专题15 基因工程（9大考点）（期末真题汇编，福建专用）高二生物下学期人教版

**基本信息** 聚焦基因工程9大高频考点，精选福建多地期末真题，融合科研情境与实验探究，全面覆盖工具酶、PCR、载体构建等核心内容。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |单选题|40+|限制酶作用、DNA粗提取、电泳鉴定等|结合TALEN技术、CRISPR/Cas9等前沿情境，考查科学思维| |非选择题|15+|基因表达载体构建、目的基因检测、蛋白质工程等|设计多步骤实验分析（如融合基因构建、PCR引物设计），体现探究实践素养|

专题15 基因工程 9大高频考点概览 考点01 DNA重组技术的基本工具 考点02 DNA的粗提取及鉴定 考点03 电泳鉴定 考点04 目的基因的筛选与获取 考点05 基因表达载体的构建 考点06 将目的基因导入受体细胞 考点07 目的基因的检测与鉴定 考点08 基因工程的应用 考点09 蛋白质工程 地 城 考点01 DNA重组技术的基本工具 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)将一段编码序列（CDS）插入到一个载体上，将该载体命名为pVN2024。如图A所示，将CDS插入到载体的SacⅡ位点，该位点位于lacZ基因的MCS区（含多个酶切位点），CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstI的酶切位点。为确认CDS的大小和插入方向，科研人员用不同的限制酶切割重组质粒并进行电泳，结果如图B。下列叙述正确的是（    ） （A图为载体示意图，方框内表示载体中限制酶识别位点）；（B图为不同限制酶切割产物的电泳示意图，M为标准电泳条带） A．SpeI酶切可用于判断CDS插入的方向 B．CDS插入时方向与lacZ基因的方向相同 C．CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点 D．若重组质粒同时用EcoRI和SpeI酶切，电泳能检测到5个不同条带 【答案】C 【分析】基因工程的应用：①植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。②动物基因工程：提高动物生长速度；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物，如乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。③基因治疗是把正常基因导入病人的体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗的目的，这是治疗遗传病最有效的手段。 【详解】A、由题意可知，CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstⅠ的酶切位点，而SpeⅠ酶切后产生的两个片段为4.3kb和1.3kb，由此只能推出CDS上有1个SpeⅠ酶切位点，且位于CDS的中间位置，但不能判断CDS插入的方向，A错误； B、CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstⅠ的酶切位点，分析图B可知，SpeI酶切割后产生了0.8kb的片段，分析图A可知，PstI的酶切位点位于CDS终止子的位置，则与lacZ基因的方向相比，CDS插入时方向相反，B错误； C、线性空载体为3.0kb，MCS上有两个EcoRI位点，EcoRI酶切后产生3.0kb、2.1kb、0.5kb共3个片段，说明CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点，C正确； D、由图B可知，重组质粒上有3个EcoRI位点，1个SpeⅠ位点，该重组质粒为一个环状质粒，若重组质粒同时用EcoRⅠ和SpeⅠ酶切，电泳能检测到4个不同条带，D错误。 故选C。 2．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（    ） 注：箭头表示识别序列中切断部位。 A．KpnI和Acc65I切割形成的黏性末端不同 B．BamHI与MboI切割后的产物可以通过DNA连接酶连接，连接后序列可能无法被BamHI再次切开 C．用EcoRI和HhaI切割获取的目的基因含有4个游离的磷酸基团，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解 D．若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化 【答案】C 【详解】A、观察KpnI和Acc65I的识别序列和切点：KpnI（-GGTAC↓C-），Acc65I（-G↓GTACC-），二者切割形成的黏性末端碱基组成相同，但游离端碱基不同，A正确； B、BamHI与MboI切割形成的黏性末端相同（都是GATC-)），可以通过DNA连接酶连接，连接后序列不一定能被BamHI特异性识别，故不一定会被BamHI再次切开，B正确； C、用EcoRI和HhaI切割获取目的基因，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解，获取的目的基因由两条反向平行的DNA链组成，只含有2个游离的磷酸基团，C错误； D、若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，切割后形成的黏性末端完全相同，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a完全切割，再把得到的产物用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．限制酶a和b切出的DNA片段能相互连接后可被限制酶a识别切割 B．限制酶切割DNA分子一次可断开1个磷酸二酯键产生1分子水 C．仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段 D．该DNA上含有3个a酶的切割位点，5个b酶的切割位点 【答案】C 【详解】A、由图可以看出限制酶a和b切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，但是连接后没有限制酶a的识别序列，不能被限制酶识别切割，A错误； B、限制酶切割的是DNA双链，一次可断开2个磷酸二酯键，消耗2分子水，B错误； CD、限制酶a可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即限制酶a的识别序列有3个，限制酶b把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，再把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，说明限制酶b在该DNA分子上有2个切口，即b酶的识别序列有2个，仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段，C正确，D错误。 故选C。 4．(24-25高二下·福建南平·期末)某科研小组通过PCR技术获得含有目的基因的DNA片段，并用限制酶（如图1）进行酶切，获得了带有黏性末端的DNA片段（如图2），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列相关叙述，错误的是（　　） A．上述PCR过程所用引物序列之一为5'-AGCTAGCAATGCTC…-3' B．限制酶SpeⅠ和限制酶NheⅠ酶切产物具有相同的黏性末端 C．DNA连接酶可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 D．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ 或者 NheⅠ和CfoⅠ 【答案】D 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。 【详解】A、在PCR过程中，引物与模板链结合，根据碱基互补配对原则，从图2中DNA片段的一端序列可知，上述PCR过程所用引物序列之一为5'-AGCTAGCAATGCTC -3'，A正确； B、观察限制酶SpeI和限制酶NheI的识别序列和切割位点可知，它们切割后产生的黏性末端都是 -CTAG- ，所以限制酶SpeI和限制酶NheI酶切产物具有相同的黏性末端，B正确； C、DNA连接酶的作用是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，即可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，C正确； D、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，因此要获得图2中带黏性末端的DNA片段，步骤①所用的酶应该是NheI和CfoI ，D错误。 故选D。 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)TALEN技术利用 TALE蛋白识别目标 DNA序列，用 FokI二聚体切断 DNA，机理见下图。TALE蛋白需根据靶基因的序列进行人工合成，其二连氨基酸 （NI、NG、HD、NN）与四种碱基有恒定的对应关系：NI识别 A、NG识别 T、HD识别 C、NN 识别 G。下列叙述错误的是（    ） A．FokI二聚体作用的化学键是磷酸二酯键 B．FokI二聚体切割 DNA后形成的末端是黏性末端 C．TALE蛋白的左臂氨基酸序列需与右臂序列不同 D．TALE蛋白识别目标序列时遵循碱基互补配对原则 【答案】D 【分析】TALEN技术利用 TALE蛋白识别目标 DNA序列，用 FokI二聚体切断 DNA， FokI二聚体会破坏DNA中的磷酸二酯键。TALE蛋白与四种碱基之间存在恒定的一一对应的关系。 【详解】A、FoKI能切断DNA，作用的化学键是磷酸二酯键，A正确； B、由图可知，FoKI切割后的产物是黏性末端，B正确； C、为了保证在靶基因的左右两侧正确进行切割，TALE蛋白的左臂氨基酸序列需与右臂序列不同，C正确； D、氨基酸内部没有碱基，不能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对，只是存在恒定的对应关系，D错误。 故选D。 6．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)植物的花色由 D/d 基因控制，存在 D基因时开红花，否则开白花。研究人员将1个控制蓝色色素合成的B基因(蓝色叠加红色呈紫色，蓝色叠加白色呈淡蓝色)导入到 D/d基因所在的染色体上，并获得转基因幼苗若干。用同一种限制酶分别对未转基因植株和转基因幼苗甲、乙、丙、丁的 D/d基因酶切，凝胶电泳结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．图Ⅱ中未转基因植株的基因型为 Dd B．B基因中不含该限制酶的酶切位点 C．幼苗甲开紫花，乙均开淡蓝色花 D．幼苗丙中B基因插入到了基因d所在片段中 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、据图I可知，D基因有1个限制酶切割位点，d基因不含限制酶切位点，分析图Ⅱ可知，未转基因植株含有3个片段，据此推测其基因型是Dd，A正确； B、D基因有1个限制酶切割位点，d基因不含限制酶切位点，分析图Ⅱ可知，D、d基因片段大小分别为1200bp，D基因被限制酶切割后形成300bp和900bp两个片段，由此推测，幼苗甲的B基因插到d基因片段上，且切割还是一条带，说明B基因中不含该限制酶的酶切位点，B正确； C、而幼苗甲B基因插入到d所在的片段上，故片段增大到1400bp，能同时呈现蓝色（B）和红色（D），幼苗甲呈现呈紫色；幼苗乙的片段长度是500bp、900bp和1200bp，说明B基因插到D基因酶切后形成的300bp的片段上，破坏了D基因，能同时呈现蓝色（B）和白色（d），幼苗乙呈现呈淡蓝色，C正确； D、分析图Ⅱ，D、d基因片段大小为1200bp，D基因被限制酶切割后形成300bp和900bp两个片段，由此推测，幼苗丙的B基因连接到D基因酶切后形成的900片段上，相应片段大小增大为1100bp，且B基因的长度为200bp，D错误。 故选D。 7．(24-25高二下·福建三明·期末)下表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是（    ） 限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ -G↓GATCC- KpnⅠ -GGTAC↓C- EcoRⅠ -C↓AATTC- Sau3AⅠ -↓GATC- HindⅡ -GTY↓RAC- SmaⅠ -CCC↓GGG- 注：Y为C或T，R为A或G。 A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 D．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 【答案】C 【分析】限制酶主要从原核生物中分离纯化出来。特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。 【详解】A、HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确； B、Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确； C、一种限制酶可以识别两种核苷酸序列，如Sau3AⅠ能识别GATC，也能识别GGATCC，C错误； D、BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，D正确。 故选C。 8．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)将具有抗肿瘤作用的细胞因子IFNγ基因连接到Egr-1基因启动子上后，利用Egr-1基因启动子的放射诱导性，在X射线等电离辐射诱导下，启动Egr-1基因启动子，进而诱导与其连接的IFNγ基因表达。这样在肿瘤部位可以通过射线和IFNγ的双重作用杀伤肿瘤细胞。图示为重组质粒的构建过程，下列叙述正确的是（　　） A．重组质粒上的Egr-1基因启动子可以被肿瘤细胞核糖体识别 B．通过PCR扩增cDNA进行30轮时，共需要消耗的引物数量为230个 C．将外源IFNγ基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒 D．T4DNA连接酶能连接质粒和IFNγ基因双链之间的氢键和磷酸二酯键 【答案】C 【分析】题图分析：图为重组质粒的构建过程，由图可知，IFNγ为目的基因，目的基因两端有NruⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶的切割位点，质粒也存在这两种限制酶的切割位点，所以将目的基因插入质粒，需用HindⅢ和BamHⅠ两种限制酶同时酶切质粒和获得目的基因；DNA连接酶按其来源不同，可分为两类，即E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 【详解】A、启动子驱动遗传信息转录，是RNA聚合酶识别和结合的位点，A错误； B、PCR扩增cDNA进行30轮时，产生了230个产物，每条新合成的链都要消耗一个引物，但产物中有两条起始的模板链不含引物，故共需要消耗的引物数量为个，B错误； C、在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等，故将外源IFNγ基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒，C正确； D、T4DNA连接酶连接质粒和IFNγ基因间的磷酸二酯键，D错误。 故选C。 9．(24-25高二下·福建百校·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（　　） a酶切割产物（ bp） b酶再次切割产物（ bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接 C．限制酶将一个DNA分子切成两个片段需要消耗两个水分子 D．用a酶切割与线性DNA分子具有相同碱基序列的质粒，一定能得到4种切割产物 【答案】D 【分析】分析题图：a酶和b酶识别的脱氧核苷酸序列不同，但切割后产生的黏性末端相同。分析表格：a酶可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即a酶的识别序列有3个；b酶把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，把大小是500的DNA切成大小分别为200和300两个片段且a酶和b酶的识别位点不同，说明b酶的识别序列有3个。 【详解】A、a酶可以把原有DNA切成4段，说明有该DNA分子上有3个切口，即a酶的识别序列有3个；b酶把大小是2100的DNA切成大小分别为1900和200两个片段，把大小是1400的DNA切成大小分别为800和600两个片段，把大小是500的DNA切成大小分别为200和300两个片段且a酶和b酶的识别位点不同，说明b酶的识别序列有3个，A正确； B、由图可以看出a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，B正确； C、DNA分子是双链结构，限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需断裂两个磷酸二酯键消耗两个水分子，C正确； D、质粒是环状DNA分子，与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个a酶的切割位点，则其被a酶切割后可以得到3种切割产物，而不是4种，D错误。 故选D。 10．(23-24高二下·福建南平·期末)研究表明，DNA 连接酶能够封闭DNA双螺旋骨架上的切口（图a），却无法封闭缺口（图b ），下列相关叙述，正确的是（　　） A．DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成 B．DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口3'→5'方向修复 C．DNA 连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的 DNA 分子 D．DNA 连接酶封闭切口时，需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列 【答案】C 【分析】基因工程的工具： (1)限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二 酯键断裂。 (2)DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶和DNA聚合酶的区别： ①DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上， 形成磷酸二酯键； ②DNA连接酶是同时连接双链的切口，而DNA聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来； ③DNA连接酶不需要模板，而DNA聚合酶需要模板。 (3)运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、DNA连接酶的封闭是指催化脱氧核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成，A错误； B、DNA单链发生缺失，在DNA聚合酶作用下沿缺口5'→3'方向修复，B错误； C、DNA分子的空间结构都是相同的， 所以DNA连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的DNA分子，形成重组DNA，C正确； D、DNA连接酶封闭切口时，不需要识别DNA片段特定的核苷酸序列，D错误。 故选C。 11．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（    ） A．该DNA分子和质粒上均含有酶的一个切割位点和酶的一个切割位点 B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系 C．用T4D NA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来 D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子 【答案】D 【分析】1、分析图形：图中所示的是酶M和酶N两种限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒的结果。 2、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的； （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性； （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 【详解】A、该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确； B、根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确； C、图中经酶切后形成的片段均是黏性末端，T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端，而E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，片段乙和片段丁黏性末端互补，C正确； D、根据图中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。 故选D。 二、非选择题 12．(23-24高二下·福建泉州·期末)生长激素在治疗激素分泌过少的矮小症方面有积极的作用，为了批量生产生长激素，可以采用转基因技术将控制生长激素合成的基因转移到微生物细胞内。请回答下列相关问题： (1)该技术流程的核心步骤是____。 (2)①获取生长激素基因时可以使用PCR技术扩增，该技术的一个循环中所需温度最低的步骤是____。下表是用于扩增的两种引物序列，请据表回答相关问题： 引物名称 引物序列（5'-3'） 引物1 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 引物2 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 引物1对应的模板链序列（5'-3'）为____。 ②下图为生长激素基因的部分序列，请问引物1和引物2分别对应的位置____。 