方式，对转基因小鼠用荧光蛋白成像系统测量荧光蛋白的优点是：无需提取组织或细胞，可在活体状态下实时观察；能在细胞、组织甚至个体水平上动态监测蛋白表达与定位；对细胞或个体无损伤等。 11.（2026·安徽鞍山·一模）我国科研人员将兔毛角蛋白基因导入到棉花细胞中培育成新型品种“兔毛棉花”。它标志着纺织品已由天然纤维时代、化学纤维时代进入转基因时代。兔毛角蛋白基因片段和质粒的酶切位点如图所示。回答下列问题。 （1）可从兔毛囊细胞中提取总RNA，通过　　　　　　合成cDNA，以此为模板设计特异性引物，通过PCR扩增得到兔毛角蛋白基因的完整编码区序列。 （2）为了使兔毛角蛋白基因能够正确地插入质粒中，PCR获取兔毛角蛋白基因时，需在引物a和引物b的　　　　　　端分别添加酶切位点　　　　　　　和　　　　　　　的识别序列。扩增缓冲液中Mg2+的作用是　　　　　　。PCR的产物一般通过　　　　　　　来鉴定。 （3）采用农杆菌转化法将兔毛角蛋白基因导入棉花细胞中，其中Ti质粒所含T-DNA的作用是　　　　　　　。 （4）检测转基因棉花是否成功表达出兔毛角蛋白常用方法的原理是　　　　　　　。 【答案】（1）逆转录（反转录）     （2）① 5'端    ② EcoRI    ③ HindIII    ④ 激活 DNA 聚合酶的活性    ⑤ 琼脂糖凝胶电泳     （3）携带目的基因（兔毛角蛋白基因）整合到棉花细胞的染色体 DNA 上     （4）抗原 - 抗体特异性结合      【分析】 基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4) 目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 从兔毛囊细胞中提取总 RNA 后，通过逆转录（反转录）合成 cDNA，以此为模板设计特异性引物，通过 PCR 扩增得到兔毛角蛋白基因的完整编码区序列。 (2)小问详解： 质粒上启动子和终止子之间有 Hind III、Xba I、EcoR I 位点。为了使目的基因正确插入并表达，应选择能将目的基因定向插入启动子和终止子之间的酶。根据转录方向和质粒图谱，Xba I有两个酶切位点不合适，则选择 Hind III 和 EcoR I 可保证目的基因的正确方向。 由于转录方向是由右向左，根据质粒中启动子的位置，则引物b的5'端添加HindIII酶切位点，引物a的5'端添加EcoRI酶切位点，扩增缓冲液中 Mg²⁺的作用是：作为DNA 聚合酶的辅因子，激活 DNA 聚合酶的活性，同时稳定引物与模板的结合。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 (3)小问详解： 采用农杆菌转化法将兔毛角蛋白基因导入棉花细胞中，其中 Ti 质粒所含 T-DNA 的作用是：携带目的基因（兔毛角蛋白基因）整合到棉花细胞的染色体 DNA 上，使目的基因能够稳定遗传给子代细胞。 (4)小问详解： 检测转基因棉花是否成功表达出兔毛角蛋白常用方法的原理是：抗原 - 抗体特异性结合（即利用兔毛角蛋白作为抗原，制备特异性抗体，通过检测抗体与棉花提取物中蛋白质的结合情况，判断是否表达出目标蛋白）。 12.（2026·安徽滁州·一模）基因工程的基本操作程序中，基因表达载体的构建是核心工作。回答下列问题。 （1）图1为某基因工程构建重组质粒的过程示意图，甲、乙、丙为三条引物，图中的目的基因插入方向正确。为鉴定选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR扩增，PCR扩增时应选择的一对引物是　　　　　　。若目的基因反向插入，则PCR扩增时应选择的另外一对引物是　　　　　　　　。两种情况下扩增出的DNA片段长度不同，常通过　　　　　　　进行鉴定。 （2）研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株，从中克隆得到了一种纤维素酶基因N。将获得的基因N与高效表达载体（HT质粒）连接，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。如图2所示，基因N无限制酶切点，a链为转录模板链，为保证基因N与HT质粒正确连接，PCR扩增基因N时，需在引物1和引物2的5′端分别引入　　　　　　和　　　　　　　限制酶识别序列。筛选过程中，能在含有氨苄青霉素的培养基上生长的　　　　　　　　（填“是”“不一定是”或“一定不是”）含重组载体的工程菌，理由是　　　　　　　。 （3）启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子，其中组成型启动子能够持续启动目的基因在植物多种组织中表达。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体，再利用农杆菌转化法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种。为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株，利用自来水和20%PEG（聚乙二醇，模拟干旱条件）处理8h，检测发现20%PEG条件下转基因植株的AmDHN基因表达水平高，说明Rd29A启动子是　　　　　　　型启动子。 【答案】（1）① 丙+乙    ② 甲+乙    ③ 电泳     （2）① KpnI    ② MfeI    ③ 不一定是    ④ 仅含普通载体的工程菌也能生长     （3）诱导      【分析】 基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 (1)小问详解： 要鉴定选出的菌落中是否有正确插入目的基因的重组质粒，当目的基因正向插入时，PCR扩增应选择引物丙和乙；若目的基因反向插入，PCR扩增应选择引物甲和乙。两种情况下扩增出的DNA片段长度不同，通常通过电泳进行鉴定。因为引物丙和乙、引物甲和乙分别能与不同插入方向的目的基因及载体部分结合进行扩增，而电泳可根据DNA片段长度不同进行分离鉴定。 (2)小问详解： 为保证基因N与HT质粒正确连接，PCR扩增基因N时，需在引物1和引物2的5′端分别引入KpnI和MfeI限制酶识别序列。筛选过程中，能在含氨苄青霉素的培养基上生长的不一定是含重组载体的工程菌，因为普通的HT质粒（不含目的基因）上也有氨苄青霉素抗性基因，含有普通HT质粒的工程菌也能在该培养基上生长。 (3)小问详解： 因为在20%PEG（模拟干旱条件）下转基因植株的AmDHN基因表达水平高，说明该启动子受干旱条件诱导才启动基因表达，所以Rd29A启动子是诱导型启动子。 13.（2026·安徽芜湖·一模）土壤中的污染物环三亚甲基三硝胺（RDX）具有高毒性和不易降解的特点。XplA与XplB是存在于细菌中的两种RDX降解酶基因，研究人员拟将XplA与XplB整合为融合基因导入柳枝稷草，使其根细胞分泌RDX降解酶以修复污染土壤。据图回答下列问题： （1）研究人员通过检索　　　　　　　获取了XplA与XplB的基因序列。通过PCR技术使XplB基因的末端与XplA基因的首端正确连接，应选择的两种引物分别是　　　　　　　，且在它们的　　　　　　　端插入一段互补的核苷酸序列。 （2）为初步检验融合基因是否成功导入T-DNA，可采用　　　　　　　技术对以重组质粒为模板的PCR产物进行分析鉴定。 （3）将成功构建的重组质粒导入经过处理的农杆菌，筛选出成功转化的农杆菌，让其侵染柳枝稷草的外植体，其目的是　　　　　　　。 （4）若经过上述正确操作后获得的转基因柳枝稷草仍未能降解土壤中的RDX，其可能的原因是　　　　　　　。（写出一点即可） 【答案】（1）① 基因数据库（或“序列数据库”、“基因文库”）    ② 引物2和引物4    ③ 5'     （2）琼脂糖凝胶电泳     （3）利用农杆菌的T-DNA将融合基因整合到柳枝稷细胞的染色体DNA上     （4）转录水平问题：外源基因的启动子可能在植物根细胞中活性很低，导致融合基因无法有效转录。翻译或修饰问题：原核细菌的基因在真核植物细胞中表达，其mRNA可能无法被正确翻译，或翻译出的蛋白质空间结构不正确、缺乏必要的翻译后修饰，导致酶无活性      【分析】 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 (1)小问详解： ①现代生物学研究中，获取已知基因序列的主要途径是检索基因数据库（或序列数据库、基因文库），这些数据库存储了大量已测序的基因信息。 ②要使XplB基因的末端与XplA基因的首端连接，需要让XplB的3'端和XplA的5'端能通过引物互补拼接。图中引物2结合在XplB的b链的3'端，能扩增出XplB的末端；引物4结合在XplA的b链（模板链）的3'端，能扩增出XplA的首端。选择这两种引物，可使两个基因的末端和首端靠近并连接。 ③PCR引物的延伸是从3'端开始的，因此互补的核苷酸序列需要插入在引物的5'端，这样在延伸时才能让两个基因的片段互补配对，实现拼接。 (2)小问详解： PCR扩增产物是DNA片段，要初步检验融合基因是否成功导入T-DNA，可采用琼脂糖凝胶电泳技术。该技术能根据DNA片段的大小和带电性，将不同片段分离，通过观察电泳条带的位置和数量，判断PCR产物是否包含预期的融合基因片段。 (3)小问详解： 农杆菌转化法是植物转基因的常用方法，其原理是农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。将构建好的重组质粒导入农杆菌，再让农杆菌侵染柳枝稷草的外植体，目的就是利用农杆菌的这一特性，将融合基因整合到柳枝稷细胞的染色体DNA上，使融合基因能在植物细胞中稳定遗传和表达。 (4)小问详解： 若转基因柳枝稷草仍不能降解RDX，可能的原因有： 转录水平问题：外源基因的启动子可能在植物根细胞中活性很低，导致融合基因无法有效转录。翻译或修饰问题：原核细菌的基因在真核植物细胞中表达，其mRNA可能无法被正确翻译，或翻译出的蛋白质空间结构不正确、缺乏必要的翻译后修饰，导致酶无活性。 14.（2026·安徽·一模）为培育富含花青素的紫色番茄，科研人员拟将金鱼草中调控花青素合成的关键转录因子基因（Del）转入番茄。选用的植物表达载体及Del基因的结构如下，请回答下列问题： （1）科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列的原因是　　　　　　（答出两点即可）。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物为：5-　　　　　　ATGGCT-3。（请填写6个碱基序列） （2）将重组质粒导入农杆菌，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加　　　　　　。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的　　　　　　区域。 （3）科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是　　　　　　。 【答案】（1）① 保证酶切后与质粒正确连接，同时可避免目的基因和质粒自连    ② GGATCC     （2）① 潮霉素    ② T-DNA     （3）在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子      【分析】 1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 (1)小问详解： 科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列，这样才能保证目的基因被酶切后获得与质粒切割后相同的黏性末端，保证目的基因和质粒正确连接，同时也能避免目的基因自连。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物需要连接BamHⅠ的识别序列，为：5-GGATCCATGGCT-3。 (2)小问详解： 重组质粒中含有潮霉素抗性基因，在将重组质粒导入农杆菌时，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加潮霉素。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的T-DNA，因此需要将目的基因植入其中。 (3)小问详解： 科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子，这样可以实现目的基因只在果实细胞中表达。 15.（2026·质检）黑麂是中国特有的珍稀鹿科动物，其D基因家族（含多个等位基因形式）编码的产物在诱发免疫应答中起重要作用，D基因的多样性被认为是评估群体免疫力高低的一个重要指标，研究人员对黑麂不同个体的D基因进行了相关研究。 （1）用于提取黑麂基因组DNA的样品有黑麂的新鲜血液及多年前的黑麂皮张，对提取的基因组DNA进行凝胶电泳，结果如图1，其中7号、8号泳道加样的是来自血液和皮张样品的基因组DNA，据图1电泳结果判断，最可能来自血液样品的是　　　　　号，判断的理由是：　　　　　。 （2）首次扩增黑麂D基因时，研究人员先从GenBank下载了牛的D基因序列，再根据这些序列设计引物对黑麂的基因组DNA进行扩增，此方法具有可行性的理论依据是：　　　　　。对扩增得到的DNA片段，除了凝胶电泳显示的长度要符合预期外，还需要进行　　　　　，才能最终确定该扩增产物是黑麂D基因。 （3）研究人员将黑麂D基因转入受体细胞以便进一步研究。图2为基因表达载体及其上的酶切位点，图3为D基因相关信息。回答下列问题。 ①已知D基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现，在紧邻起始密码子AUG之前加入序列GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术扩增D基因时，为保证D基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物　　　　　（填“P2”或“P3”），并在该引物5'端增加碱基序列　　　　　。 ②综合图2、图3，应选用四种限制酶中的　　　　　切割载体，用　　　　　切割①中通过PCR获得的D基因。 【答案】（1）① 8    ② 新鲜的血液含DNA多，电泳条带亮且宽     （2）① 亲缘关系近的物种，其相同基因的DNA序列较为接近    ② 测序和比对     （3）① P2    ② GAATTCGCCACC    ③ MunⅠ、SalⅠ    ④ XhoⅠ、EcoRⅠ      【分析】 本题图1电泳显示：新鲜血液样品（如8号）DNA完整性高，条带清晰集中；皮张样品（如7号）DNA降解，条带弥散模糊，可评估样品DNA质量。图2为基因表达载体，含启动子、终止子与多酶切位点，用于目的基因表达。图3标注D基因编码区与引物结合位点，为PCR扩增与酶切提供序列依据，三者共同服务于黑麂D基因的提取、扩增与功能研究。 (1)小问详解： 新鲜的血液含完整的DNA多，而且DNA一般都没有降解，长度长，因此提取后电泳条带亮且宽，靠前，而黑麂皮张由于时间久远，DNA多发生不同程度的降解，因此电泳时呈现的条带暗且较为靠后或较为分散。因此8号最可能是来自血液的样品。 (2)小问详解： 亲缘关系近的物种，其相同基因的DNA序列较为接近，这样可以根据这些序列来设计引物。扩增得到的序列，还需要测序，并和已知的亲缘关系近的物种的D基因序列进行比对才能最终确认其是D基因。 (3)小问详解： ①首先需要观察酶切序列，XhoⅠ和SalⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ都是同尾酶，虽然是属于不同的切点，但是切断后，相互之间可以连接，将无法保证方向性。由于D基因上游在右边（图示），所以右边要接到载体的启动子后面，又需要保证接入的方向（即需要双酶切，且不能是具有同尾序列的两种酶），最后还需要在启动子之前加入序列GCCACC，所以综合考虑，选择P2引物（如果选择P3，则无法保证在启动子前面加GCCACC序列），并在其5′选择加入EcoRⅠ的酶切序列，故在该引物5'端增加碱基序列GAATTCGCCACC 。 ②综合图2、图3，应选用MunⅠ、SalⅠ两种酶切割载体（载体上标记基因中有EcoRⅠ切点，故载体不能选用EcoRⅠ），用XhoⅠ、EcoRⅠ两种酶切割①中通过PCR获得的D基因。 16.（2026·安徽巢湖·一模）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D导入该病患者的细胞，以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙为重组载体的示意图。Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物Xgal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题： （1）科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是　　　　　　。图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒　　　　　　（填字母），与另外两种质粒相比，其优点是　　　　　　。 （2）获取目的基因D时应选择乙图中　　　　　　限制酶对其所在的DNA进行切割。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，可根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用　　　　　　　技术扩增目的基因。 （3）将目的基因D和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，使用　　　　　　限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为　　　　　　Kb的两条带，则为正向连接的重组质粒。 （4）利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是　　　　　　。 【答案】（1）① 显微注射法    ② B    ③ 有标记基因，复制原点不会被限制酶切割     （2）① PvuI    ② PCR     （3）① EcoRI    ② 1.2kb和5.5kb     （4）在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞      【分析】 分析题图可知，目的基因只能用PvuⅠ进行切割，质粒A上有复制原点以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制酶限制酶切位点，无标记基因，不能进行目的基因的检测；质粒B含有EcoRⅠ、PvuⅠ两种酶切位点、氨苄青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性；质粒C中含有氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因以及EcoRⅠ、PvuⅠ两种限制酶限制酶切位点，但是PvuⅠ的酶切位点位于复制原点，目的基因插入会导致重组质粒不能进行复制。 (1)小问详解： 科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是显微注射法，基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建。图甲中三种质粒适宜作为运载体的是质粒B，因为质粒B含有EcoRⅠ、PvuⅠ两种酶切位点、氨苄青霉素抗性基因和蓝色显色基因，而且相应的限制酶切割后，可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性。与另外两种质粒相比，其作为载体的优点是有标记基因，复制原点不会被限制酶切割。 (2)小问详解： 获取目的基因D时应选择乙图中的PvuI对其所在的DNA进行切割，因为目的基因两端存在酶切位点。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用PCR扩增目的基因。 (3)小问详解： 由于EcoRI在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRI对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒B中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2Kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切点之间的距离是0.2+1=1.2Kb，重组质粒长度为：2.7+4=6.7Kb，故EcoRⅠ酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2kb和5.5kb两条带。 (4)小问详解： 要筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。 17.（2026·安徽合肥·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。     相应基因合成的肽链的氨基酸序列为Oshipll               MANSKSLLLCWCSLLLL……*73     a                  MANSKSLLLLLVLAPPP……*64     b                    MANSKSLLL*9     c                    MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA （1）该复合物与基因工程基本操作工具中　　　　　　酶作用相似，作用的化学键为　　　　　　。 （2）若分析基因a、b、c的突变位点，应设计　　　　　　　　　　　　，扩增相应基因，然后测序，并利用　　　　　　　　　　　　分析比较得出突变位点。 （3）该复合物所含的向导RNA的序列为5´-　　　　　　...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为　　　　　　　　　　　　　　　　　　；出现图2结果的作用机制可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。     【答案】（1）① 限制酶    ② 磷酸二酯键     （2）① 特异性引物    ② 序列比对工具（BLAST）     （3）① GCAGAG    ② 基因b的基因编辑位点增加了一个碱基，使终止密码子提前出现，翻译出多肽链变短     （4）① 提高了发芽率，缩短了发芽时间    ② Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发      【分析】 限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 (1)小问详解： 由题意可知，CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，会切割互补序列某位点，与基因工程中限制酶作用相似，作用的化学键为磷酸二酯键。 (2)小问详解： PCR技术可以特异性地扩增目的基因。若分析基因a、b、c的突变位点，应设计特异性引物，扩增相应基因，然后测序，并利用序列比对工具（如BLAST）等分析比较得出突变位点。 (3)小问详解： CRISPR/Cas9复合体含有的向导RNA定位目标序列的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），与该位点5´端相连的序列互补配对，故向导RNA的序列为5´-GCAGAG-3´，对比Oshipll和突变基因b的序列可知，基因b的基因编辑位点增加了一个碱基A，使终止密码子提前出现，导致翻译提前终止，翻译出多肽链变短。 (4)小问详解： 由图1可知，携带基因Oshipll水稻的发芽率高于携带突变基因a、b、c的水稻。由图2可知，在3种ABA浓度下，携带基因Oshipll水稻的发芽指数高于携带突变基因a、b的水稻，即种子萌发速度快。综上所述，基因Oshipll对于水稻萌发的作用为提高水稻种子的发芽率和发芽速率，缩短了发芽时间。图2中，携带突变基因a、b的水稻随着ABA浓度升高，发芽指数下降程度大于携带基因Oshipll水稻，可能是由于基因Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发。 18.（2026·安徽芜湖·二模）非洲猪瘟病毒特异性蛋白A具有良好的抗原性。为制备蛋白疫苗，可利用基因工程技术实现蛋白A的大规模生产。 （1）获取基因A：通常采用PCR技术进行扩增，前提是要有一段已知的基因A核苷酸序列，原因是　　　　　。随着PCR反应进行，在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸组分中，分子数量明显减少的是　　　　　。 （2）构建基因A表达载体：用质粒和基因A构建重组质粒时，应选择限制酶　　　　　对质粒进行处理，选择限制酶　　　　　对含基因A的DNA片段进行处理。（用图中限制酶作答） （3）利用蛋白A可制备单克隆抗体。给小鼠注射蛋白A的目的是　　　　　；对杂交瘤细胞进行　　　　　，多次筛选获得能分泌蛋白A抗体的细胞。 【答案】（1）① PCR需要引物，引物需根据目的基因的核苷酸序列设计    ② 引物和脱氧核苷酸     （2）① BamHⅠ、MfeⅠ    ② BamHⅠ、EcoRⅠ     （3）① 诱导产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞    ② 克隆化培养和抗体检测      (1)小问详解： PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，因为PCR需要引物，引物需根据目的基因的核苷酸序列设计。在PCR反应中，引物与模板链结合后，在后续循环中不会再增加数量，而DNA聚合酶、模板DNA和脱氧核苷酸会在反应中不断参与合成新的DNA链，所以分子数量明显减少的是引物和脱氧核苷酸。 (2)小问详解： 构建基因表达载体时，为了使目的基因与载体正确连接且不破坏载体的关键结构（如启动子等），应选择合适的限制酶。