A．I和Ⅱ  B．Ⅱ和Ⅲ  C．Ⅲ和Ⅳ  D．I和Ⅳ ③假设加入的模板数为a，引物能与模板上唯一基因序列特异性结合，理论上n次循环需要消耗引物2的数量是____。 (3)若目的基因用限制酶切割后形成如图1所示的末端，则切割质粒载体（图2所示）应选择使用的限制酶是____。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2) 复性（退火） 5'-ATGAGCACCCTCAACATCGAA-3' B a（2n-1） (3)KpnⅠ和XmaⅠ 【分析】1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 2、PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。 （2）①PCR的过程为：高温变性、低温复性、中温延伸，因此一个循环中所需温度最低的步骤是复性。引物1的碱基序列为（5'-3'）TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT，根据碱基互补配对可得到模板的碱基序列，且DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链连接而成，因此引物1对应的模板链序列为5'-ATGAGCACCCTCAACATCGAA-3'。 ②子链延伸的方向是从5'端到3'端，引物应选择Ⅱ和Ⅲ ，即B正确，ACD错误。 故选B。 ③每合成一个新的DNA需要一个引物2，因此若加入的模板数为a，n次循环新合成的DNA分子数为a（2n-1）。则需要消耗引物2的数量是a（2n-1）。 （3）若想目的基因和质粒连接成重组质粒，两者需要相同的黏性末端，目的基因的黏性末端已知，根据各限制酶识别序列，可判断用限制酶KpnⅠ和XmaⅠ切割后的质粒和与目的基因相连。 地 城 考点02 DNA的粗提取及鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)酒精在生物实验中扮演着重要角色。下列关于酒精叙述，错误的是（　　） A．“检测生物组织中的脂肪”实验中，50%的酒精溶液洗去浮色 B．“植物的组织培养”实验中，70%的酒精对外植体进行灭菌 C．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，95%的冷酒精溶液不能溶解DNA D．“探究酵母菌呼吸类型”实验中，可通过检测是否产生酒精进行判断 【答案】B 【详解】A、在脂肪检测实验中，苏丹染色后需用50%酒精洗去切片外的浮色，避免干扰观察，A正确； B、植物组织培养时，为了防止杂菌污染，可用 70% 的酒精对外植体进行消毒（非灭菌），B错误； C、DNA不溶于高浓度冷酒精，95%冷酒精用于沉淀DNA，C正确； D、酵母菌无氧呼吸产生酒精，有氧呼吸不产生酒精，故可通过检测是否产生酒精判断其呼吸类型，D正确。 故选B。 2．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)生物实验技术是生命科学研究的核心工具，涵盖从分子到生态水平的多种方法。下列相关叙述正确的是（　　） A．用放射性同位素15N标记氨基酸的方法，可用于研究细胞器在合成蛋白质过程中结构与功能上的关系 B．艾弗里的肺炎链球菌体外转化实验中，向S型细菌的细胞提取物中加入不同的酶进行处理体现了“加法原理” C．在统计个体较大、种群分布范围较小的物种的种群密度时，可以使用逐个计数的方法 D．向提取到的DNA溶液中加入二苯胺试剂后，溶液即可呈现明显的蓝色 【答案】C 【详解】A、¹⁵N是稳定性同位素，无法通过放射性追踪技术直接观察标记物的转移路径。研究分泌蛋白的合成与运输通常使用³H或³⁵S等放射性同位素标记氨基酸，A错误； B、艾弗里的实验中，通过向S型细菌提取物中分别加入DNA酶、蛋白酶等，去除特定成分以观察转化效果，属于“减法原理”（排除某种物质的作用），而非“加法原理”（添加某种物质），B错误； C、对于个体较大、分布范围较小的物种（如珍稀植物或大型动物），逐个计数是统计种群密度的合理方法，C正确； D、二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下才会显蓝色，常温下无法立即呈现明显蓝色，D错误。 故选C。 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验操作，下列相关叙述正确的是（　　） A．实验I，在肝脏研磨液的上清液中加入等量预冷的酒精溶液粗提取DNA B．实验I，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水浴，用于鉴定DNA C．实验II，可用生理盐水配制的琼脂糖凝胶作为DNA电泳的介质 D．实验II，在凝胶载样缓冲液中加入核酸染料可使DNA被检测出 【答案】A 【详解】A、DNA不溶于冷酒精，在实验I中，DNA的粗提取应在肝脏研磨液的上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2-3分钟，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，A正确； B、实验I中，DNA鉴定需将白色丝状物溶解于2mol/L NaCl溶液，再加入二苯胺试剂并沸水浴，可观察到蓝色，B错误； C、实验II中，DNA电泳的凝胶需用电泳缓冲液配制，以维持稳定pH和离子环境。生理盐水缺乏缓冲能力，无法替代专用缓冲液，C错误； D、实验II中，核酸染料应加在溶化并冷却的琼脂糖溶液中，而凝胶载样缓冲液中加入的是指示剂，D错误。 故选A。 4．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 C．DNA的粗提取与鉴定实验不要求对实验结果精确定量 D．动、植物细胞DNA的提取无需在无菌条件下进行 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： （1）DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的； （2）DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离； （3）在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，而不是加速DNA沉淀，A错误； B、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，B正确； C、DNA的粗提取与鉴定实验对实验结果不需要精确定量，只是定性，C正确； D、动、植物细胞含有DNA，提取时不需要在无菌条件下进行，D正确。 故选A。 5．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验操作，下列相关叙述正确的是（　　） A．实验I，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水浴，用于鉴定DNA B．实验II，凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 C．实验I，在离心后肝脏研磨液的沉淀物中加入等量冷却的酒精溶液粗提取DNA D．实验II，在紫外灯下观察DNA条带的分布及粗细程度可评价扩增是否成功 【答案】D 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： (1)DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的。 (2)DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、实验Ⅰ中，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，用于鉴定DNA，A错误； B、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。凝胶的浓度越大，DNA分子越大，DNA分子的迁移速率越慢，DNA构象也影响迁移速率，B错误； C、由于DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质等杂质溶于酒精， 因此在离心后肝脏研磨液的上清液中加入等量冷却的酒精溶液可以粗提取DNA，C错误； D、凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果，D正确。 故选D。 6．(23-24高二下·福建厦门·期末)下列叙述中，实验过程与结果或结论均正确的是（    ） 选项 实验过程 结果或结论 A 利用水绵和需氧细菌进行实验，在黑暗中用极细的光束照射水绵 细菌只向叶绿体被光束照射到的部位集中，说明叶绿体能吸收光能用于光合作用放氧 B 在离体叶绿体的悬浮液中加入铁盐或其他氧化剂（悬浮液中有H2O没有CO2） 叶绿体在光照下释放出O2，说明光合作用释放的O2中的O全部来自水 C 用无水乙醇分离菠菜叶片中的色素 滤纸条上有4条不同颜色的色素带，从上到下依次为黄色、橙黄色、蓝绿色、黄绿色 D 向兔血中加入预冷的酒精进行DNA粗提取 溶液中出现的白色丝状物即为粗提取的DNA A．A B．B C．C D．D 【答案】A 【分析】离体叶绿体在适当条件下发生水的光解、产生氧气的化学反应称为希尔反应。希尔反应的结果虽能说明水的光解产生氧气，但并不能说明所产生的氧气中的氧元素全部来自水；恩格尔曼利用水绵和需氧细菌在没有空气的暗处进行局部光照实验，证明光合作用的放氧部位是叶绿体；鲁宾和卡门用18O分别标记参加反应的水和二氧化碳，通过两组对照实验有力地证明了光合作用释放的氧气来自水； 【详解】A、利用水绵和需氧细菌进行实验，在黑暗中用极细的光束照射水绵，细菌只向叶绿体被光束照射到的部位集中，证明光合作用的放氧部位是叶绿体，叶绿体能吸收光能用于光合作用放氧，A正确； B、在离体叶绿体的悬浮液中加入铁盐或其他氧化剂（悬浮液中有H2O没有CO2），叶绿体在光照下释放出O2，只能说明水的光解产生氧气，但并不能说明光合作用释放的O2中的O全部来自水，B错误； C、菠菜叶片中的色素易溶于无水乙醇，而在层析液中的溶解度不同，因此应用层析液分离菠菜叶片中的色素，C错误； D、兔是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和众多细胞器，故不能用兔血作为实验材料提取DNA，D错误。 故选A。 7．(23-24高二下·福建漳州·期末)下列有关“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度与 NaCl浓度无关 B．酵母、菜花和哺乳动物的成熟红细胞都可作为提取 DNA 的材料 C．在溶有 DNA 的滤液中加入木瓜蛋白酶，可分解其中的杂质蛋白 D．鉴定 DNA时，将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴加热 【答案】C 【分析】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理方法或化学方法对它们进行提取。 【详解】A、DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大，高于或低于此浓度其溶解度均降低，A错误； B、只要含有DNA的生物组织均可作为提取DNA的材料，但哺乳动物成熟红细胞无细胞核，不可作为提取DNA的材料，B错误； C、在溶有DNA的滤液中加入蛋白酶，可分解其中的杂质蛋白，C正确； D、鉴定DNA时，应将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，然后再加入二苯胺试剂进行沸水浴加热，D错误。 故选C。 8．(23-24高二下·福建南平·期末)某同学用改良的方法进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，具体操作如下，相关说法错误的是（　　） 流程 具体操作 裂解 香蕉去皮剪碎，加入食盐水及5滴洗洁精（替代研磨液）， 充分研磨 分离 在研磨液中加入2g嫩肉粉（有效成分是木瓜蛋白酶）， 混合均匀后适温加热 沉淀 冷却后加入等体积、预冷的体积分数为 95%的酒精； 静置后挑取白色絮状析出物 鉴定 加入二苯胺试剂 A．研磨的目的是裂解细胞膜，同时释放出DNA 等物质 B．适温加热可以加快嫩肉粉对多糖和蛋白质的水解 C．预冷的体积分数为95%的酒精能溶解某些蛋白质 D．沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会呈现蓝色 【答案】B 【分析】DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 【详解】A、研磨可以裂解细胞膜，将细胞中的DNA释放出来，A正确； B、嫩肉粉中含有蛋白酶，适当升温可以加快对蛋白质的水解，但不能加快对多糖的水解，B错误； C、DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，因此可用体积分数为95%冷酒精析出DNA，C正确； D、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D正确。 故选B。 9．(23-24高二下·福建泉州·期末)下列关于DNA粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的叙述错误的是（　　） A．新鲜的鸡血、大蒜、洋葱等都可作为DNA粗提取的实验材料 B．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质 C．PCR技术是通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 D．DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象和凝胶浓度有关 【答案】B 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、新鲜的鸡血、大蒜、洋葱等都含有DNA，因而均可作为DNA粗提取的实验材料，A正确； B、因DNA不溶于酒精但蛋白质溶于酒精，因而可分离DNA与蛋白质，B错误； C、PCR是一种体外扩增DNA片段的技术，利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，C正确； D、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等均有关，包括其所带电荷多少，D正确。 故选B。 地 城 考点03 电泳鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH三种限制酶的酶切位点。BamH酶切位点位于两个EcoRI酶切位点正中间，以下是不同酶切产物的电泳图谱：泳道①是未酶切的质粒P电泳条带。②到④分别为三种酶单酶切质粒P产物的电泳条带，⑤到⑦为双酶切质粒P产物的条带。以下说法正确的是（    ） A．电泳时片段移动方向是从正极到负极 B．图中②、③分别是SacI和EcoRI的酶切产物 C．泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物 D．泳道①②表明酶切后质粒P碱基数增大 【答案】C 【详解】A、电泳时，DNA片段带有负电荷，在电场中会从负极向正极移动，A错误; B、质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH酶切位点。EcoRI有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，片段较小；SacI有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。观察电泳图谱，②和③都是一个条带，且片段大小相同，因此图中②可以是是SacI的酶切产物，但③不是EcoRI酶切产物，B错误; C、EcoRI有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段；SacI有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。SacI和EcoRI双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑦有3个条带，可推测泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物，C正确; D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。    故选C。 2．(24-25高二下·福建三明·期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA”实验的叙述，错误的是（    ） A．香蕉研磨后离心取上清液，加入95%的冷酒精，有利于DNA析出 B．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 C．配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．电泳鉴定DNA时，应先将PCR扩增产物与含有指示剂的凝胶载样缓冲液混合 【答案】B 【详解】A、DNA在95%冷酒精中溶解度低，离心后上清液加入冷酒精可促进DNA析出，A正确； B、二苯胺试剂用于鉴定DNA（沸水浴显蓝色），检测蛋白质应使用双缩脲试剂（常温紫色），B错误； C、PCR扩增需以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为原料，C正确； D、电泳前需将DNA样品与含指示剂的载样缓冲液混合，以追踪电泳进程并增加样品密度，D正确。 故选B。 3．(24-25高二下·福建龙岩·期末)关于DNA粗提取及电泳鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔，并沿多个方向搅拌 B．鉴定DNA时，将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴 C．电泳实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】D 【分析】本题主要考查DNA粗提取及电泳鉴定实验的操作要点，需结合实验步骤和试剂作用进行判断。 【详解】A、DNA析出时需沿同一方向缓慢搅拌，避免DNA断裂，若多方向搅拌会破坏DNA结构，A错误； B、鉴定DNA需将丝状物溶于2mol/L NaCl溶液后再与二苯胺试剂混合并沸水浴，直接加入无法充分反应，B错误； C、核酸染料（如GelRed）需在琼脂糖溶液凝固前加入并混匀，若倒入模具后再加会导致染色不均，C错误； D、电泳时指示剂（如溴酚蓝）迁移至凝胶边缘时需停止，防止DNA条带移出凝胶，D正确。 故选D。 4．(24-25高二下·福建宁德·期末)双脱氧测序法是一种用于确定DNA序列的经典方法，其原理是在DNA复制过程中引入特殊的化学物质——ddNTP来中断DNA链的延伸。ddNTP与dNTP均能遵循碱基互补配对原则，结合在延伸的子链上，当ddNTP结合在子链上时，DNA合成终止。PCR产物变性后电泳检测，可确定序列信息，通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．电泳时产物的片段越小，迁移速率越快 B．患者该段序列中某位点的碱基T突变为C C．5＇—CTACCCGTGAT—3＇为对照个体的一段序列 D．ddNTP导致DNA合成终止的原因是3＇端无—OH，无法形成磷酸二酯键 【答案】B 【详解】A、电泳时DNA 片段越小，迁移速率越快， A正确； B、对照个体序列为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者个体序列为5'-CTACCTGTGAT-3'，患者该段序列中某位点碱基C变为T，B错误； C、双脱氧测序法读序列是从下往上读，即和电泳方向相反，所以对照个体的顺序为5'-CTACCCGTGAT-3'，C正确； D、ddNTP 终止 DNA 合成的原因是 3’端无-OH，无法形成磷酸二酯键，D正确。 故选B。 5．(24-25高二下·福建三明·期末)与哺乳动物睡眠节律调控有关的基因发生突变会导致睡眠紊乱，利用PCR技术可扩增基因。下列说法错误的是（    ） A．扩增时要一对能与基因一段碱基序列互补配对的短单链核酸为引物 B．当温度超过90℃时，磷酸二酯键断裂，双链DNA解聚为单链 C．为了激活耐高温DNA聚合酶的活性，PCR反应缓冲液中一般要添加 D．扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 【答案】B 【详解】A、PCR扩增需要两种引物，分别与目的基因两条链的3'端互补配对，确保DNA聚合酶能够延伸合成新链，A正确； B、高温（90℃以上）使双链DNA解旋为单链，破坏的是碱基对之间的氢键，而非磷酸二酯键，磷酸二酯键的断裂需通过水解作用（如限制酶或化学处理），B错误； C、耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）需要Mg2+作为激活剂，PCR反应缓冲液中通常添加Mg2+以维持酶活性，C正确； D、PCR扩增后的产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，依据DNA片段大小形成不同条带，D正确。 故选B。 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．2号加样孔中的样品均为PCR产物直接电泳结果 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 【答案】B 【分析】题干信息分析，A基因和a基因碱基对数量不同，直接电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。 【详解】AC、A基因和a基因碱基对数量不同，电泳形成两种条带，根据图示可知，A基因具有Apol酶切位点，A基因被酶切后经过电泳会形成两个条带，a基因不能被酶切，因此PCR产物直接电泳最多有两个条带，用Apol切割后电泳最多有三个条带，而甲的1号加样孔有三个条带，说明1号加样孔是用Apol切割后电泳结果，2号加样孔是直接电泳的结果。由于a基因是A基因缺失了32个特定碱基对突变而来，A基因分子更大，电泳时移动速度更慢，故3表示A基因，4表示a基因，测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列，AC正确； B、根据乙的1号加样孔用ApoI酶切割后电泳的产物可知，该个体的基因型为aa，由于a基因不能被ApoI酶切，因此出现乙个体两个加样孔条带一致的情况，B错误； D、DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关，D正确。 故选B。 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析正确的是（    ） 注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低 A．条带1越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强 B．显示条带2就说明O2蛋白与P无法结合 C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 【答案】C 【分析】探针：是指经过同位素或荧光标记的DNA分子。 【详解】AB、泳道2与泳道1相比较，条带2变窄，条带1变宽，说明O2蛋白与指示探针结合，二者结合的越多，条带1就会越宽，条带2就会越窄，由于无荧光标记的P和突变体（M1、M2、M3）会竞争指示探针与O2蛋白结合，从而使条带2变宽，条带1变窄，且与O2蛋白的结合能力越强，条带1会越窄，条带2越宽，条带1越宽说明O2蛋白与指示探针的结合越强，探针与待测物的结合越弱，所以显示条带2说明全部或部分探针未结合O2蛋白，即说明O2蛋白与P可以结合，AB错误； C、M1的电泳条带与片段P的电泳条带大体一致，说明了M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合，C正确； D、M2和M3的电泳条带不同，说明其与O2蛋白的结合强度不同，D错误。 故选C。 二、非选择题 8．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)无核葡萄品质优良，但抗寒性差。我国科学家以中国野生葡萄资源中抗寒性最强的山葡萄为材料，对抗寒基因Va的功能展开相关研究。 (1)通过前期研究结果，科研人员推测Va基因的产物可能为转录因子。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控______与启动子的结合。 (2)研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的_____推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用______凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 (3)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是______。 A．DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Va基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因 (4)为进一步验证Va基因的转录激活功能，科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中（图1）。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①敲除GAL4的原因是_____。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统（图2）实现对GAL4的敲除，sgRNA（一种小RNA）有引导作用，使Cas9酶在配对区域定点切割，导致基因丧失功能，因此sgRNA序列必须以_______为设计依据。如果要获得基因敲除酵母AH109菌株，应用_____法导入CRISPR/Cas9基因表达载体。 ②为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的_____组，此外还需额外添加______，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ③研究人员运用GAL4基因和pCG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入______。另外，还需设置一个对照组2，即导入______，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④预测实验组和对照组1、2的菌落生成及颜色情况分别是：______、有菌落和蓝色和______。 【答案】(1) RNA聚合酶 (2) 密码子 5' 琼脂糖 (3) C (4) 避免酵母菌细胞中产生具有转录激活功能的蛋白 GAL4基因中的一段特异性序列 Ca2+处理 B X-α-gal pG-Va重组载体 PG载体 蓝色，有菌落 不会出现蓝色物质，也无菌落生长 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控RNA聚合酶与启动子的结合。 （2）研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的密码子推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的5'端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用琼脂糖凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 （3）A、若DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染，其他葡萄细胞基因组DNA中可能含有与目的基因不同的序列，在PCR扩增时可能会产生额外的条带，A正确； B、如果每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，那么在PCR扩增过程中，除了目的基因片段被扩增出来，还会有引物结合到另外的位点并进行扩增，从而出现额外的条带，B正确； C、在基因组中Va基因有2个拷贝，这2个拷贝的序列完全相同，那么在PCR扩增时，引物会特异性地结合到这2个拷贝上，扩增出的产物是相同的，只会出现一条阳性条带，不会出现另外一条额外的条带，C错误； D、在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因，在 PCR 扩增时，引物可能会非特异性地结合到这个高度相似的基因上，从而扩增出另外一条条带，D正确。 故选C。 （4）①GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，敲除GAL4的目的是避免酵母菌细胞中产生具有转录激活功能的蛋白。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现对GAL4的敲除，sgRNA序列必须以GAL4基因中的一段特异性序列为设计依据，这样该序列可以与GAL4基因中的特定序列结合，并在该部位实现切割，进而得到敲除GAL4基因的酵母菌。在基因工程中，若受体细胞是酵母菌，应用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 ②依据题干信息，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，重组的载体中含有编码色氨酸合成酶的基因和具有转录激活功能的Va基因，AH109菌株的基因中含有HIS3基因可以编码组氨酸合成酶，所以若重组成功，就可以合成色氨酸和组氨酸，为了能够筛选得到重组酵母，所用培养基配方中无需添加色氨酸和组氨酸，故选B。若用显色反应进行验证，依据题干信息，MEL1基因可以编码α-半乳糖苷酶，可分解X-α-gal产生蓝色物质，所以培养基中需额外添加X-α-gal。 ③研究人员运用GAL4基因和pG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入pG-Va重组载体。另外，还需设置一个对照组2，即只导入PG载体，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④对照组1导入pG-GAL4重组载体，其中含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。对照组2只导入PG载体，无菌落接种，且不含有MEL1基因，所以不会出现蓝色物质，也无菌落生长；实验组导入pG-Va重组载体，也含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。 9．(24-25高二下·福建南平·期末)疟疾是由疟原虫引起的一种疾病，氯喹是治疗非耐药疟疾的常用药物。为实现精准治疗，需进行抗性筛查，以便筛选出适合使用氯喹治疗的患者。已知疟原虫获得对氯喹的抗性与pfcrt基因突变有关。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2四种备选引物，用于扩增目的基因的片段，如图甲所示。回答下列问题： (1)用PCR扩增疟原虫的DNA，用于耐药基因分析。PCR过程每次循环一般包括_______三个步骤。 (2)据图甲可知，pfcrt基因突变导致该部位相应的密码子由_______转变为_______。 (3)图乙为利用F1、F2、R1和R2引物扩增pfcrt基因后，电泳分离扩增产物的部分结果。 ①PCR过程使用不同的引物，对比泳道1、2、3的结果，推测泳道3内无条带的原因可能是引物_______不能与模板正常结合，导致PCR产物的量过低，电泳时无法分离出准确的结果。 ②与泳道1相比，泳道2中增加了条带的数量。这可能与引物R2的性质有关。为减少此种现象的发生，设计引物R2时，应满足：_______ A．引物R2与基因的特异性结合位点只有一个 B．引物R2与特异性结合位点的结合足够稳定 C．引物R2与引物F1不存在互补序列 D．引物R2的内部不能存在互补序列 E．引物R2最适的复性温度与引物F1的最适复性温度差异明显 (4)现由4份患者血样处理后获得pfcrt基因进行PCR，产物用限制酶ApoI处理，电泳结果如图丙。 综合上述信息，可初步判断来自氯喹非耐药疟疾患者的血样是_______，判断理由是：_______。 【答案】(1)变性、复性和延伸 (2) AAA ACA (3) F2 ABCD (4) 1和4 正常的pfcrt基因中含有1个限制酶Apo I的切割位点，而抗性基因中无Apo I切割位点，所以含有正常pfcrt基因血样电泳的结果应有2个条带 【分析】PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，其核心是通过模拟体内DNA复制过程，实现目标DNA的大量复制。PCR的基本原理   基于DNA半保留复制的特性，通过温度变化控制DNA的变性、复性和延伸，循环往复以扩增DNA。主要步骤   1. 变性：将反应体系加热至90℃左右，使模板DNA双链解旋为单链。 2. 复性（退火）：降温至50℃左右，让引物与模板DNA单链的互补序列结合。 3. 延伸：升温至72℃左右，DNA聚合酶（如Taq酶）以dNTP为原料，沿引物延伸方向合成新的DNA链。 【详解】（1）PCR过程每次循环一般包括变性、复性、延伸三个步骤。变性是指在高温下DNA双链解开；复性是指在较低温度下引物与模板链结合；延伸是指在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，合成新的DNA链。 （2）根据图甲，未突变时模板链对应的碱基序列为TTT，根据碱基互补配对原则，其转录形成的密码子为AAA（编码赖氨酸）；突变后模板链对应的碱基序列为TGT，转录形成的密码子为ACA（编码苏氨酸）。所以pfcrt基因突变导致该部位相应的密码子由AAA转变为ACA。 （3）① 对比泳道1（F1 - R1引物组合）、泳道2（F1 - R2引物组合）、泳道3（F2 - R1引物组合）的结果，泳道3内无条带，而泳道1和2中均有条带，说明F1、R1、R2均可正常与模板结合，推测可能是引物F2不能与模板正常结合，导致PCR产物的量过低，电泳时无法分离出准确的结果。 ② A、若引物R2与基因的特异性结合位点只有一个，能减少非特异性结合，从而减少多余条带的出现，A正确； B、引物R2与特异性结合位点的结合足够稳定，可保证引物准确结合到目的位点进行扩增，减少非特异性扩增，B正确； C、引物R2与引物F1不存在互补序列，可避免引物之间相互结合形成二聚体等影响扩增，减少多余条带，C正确； D、引物R2的内部不能存在互补序列，否则引物自身会形成发夹结构等影响其与模板链的结合，导致非特异性扩增，D正确； E、引物R2最适的复性温度与引物F1的最适复性温度差异明显不利于PCR反应的进行，因为PCR反应需要统一的复性温度，差异明显会导致引物结合效率低或非特异性结合等问题，而不是减少多余条带，E错误。 故选ABCD。 （4）结合题干及图丙分析可知：正常的pfcrt基因中含有1个限制酶Apo I的切割位点，而抗性基因中无Apo I切割位点，所以含有正常pfcrt基因血样电泳的结果应有2个条带，故来自氯喹非耐药疟疾患者的血样是1和4。 10．(23-24高二下·福建厦门·期末)无植物中的碳苷黄酮类化合物具有明显的抗糖尿病功效。水稻中的CYP93G2基因（大小为1557bp）在碳苷黄酮类化合物的生物合成中发挥重要作用研究人员将该基因转入番茄，使其在番茄果实中特异性表达，以获得含有抗糖尿病有效成分的可食用番茄。 请回答： (1)过程①和②需要用到的酶分别为________、________。将目的基因与克隆载体A连接后导入经______（填物质）处理的大肠杆菌细胞，从而实现对目的基因的克隆。 (2)实验中使用的p2A11启动子应具备的特点是________。 (3)用农杆菌介导番茄转化时，T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的______上。以被侵染的番茄茎段作为外植体，经过______过程形成植株。 (4)用PCR等技术鉴定目的基因是否成功导入番茄，结果如图所示。据此判断，样本______（填序号）为非转基因植株，无法进一步使用。其余样本还需进行基因测序，原因是_______。 (5)经鉴定，转基因番茄果实中成功表达了碳苷黄酮类化合物，上市前还需进行哪些研究__________（答出1点即可）。 【答案】(1) 逆转录酶 DNA聚合酶 Ca2+ (2)在番茄果实中特异性表达 (3) 染色体 植物组织培养 (4) 2、5 PCR技术的特异性不强等原因，电泳条带不一定都是目的基因 (5)需要对其含有的其他营养成分进行检测，以防转入的基因影响其他基因表达，合成其他不明成分的物质。 【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 3、基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】（1）由图可知①和②是以RNA为模板合成（或目的基因）基因的过程，具体过程是以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成的一条链，然后又以该单链为模板在聚合酶催化下合成了双链。故需要用到逆转录酶和聚合酶，用Ca2+处理的大肠杆菌，大肠杆菌易于接受外界的DNA。 （2）由于目的基因要在番茄果实中表达，因此实验中使用的p2A11启动子应具备的特点是在蕃茄果实中特异性表达的特点。 （3）用农杆菌介导番茄转化时，T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体上。通过植物组织培养技术，利用植物细胞的全能性，可以形成完整的植株。 （4）根据题意，水稻中的CYP93G2基因，大小为1557bp，用PCR等技术鉴定目的基因是否成功导入番茄的电泳图中1、3、4、6都出现了大小在1500bp左右的条带，而2和5没有，因此样本2、5为非转基因植株，而其余样本还需要进一步的基因测序，因为PCR技术的特异性不强等原因，电泳条带不一定都是目的基因。 （5）转基因番茄在上市前，还需要对其含有的其他营养成分进行检测，以防转入的基因影响其他基因表达，合成其他不明成分的物质。 地 城 考点04 目的基因的筛选与获取 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)下列关于PCR扩增DNA的叙述，错误的是（    ） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 C．复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 D．引物序列过短，使PCR产物特异性较差 【答案】C 【详解】A、PCR扩增需要设计引物，引物需根据目的基因两端的已知序列设计，因此，用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列，A正确； B、DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链，因该酶需结合到双链区并沿模板合成，B正确； C、复性的温度通常为50℃左右，此时引物与模板结合；72℃是延伸阶段的温度，此时DNA聚合酶催化合成新链，C错误； D、引物过短会导致与模板结合的特异性降低，易与非目标序列结合，使产物中出现非特异性扩增，D正确。 故选C。 2．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。 下列推测不合理的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合具有特异性 B．淬灭基团与荧光基团间距离影响荧光强度 C．CT值越小则提取到的病毒RNA含量越低 D．病毒发生单个碱基的突变可能不影响检测结果 【答案】C 【详解】A、探针中携带荧光基因，因而探针与CDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则具有特异性，A正确 B、根据题意，通过病毒的RNA进行逆转录产生CDNA，CDNA在PCR过程中解旋后可以和引物一起 与模板结合，探针两侧有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，延申过程DNA酶破坏了探针使淬灭基团分离后发出荧光而检测到是否有CDNA来判断是否有病毒，因此淬灭基团与荧光基团间距离会影响荧光强度，B正确； C、由题可知C值越小，该反应管内的荧光信号到达设定阈值经历的循环数越小，即每次循环出现的荧光信号越多。每次循环出现的荧光信号越多，代表被检测样本中的病毒数目越多，C错误； D、若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果，因为单个碱基没有发生配对不会影响PCR 进程，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 【答案】D 【详解】A、①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的RNA单链水解，留下DNA单链为模板合成双链DNA，A错误； B、PCR扩增时需在试管内加入模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶以及含Mg²⁺的缓冲液等成分，B错误； C、③过程为变性，变性过程使用90~95℃的高温处理是为了让双链DNA的氢键断裂，获得单链DNA，C错误； D、⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间，D正确。 故选D。 4．(24-25高二下·福建宁德·期末)引物的设计是PCR技术的重要环节，下列叙述错误的是（　　） A．需要根据目的基因的完整碱基序列来设计引物 B．引物的长度不能过短，否则会影响PCR扩增产物的特异性 C．引物的作用是使DNA聚合酶能够从其3＇端开始连接脱氧核苷酸 D．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 【答案】A 【详解】A、设计引物时，不需要根据目的基因的完整碱基序列来设计，只需要根据目的基因两端的部分碱基序列设计引物即可，A错误； B、引物长度不能过短，过短的引物可能会与模板DNA的多处非特异性位点结合，从而影响PCR扩增产物的特异性，B正确； C、在PCR技术中，引物的作用是为DNA聚合酶提供起始位点，使DNA聚合酶能够从其3’端开始连接脱氧核苷酸，从而合成子链DNA，C正确； D、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，它可以是DNA单链，也可以是RNA单链，D正确。 故选A。 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员采用 PCR技术扩增 M、N基因，然后用限制酶 Smal （识别序列为一 GGG↓CCC—）切割，再用 DNA连接酶将其连接成融合基因，最后构建出基因表达载体，如下图所示. 下列叙述错误的是（    ） A．引物 2和引物 4的 5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列 B．引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列 C．建议用 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因 D．用PCR鉴定目的基因是否导入受体细胞应选择引物 2和引物3 【答案】D 【分析】由图可知，选择引物1和2扩增M基因，选择引物3和4扩增N基因，顺着转录方向，依次是M基因、N基因，转录时子链的延伸方向是5'到3'，结合两个基因的模板链可知，M基因的左端需要与N基因的左端相连接。根据质粒上的限制酶识别序列可知，需要在融合基因的左端即M基因的右端应该加上KpnⅠ的识别序列，右侧（即N基因的右侧）加上XhoⅠ的识别序列。 【详解】A、根据上述分析可知，M基因的左端需要与N基因的左端相连接，才能保证融合基因的正常转录，所以引物2和引物4的5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列，方便扩增后用该酶切割并实现二者的连接，A正确； B、结合上述分析可知，融合基因的左端（即M基因的右端）应该加上KpnⅠ的识别序列，右侧（即N基因的右侧）加上XhoⅠ的识别序列，故引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列，B正确； C、由于限制酶 Smal 切割后的末端为平末端，故应选择 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因，C正确； D、引物2和3结合在融合基因的同一条链上，无法扩增得到产物，无法鉴定目的基因是否导入受体细胞，D错误。 故选D。 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)疟疾是由疟原虫引起的一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，临床上可用氯喹治疗。研究发现部分疟原虫的Pfcrt基因发生突变，会导致该蛋白的其中一个赖氨酸改变为苏氨酸，从而获得对氯喹的抗性。现有1～5号共5份血样，处理后利用PCR扩增Pfcrt基因。