一般采用双酶切，可以防止目的基因和质粒自身环化，避免目的基因反向连接，保证目的基因正向连接，由图可知，应选择限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ对含基因A的DNA片段进行处理，但是在切割质粒时，EcoRⅠ会破坏复制原点，根据三种限制酶识别序列和切割位点，EcoRⅠ和MfeⅠ会产生相同的黏性末端，故使用BamHⅠ、MfeⅠ对质粒进行处理，，这样可以保证目的基因和质粒有相同的黏性末端，便于连接。 (3)小问详解： 给小鼠注射蛋白A，是因为蛋白A作为抗原，能刺激小鼠的免疫系统诱导产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞。对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，通过多次筛选，就能获得能分泌蛋白A抗体的细胞。 19.（2026·安徽滁州·二模）基因工程在工业、农业、医学等方面均有广泛应用。请分析相关应用并回答下列问题。 （1）基因工程的操作步骤中，最核心步骤是　　　　　　　　　　。 （2）工业上生产可降解塑料——聚乳酸时可利用D-乳酸，D-乳酸是丙酮酸经DH酶催化产生的，酵母菌本身不含此酶，导入DH基因后能产生DH酶。培养改造的酵母菌进行发酵，随时间延长，D-乳酸相对产量逐渐下降，据推测，D-乳酸可能被酵母菌细胞中原有的其他代谢途径所消耗。为获得更多的D-乳酸，可以利用基因工程的方法对酵母菌自身的消耗D-乳酸相关酶基因进行　　　　　　　　　　　　　　。 （3）农业上培育抗除草剂作物时，欲将抗除草剂基因X插入Ti质粒，可选用图1中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择酶SmaⅠ和酶N（XbaⅠ或PstⅠ）对Ti质粒进行完全酶切，并用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平。请在图2的末端竖线处填写相应碱基，然后判断：酶N是　　　　　　（填“XbaⅠ”或“PstⅠ”）。 （4）医学研究发现，C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”工程菌以实现癌症的精准治疗。科研人员制备了工程菌1，其中含有图3所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，升温至42℃，　　　　　　　　　　　　　　　　　　，从而发挥抗肿瘤作用。工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图4所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整：Ⅰ-　　　　，Ⅱ-　　　　　，Ⅲ-　　　　　　，Ⅳ-　　　　　，Ⅴ-③。（选填序号） ①Pl启动子   ②P3启动子（持续表达型启动子）   ③T基因   ④C基因   ⑤B基因 【答案】（1）构建基因表达载体     （2）敲除/编辑/突变     （3）①5'-CTGCA-3'（Pst I 末端）、3'-G-5'②3'-AGATC-5'（Xba I末端）、5'-T-3'。 ③Xba I     （4）① T蛋白（二聚体）对P1启动子的抑制解除，启动（促进）C基因的表达    ② ②    ③ ④    ④ ①    ⑤ ⑤      (1)小问详解： 基因工程的操作步骤为：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。其中构建基因表达载体是最核心步骤，该过程可使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传给下一代，并能表达和发挥作用。 (2)小问详解： 酵母菌自身无D-乳酸酶，导入后D-乳酸仍因被代谢而产量下降，说明酵母菌细胞内存在消耗D-乳酸的代谢途径。为获得更多D-乳酸，需敲除 / 编辑/突变消耗D-乳酸的相关酶基因，阻断该代谢途径，减少D-乳酸的消耗。 (3)小问详解： Xba I识别序列：5'-TCTAGA-3'，切割后产生黏性末端 3'-AGATC-5'、5'-T-3'：GATC Pst I识别序列：5'-CTGCAG-3'，切割后产生黏性末端5'-CTGCA-3'、3'-G-5' ，如图所示（左边为Xba I酶切的末端，右边为Pst I酶切的末端： 抗除草剂基因 X两端均含Sma I酶切位点，用 SmaI完全酶切后，两端均为平末端； 质粒处理方式：用 SmaI + 酶N（Xba I 或 Pst I）双酶切，再用DNA聚合酶将黏性末端补平，使质粒两端也变为平末端，才能与目的基因连接。 根据Xba I 和 Pst I酶切后产生的粘性末端分析，只有Xba I 酶切后产生的粘性末端可以利用DNA聚合酶进行补平，原因是3'-AGATC5'做模板，可以按照碱基互补配对原则补平另外一条链，而Pst I酶切后产生的粘性末端，缺少模板，无法在DNA聚合酶的作用下进行补平，因此酶N是Xba I。 (4)小问详解： 图4可知，37℃下T蛋白二聚体可以抑制P1启动子，从而抑制C基因表达；37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，升温至42℃，T蛋白（二聚体）对P1启动子的抑制解除，启动（促进）C基因的表达，从而发挥抗肿瘤作用。工程菌2需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗,即通过一次刺激启动持续表达。B酶的作用：B酶可识别位点a和 b，使中间DNA片段倒转。倒转后,启动子方向需与转录方向一致。载体设计逻辑：P2启动子之后连接T基因； a、b之间应为持续表达型启动子,即 P3启动子,其后应连接的是C基因；中间应为P1启动子和B基因，超声波刺激升温后，Pl启动子的抑制解除，启动B基因转录，表达的B酶使a、b之间 DNA片段逆转，进而启动C基因的持续表达。 20.（2026·安徽滁州·二模）病毒感染机体后，机体会产生抗体阻止其入侵细胞，当病毒侵入细胞后，就要靠T细胞参与病毒的清除。图1是细胞毒性T细胞活化机制示意图。回答下列问题。 （1）细胞毒性T细胞的活化既需要识别树突状细胞等抗原呈递细胞（APC）呈递的抗原信息，获得激活信号，还需要同一APC提供的共刺激信号（如APC表面的B7）与细胞毒性T细胞上的CD28结合。在细胞因子的进一步作用下，细胞毒性T细胞完成增殖分化。抗原呈递细胞除了树突状细胞，还有　　　　　　　　　　　　　。活化的细胞毒性T细胞的作用是　　　　　　　　　　　　　。 （2）调节性T细胞在调节免疫系统功能方面发挥非常重要的作用，其核心功能是防止免疫反应过度活跃，维持免疫稳态，其调节机制如图2所示。由图可知，调节性T细胞除产生并释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子直接起作用外，还可以合成更多的IL-2受体，与活化T细胞竞争结合IL-2，从而导致活化T细胞的　　　　　　　　　　　　。同时调节性T细胞还可以合成　　　　　　，竞争性结合B7分子，从而抑制T细胞的激活，同时削弱APC的抗原呈递功能。 （3）研究表明，FOXP3基因表达的FOXP3蛋白是调控初始T细胞分化为调节性T细胞的核心转录因子。FOXP3蛋白可以作为筛选调节性T细胞的标志物，其根本原因是　　　　　　　　　　　　　。综合上述信息，利用现代生物技术与工程，提出一种验证FOXP3基因功能的思路：　　　　　　　　　　　（具体操作不作要求）。 【答案】（1）① 巨噬细胞、B细胞    ② 识别、裂解被（同样）病原体感染的靶细胞     （2）① 增殖受抑制和凋亡（存活率和增殖能力下降）    ② CTLA-4     （3）① FOXP3基因只在调节性T细胞中表达    ② 利用基因工程技术对正常初始T细胞的FOXP3基因进行敲除或突变，检测其是否能分化成调节性T细胞      (1)小问详解： 抗原呈递细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞；活化的细胞毒性T细胞的功能是特异性识别被抗原入侵的宿主细胞（靶细胞），并使靶细胞裂解死亡，从而释放胞内抗原。 (2)小问详解： 根据题干注释，IL-2可促进T细胞的存活和增殖，调节性T细胞与活化T细胞竞争IL-2后，活化T细胞可利用的IL-2不足，因此导致活化T细胞增殖受抑制和凋亡；结合图2可知，调节性T细胞合成的CTLA-4可竞争性结合APC表面的B7，阻断T细胞的共刺激信号，从而抑制T细胞活化。 (3)小问详解： 细胞分化的实质是基因选择性表达，FOXP3蛋白可以作为筛选调节性T细胞的标志物，根本原因是FOXP3基因仅在调节性T细胞中特异性表达，因此其可作为筛选标志物；验证FOXP3基因功能，可利用基因工程技术对正常初始T细胞的FOXP3基因进行敲除或突变，检测其是否能分化成调节性T细胞。