产物用限制酶Apol处理，酶解产物的电泳结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．1号个体的电泳检测结果支持该患者可用氯喹进行治疗 B．2号无条带是因为Pfcrt基因上无限制酶ApoI识别位点 C．3号和4号个体为氯喹抗性患者，应考虑其他治疗方案 D．5号个体可能被多种疟原虫感染，氯喹的治疗效果不佳 【答案】B 【分析】PCR过程为：变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、1 号个体电泳结果显示有与正常基因酶切产物一致的条带，说明其疟原虫的 Pfcrt 基因未发生导致抗性的突变，该患者可用氯喹进行治疗，A 正确； B、2 号无条带，可能是 2号没有感染过疟原虫，2号血样中没有疟原虫基因，而不是基因上原本就无识别位点，B错误； C、3 号和 4 号个体的电泳条带与 1 号不同，说明其 Pfcrt 基因发生了突变，是氯喹抗性患者，应考虑其他治疗方案，C正确； D、5 号个体出现了多种条带，可能被多种疟原虫感染，其中可能存在具有氯喹抗性的疟原虫，所以氯喹的治疗效果不佳，D 正确。 故选B。 7．(24-25高二下·福建三明·期末)F1、F2、R1和R2是扩增基因片段的四种引物，它们与模板链结合的位置如图。M基因可能正向或反向插入质粒中，选用不同引物组合对基因扩增和电泳，可对M基因的插入情况进行鉴定。则可选用的引物组合是（    ） A．F2和R2、F2和R1 B．F1和R2、F2和R1 C．F1和R1、F2和R1 D．F1和R1、F2和R2 【答案】B 【分析】分析题图可知，若图中M基因插入方向正确，选择引物F2和R1、F2和R2、F1和R1、F1和R2均可扩增到基因片段。 【详解】若图中M基因插入方向正确，选择引物F2和R1、F2和R2、F1和R1、F1和R2均可扩增到基因片段。若M基因反向插入时，则图示为用F2和R2、F2和F1、R1和F1、R1和R2均可扩增到基因片段。综合分析，应选用F2和R1、F1和R2进行M基因扩增，正向插入时可扩增到片段，反向插入时不能扩增到片段，B正确。 故选B。 8．(23-24高二下·福建漳州·期末)利用PCR 技术扩增下图的一个P基因，下列说法错误的是（　　） A．PCR 扩增过程中，循环4轮共需要引物数为32 B．利用PCR 技术扩增图中的P基因，需要选择引物b、c C．PCR 扩增过程中，至少需要经过3轮循环后才能产生双链等长的P 基因 D．在延伸时，DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 【答案】A 【分析】利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 【详解】A、CR 扩增过程中，循环4轮共新形成30条DNA单链，每新形成一条单链需要消耗一个引物，所以PCR 扩增过程中，循环4轮共需要引物数为30，A错误； BD、DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能将单个核苷酸加到已有链的3'端，所以利用PCR 技术扩增图中的P基因，引物需要与模板链的3'端结合，即需要选择引物b、c，BD正确； C、由于DNA复制为半保留复制，所以PCR 扩增过程中，至少需要经过3轮循环后才能产生双链等长的P 基因，C正确。 故选A。 9．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)多溴联苯醚（分子式C12H5Br4O，简称BDE-47）是一种电子垃圾分解后产生的环境污染物，进入人体会对神经系统、生殖系统等产生毒害。为了提高好氧细菌的降解效率，将GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因导入WT-G受体菌，构建成基因工程菌1、2、3，如图是对三种菌相关基因的电泳结果。下列叙述错误的是（　　） A．由图可知，工程菌2为降解BDE-47能力强的目的菌株 B．从GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因可通过PCR技术进行扩增 C．将含有BDE-47降解基因的重组质粒导入WT-G受体菌时，用Ca2+处理会增大导入率 D．若要增加筛选GB-2细菌的可能性，应从多溴联苯醚污染区取样并进行菌体培养 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，工程菌2含有降解基因，若要鉴定工程菌2的降解能力，需进行相关的降解能力的实验，A错误； B、从GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因可通过PCR技术进行扩增，B正确； C、Ca2+处理会使受体菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，因此会增大导入率，C正确； D、污染区的土壤中降解BDE-47的菌体数量相对较多，从污染区取样，再经过菌体培养增加目的菌的浓度，利于筛选得到GB-2细菌，D正确。 故选A。 10．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述正确的是（    ） A．导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3’-端进行子链合成 C．若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列 D．利用显微注射法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，而是受精卵或早期胚胎细胞，A错误； B、在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'-端进行子链合成，B错误； C、成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，故若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，C正确； D、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上，将基因转入动物细胞常用显微注射法，但显微注射法不能将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上，D错误。 故选C。 二、多选题 11．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)下图为某DNA片段的结构示意图，其中L和R 表示方向，①和②代表DNA 的两条链，③和④为 PCR 所需的引物。下列叙述正确的是（    ） A．①链的复制方向为R→L，②链的复制方向为L→R B．所选择的两个引物（③和④）的碱基序列应当互补配对 C．若以该DNA 为模板，并进行PCR扩增n次，则一共需要2n⁺¹个引物 D．若要在新合成的DNA 中添加限制酶的识别序列，则需要在引物的5'端进行设计 【答案】AD 【分析】PCR技术：1、概念：PCR.全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开) ；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸:合成子链。 【详解】A、DNA复制时，子链延伸方向为5’→3’。结合图中L和R方向，①链（模板链）的子链复制方向是R→L，②链的子链复制方向是L→R（同理）。但实际DNA复制是半不连续复制，两条链复制方向均为5’→3’ ，图中表述是基于模板链与子链延伸的相对方向，A正确； B、PCR中，引物③结合于①链、引物④结合于②链，分别引导两条链的扩增，引物结合的是两条模板链的不同区域，碱基序列不互补配对，B错误； C、PCR扩增n次，最终得到2n个DNA分子，共2n+1条单链。每次扩增，每个DNA分子需要2个引物。扩增n次，共合成2n+1−2条新链（初始2条模板链不新合成），每条新链需1个引物启动，故引物总数为2n+1−2，C错误； D、PCR扩增时，引物与模板链3’端结合，子链从引物3’端延伸（方向5’→3’）。因此，若要在新DNA两端添加限制酶识别序列，需在引物的5’端设计该序列（延伸时5’端序列会被整合到新DNA中），D正确。 故选AD。 三、非选择题 12．(24-25高二下·福建百校·期末)胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。请据图回答下列问题： 已知HindⅢ的识别序列及切割位点为5′－A↓AGCTT－3′；EcoRⅠ的识别序列及切割位点为5′－G↓AATTC－3′；BamHⅠ的识别序列及切割位点为5′－G↓GATCC－3′。 (1)若从动物细胞中直接提取kit基因的mRNA，需通过______酶获得cDNA。目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，说明不同生物密码子______。 (2)②过程需要使用的限制酶为______。已知kit部分基因（如下所示）且基因上并无质粒中相关限制酶识别序列，为使基因与质粒成功连接，利用PCR技术扩增kit基因时需要设计一对引物，这对引物的序列分别是______________________（从引物5′端开始书写，只写前12个碱基即可）。 5′－CGGGATCCA………………AGAATTCCG－3′ 3′－GCCCTAGGT………………TCTTAAGGC－5′（模板链） (3)为了使重组质粒更易进入大肠杆菌，可以用______处理大肠杆菌，筛选转化成功的大肠杆菌时，培养基中需添加______。可通过______技术检测胶原蛋白是否表达，若结果呈阳性，说明_____________。 (4)与动物细胞相比，利用大肠杆菌生产胶原蛋白的优点是______（写出1点）。大肠杆菌生产的胶原蛋白一般不具备天然状态下的活性，原因是______________________。 【答案】(1) 逆转录 （基本）相同 (2) BamHⅠ和EcoRⅠ 5′－GAATTCCGGGAT－3′和5′－GGATCCCGGAAT－3′ (3) Ca²⁺（或CaCl₂） 硫链丝菌素 抗原—抗体杂交 kit基因已表达出胶原蛋白 (4) 繁殖快、成本低、易培养 大肠杆菌为原核生物，细胞内缺乏内质网与高尔基体，无法对表达的蛋白质进行加工修饰 【分析】1、目的基因的获取：通过逆转录法从mRNA合成cDNA的过程，以及不同生物密码子通用性的原理。 2、基因表达载体的构建：包括限制酶的选择（需避免破坏标记基因和复制原点）、引物设计（需包含限制酶识别序列以实现目的基因与质粒的连接）等关键操作。 【详解】（1）以mRNA为模板合成cDNA的过程称为逆转录，需要用到逆转录酶；目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，说明不同生物密码子基本相同。 （2）由于ori复制原点中含有限制酶HindⅢ的识别序列，因此不能用限制酶HindⅢ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ对质粒进行双酶切；根据图中所给模板链可得知应将模板链的3′端连接到启动子一侧，所以EcoRⅠ限制酶序列被添加到引物的5′端，故得到5′－GAATTCCGGGAT－3′，BamHⅠ添加到非模板链引物的5′端，故得到5′－GGATCCCGGAAT－3′。 （3）将基因表达载体导入微生物细胞前，常用Ca2＋/CaCl2处理受体细胞，使其细胞壁通透性增大，处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组质粒的导入；重组后的质粒中含有硫链丝菌素抗性基因，所以含有重组质粒的大肠杆菌可在含有硫链丝菌素的培养基中生存；抗原与抗体的结合具有特异性，故可用抗原—抗体杂交进行检测，若结果为阳性，则说明kit基因已表达出胶原蛋白。 （4）大肠杆菌作为基因工程宿主细胞的优点：单细胞结构简单，繁殖快，遗传物质少，易培养等；大肠杆菌生产的胶原蛋白一般不具备天然状态下的活性是因为大肠杆菌为原核生物，细胞内缺乏内质网与高尔基体，无法对表达的蛋白质进行加工修饰。 【点睛】本题主要考查基因工程的基本操作技术，这些内容均是基因工程中构建重组载体的核心步骤，侧重考查对基因工程工具及操作逻辑的理解和应用。 13．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)人体内的t－PA蛋白能高效降解血栓，然而为心梗患者注射大剂量的基因工程t－PA会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的t－PA改良蛋白，显著降低出血的副作用。改良过程如图，图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列，回答下列问题： (1)科学家将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t－PA突变蛋白的生物技术手段属于__________范畴。获得性能优良的t－PA突变蛋白的正确顺序是________________（选择正确编号并排序）。 ①t－PA蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t－PA基因序列③检验t－PA蛋白的结构和功能④设计t－PA蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t－PA蛋白 (2)已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t－PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b中该突变位点的碱基是____________________，引物c中该突变位点的碱基是____________________。 (3)据图可知，PCR3时，需要的引物是__________，引物的作用是__________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因________________（答两点）。 (4)若获得的t－PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶__________切开，才能与t－PA突变基因高效连接。 (5)mlacZ表达产物会分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有______________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是____________________。 【答案】(1) 蛋白质工程 ①④②⑤③ (2) G/鸟嘌呤 C/胞嘧啶 (3) 引物a和引物d 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 退火（复性）温度过低、引物特异性不高 (4) XmaⅠ、BglⅡ (5) 新霉素和X－gal 长出的大肠杆菌菌落为白色 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 【详解】（1）由题干信息可知，生产改良t－PA蛋白的技术是先对天然的t－PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t－PA蛋白，因此属于蛋白质工程。蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，因此获得性能优良的t－PA突变蛋白的正确顺序是①t－PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t－PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t－PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t－PA蛋白→③检验t－PA蛋白的结构和功能。 （2）已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t－PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t－PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t－PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t－PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t－PA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C。 （3）由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合，故据图可知，重叠延伸时，需要的引物是引物a和引物d；DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。出现非目的序列产物的原因有：引物设计太短（或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性）、两引物之间碱基互补配对（形成引物二聚体）、复性温度过低、Mg2+浓度过高、DNA模板出现污染等。 （4）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割质粒，才能与目的基因t－PA改良基因高效连接。 （5）在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即新霉素抗性基因为标记基因，作用是便于筛选出成功导入质粒（普通质粒和重组质粒）的大肠杆菌。此外在培养基上还要加入X－gal，培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有mlacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的mlacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t－PA蛋白的工程菌。 14．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)我国科研团队从水稻中筛选出能调控耐高温性状的关键基因QT12，并将QT12基因导入水稻品种“华占”，获得的改良品种在高温下产量与品质均提升。回答下列问题： (1)科研团队利用PCR扩增QT12基因，引物是扩增过程的关键。根据QT12基因设计的四种引物如图所示，选用的引物组合应为______（选填“a”“b”“c”或“d”），理由是______。 (2)构建基因表达载体时，需要将QT12基因与启动子、终止子等连接，其中启动子的作用是______。若以质粒DNA分子为运载体，质粒上有标记的潮霉素抗性基因，则利用抗生素可初步筛选出含重组载体的水稻细胞，方法是______。 (3)将含QT12基因的表达载体导入水稻细胞后，需要通过______技术将单个细胞培育成完整植株。现要验证水稻的改良品种在高温下表现出更高的产量，请简要叙述实验思路和预期结果：______。为避免改良品种推广时发生基因污染，最好将目的基因导入细胞的______（填“细胞核”或“细胞质”），降低通过花粉扩散的风险。 【答案】(1) b、c PCR扩增时，引物会结合在模板链的3＇端并从自身的3＇端开始连接脱氧核苷酸 (2) 作为RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因转录 将导入目的基因的水稻细胞接种在含有潮霉素的培养基上，能生长的细胞即为含重组载体的细胞 (3) 植物组织培养 将改良品种和原品种在相同高温条件下种植，比较两者的产量 细胞质 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）PCR扩增时，引物要结合在模板链的3＇端，且从自身3＇端开始延伸子链，观察引物与模板链的位置关系，引物b结合在模板链上方的3＇端 、引物c结合在模板链下方的3＇端，能保证扩增出QT12基因，所以选b、c。 （2）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点，结合后能驱动基因转录出mRNA。质粒上有潮霉素抗性基因，含重组载体（有潮霉素抗性基因）的水稻细胞能在含潮霉素的培养基上生长，不含的则不能，所以将导入目的基因的水稻细胞接种在含潮霉素培养基上，能生长的就是含重组载体的细胞。 （3）植物组织培养可将植物单个细胞培育成完整植株，利用了植物细胞的全能性。要验证改良品种高温下产量更高，需控制单一变量（高温条件相同 ），将改良品种和原品种在相同高温下种植，比较产量，若改良品种产量高则结论成立。受粉时花粉的细胞核进入卵细胞，细胞质不进入卵细胞，因此将目的基因导入细胞质（如线粒体、叶绿体 ），可降低因花粉扩散导致的基因污染风险，所以导入细胞质。 15．(23-24高二下·福建厦门·期末)泡菜母水中含有丰富的微生物，这些微生物是多轮使用后选择出来的，具有较好的发酵性能。研究人员欲从泡菜母水中分离优质乳酸菌种，流程如下。 请回答： (1)步骤①使用的MRS培养基应为_________（填“固体”或“液体”）培养基。步骤②应采用_________法进行接种，可根据_________初步判断其为产乳酸的微生物，并将之选出。 (2)16S rDNA编码细菌核糖体16S rRNA，具有高度保守性，可用于菌种鉴定。提取初步筛选出的产乳酸微生物的DNA作为模板，依据_________的序列设计引物进行PCR扩增，利用_________技术检测PCR产物，并对目标条带对应的PCR样品纯化后测序，比对序列确定了3种乳酸菌L1、L2、L3。 (3)泡菜制作过程中需要使用高浓度盐水进行浸泡，其主要目的是_________。因此，需要对L1、L2、I3菌株进行耐盐能力鉴定，从中筛选出耐盐能力强的菌株，请设计一个实验结果记录表________。（ 泡菜制作时，盐水浓度通常为5%-20% ；培养24h后检测OD值作为菌株生长情况的指标） 【答案】(1) 液体 稀释涂布平板 出现透明圈 (2) 乳酸菌的16S rDNA/乳酸菌的16S rRNA 琼脂糖凝胶电泳 (3) 抑制杂菌生长 【分析】人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供 其生长繁殖的营养基质-培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。其中，不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基为液体培养基，呈固体状态的培养基为固体培养基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培 养基之一。微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。 【详解】（1）泡菜母水中含有很多的微生物菌种，使用步骤①的MRS培养基可以实现菌株的扩大培养，所以①使用的MRS培养基应为液体培养基。步骤②的目的是为了筛选产乳酸的微生物，所以要通过稀释涂布平板法接种。如果该微生物能够产乳酸，则该菌落周围会出现透明圈。 （2）提取初步筛选出的产乳酸微生物的DNA作为模板，由于16S rDNA编码细菌核糖体16S rRNA，具有高度保守性，具有种属特异性，据此根据乳酸菌的16S rDNA序列设计引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物。 （3）泡菜制作过程中需要使用高浓度盐水进行浸泡，高浓度的盐水能使某些微生物脱水死亡，所以其主要目的是抑制杂菌生长。实验目的是对L1、L2、I3菌株进行耐盐能力鉴定，从中筛选出耐盐能力强的菌株。所以选择一系列的盐浓度（依次为5%、10%、15%、20%），至少做三个重复、再求平均值，这样可以减少实验误差。通过检测OD值作为菌株生长情况的指标，据此设计表格如下： 地 城 考点05 基因表达载体的构建 一、单选题 1．(23-24高二下·福建厦门·期末)研究人员拟利用下图所示的目的基因片段和质粒构建基因表达载体。下列相关叙述错误的是（    ） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA AGATC↑T A．应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒 B．应选用T4 DNA连接酶连接目的基因与质粒 C．重组表达载体能被XbalⅠ识别并切割 D．目的基因以β链为模板链进行转录 【答案】C 【分析】E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端。 【详解】A、据表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可产生相同的黏性末端，由图可知，为了保证目的基因能正向接入载体，应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒，A正确； B、图中用SmaⅠ切割后产生平末端，用AvrⅡ和XbalⅠ切割后产生黏性末端，所以应用T4DNA连接酶目的基因与质粒，B正确； C、重组表达载体序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ识别，不能被二者切割，C错误； D、转录的方向为5'→3'端，据图可知，目的基因以β链为模板链进行转录，D正确。 故选C。 2．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（    ） A．用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA 连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法:将目的基因导入动物细胞最有效的方法是是微注射法:将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原—体杂交技术。 【详解】A、根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒，A正确； B、将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确； C、图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误； D、可采用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上，D正确。 故选C。 3．(24-25高二下·福建百校·期末)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图，PmeI、BamHI、SpeI、SacI为不同限制酶），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法错误的是（    ） A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因 B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeI和BamHI C．sfp和idgS基因表达时不是以T-DNA的同一条链为模板进行转录 D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上 【答案】B 【分析】由图可知，将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeI和BamHI，则会将终止子一同切除，故只能用BamHI；将idgS基因插入Ti质粒时可用SpeI和SacI以避免产生的黏性末端环化，增加构建成功的概率。 【详解】A、靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确； B、将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeI和BamHI，则会将终止子一同切除，故只能用BamHI，B错误； C、sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，转录是以DNA的一条链为模板进行的，由启动子方向可知：两基因转录的模板不同，C正确； D、将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。 故选B。 二、非选择题 4．(24-25高二下·福建三明·期末)抗凋亡因子Bcl-xL能与促凋亡蛋白Bax结合，阻止细胞凋亡。蛋白Bad能与Bcl-xL结合，释放Bax。为研究线粒体中p53蛋白与细胞凋亡的关系，研究人员利用pCMV-EGFP质粒，构建了pCMV-EGFP-p53、pCMV-EGFP-Bad和pCMV-EGFP-p53-Bad基因表达载体（EGFP代表增强型荧光蛋白基因）。图1为pCMV-EGFP-p53-Bad基因表达载体构建过程和部分限制酶切割位点。 (1)基因工程的核心步骤是___________，该步骤的目的是______________。 (2)PCR扩增Bad基因时引物的作用是______，图2所示引物不适合用于PCR，原因是____________。 (3)若Bad基因的α链为转录的模板链，则在引物1和引物2的_____（5'端或3'端）添加的限制酶分别是_______，在pCMV-EGFP-p53-Bad表达载体中，EGFP的主要作用是______________。 (4)研究人员将pCMV-EGFP质粒及上述三种基因表达载体导入肝细胞，分析细胞的死亡率相对值及细胞内Bcl-xL的含量，结果如图3。据图分析推测p53与Bad蛋白在调控细胞死亡过程中可能存在_______关系（填“协同”或“拮抗”），判断依据是___________。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传和表达 (2) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 引物1自身会出现局部碱基互补配对而失效 (3) 5’端 XhoⅠ、NheⅠ 作为标记基因，用于反映p53和Bad基因的表达情况 (4) 协同 与 EGFP 组相比，p53 或 Bad 组细胞死亡率升高、Bcl - xL 含量降低，而 p53 - Bad 组细胞死亡率更高、Bcl - xL 含量更低 【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】（1）基因工程核心是基因表达载体的构建；目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。 （2）引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，图2所示引物不适合用于PCR，这是因为引物1自身会出现局部碱基互补配对而失效，因而不能获取相应的产物。 （3）若Bad基因的α链为模板链，则在引物1和引物2的5'端添加的限制酶分别是XhoⅠ、NheⅠ，便于和质粒连接，这里不选择MunⅠ的原因是其在质粒中有两个限制酶切割位点，且会破坏标记基因EGFP，在pCMV - EGFP - p53 - Bad克隆载体中，EGFP作为标记基因，用于反映p53和Bad基因的表达情况。 （4）p53、Bad 单独作用时，细胞死亡率和 Bcl - xL 含量变化协同→p53 与 Bad 协同促进细胞凋亡；依据是 “p53 - Bad 组细胞死亡率高于 p53、Bad 单独作用组，且 Bcl - xL 含量更低”。 研究人员将pCMV - EGFP质粒及构建的pCMV - EGFP - p53、pCMV - EGFP - Bad、pCMV - EGFP - p53 - Bad载体导入肝细胞系，分析细胞的死亡率相对值及细胞内Bcl - xL的含量，结果如图3。结合图示可知，p53 - Bad 组细胞死亡率最高，Bcl - xL 含量最低，较EGFP组，p53、Bad 单独作用时，细胞死亡率升高， Bcl - xL 含量降低，但变化量都低于p53-Bad组，说明p53与Bad蛋白在调控细胞死亡过程中可能存在协同关系。 5．(23-24高二下·福建南平·期末)瘦素是一种由脂肪组织分泌的肽类激素，参与脂肪代谢的调节。科研人员改造了 P载体并进一步构建瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况，为肥胖患者的治疗提供新思路。瘦素基因及P载体的结构如下图所示，P载体上含有能在真核细胞中表达的绿色荧光蛋白基因（GFP）。回答问题。 (1)运用PCR 技术扩增瘦素基因应选择图中的引物________，PCR 每次循环一般分为变性→复性→_______。 (2)利用琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定时，结合上图分析，应选用_______分别对瘦素基因的PCR 产物、P载体和重组质粒进行切割，以确定重组质粒是否构建成功。若重组质粒构建成功，则电泳结果应为________（填“甲”或“乙”）图，理由是________。 (3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中的表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中的表达则具有卡那霉素抗性。本实验为筛选出转化成功的细胞，应在培养基中添加_______。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，原因可能是Kanʳ/Ncor抗性基因在真核细胞与原核细胞中具有________，驱动基因转录出不同的 mRNA；同时从细胞结构上分析，由于_______，导致Kanr/Neor在原核细胞中翻译出的多肽仅能进行简单的修饰和加工。 (4)分析P 载体插入绿色荧光蛋白基因（GFP）的目的是_______。 【答案】(1) 1和4 延伸 (2) HindⅢ和BamHI 乙 重组质粒经酶切电泳后，产生两个片段，且片段大小分别与瘦素基因PCR产物和P载体相近 (3) 新霉素 不同的启动子 原核细胞无内质网、高尔基体等细胞器 (4) 可通过GFP基因表达出的荧光特性及强度检测目的基因的表达情况 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）根据碱基互补配对原则，及DNA延伸方向可知，运用PCR 技术扩增瘦素基因应选择图中的引物1和4，PCR 每次循环一般分为变性→复性→延伸。 （2）由于HindⅢ和BamHI在P载体上的切割位点非常接近，因此用HindⅢ、BamHI对P载体进行切割后，会形成一个大片段，接近4700bp，一个超小片段可忽略，即对P载体酶切产物电泳后，只出现4700bp的条带，若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用HindⅢ、BamHI对重组质粒切割后，会出现两个片段，一个是瘦素基因，一个是近4700bp的片段，则电泳结果会出现两个条带，结果如图乙。 （3）科研人员改造了P载体并进一步构建瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况，小鼠是真核生物，Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中的表达具有新霉素抗性，则本实验为筛选出转化成功的细胞，应在培养基中添加新霉素。 Kanr /Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子或转录后的加工不同或翻译后的加工不同，因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。由于原核细胞无内质网、高尔基体等细胞器，导致Kanr/Neor在原核细胞中翻译出的多肽仅能进行简单的修饰和加工。 （4）P 载体插入绿色荧光蛋白基因（GFP），则可通过GFP基因表达出的荧光特性及强度检测目的基因的表达情况。 6．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)已知镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常；而人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。回答下列问题： (1)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作______（填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作______。 (2)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____，以其作为模板，在_____酶的作用下反（逆）转录合成cDNA．cDNA与载体需在限制酶和______酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (3)如图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X－gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是_____或_____。 (4)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外，还可以通过_____来获得。据图可知，该目的基因的具体功能是______。 (5)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入____，培养一段时间挑选出____色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 【答案】(1) 不属于 没有对现有的蛋白质进行改造（或没有对基因进行修饰） (2) mRNA（或RNA） 逆转录 DNA连接 (3) 只用BamHⅠ 同时用EcoRⅠ和BamHⅠ (4) 人工合成（或PCR技术扩增） 指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成 (5) 青霉素和X－gal 白 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法:将目的基因导入动物细胞最有效的方法是是微注射法:将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-体杂交技术。 【详解】（1）蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质进行改造或合成新的基因，因此不属于蛋白质工程。 （2）因为血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反（逆）转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶协助。 （3）根据图解可知，含有目的基因的外源DNA和载体上都有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRV的识别序列和切割位点，用EcoRV切割会破坏目的基因，因此图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是只用BamHⅠ或同时用EcoRⅠ和BamHⅠ。 （4）获取目的基因的方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。根据图中④目的基因最终产生乙肝病毒外壳进行接种，说明该目的基因具体功能是指导合成乙肝病毒蛋白质外壳。 （5）用限制酶BamHⅠ切割时破坏了lacZ基因，但没有破坏青霉素抗性基因，因此为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X－gal，根据题干信息“质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X－gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色”可知，培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 7．(24-25高二下·福建宁德·期末)科研人员利用基因工程改造大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌。图1表示利用PCR技术获取胰岛素基因（①②③④表示相关引物的部分序列），图2表示质粒的结构。 注：1.图中限制酶的识别序列和切割位点为：BamHⅠ：5＇—G↓GATCC-3＇，EcoRⅠ：5＇—G↓AATTC—3＇，SalⅠ：5＇—G↓TCGAC—3＇；2.LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色。 回答下列问题： (1)从__________细胞中提取mRNA，经__________过程得到cDNA，然后设计引物并利用PCR技术扩增胰岛素基因。 (2)根据图1判断__________链为胰岛素基因转录的模板链。已知胰岛素基因α链的部分碱基序列为5＇—TTTAAA—3＇，强启动子α链的部分碱基序列为5＇—GCTG…CATG—3＇，为确保胰岛素基因与质粒正向连接，利用PCR扩增胰岛素基因时，基因上游应选__________（填“①”或“②”或“③”或“④”）作为引物，其部分碱基序列为__________。（填序号） A．5＇—GGATCCCGAC…GTACAAATTT—3＇ B．5＇—GGATCCGCTG…CATGTTTAAA—3＇ C．5＇—GTCGACGCTG…CATGTTTAAA—3＇ D．5＇—GTCGACCGAC…GTACAAATTT—3＇ (3)将构建的基因表达载体与经__________处理的大肠杆菌，在适宜的条件下共培养一段时间，再接种到含__________的培养基上培养，筛选出呈__________色的菌落，即可得所需菌落。 (4)从上述工程菌的培养液中可以提取到胰岛素原，经鉴定该胰岛素原无生物活性。从大肠杆菌的结构分析，胰岛素原无生物活性的主要原因是__________。 【答案】(1) 胰岛B 逆转录 (2) β ② B (3) Ca2+或CaCl2 氨苄青霉素和X-gal 白 (4)大肠杆菌无内质网和高尔基体等结构，无法对胰岛素原进行加工 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由于基因的选择性表达，只有胰岛B细胞中胰岛素基因才能转录出mRNA，并翻译出胰岛素。从胰岛B细胞中提取mRNA，经逆转录过程得到cDNA，然后设计引物并利用PCR技术扩增胰岛素基因。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，并起始转录，转录的方向是按照模板链的3'端到5'端进行。由图可知，强启动子在胰岛素基因的左侧，转录的方向是从左向右，因此，β链为胰岛素基因转录的模板链。DNA复制的方向是从模板链的3'端开始，因此PCR所需的引物组合是②③；据图可知，在构建重组DNA分子时需要用到BamHI和SalI识别序列，因此在引物②的5′端添加BamHI识别序列和强启动子，在引物③的5′端添加SalI识别序列。已知胰岛素基因的β链为转录模板，则α链为编码链，胰岛素基因α链的部分碱基序列为5＇—TTTAAA—3＇，强启动子α链的部分碱基序列为5＇—GCTG…CATG—3＇，为确保胰岛素基因与质粒正向连接，引物②的5'端的部分碱基序列为5＇—GGATCCGCTG…CATGTTTAAA—3＇，B正确，ACD错误，故选B。 （3）将构建的基因表达载体与经Ca2+或CaCl2处理的大肠杆菌，在适宜的条件下共培养一段时间，再接种到含氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养。基因表达载体上含有抗氨苄青霉素基因，所以导入基因表达载体的大肠杆菌可以在含有氨苄青霉素的培养基上存活下来，而未导入的会死亡。目的基因的插入会破坏LacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以在培养基中筛选出白色的菌落，即可得所需菌落。 （4）从上述工程菌的培养液中可以提取到胰岛素原，经鉴定该胰岛素原无生物活性。从大肠杆菌的结构分析，胰岛素原无生物活性的主要原因是大肠杆菌无内质网和高尔基体等结构，无法对胰岛素原进行加工。 地 城 考点06 将目的基因导入受体细胞 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T-DNA插入的具体位置。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其拟核上 B．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．若用PCR技术扩增循环n次，需要2n-1个引物 【答案】B 【分析】农杆菌的转化作用原理：农杆菌细胞中含有Ti质粒，其上的T-DNA在侵染植物细胞时，会整合到植物细胞的染色体DNA上；把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】A、农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其Ti质粒上，A错误； B、不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，B正确； C、耐高温的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、扩增循环n次，得到2n个DNA分子，共有2n+1条DNA单链，只有最初的两条母链不需要引物，共需要2n+1-2个引物，D错误。 