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 3年真题1年模拟 考点分类 安徽考情 命题规律 考点01 基因工程的基本工具 2024安徽（1题） · 情境设置：依托教材基础实验"DNA粗提取与鉴定"设置辨析情境。 · 考查重点：限制酶、DNA连接酶功能及DNA理化性质（溶解度、鉴定原理）。 · 命题趋势：单独命题频次降低，多渗透于完整基因工程流程中考查，注重实验原理与操作细节辨析。 考点02 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2025安徽（2题）、2024安徽（1题） · 情境设置：以农业育种（水稻抗稻瘟病）和微生物筛选为真实情境，融合基因工程与微生物培养技术。 · 考查重点：PCR引物设计、扩增条件优化、产物鉴定及与遗传育种综合应用。 · 命题趋势：趋向多技术整合考查，强调PCR在实际问题解决中的工具性作用，安徽卷连续两年聚焦该考点。 考点1 基因工程的基本工具 1.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（       ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.（2025·安徽·高考真题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（       ） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 2.（2024·安徽·高考真题）甲是具有许多优良性状的纯合品种水稻，但不抗稻瘟病(rr)，乙品种水稻抗稻瘟病(RR)。育种工作者欲将甲培育成抗稻瘟病并保留自身优良性状的纯合新品种，设计了下列育种方案，合理的是（       ） ①将甲与乙杂交，再自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 ②将甲与乙杂交，F1与甲回交，选F2中的抗稻瘟病植株与甲再次回交，依次重复多代；再将选取的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 ③将甲与乙杂交，取F1的花药离体培养获得单倍体，再诱导染色体数目加倍为二倍体，从中选取抗稻瘟病植株 ④向甲转入抗稻瘟病基因，筛选转入成功的抗稻瘟病植株自交多代，每代均选取抗稻瘟病植株 A. ①② B. ①③ C. ②④ D. ③④ 3.（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用　　　　　　　　（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是　　　　　　　　。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的　　　　　　　　。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落　　　　　　　　（填序号），出现菌落④的可能原因是　　　　　　　　。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路　　　　　　　　。 4.（2026·安徽·高考真题）肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 （1）培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液　　　　　　异常；乳腺癌细胞培养时　　　　　　（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是　　　　　　。 （2）P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为　　　　　　（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是　　　　　　。 （3）S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因　　　　　　S基因的转录，　　　　　　（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 1.（2026·安徽铜陵·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A. 生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B. 从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C. 氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D. 该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 2.（2026·安徽宿州·质量检测）大肠杆菌具有繁殖迅速、培养简单、遗传稳定等特点，是基因工程研究中的重要生物。图1是大肠杆菌基因表达过程，图2是图1中部分结构的放大，下列相关叙述正确的是（　　） A. RNA聚合酶沿模板链的5’→3’方向移动 B. 图1中mRNA的5’端最先从模板链中脱离 C. 图2中mRNA的左侧为5’端右侧为3’端 D. 图2中的tRNA②正处于核糖体的位点1 3.（2026·安徽滁州·一模）实验过程中的变化因素称为变量，变量有自变量、因变量和无关变量之分。下列关于课本中的实验，叙述正确的是（　　） A. 比较过氧化氢在不同条件下分解的探究实验，自变量为催化剂的种类 B. 探究土壤微生物对落叶的分解作用实验，60℃处理土壤1h组为实验组 C. 探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用实验，需选用碘液对因变量进行检测 D. 探究酵母菌细胞呼吸的方式实验，两组培养液中的溶氧量是无关变量 4.（2026·安徽芜湖·一模）下图为检测残留在生物组织或环境中四环素水平的大肠杆菌工程菌的作用原理，当四环素存在时，大肠杆菌可以发出绿色荧光。下列叙述错误的是（       ） 注：图中“+”表示促进，“-”表示抑制 A. 图中?处应为“-”，四环素直接解除对启动子2的抑制，使大肠杆菌发光 B. DNA的双螺旋结构是外源基因整合到大肠杆菌DNA上的结构基础 C. 大肠杆菌出现绿色荧光性状受到T基因和绿色荧光基因的共同影响 D. 启动子是基因上游的一段特殊的DNA序列，与RNA聚合酶发生特异性结合 5.（2026·安徽皖北协作区·一模）水杨酸是一种常见的水体污染物。科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器（如图1所示），为环境污染治理提供新方法。水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因（图2），则工程菌可同时实现对水杨酸的动态监测和清除。下列相关说法错误的是（　　） A. 启动子是mRNA上一段特殊的序列，是转录的起始位点 B. 当环境中存在水杨酸时，水杨酸—调控蛋白激活Ps，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度 C. 可在基因前插入水杨酸诱导型强启动子，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度增强为原来的2倍，从而提高传感器的灵敏度 D. 欲通过PCR判断融合基因是否准确连接，应选择图2中的引物组合1和3 6.（2026·安徽巢湖·一模）HIV病毒是一种致病性强的逆转录病毒，其遗传物质是单链RNA。科学家利用基因编辑技术CRISPR-Cas9，精准识别并切割整合到宿主细胞基因组中的HIV病毒DNA，阻止其复制和表达。下列叙述正确的是（       ） A. HIV病毒通过DNA聚合酶将RNA转化为DNA，并整合到宿主细胞基因组中，形成潜伏感染 B. CRISPR-Cas9基因编辑技术能够精准切割宿主细胞DNA，阻止其复制和表达，可治疗艾滋病 C. 利用CRISPR-Cas9治疗艾滋病应针对患者的辅助性T细胞进行基因编辑 D. 与HIV感染者握手、拥抱、共用牙刷和剃须刀、纹眉器械不会使人感染HIV 7.（2026·安徽巢湖·一模）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（       ） A. 目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物 B. 