故选B。 2．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)科研工作者将从某真菌中获得的C1酶基因（可编码纤维素酶）与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入大肠杆菌，以期短期内获得大量纤维素酶。下列相关叙述错误的是（    ） A．将重组质粒导入大肠杆菌前，需要先用Ca²⁺处理大肠杆菌 B．从真菌中克隆得到Cl酶基因的过程中需要用到PCR技术 C．为实现高效连接，可用同一种限制酶切割Cl酶基因和HT质粒两端的碱基序列 D．从大肠杆菌中获得的纤维素酶的空间结构可能不同于从真菌中获得的 【答案】C 【详解】A、用Ca²⁺处理大肠杆菌可使其细胞壁通透性改变，成为感受态细胞以便吸收重组质粒，A正确； B、克隆目的基因（C1酶基因）可通过PCR技术扩增特定DNA片段，B正确； C、若仅用同一种限制酶切割目的基因和质粒，两者黏性末端相同，易导致质粒自身环化或反向连接，降低重组效率。通常需用两种酶实现定向连接，C错误； D、大肠杆菌缺乏真核生物的内质网和高尔基体，无法对蛋白质进行加工，导致表达的酶空间结构可能不同，D正确； 故选C。 3．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)下图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（　　） A．基因工程的操作程序中核心步骤是目的基因的筛选与获取 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．农杆菌转化法是指上图中的②→③的过程 D．基因工程的原理是基因重组，其变异为定向变异 【答案】D 【分析】农杆菌转化法的原理是：农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA分子中。 【详解】A、基因工程操作程序中核心步骤是基因表达载体的构建，而不是目的基因的筛选与获取，A 错误； B、③侵染植物细胞后，是重组 Ti 质粒上的 T - DNA 整合到④的染色体上，B 错误； C、农杆菌转化法是指将目的基因插入 Ti 质粒的 T - DNA 上，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞并整合到植物细胞染色体的 DNA 上，应该是图中的①→②→③→④的过程，C 错误； D、基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，原理是基因重组，能按照人们的意愿定向改造生物的性状，其变异为定向变异，D 正确。 故选D。 4．(23-24高二下·福建泉州·期末)下列关于目的基因导入受体细胞的叙述错误的是（　　） A．目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化 B．可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使它能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重组的基因表达载体导入其中 C．可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 D．农杆菌只能侵染单子叶植物和裸子植物 【答案】D 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是：显微注射法；将目的基因导入微生物绌胞的方法是感受态细胞法。 【详解】A、基因表达载体中包含了目的基因，基因工程中的转化是指目的基因进入受体细胞，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，A正确； B、可以用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA分子（使大肠杆菌处于感受态细胞状态），有利于重组的基因表达载体导入其中，B正确； C、花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注射到子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，C正确； D、农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物无感染能力，D错误。 故选D。 二、非选择题 5．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。 (1)利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物的____________（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是_____，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是__________。 (2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5'-__________-3'和5'_______-3'（引物长度均为12个碱基）。 (3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入Ti质粒的_______上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入________，从而使其得以维持稳定和表达。 (4)乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。 正常植株 转基因A植株 转基因B植株 AC酶 ATGL酶 ①在分子水平上，用_____方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述表格结果。 ②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是________。 【答案】(1) 5'端 EcoR V和Xbal 引物特异性差 (2) -GATATCATGGGC- -TCTAGACTAGTG- (3) T-DNA 染色体DNA (4) 抗原—抗体杂交 LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加；VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）DNA聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从引物的3'端延伸DNA链，因此PCR扩增需要引物。利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。由题意和题图可知：基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，而Luc中存在BamH I识别序列，BamH I酶切可将Luc切断，单一酶切后可能会导致载体、LEA基因自身环化及LEA反向连接，因此引物添加序列对应的限制酶是 EcoR V和Xbal。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是设计的引物特异性差。 （2）为了构建基因表达载体甲，在LEA基因左右两端分别添加相应的限制酶 EcoRV和Xbal.识别序列，由于引物只能引导子链从5'→3'延伸，根据碱基互补配对原则，用PCR扩增时的两个引物对应的序列为:5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'。 （3）农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到油菜受体细胞中染色体DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。 （4）①AC酶和ATGL酶的化学本质是蛋白质，检测其含量，在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术。 ②根据检测结果，转基因A植株的AC酶表达量升高，转基因B植株的ATGL酶表达量变低，据此可推测在干旱胁迫的环境下，LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加；VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低。 6．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁重要组成部分，其功能障碍可导致主动脉瘤。M蛋白（与肌肉收缩相关，由M基因控制合成）在SMC中含量高，其他细胞中几乎不存在。科研团队为获得血管SMC被特异性标记的模型鼠，开展了系列实验。 (1)获得融合基因：如图1所示，利用_________技术获得Cre重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因（CE）。欲得到大量完整的CE基因，该技术的最后一个环节应选用引物_________。 (2)构建基因表达载体：为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠的____基因的启动子之后。已知CE基因的连接处有XbaI的识别序列，图2为用于构建CE基因表达载体的质粒的部分示意图。据图可知，可用限制酶________对载体质粒进行双酶切，在CE融合基因的两端分别添加限制酶________的识别序列。 (3)将目的基因导入受体细胞：将构建成功的表达载体通过________法导入小鼠的_______作为受体细胞，培养后获得小鼠A。 (4)获得CE杂合小鼠C：构建含Stop和tdT的表达载体并获得小鼠B，让小鼠A与B进行杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C，如图3。 在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。用药物T饲喂小鼠C后，借助一定的技术手段可观察到________。 【答案】(1) PCR P1、P4 (2) M Xba I、EcoR I Spe I、EcoR I (3) 显微注射 受精卵 (4)SMC发出红色荧光 【分析】基因工程的基本步骤： （1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）； （2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）； （3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）如图1所示，可以利用PCR技术获得Cre重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因(CE)。欲得到大量完整的CE基因，需要将两个基因均复制，而DNA聚合酶只能从引物的3'-末端延伸子链，因此该技术的最后一个环节应选用引物P1、P4。 （2）构建基因表达载体：由于M蛋白在SMC中含量高，因此为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠的M基因的启动子之后。图2为用于构建融合基因表达载体的质粒的部分示意图。据图可知，可用Xba I、EcoR I限制酶对载体质粒进行双酶切，不能用Spe I酶和BamH I酶，因为会切割标记基因；不能使用Sma Ⅰ，因为其切割后产生的是平末端，连接效率较低。已知CE基因(融合基因)的连接处有Xba I的识别序列，故不能用Xba I切割目的基因，依据表达载体使用的限制酶、启动子的位置以及各限制酶的识别序列可知，在CE融合基因的两端分别添加Spe I（该酶切割后形成的黏性末端与Xba I相同）、EcoR I限制酶的识别序列。 （3）将目的基因导入受体细胞：将经筛选后构建成功的表达载体通过显微注射法导入小鼠的受精卵中，培养后获得小鼠A。 （4）在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。用药物T饲喂小鼠C后，借助一定的技术手段可观察到SMC发出红色荧光。 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)斑马鱼是一种常用的模式动物，具有体外受精、体外　发育、胚胎透明等诸多优势。研究人员建立一种绿色荧光蛋白（EGFP）在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达的转基因斑马鱼品系，为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。请回答: (1)基因表达载体的构建 ①研究人员构建了如图1所示基因表达载体，其中Tol2序列 可携带ttn.2启动子和EGFP基因随机插入染色体DNA的任意位点;ttn.2启动子的作用是__________。 ②构建完成的表达载体导入大肠杆菌感受态细胞，在含_____________的平板上培养一段时间后挑选单菌落，扩大培养后提取质粒DNA并通过酶切、测序验证是否构建成功。若构建成功，则用限制酶StuI切割后进行琼脂糖凝胶电泳，将观察到_____个条带。 (2)将表达载体导入受体细胞通常使用__________法将构建好的表达载体导入斑马鱼的受精卵中。 (3)反向PCR鉴定整合位点 ①通过反向PCR扩增并对产物进行测序（如图2），再将测序结果与基因序列数据库中已知斑马鱼DNA序列进行比对，可以判断出目的片段所插入的染色体及所在的位置。已知目的片段的一条单链序列为:5＇-GCAATGCGTAGCCTCT.............AACTATGCGCTCATGA-3＇（虚线处省略了部分核苷酸序列），则在步骤Ⅲ中选用的PCR引物是__________。 A．5＇-TTGATACGCGAGTACT-3＇ B．5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇ C． 5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇ D．5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇ ②对成功导入上述表达载体的3个斑马鱼品系的反向PCR产物进行电泳，结果如图3。据图分析，出现图中现象的原因最可能是__________。 【答案】(1) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动EGFP基因在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异性转录出mRNA 氨苄青霉素 2 (2) 显微注射 (3) BC 1号品系插入了1个目的片段，2、3号品系插入了2个目的片段 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：分子水平鉴定用抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）①启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动基因的转录。因此，ttn.2启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动EGFP基因在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异性转录出mRNA。 ②构建的表达载体含有氨苄青霉素抗性基因，因此需在含氨苄青霉素（或对应抗性标记的抗生素）的平板上筛选转化成功的大肠杆菌。如图1所示，基因表达载体上存在2个StuI的酶切位点，用限制酶StuI切割后会得到长度不同的2条片段，电泳后得到2条条带。 （2）通常使用 显微注射法 将基因表达载体直接注入受精卵的细胞质或细胞核。 （3）已知目的片段的一条单链序列为:5＇-GCAATGCGTAGCCTCT.............AACTATGCGCTCATGA-3＇，其互补链的序列为3＇-CGTTACGCATCGGAGA.............TTGATACGCGAGTACT-5＇，根据反向PCR扩增的要求，应在两端选择反向引物，故引物序列为 5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇和5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇。综上所述，AD错误，BC正确。 故选BC。 分析图3，1号品系有1个条带，说明1号品系插入了1个目的片段，2、3号品系有2个条带，说明2、3号品系插入了2个目的片段。 8．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)科研人员利用农杆菌转化法，将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。利用含Pin-Ⅱ的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程如图所示，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别位点如表所示。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，应该选择的引物是________，引物的作用是________。为使Pin-Ⅱ与Ti质粒正确连接，应在所选引物的5′端分别添加限制酶________的识别序列。 (2)为了更好地将表达载体导入农杆菌，一般要先用________处理农杆菌细胞，目的是________。 (3)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，应在含________的培养基中进行筛选。为检测转基因杨树的Pin-Ⅱ是否成功表达出相应蛋白质，常用的方法是________。 【答案】(1) 引物2和引物3 使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、HindⅢ (2) Ca2+ 使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 (3) 新霉素 抗原—抗体杂交法 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）根据引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物3'端开始连接脱氧核苷酸，利用PCR扩增目的基因时，应该选择引物2和引物3。为使Pin-Ⅱ与T质粒正确连接，应在所选引物的5'端添加限制酶Kpn I、HindⅢ的识别位点，因为EoRI会破坏目的基因。 （2）原核生物作为受体细胞时，一般要先用Ca2+处理受体细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （3）用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，T-DNA区段会导入杨树细胞的染色体，T-DNA区段含有新霉素抗性基因，因此应在含新霉素的培养基中进行筛选。为了检测目的基因是否表达，需从转基因杨树中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，该方法称为抗原一抗体杂交法。 地 城 考点07 目的基因的检测与鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析正确的是（    ） A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因能翻译，但不能转录 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因无法表达 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白和无Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞 【答案】C 【详解】A、若检测到Bt抗虫蛋白，说明基因已完成转录和翻译，A错误； B、若检测到mRNA但无蛋白质，说明基因完成转录但翻译受阻，B错误； C、若检测到抗虫基因但无mRNA，可能是基因反向插入导致无法转录，C正确； D、由题干信息可知，“鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”，说明导入受体细胞的DNA分子含有目的基因，D错误。 故选C。 2．(24-25高二下·福建福州福清·期末)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错误的是（　　） A．可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录 B．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶III C．利用PCR从海鱼中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 D．要用含有卡那霉素的选择培养基筛选含抗冻基因的番茄细胞 【答案】D 【详解】A、可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录，这属于分子水平的检测，A正确； B、限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因影响后续的筛选，限制酶Ⅱ有两个识别位点，会影响目的基因连接在正确的位置，因此选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶Ⅲ，B正确； C、利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物，目的是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C正确； D、四环素抗性基因位于T-DNA上，要用含四环素的选择培养基筛选含抗冻基因表达载体的受体细胞，D错误。 故选D。 3．(24-25高二下·福建三明·期末)一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸（密码子:ACA）换成丝氨酸（密码子:UCU），能显著降低其诱发出血的副作用。下列说法正确的是（    ） A．改造后的基因中决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为TCT B．构建重组质粒时需要选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒pCLY11 C．使用T4DNA连接酶不能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 【答案】B 【详解】A、由题意可知，是将t-PA第84位的半胱氨酸（密码子：ACA）换成丝氨酸（密码子：UCU），丝氨酸密码子为 UCU，根据碱基互补配对原则，模板链碱基序列为 AGA，A错误； B、根据碱基互补配对原则，t-PA基因的左端黏性末端为CCGG-，为XmaⅠ酶切得到，t-PA基因的右端黏性末端为GATC-，为BglⅡ酶切得到，质粒需要用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相同的黏性末端，因此质粒需选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒pCLY11，B正确； C、T4DNA连接酶能连接黏性末端，还可以连接平末端，使用T4DNA连接酶能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接，C错误； D、由于重组质粒含有新霉素抗性基因，所以成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，mlacZ表达产物会使细胞呈蓝色，否则细胞呈白色，成功导入重组质粒后mlacZ被破坏，成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现具有抗性的白色菌落，D错误。 故选B。 4．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．基因工程核心步骤需要的工具酶有DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 C．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 【答案】A 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确； B、基因工程核心步骤是基因表达载体的构建，需要的工具酶是限制酶、DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，B错误； C、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，因为卡那需素抗性基因在载体的非T-DNA区域，即使T-DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，C错误； D、由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 故选A。 5．(24-25高二下·福建三明·期末)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组 B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞 D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜 【答案】C 【分析】农杆菌转化法：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。据此如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误； B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误； C、可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确； D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D错误。 故选C。 二、非选择题 6．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)MS2噬菌体是一种RNA病毒，其遗传物质由控制合成A蛋白、衣壳蛋白（CP）、复制酶（REP）等蛋白的基因组成。A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，颗粒中含REP，缺乏REP时噬菌体不能增殖形成噬菌斑。将逆转录得到的MS2基因组中的REP基因拆分成REP-a和REP-b基因片段，并将REP-a基因与X基因融合，将REP-b基因与Y基因融合，若X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，则会使REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，相关过程如下图。回答下列问题： (1)若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有______（填“互补末端”或“不同末端”）的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因。重叠PCR中_______过程所需温度最低。若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助_______酶将两个片段连接起来。 (2)质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含______段。质粒1的表达产物________与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs。 (3)将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成_________，图中培养基出现阳性结果，则说明__________。 【答案】(1) 互补末端 复性 限制酶和DNA连接 (2) REP-b基因 A蛋白和CP (3) 噬菌斑 X、Y蛋白之间有相互作用 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有互补末端的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因；PCR一次循环过程包括变性—复性—延伸，其中复性过程所需温度最低（50℃左右）；若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接 酶（连接切割后的目的基因和运载体）将两个片段连接起来。 （2） 分析题意及题图可知， 质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含 REP-b基因片段；由题意可知，A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，结合图示可知，质粒1的表达产物包括A蛋白和衣壳蛋白（CP），故质粒1的表达产物A蛋白和CP与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后 形成VLPs。 （3）将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成噬菌斑（LPs侵染宿主后，如果形成噬菌斑，说明VLPs具有感染性）；培养基出现阳性结果（形成噬菌斑）表明X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，使得REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，从而使得VLPs能够感染宿主并形成噬菌斑 7．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)研究表明，基因S参与水稻盐碱胁迫的应答过程，该基因过表达可降低水稻植株对盐碱胁迫的敏感性。现利用基因S获得过表达基因SP（由强启动子驱动S基因的编码区过表达），从而培育耐盐碱水稻新品种。请回答下列问题： (1)如图1所示，可利用________技术从水稻基因组DNA中扩增目的基因S，欲使获得的基因S两端携带限制酶识别序列，需要在引物的________端添加。 (2)构建如图基因表达载体时，需用________酶切割目的基因和质粒，酶切后质粒上保留的黏性末端序列分别为5＇-________-3＇和5＇-________-3＇。潮霉素抗性基因和基因S转录时的模板链________（填“是”或“不是”）同一条链。 (3)据信息可知，过表达基因SP由________（答出2部分）组成。可使用________筛选转化成功的水稻愈伤组织细胞。 (4)已知水稻细胞中也存在基因S，由于其启动子为普通启动子而无法高效表达，导致水稻无法耐盐碱。现获得有上述抗生素抗性水稻甲～丁，为进一步鉴定甲～丁的基因型，通过PCR技术将相应启动子与基因S整体扩增出来，应选择图2中的引物组合是________。部分序列信息及可选用的酶切位点如图3所示，PCR产物利用KpnⅠ完全酶切后的电泳结果如图4所示。据图可判断甲的基因型为________。 【答案】(1) PCR 5' (2) SacⅠ和EcoRⅠ AGCT AATT 不是 (3) 强启动子和基因S编码区 含有潮霉素的培养基 (4) C和D SPS 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）扩增目的基因S最常利用 PCR 获取和扩增。PCR扩增时，需要利用引物，引物与模板链的3'端结合，在耐高温DNA聚合酶的作用下，从引物的3'端进行延伸合成DNA子链，所以欲使获得的基因S两端携带限制酶识别序列，需要在引物的5'端添加。 （2）目的基因两端存在Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ限制酶切割位点，质粒中也存在Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ限制酶切割位点且位于启动子和终止子之间，所以构建基因表达载体时，可以用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切割目的基因和质粒。Sac I切割后形成的黏性末端序列为5′—AGCT—3'，EcoR I切割后形成的黏性末端序列为5′—AATT—3′。转录时的DNA上的模板链方向均为3'→5′，潮霉素抗性基因和基因S的启动子方向相反，说明转录的方向相反，因此潮霉素抗性基因和基因S转录时的模板链不是同一条链。 （3）由题干中“现利用基因S获得过表达基因SP（由强启动子驱动S基因的编码区过表达）”可知，过表达基因SP由强启动子和基因S编码区组成。Ti质粒中的T-DNA中含有潮霉素抗性基因，T-DNA可以携带潮霉素抗性基因整合到水稻细胞染色体DNA上，因此可以使用含有潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻愈伤组织细胞。 （4）引物与模板链的3'端结合，若要通过PCR技术将相应启动子与基因S整体扩增出来，应选择的引物组合为C和D。基因S由普通启动子和基因S编码区等构成，基因SP由强启动子和基因S编码区等组成，根据图3中碱基序列，基因S部分碱基序列为5'…GCAATTGGCCTACCCACCTGACGAATCCAA…3'，基因SP部分碱基序列为5'…GCAATTGGCCTAGGTACCTGACGAATCCAA…3'。PCR扩增基因S和SP后，基因SP中含有KpnI的酶切位点，酶切后形成两条较小的条带，即图4的下面两条带；而基因S中没有KpnI的酶切位点，酶切后形成一个条带，位于最上方。因此甲、丙的基因型均为SPS，乙、丁的基因型为SPSP。 8．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)为构建效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1中的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录出来的短链RNA与目的基因发生碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，能敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 (1)大肠杆菌的LacZ基因表达产物能使X-gal分解产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因。大肠杆菌在含_______的培养基上（添加了X-gal）培养，出现_______色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 (2)Cas9的表达量与敲除效率有关，但表达过量会对大肠杆菌产生毒性。为评估毒性和敲除效率，分别用ABCDE启动子对Cas9进行转录，结果如图2。其结果表明，启动子_____对细胞毒性最小。综合考量敲除效率和毒性，应选择启动子______作用于该系统。 (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在LacZ基因被成功敲除的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为_____（填选项）。 A．含有质粒1和质粒2  B．只有质粒1 C．只有质粒2         D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板中筛选出质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，请简要写出实验设计思路并预测实验结果。________。 【答案】(1) 四环素和卡那霉素 白 (2) C A (3) B 平板中以蔗糖为唯一碳源无抗生素，且置于37℃环境中培养，生长出来的菌落即为质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因（LacZ基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 （2）Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。 （3）①质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，ACD错误。 故选B。 ②试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：在以蔗糖为唯一碳源且无抗生素的平板，在37℃环境中培养，能生长出来的菌落即为质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌。 9．(24-25高二下·福建莆田·期末)西瓜是重要的经济作物，西瓜果实中C基因编码的C蛋白会影响西瓜的品质。科研工作者利用PCR和Gibson无缝克隆技术（三酶协同）构建了C-GFP基因表达载体，并进行了相关研究。实验流程如下： (1)PCR的每次循环一般分为______三步。过程②中设计引物3和引物4的序列时，应根据______两端的序列进行设计。 (2)Gibson无缝克隆技术中用到的三酶分别是T5核酸外切酶、DNA聚合酶和______。 (3)将构建的C-GFP基因表达载体转入农杆菌，培养筛选获得6个农杆菌单菌落，用PCR技术对其进行DNA检测，处理如下。 组别 编号1-6 对照组1 对照组2 模板 1-6菌落中农杆菌DNA ______ 普通农杆菌DNA PCR反应 PCR反应体系必需物质 琼脂糖凝胶电泳结果 对照组1的模板是______，基于上述实验结果______，（填“能”或“不能”）判定2号、5号农杆菌成功表达了C-GFP融合蛋白，原因是______。 (4)实验结果显示，转化成功的果实细胞能观测到细胞质和细胞核均发出绿色荧光。据此推测，通过构建上述基因表达载体获得C-GFP融合蛋白的目的是________。 【答案】(1) 变性、复性和延伸 C基因和线性化Ti质粒 (2)DNA连接酶 (3) C-GFP 基因表达载体 不能 出现条带只能说明 2、5 农杆菌有成功转入 C-GFP 基因，该融合基因是否成功表达出 C-GFP 融合蛋白还需进行转录和翻译水平的检测 (4)通过观察绿色荧光来确定C蛋白的合成情况及其分布场所 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： （1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 （2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 （3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）PCR 每次循环分变性（高温使 DNA 双链解旋 ）、复性（低温使引物与模板结合 ）、延伸（中温使 Taq 酶催化子链合成 ）三步。过程②是扩增 C 基因，引物 3 和引物 4 需根据C基因和线性化Ti质粒两端序列设计，才能特异性结合并扩增。 （2）Gibson 无缝克隆利用T5核酸外切酶切出黏性末端、DNA 聚合酶填补缺口、DNA 连接酶连接片段，所以三酶是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶。 （3）实验检测农杆菌是否含重组载体，对照组1应是含C-GFP 基因表达载体的DNA（或C-GFP基因表达载体）。PCR 检测仅能说明农杆菌含目的基因，而基因表达包括转录和翻译，无法证明翻译出融合蛋白；且 2 号、5 号虽 PCR 检测有目的基因，但不确定是否转录和翻译，因此基于上述实验结果不能判定2号、5号农杆菌成功表达了C-GFP融合蛋白。 （4）C-GFP融合蛋白中GFP（绿色荧光蛋白）可发荧光，通过观察荧光分布能定位C蛋白在细胞内的分布。 10．(24-25高二下·福建福州福清·期末)农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草（一种沉水植物）染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图1所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题： (1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据__________设计特异性引物序列。在PCR中，引物的作用是使__________酶能够从引物的__________端开始连接脱氧核苷酸。 (2)将基因mpd和ophc2拼接成融合基因。在转录时，融合基因共用__________，因而基因mpd的a链的5'端与基因ophc2的__________（填“a链”或“b链”）的3'端相连。 (3)为构建融合基因，并确保融合基因按照正确的方向插入图2质粒pBI121中，在图1引物的5'端加入特定的限制酶切割位点。已知引物2上加入BamHI位点，其余三种引物加入的分别是：引物1加入______位点，引物3加入______位点，引物4加入______位点。 (4)将受体细胞接种到添加__________的培养基中进行培养，将筛选出的受体细胞经植物组织培养技术获得植株。还需在__________水平检测转基因苦草降解有机磷农药的能力，简要写出实验思路：__________。 【答案】(1) 基因mpd和ophc2的核苷酸序列 Taq/热稳定DNA聚合 3' (2) 一个启动子 b链 (3) XbaⅠ Hind Ⅲ BamHⅠ (4) 卡那霉素 个体 选取生长状况相同的转基因苦草和非转基因苦草，分别置于含有等量有机磷农药的相同水体中，一段时间后检测水体中有机磷农药的剩余量，比较两者的降解能力 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）在利用PCR技术扩增基因时，需要根据目的基因（基因mpd和ophc2）两端的碱基序列设计特异性引物序列。因为引物要与目的基因的特定区域结合，引导DNA聚合酶进行DNA合成。在PCR中，引物的作用是使热稳定DNA聚合酶（Taq酶）能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸添加到已有核酸链的3' - OH末端。 （2）将基因mpd和ophc2拼接成融合基因，在转录时，融合基因共用一个启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录过程。由于融合基因共用启动子和终止子，因此基因mpd和ophc2的转录模板链应在DNA的一条链上，因此将基因mpd和ophc2拼接成融合基因时，基因mpd的a链的5′端与基因ophc2的b链的3'端相连。 （3）为了构建融合基因并确保其按照正确方向插入图2质粒pBI121中，需要在引物5'端加入合适的限制酶切割位点。模板链的3'端应与启动子接近，扩增mpd基因的引物1对应序列应与启动子接近，已知引物2上加入BamHI位点，根据图1中基因mpd和ophc2的方向以及图2质粒上的酶切位点分布。引物1应加入Xba I位点，引物3对应序列应与终止子接近，应加入Hind Ⅲ位点，引物4应加入BamHI位点，与引物2配合将基因mpd和ophc2融合。 （4）图2质粒中含有卡那霉素抗性基因，所以将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，只有成功导入重组质粒的受体细胞才能在该培养基上生长，从而起到筛选作用。还需在个体水平检测转基因苦草降解有机磷农药的能力。实验思路为：将转基因苦草和非转基因苦草分别置于含有相同浓度有机磷农药的水体中，在相同且适宜的条件下培养一段时间后，检测水体中有机磷农药的含量。通过对比转基因苦草和非转基因苦草处理后水体中有机磷农药的含量，来判断转基因苦草降解有机磷农药的能力。 地 城 考点08 基因工程的应用 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 C．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 【答案】C 【分析】1、若受体细胞为大肠杆菌等单细胞生物，则导入的目的基因会随单细胞生物的生殖遗传给后代。若受体细胞为植物细胞，则导入的目的基因可通过无性繁殖遗传给后代。若受体细胞为动物的受精卵，则导入的目的基因可通过转基因动物的有性生殖遗传给后代。 2、基因治疗是指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。由于病人的生殖细胞中没有目的基因，因此导入的目的基因不会遗传给后代。 【详解】A．将胰岛素基因转入大肠杆菌的质粒中，质粒会随大肠杆菌的无性繁殖（二分裂）传递给子代，A错误； B．将基因导入植物体细胞后经组织培养获得的植株，其生殖细胞也含该基因，可通过有性生殖遗传给子代，B错误； C．腺苷酸脱氨酶基因转入的是患者的体细胞（淋巴细胞），体细胞的基因改变不会通过生殖细胞遗传给子代，C正确； D．将基因导入受精卵后，所有细胞（包括生殖细胞）均含该基因，可通过生殖遗传给子代，D错误。 故选C。 2．(24-25高二下·福建龙岩·期末)下列有关基因工程应用的说法，错误的是（    ） A．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于基因工程的应用 B．将药用蛋白基因导入到动物乳腺细胞中，可培育出乳腺生物反应器 C．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质 D．相比天然产物提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高 【答案】B 【详解】A、通过基因工程将分解石油的基因导入细菌，使其获得降解能力，属于基因工程的应用，A正确； B、乳腺生物反应器需将药用蛋白基因导入动物受精卵，使其在乳腺细胞中表达，而非直接导入乳腺细胞（体细胞无法传代），B错误； C、将富含必需氨基酸的蛋白质基因导入农作物，可改良其营养价值，属于基因工程改良品质的应用，C正确； D、基因工程通过微生物发酵生产酶，可避免天然提取中的杂质干扰，纯度更高，D正确。 故选B。 二、非选择题 3．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员构建了远红光可控的分泌肿瘤坏死因子 （TNF）的工程细胞，并将其植入肿瘤切除部位，有效调动机体局部的免疫反应，为癌症治疗提供新思路。调控原理和主要模块的部分结构如图 1。 回答下列问题： (1)构建模块 1和模块 2的过程需使用____酶。 (2)为使远红光的诱导效果更高效，启动子 1应为____（填“诱导型启动子”或“持续表达型启动子”）。在远红光照射下，____（填物质）可激活启动子 PF促进 TNF 合成与分泌。 (3)研究人员测定了多个工程细胞在黑暗条件和远红光照射下的 TNF分泌量，结果如图 2据图分析，应选用____号工程细胞开展后续动物实验，理由是____。 (4)研究人员希望工程细胞在远红光照射下能同时分泌 TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效。请据此要求提出一个改造模块 2的简单思路____。 【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶 (2) 持续表达型启动子 BIdD二聚体 (3) 7 7号工程细胞在黑暗条件下不分泌TNF，在远红光条件下分泌TNF量最大，光控效果最佳 (4) 在模块2中启动子PF后加入IFN基因和TNF基因 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，需要用到限制酶、DNA连接酶。 【详解】（1）限制酶用于切割DNA片段，DNA连接酶用于连接模块1和模块2的DNA片段。构建重组质粒需要这两种酶，故构建模块 1和模块 2的过程需使用限制酶、DNA连接酶。 （2）持续表达型启动子可保证模块1中的光敏元件持续表达，为远红光诱导提供基础，使远红光的诱导效果更高效；远红光激活光敏元件后，由图可知，产生BIdD二聚体，该物质结合启动子PF并激活TNF 基因表达。 （3） 图2显示，7号细胞在黑暗条件下TNF分泌量为0，远红光下分泌量最高，表明其光控响应最灵 敏，适合用于后续动物实验。 （4） 要使工程细胞在远红光照射下能同时分泌TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效，可在启动子 PF后并列插入TNF基因和IFN基因，使两者受同一启动子调控，远红光诱导时两种免疫因子同时表达并分泌。 4．(24-25高二下·福建龙岩·期末)除草剂的有效成分草甘膦能够专一地抑制EPSP合酶的活性，从而使植物体内多种代谢途径受到影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，它在除掉杂草的同时也会使作物受损。解决这个问题的方法之一就是培育抗草甘膦的作物。科研人员尝试用薤白（草本植物）EPSP合酶基因培育抗草甘膦烟草，下图为重组Ti质粒示意图，请回答下列问题。 农杆菌菌株 潮霉素 卡那霉素 E 敏感性 抗性 L 抗性 敏感性 (1)为获取EPSP合酶基因，可以从薤白细胞中提取总mRNA，经过________过程获得cDNA并利用PCR扩增。PCR反应缓冲溶液中一般要添加用于激活DNA聚合酶。复性温度下发生的扩增过程是____________。 (2)Ti质粒与EPSP合酶基因构建重组Ti质粒后，将重组Ti质粒导入受体菌，结合表分析，在适宜温度下，将含目的基因表达载体的溶液与CaCl2处理过的______________(填“E”或“L”)农杆菌混合并培养筛选转化成功的农杆菌。下列可以采用的筛选转化成功的农杆菌的方法是________。 A．提取农杆菌的DNA，酶切后电泳 B．在显微镜下观察是否有绿色荧光 C．在培养基中添加潮霉素 D．提取农杆菌的DNA进行PCR (3)如何在个体水平鉴定转基因烟草具有抗草甘膦的特性，请写出实验思路____________。 (4)科研人员发现重组Ti质粒导入烟草的数量不等，且发现绿色荧光强度越大的烟草对草甘膦抗性越强，据此可为抗草甘膦作物的培育提供进一步的研究思路是______________。 【答案】(1) 逆转录 引物与模板结合 (2) L AD (3) 用草甘膦分别处理非转基因烟草和转基因烟草，观察其生活状况 (4) 可以向多组烟草分别导入不同数量的重组Ti质粒，观察绿色荧光强度及对草甘膦的抗性，确定重组Ti质粒导入烟草的最佳数量 【分析】基因工程的操作步骤包括目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）mRNA经过逆转录过程合成cDNA，复性时，引物与模板链结合。 （2）由于质粒中潮霉素抗性基因位于T-DNA区域，且只在真核生物细胞中表达，卡那霉素抗性基因位于T-DNA区域之外，可以在农杆菌细胞中表达，应该选择对卡那霉素敏感的农杆菌即L作为受体菌，用含卡那霉素的培养基对农杆菌进行筛选，含重组质粒的农杆菌可以在该培养基中存活下来。 A、提取农杆菌的DNA，酶切后电泳，该方法能获得相对分子量不同的DNA，这里可对转基因农杆菌中的目的基因做出初步判断，A正确； B、不能通过用显微镜下观察是否有荧光进行检测，因为重组质粒中的绿色荧光蛋白基因在农杆菌中不表达，B错误； C、在培养基中添加潮霉素不能作为判断转基因是否成功的依据，因为潮霉素基因在农杆菌中不表达，因而不能表现出相关性状，C错误； D、提取农杆菌的DNA进行PCR，同时添加目的基因相关的引物，对PCR的产物进行鉴定，D正确。 故选AD。 （3）若转基因烟草具有抗草甘膦的特性，则用草甘膦处理转基因烟草，转基因烟草可以正常存活，要在个体水平鉴定转基因烟草具有抗草甘膦的特性，可以用草甘膦分别处理非转基因烟草和转基因烟草，观察其生活状况。 （4）可以向多组烟草分别导入不同数量的重组Ti质粒，观察绿色荧光强度，确定向重组Ti质粒导入烟草的最佳数量。 5．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员研究了R基因来提高酵母的絮凝能力。 (1)啤酒生产中，酵母菌产酒过程的反应式为：_______。 (2)科研人员利用基因工程技术获得R基因被敲除的酵母菌菌株。 ①构建含有卡那霉素抗性基因和R基因上、下游序列的打靶DNA序列，用LiC1处理酵母菌，使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现_______。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因（如图1）。这种机制与减数分裂中的__________过程机制相似，都属于基因重组。 ②利用含有卡那霉素的培养基获得单菌落。挑取单菌落，利用PCR技术进行扩增，以确定酵母细胞的R基因是否被成功敲除，供选择的引物如图1所示。除引物1、4组合外，还可以选用的引物组合有_______，请在答题纸上画出用引物1、4组合进行PCR时敲除和未敲除对应的电泳结果，要求标出每个电冰条带对应的DNA片段长度________。 (3)科研人员对野生菌株和R基因敲除菌株的酒精发酵能力和絮凝能力进行了测定，结果如下表。 菌株\指标 酒精发酵能力 絮凝能力 野生菌株 4.5% 63.06% R基因敲除菌株 4.5% 83.12% ①检测酒精发酵能力时，将菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，11℃静置发酵7天。发酵期间，每个锥形瓶应注意保持________条件和定时排气。 ②实验结果表明，获得的R基因敲除菌株符合生产需求，依据是_______。 (4)科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。 ①将R基因敲除菌株和野生菌株分别用________水进行稀释。将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30μg/mL钙荧光白（细胞壁组装抑制剂）的YPD平板培养（培养酵母菌的常用培养基）上，培养适当时间后结果如图2。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是_______。 (5)若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：_______。 【答案】(1) C6H12O62C2H5OH（酒精）+2CO2+能量 (2) 打靶DNA序列的导入 同源染色体的非姐妹染色单体交换片段 2和3、1和3、2和4 见图 (3) 密闭 不影响酒精发酵能力，但絮凝能力提高 (4) 无菌 R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，进而提高絮凝能力 (5) R基因敲除菌株的食用安全性/R基因敲除菌株的遗传稳定性 【分析】PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。 【详解】（1）酵母菌无氧呼吸可以产生酒精，可依据该原理将其应用于酒精生产，反应式为C6H12O6→2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量。 （2）①将目的基因导入微生物细胞时，常用感受态细胞法，即使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现重组质粒的导入。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因，这种机制与减数分裂中的同源染色体的非姐妹染色单体交换片段过程机制相似，都属于基因重组。 ②R基因的碱基长度不同于打靶DNA序列，不同长度的DNA片段电泳时迁移的速率不同，根据电泳结果就可以判断酵母细胞的R基因是否被成功敲除，PCR扩增时需要两种引物，延伸的方向均是从模板的3'→5'，可以选择的引物可以是引物1和引物3或引物1和引物4或引物2和引物3或引物2和引物4。用引物1、4组合进行PCR时敲除，能够扩增出的DNA片段长度为36+38+2073=2147bp，未敲除时扩增的DNA片段长度为36+38+1062=1136bp，电泳结果如图所示： （3）①酒精发酵是在无氧条件下进行的，故发酵期间，每个锥形瓶应注意保持密闭条件。 ②分析表格数据可知，与野生菌株相比，R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，絮凝能力提高，故获得的R基因敲除菌株符合生产需求。 （4）①微生物培养和计数应注意无菌操作，则将R基因敲除菌株和野生菌株分别用无菌水进行梯度稀释。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是：R基因敲除使菌株的细胞壁组装能力提高，絮凝能力提高。 （5）由于啤酒是饮用食品，应保证其安全性，故还需要进一步研究的问题是R基因敲除菌株的食用安全性。 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。研究发现，叶用莴苣（俗称生菜）细胞中的FANCM蛋白能够阻止减数分裂过程中交叉互换的发生，科学家借助CRISPR/Cas9基因编辑技术（原理如图1所示），研发出人工FANCM基因驱动系统，从而在叶用莴苣中实现了外部引入的基因多代遗传。图2表示利用基因驱动技术获得FANCM突变基因的过程，利用同源定向修复功能，可以使另一条同源染色体上也插入基因驱动元件，从而获得FANCM基因纯合突变体。 (1)图1中组成gRNA的单体是，gRNA的作用是_____________，为确定图2中基因驱动元件是否完整插入FANCM基因，最好选择的两组引物是_____________（从图2中P1-P4四种引物中选择）进行PCR。 (2)图2中科研人员首先构建了基因驱动元件，将其导入叶用莴苣细胞中，需要将其DNA序列插入到Ti质粒的T-DNA内部，原因是_____________，为提高导入成功率，常利用_____________处理农杆菌。 (3)用FANCM基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达7%的植株为纯合突变体。请解释纯合突变体产生的原因是_____________。 (4)利用基因驱动技术获得FANCM基因突变纯合体，在叶用莴苣遗传育种中的应用价值是_____________。 (5)遗传学家研究发现，基因驱动技术几乎可以百分之百地使突变基因在该种群群体之间传播，某些生物学家曾提出把这种技术应用于消灭一些入侵物种，从而保护那些濒危物种，一些遗传学家立即呼吁增强这种技术的管制。请从生物技术安全性的角度简要谈谈你对该技术的看法。____________________。 【答案】(1) 识别并结合DNA特定序列 P1、P3和P2、 P4 (2) T-DNA可以插入到受体细胞的染色体上 Ca2+/CaCl2 (3) F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的同源染色体上也插入FANCM基因驱动元件 (4) 增加杂交育种过程中基因重组的频率，产生更多新品种，加速育种进程 (5) 应理性对待基因驱动技术，该技术既可造福人类，也可能带来潜在危害，如果该技术获得的突变基因能够控制繁殖或是在一定程度上控制该物种的生存，那么从理论上说，它就能够让该物种灭绝，导致生物多样性降低，进而引发生态危机。 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析图1可知gRNA的作用是识别并结合DNA特定序列(图上的靶序列)。若将基因驱动元件精确插入到一条染色体上的FANCM基因中(如图2)，则就能够利用P1、P3和P2、 P4引物进行PCR获得一定长度的DNA片段， 否则没有相应的DNA片段。 （2）Ti质粒的T-DNA容易带着目的基因转移，因此将目的基因插入到T-DNA上可以使目的基因转移到受体细胞的染色体上。Ca2+或CaCl2处理农杆菌能够使之成为感受态细胞，使重组质粒更加容易导入成功。 （3）纯合突变体的出现说明来自父本和母本的同源染色体上出现相同基因，可能原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的同源染色体上也插入FANCM基因驱动元件，基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达7%的植株为纯合突变体。 （4）利用基因驱动技术获得FANCM基因突变纯合体可以增加杂交育种过程中基因重组的频率，产生更多新品种，加速育种进程，缩短获得突变纯合体所需的时间。 （5）辩证看待：应理性对待基因驱动技术，该技术既可造福人类，也可能带来潜在危害，如果该技术获得的突变基因能够控制繁殖或是在一定程度上控制该物种的生存，那么从理论上说，它就能够让该物种灭绝。导致生物多样性降低，进而引发生态危机。 【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、 操作步骤等， 掌握各操作步骤中需要注意的细节能结合所学的知识准确答题。 7．(24-25高二下·福建龙岩·期末)某科研团队致力于研究植物细胞工程在提高作物抗逆性方面的应用。已知基因A与植物的抗盐能力密切相关，该团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对某植物的愈伤组织进行基因编辑，期望增强其抗盐能力。实验过程如下，请回答相关问题 (一)愈伤组织的获取与处理： (1)在获取愈伤组织的过程中，幼嫩叶片切块在培养基上先经过_______________过程形成愈伤组织，该过程中细胞的分化程度______(填“升高”或“降低”或“不变”)。生长素和细胞分裂素在该过程中起重要作用，当生长素与细胞分裂素的比值_____________(填“较高”或“较低”或“适中”)时，有利于愈伤组织的形成。将获得的愈伤组织平均分为两组，A组不做处理；B组利用CRISPR-Cas9技术对基因A进行编辑。 (二)抗盐能力检测： (2)将两组愈伤组织分别转移到含有_____________的培养基上继续培养，一段时间后，观察并统计愈伤组织的生长情况，以评估其抗盐能力。实验结果如图显示，结果说明：在相同NaCl浓度下，____________。 (3)利用CRISPR-Cas9技术对基因A进行编辑时，Cas9蛋白可识别特定的DNA序列并切割DNA,可推测Cas9蛋白类似于基因工程基本工具中_____________的作用。与传统的诱变育种相比，基因编辑技术的优点是_________(答出一点即可)。 (三)基因表达检测： 进一步对两组愈伤组织中与抗盐相关的基因B表达水平进行检测，结果如图所示，已知基因B编码的蛋白质对细胞内脯氨酸的合成有影响。 (4)请根据实验结果进行分析，两组实验中愈伤组织生长状况差异产生的原因可能是：基因A被编辑后，使实验组中____________增强了抗盐性。 【答案】(1) 脱分化 降低 适中 (2) 不同浓度的NaCl B组愈伤组织增殖速度更快 (3) 限制酶 目标明确，可控性更强 (4)基因B的表达量升高，促进了脯氨酸的合成 【分析】植物组织培养包括脱分化和再分化两个阶段，原理是植物细胞的全能性。 【详解】（1）外植体先经过脱分化形成愈伤组织，脱分化的过程中细胞的分化程度降低，细胞的分裂能力增强。当生长素和细胞分裂素的比例适中时，有利于愈伤组织的形成。 （2）根据柱形图可知，自变量是愈伤组织的种类和不同浓度的NaCl，因变量是细胞增殖的速度。需要将两组愈伤组织分别转移到含有不同浓度的NaCl的培养基上继续培养。在相同的NaCl浓度下，B组愈伤组织增殖速度更快。 （3）Cas9蛋白和限制酶均可以识别特定的DNA序列并切割DNA，说明Cas9蛋白类似于基因工程基本工具中RNA聚合酶的作用。由于基因突变是不定向的，基因编辑技术目标明确，可控性更强。 （4）由表格数据可知，B组基因B的表达量更多，脯氨酸的含量更高，由于基因B编码的蛋白质对细胞内脯氨酸的合成有影响，故推测基因A被编辑后，使B组基因B的表达量升高，促进了脯氨酸的合成，增强了耐盐性。 地 城 考点09 蛋白质工程 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 【答案】D 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、由题干可知，题图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，而蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，A正确； B、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，B正确； C、合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，C正确； D、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，因此图中新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，D错误。 故选D。 2．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)科学家利用AI技术从头设计了具有高效催化活性和新型折叠结构的丝氨酸水解酶。下列叙述错误的是（    ） A．AI技术设计该酶不用考虑肽键形成方式 B．AI技术设计该酶首先考虑基因碱基序列 C．该酶形成折叠结构需氨基酸间形成氢键 D．该酶的设计生产需利用蛋白质工程技术 【答案】B 【详解】A、肽键的形成方式是氨基酸脱水缩合的结果，该形成方式不会发生改变，故AI技术设计该酶不用考虑肽键形成方式，A正确； B、AI技术设计先设计蛋白质结构，再推导相应基因序列，而非首先考虑基因碱基序列，B错误； C、蛋白质折叠结构（如二级结构）的形成依赖氨基酸间的氢键等作用力，C正确； D、AI设计新型酶属于蛋白质工程技术的应用，D正确。 故选B。 3．(24-25高二下·福建南平·期末)科研人员通过蛋白质工程将脂肪酶的第113位氨基酸由Ala变为Gly，第74位氨基酸由Leu变为Asn后，脂肪酶活力大幅度提高。下列相关叙述，错误的是（　　） A．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 B．上述氨基酸序列的改变利用了基因的定点突变技术来进行碱基的增添 C．脂肪酶的改造可借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型 D．脂肪酶预期的蛋白质结构的设计需要中心法则提供理论支持 【答案】B 【详解】A．蛋白质工程的关键步骤包括设计预期蛋白质结构并推测所需氨基酸序列，A正确； B、基因定点突变技术通常通过替换或修改特定碱基来实现氨基酸改变，题干中两位氨基酸的改变可能仅涉及碱基替换，B错误； C、计算机建模可辅助分析蛋白质三维结构，指导脂肪酶改造，C正确； D、蛋白质结构设计需基于中心法则（从蛋白质功能逆向推导DNA序列），D正确。 故选B。 4．(24-25高二下·福建福州福清·期末)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），天然的Y通常需要在低温下保存，若将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙，可提高其热稳定性。下列说法错误的是（　　） A．改造蛋白质Y的过程需替换的碱基对不超过3对 B．获得改造的蛋白质Y属于蛋白质工程，没有用到基因工程技术 C．可从人的T细胞中提取mRNA，逆转录合成cDNA，以获得Y基因 D．改造过程可能获得多种Y基因，这些基因表达得到的Y蛋白相同 【答案】B 【详解】A、替换一个氨基酸通常需要改变mRNA上的一个密码子，而每个密码子由3个碱基组成，对应DNA中最多替换3对碱基，A正确； B、蛋白质工程通过改造基因来合成所需蛋白质，必须依赖基因工程技术（如定点诱变、基因重组等），B错误； C、T细胞中能表达Y蛋白，因此细胞内含有编码Y蛋白的mRNA，故从人的T细胞中提取的mRNA可通过逆转录合成cDNA以获取Y基因，C正确； D、由于密码