含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因 C. 限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 D. T-DNA插入水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达 8.（2026·安徽铜陵·一模）曲酸是米曲霉的次生代谢产物，为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组技术将曲酸合成有关的kojR基因导入米曲霉g-1（pyrG基因缺陷）菌株中，获得高产的g-58菌株，部分过程如图甲所示，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG（合成尿嘧啶关键基因）均为标记基因。请回答： （1）现欲通过PCR技术构建kojR-pyrG融合基因，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是　　　　　　　　。采用SacI和SalI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　　　　　条电泳条带。 （2）将重组质粒导入农杆菌后仍需用PCR验证融合基因的有无，应选择图甲中的引物组合是　　　　　　　　；现有以下培养基成分。①碳源②氮源③无机盐④水⑤卡那霉素⑥尿嘧啶，筛选g-58菌株的培养基需要添加　　　　　　　　（填序号）。 （3）研究人员计划用甲图所示的同源重组技术敲除米曲霉g-1菌株中的基因并回补pyrG基因，来探究msn2基因对米曲霉产曲酸的影响，请根据图甲过程及原理判断图乙中A、B基因分别为　　　　　　　　基因。 （4）已知米曲霉中的LaeA基因可促进其次级代谢产物合成酶基因的转录。科研人员对摇瓶培养相同时间的g-1和g-58菌株进行相关数据检测，结果如下表， 发酵时间（d） g-1菌株（g/L） g-58菌株（g/L） 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 曲酸产量（g/L） kojR基因相对表达量 LaeA基因相对表达量 2 2 — — 3 — — 3 6.5 1 1 9.5 130 2.2 4 7.5 — — 16 — — 6 10.5 3.5 3.8 25.5 100 3.7 据表分析，kojR基因能使米曲霉产曲酸增多的原因可能是：发酵早期　　　　　　　　。 9.（2026·安徽合肥·一模）人胰岛素是由A链和B链构成的蛋白质分子，是治疗糖尿病的重要药物。科研人员设计了一个含有“B链基因-F2A序列-A链基因”的目的基因（cDNA），并将其导入大肠杆菌中，获取了能同时高效表达人胰岛素A链和B链的工程菌，以大量制备有活性的胰岛素。回答下列问题。 （1）利用大肠杆菌得到的肽链还需要在体外进行加工才能形成有活性的人胰岛素分子，其原因是　　　　　　　　　　　。 （2）采用PCR技术构建“B链基因-F2A序列-A链基因”目的基因的过程如图1.在扩增B链基因时，设计的引物2的5’端需添加　　　　　　　　序列。分别扩增完B链基因和A链基因后，进行一系列过程，最后选取　　　　　　　　（填引物种类）进行扩增，可得到完整的目的基因。 （3）科研人员选用限制酶SpeⅠ和XbaⅠ切割的质粒，构建基因表达载体后导入大肠杆菌（卡那霉素敏感型），再将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基上培养。在该培养基上生长的大肠杆菌不一定含有目的基因，理由是　　　　　　　　。 （4）为进一步筛选出含有正向连接表达载体的大肠杆菌，科研人员从部分大肠杆菌中提取重组质粒，应选择限制酶　　　　　　　　切割重组质粒，并进行电泳检测。在图3中绘出正向连接的表达载体在酶切后的电泳结果　　　　　　　　。 10.（2026·安徽宿州·质量检测）研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将绿色荧光蛋白（GFP）基因与Gata3基因融合，如图甲所示，构建基因表达载体后转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，每个受精卵仅导入一个目的基因，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。荧光蛋白成像系统显示这两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。回答下列问题： （1）为获取GFP基因，可以从　　　　　　中查询基因GFP的编码序列，设计特定引物进行PCR扩增获取，其引物的作用是　　　　　　。 （2）据图甲分析，Gata3-GFP基因翻译时，先合成的蛋白质为　　　　　　，因此构建融合基因时，应将　　　　　　基因中编码　　　　　　的序列删除。 （3）科研人员将培育出的上述两只杂合小鼠进行交配来获得Gata3—GFP基因纯合的小鼠。为了鉴定交配获得的5只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。图中个体　　　　　　（填数字）是Gata3—GFP基因纯合的小鼠。若用引物1和3进行PCR扩增，　　　　　　（填“能”或“不能”）区分GFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是　　　　　　。 （4）相较于传统的物质提取、体外测量方式，对转基因小鼠用荧光蛋白成像系统测量荧光蛋白的优点是　　　　　　。 11.（2026·安徽鞍山·一模）我国科研人员将兔毛角蛋白基因导入到棉花细胞中培育成新型品种“兔毛棉花”。它标志着纺织品已由天然纤维时代、化学纤维时代进入转基因时代。兔毛角蛋白基因片段和质粒的酶切位点如图所示。回答下列问题。 （1）可从兔毛囊细胞中提取总RNA，通过　　　　　　合成cDNA，以此为模板设计特异性引物，通过PCR扩增得到兔毛角蛋白基因的完整编码区序列。 （2）为了使兔毛角蛋白基因能够正确地插入质粒中，PCR获取兔毛角蛋白基因时，需在引物a和引物b的　　　　　　端分别添加酶切位点　　　　　　　和　　　　　　　的识别序列。扩增缓冲液中Mg2+的作用是　　　　　　。PCR的产物一般通过　　　　　　　来鉴定。 （3）采用农杆菌转化法将兔毛角蛋白基因导入棉花细胞中，其中Ti质粒所含T-DNA的作用是　　　　　　　。 （4）检测转基因棉花是否成功表达出兔毛角蛋白常用方法的原理是　　　　　　　。 12.（2026·安徽滁州·一模）基因工程的基本操作程序中，基因表达载体的构建是核心工作。回答下列问题。 （1）图1为某基因工程构建重组质粒的过程示意图，甲、乙、丙为三条引物，图中的目的基因插入方向正确。为鉴定选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR扩增，PCR扩增时应选择的一对引物是　　　　　　。若目的基因反向插入，则PCR扩增时应选择的另外一对引物是　　　　　　　　。两种情况下扩增出的DNA片段长度不同，常通过　　　　　　　进行鉴定。 （2）研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株，从中克隆得到了一种纤维素酶基因N。将获得的基因N与高效表达载体（HT质粒）连接，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。如图2所示，基因N无限制酶切点，a链为转录模板链，为保证基因N与HT质粒正确连接，PCR扩增基因N时，需在引物1和引物2的5′端分别引入　　　　　　和　　　　　　　限制酶识别序列。筛选过程中，能在含有氨苄青霉素的培养基上生长的　　　　　　　　（填“是”“不一定是”或“一定不是”）含重组载体的工程菌，理由是　　　　　　　。 （3）启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子，其中组成型启动子能够持续启动目的基因在植物多种组织中表达。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体，再利用农杆菌转化法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种。为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株，利用自来水和20%PEG（聚乙二醇，模拟干旱条件）处理8h，检测发现20%PEG条件下转基因植株的AmDHN基因表达水平高，说明Rd29A启动子是　　　　　　　型启动子。 13.（2026·安徽芜湖·一模）土壤中的污染物环三亚甲基三硝胺（RDX）具有高毒性和不易降解的特点。XplA与XplB是存在于细菌中的两种RDX降解酶基因，研究人员拟将XplA与XplB整合为融合基因导入柳枝稷草，使其根细胞分泌RDX降解酶以修复污染土壤。据图回答下列问题： （1）研究人员通过检索　　　　　　　获取了XplA与XplB的基因序列。通过PCR技术使XplB基因的末端与XplA基因的首端正确连接，应选择的两种引物分别是　　　　　　　，且在它们的　　　　　　　端插入一段互补的核苷酸序列。 （2）为初步检验融合基因是否成功导入T-DNA，可采用　　　　　　　技术对以重组质粒为模板的PCR产物进行分析鉴定。 （3）将成功构建的重组质粒导入经过处理的农杆菌，筛选出成功转化的农杆菌，让其侵染柳枝稷草的外植体，其目的是　　　　　　　。 （4）若经过上述正确操作后获得的转基因柳枝稷草仍未能降解土壤中的RDX，其可能的原因是　　　　　　　。（写出一点即可） 14.（2026·安徽·一模）为培育富含花青素的紫色番茄，科研人员拟将金鱼草中调控花青素合成的关键转录因子基因（Del）转入番茄。选用的植物表达载体及Del基因的结构如下，请回答下列问题： （1）科研人员决定用BamHⅠ和HindⅢ对Del基因和载体进行双酶切后连接，PCR扩增Del基因时，需在目的基因两端添加这两种限制酶的识别序列的原因是　　　　　　（答出两点即可）。已知Del基因转录时的模板链序列为：5-TTGGCA……AGCCAT-3。为准确连接，在扩增时，在目的基因上游引物为：5-　　　　　　ATGGCT-3。（请填写6个碱基序列） （2）将重组质粒导入农杆菌，为初步筛选含有质粒的菌落，应在培养基中添加　　　　　　。农杆菌导入番茄细胞，最终整合到番茄染色体DNA上的是载体的　　　　　　区域。 （3）科研人员使用现有载体，会使Del基因在全植株表达造成物质和能量浪费，若要使Del基因仅在番茄果实中表达，需对载体进行的改造是　　　　　　。 15.（2026·质检）黑麂是中国特有的珍稀鹿科动物，其D基因家族（含多个等位基因形式）编码的产物在诱发免疫应答中起重要作用，D基因的多样性被认为是评估群体免疫力高低的一个重要指标，研究人员对黑麂不同个体的D基因进行了相关研究。 （1）用于提取黑麂基因组DNA的样品有黑麂的新鲜血液及多年前的黑麂皮张，对提取的基因组DNA进行凝胶电泳，结果如图1，其中7号、8号泳道加样的是来自血液和皮张样品的基因组DNA，据图1电泳结果判断，最可能来自血液样品的是　　　　　号，判断的理由是：　　　　　。 （2）首次扩增黑麂D基因时，研究人员先从GenBank下载了牛的D基因序列，再根据这些序列设计引物对黑麂的基因组DNA进行扩增，此方法具有可行性的理论依据是：　　　　　。对扩增得到的DNA片段，除了凝胶电泳显示的长度要符合预期外，还需要进行　　　　　，才能最终确定该扩增产物是黑麂D基因。 （3）研究人员将黑麂D基因转入受体细胞以便进一步研究。图2为基因表达载体及其上的酶切位点，图3为D基因相关信息。回答下列问题。 ①已知D基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现，在紧邻起始密码子AUG之前加入序列GCCACC，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术扩增D基因时，为保证D基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物　　　　　（填“P2”或“P3”），并在该引物5'端增加碱基序列　　　　　。 ②综合图2、图3，应选用四种限制酶中的　　　　　切割载体，用　　　　　切割①中通过PCR获得的D基因。 16.（2026·安徽巢湖·一模）苯丙酮尿症是单基因遗传病，科学家将正常基因D导入该病患者的细胞，以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙为重组载体的示意图。Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物Xgal转化为蓝色物质，使菌落呈蓝色，EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题： （1）科学家将正常基因D导入该病患者的细胞中常用的方法是　　　　　　。图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒　　　　　　（填字母），与另外两种质粒相比，其优点是　　　　　　。 （2）获取目的基因D时应选择乙图中　　　　　　限制酶对其所在的DNA进行切割。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，可根据D基因已知核苷酸序列合成引物，利用　　　　　　　技术扩增目的基因。 （3）将目的基因D和甲图中相应质粒连接后，得到图丙中三种重组质粒。为选出正向连接的重组质粒，使用　　　　　　限制酶对重组质粒完全酶切后，进行电泳分析，若电泳图谱中出现长度为　　　　　　Kb的两条带，则为正向连接的重组质粒。 （4）利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，若要在已转化的含重组质粒、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是　　　　　　。 17.（2026·安徽合肥·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。     相应基因合成的肽链的氨基酸序列为Oshipll               MANSKSLLLCWCSLLLL……*73     a                  MANSKSLLLLLVLAPPP……*64     b                    MANSKSLLL*9     c                    MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA （1）该复合物与基因工程基本操作工具中　　　　　　酶作用相似，作用的化学键为　　　　　　。 （2）若分析基因a、b、c的突变位点，应设计　　　　　　　　　　　　，扩增相应基因，然后测序，并利用　　　　　　　　　　　　分析比较得出突变位点。 （3）该复合物所含的向导RNA的序列为5´-　　　　　　...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 （4）下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为　　　　　　　　　　　　　　　　　　；出现图2结果的作用机制可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。     18.（2026·安徽芜湖·二模）非洲猪瘟病毒特异性蛋白A具有良好的抗原性。为制备蛋白疫苗，可利用基因工程技术实现蛋白A的大规模生产。 （1）获取基因A：通常采用PCR技术进行扩增，前提是要有一段已知的基因A核苷酸序列，原因是　　　　　。随着PCR反应进行，在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸组分中，分子数量明显减少的是　　　　　。 （2）构建基因A表达载体：用质粒和基因A构建重组质粒时，应选择限制酶　　　　　对质粒进行处理，选择限制酶　　　　　对含基因A的DNA片段进行处理。（用图中限制酶作答） （3）利用蛋白A可制备单克隆抗体。给小鼠注射蛋白A的目的是　　　　　；对杂交瘤细胞进行　　　　　，多次筛选获得能分泌蛋白A抗体的细胞。 19.（2026·安徽滁州·二模）基因工程在工业、农业、医学等方面均有广泛应用。请分析相关应用并回答下列问题。 （1）基因工程的操作步骤中，最核心步骤是　　　　　　　　　　。 （2）工业上生产可降解塑料——聚乳酸时可利用D-乳酸，D-乳酸是丙酮酸经DH酶催化产生的，酵母菌本身不含此酶，导入DH基因后能产生DH酶。培养改造的酵母菌进行发酵，随时间延长，D-乳酸相对产量逐渐下降，据推测，D-乳酸可能被酵母菌细胞中原有的其他代谢途径所消耗。为获得更多的D-乳酸，可以利用基因工程的方法对酵母菌自身的消耗D-乳酸相关酶基因进行　　　　　　　　　　　　　　。 （3）农业上培育抗除草剂作物时，欲将抗除草剂基因X插入Ti质粒，可选用图1中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择酶SmaⅠ和酶N（XbaⅠ或PstⅠ）对Ti质粒进行完全酶切，并用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平。请在图2的末端竖线处填写相应碱基，然后判断：酶N是　　　　　　（填“XbaⅠ”或“PstⅠ”）。 （4）医学研究发现，C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”工程菌以实现癌症的精准治疗。科研人员制备了工程菌1，其中含有图3所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，升温至42℃，　　　　　　　　　　　　　　　　　　，从而发挥抗肿瘤作用。工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图4所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整：Ⅰ-　　　　，Ⅱ-　　　　　，Ⅲ-　　　　　　，Ⅳ-　　　　　，Ⅴ-③。（选填序号） ①Pl启动子   ②P3启动子（持续表达型启动子）   ③T基因   ④C基因   ⑤B基因 20.（2026·安徽滁州·二模）病毒感染机体后，机体会产生抗体阻止其入侵细胞，当病毒侵入细胞后，就要靠T细胞参与病毒的清除。图1是细胞毒性T细胞活化机制示意图。回答下列问题。 （1）细胞毒性T细胞的活化既需要识别树突状细胞等抗原呈递细胞（APC）呈递的抗原信息，获得激活信号，还需要同一APC提供的共刺激信号（如APC表面的B7）与细胞毒性T细胞上的CD28结合。在细胞因子的进一步作用下，细胞毒性T细胞完成增殖分化。抗原呈递细胞除了树突状细胞，还有　　　　　　　　　　　　　。活化的细胞毒性T细胞的作用是　　　　　　　　　　　　　。 （2）调节性T细胞在调节免疫系统功能方面发挥非常重要的作用，其核心功能是防止免疫反应过度活跃，维持免疫稳态，其调节机制如图2所示。由图可知，调节性T细胞除产生并释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子直接起作用外，还可以合成更多的IL-2受体，与活化T细胞竞争结合IL-2，从而导致活化T细胞的　　　　　　　　　　　　。同时调节性T细胞还可以合成　　　　　　，竞争性结合B7分子，从而抑制T细胞的激活，同时削弱APC的抗原呈递功能。 （3）研究表明，FOXP3基因表达的FOXP3蛋白是调控初始T细胞分化为调节性T细胞的核心转录因子。FOXP3蛋白可以作为筛选调节性T细胞的标志物，其根本原因是　　　　　　　　　　　　　。综合上述信息，利用现代生物技术与工程，提出一种验证FOXP3基因功能的思路：　　　　　　　　　　　（具体操作不作要求）。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】D 考点2 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】C 2.【答案】C 3.【答案】（1）① 稀释涂布平板法    ② 探究内生放线菌最适的营养条件和温度     （2）① 指数级扩增    ② ②    ③ 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中     （3） 设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测    4.【答案】（1）① pH    ② 不会    ③ 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞     （2）① ③④    ② 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞     （3）① 抑制    ② 促进         1.【答案】C 2.【答案】B 3.【答案】B 4.【答案】A 5.【答案】A 6.【答案】C 7.【答案】D 8.【答案】（1）① 激活TaqDNA聚合酶    ② 2##二##两     （2）① 引物2和引物4    ② ①②③④     （3）pyrG基因和msn2基因     （4）促进LaeA基因表达，促进次生代谢产物合成酶的合成，进而增加次生代谢产物的合成，有利于曲酸的产生      9.【答案】（1）大肠杆菌无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工形成特定的空间结构     （2）① F2A    ② 引物1和引物4     （3）导入不含目的基因的pET-28a质粒的大肠杆菌也具有卡那霉素抗性，可在该培养基上生长繁殖     （4）① Spe Ⅰ和Hind Ⅲ    ②       10.【答案】（1）① 基因文库    ② 使DNA聚合酶（Taq 酶）能够从引物的 3' 端开始连接脱氧核苷酸（或定位目的基因的扩增区域，提供DNA复制的起始位点）     （2）① Gata3    ② Gata3    ③ 终止密码子     （3）① 1、5    ② 不能    ③ 杂合子还是纯合子都含有Gata3-GFP融合基因，用引物1和3扩增均能获PCR产物     （4）无需提取组织或细胞，可在活体状态下实时观察；能在细胞、组织甚至个体水平上动态监测蛋白表达与定位；对细胞或个体无损伤等      11.【答案】（1）逆转录（反转录）     （2）① 5'端    ② EcoRI    ③ HindIII    ④ 激活 DNA 聚合酶的活性    ⑤ 琼脂糖凝胶电泳     （3）携带目的基因（兔毛角蛋白基因）整合到棉花细胞的染色体 DNA 上     （4）抗原 - 抗体特异性结合      12.【答案】（1）① 丙+乙    ② 甲+乙    ③ 电泳     （2）① KpnI    ② MfeI    ③ 不一定是    ④ 仅含普通载体的工程菌也能生长     （3）诱导      13.【答案】（1）① 基因数据库（或“序列数据库”、“基因文库”）    ② 引物2和引物4    ③ 5'     （2）琼脂糖凝胶电泳     （3）利用农杆菌的T-DNA将融合基因整合到柳枝稷细胞的染色体DNA上     （4）转录水平问题：外源基因的启动子可能在植物根细胞中活性很低，导致融合基因无法有效转录。翻译或修饰问题：原核细菌的基因在真核植物细胞中表达，其mRNA可能无法被正确翻译，或翻译出的蛋白质空间结构不正确、缺乏必要的翻译后修饰，导致酶无活性      14.【答案】（1）① 保证酶切后与质粒正确连接，同时可避免目的基因和质粒自连    ② GGATCC     （2）① 潮霉素    ② T-DNA     （3）在目的基因的首端添加在果实细胞中特异性表达的启动子      15.【答案】（1）① 8    ② 新鲜的血液含DNA多，电泳条带亮且宽     （2）① 亲缘关系近的物种，其相同基因的DNA序列较为接近    ② 测序和比对     （3）① P2    ② GAATTCGCCACC    ③ MunⅠ、SalⅠ    ④ XhoⅠ、EcoRⅠ      16.【答案】（1）① 显微注射法    ② B    ③ 有标记基因，复制原点不会被限制酶切割     （2）① PvuI    ② PCR     （3）① EcoRI    ② 1.2kb和5.5kb     （4）在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞      17.【答案】（1）① 限制酶    ② 磷酸二酯键     （2）① 特异性引物    ② 序列比对工具（BLAST）     （3）① GCAGAG    ② 基因b的基因编辑位点增加了一个碱基，使终止密码子提前出现，翻译出多肽链变短     （4）① 提高了发芽率，缩短了发芽时间    ② Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发      18.【答案】（1）① PCR需要引物，引物需根据目的基因的核苷酸序列设计    ② 引物和脱氧核苷酸     （2）① BamHⅠ、MfeⅠ    ② BamHⅠ、EcoRⅠ     （3）① 诱导产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞    ② 克隆化培养和抗体检测      19.【答案】（1）构建基因表达载体     （2）敲除/编辑/突变     （3）①5'-CTGCA-3'（Pst I 末端）、3'-G-5'②3'-AGATC-5'（Xba I末端）、5'-T-3'。 ③Xba I     （4）① T蛋白（二聚体）对P1启动子的抑制解除，启动（促进）C基因的表达    ② ②    ③ ④    ④ ①    ⑤ ⑤      20.【答案】（1）① 巨噬细胞、B细胞    ② 识别、裂解被（同样）病原体感染的靶细胞     （2）① 增殖受抑制和凋亡（存活率和增殖能力下降）    ② CTLA-4     （3）① FOXP3基因只在调节性T细胞中表达    ② 利用基因工程技术对正常初始T细胞的FOXP3基因进行敲除或突变，检测其是否能分化成调节性T细胞      试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $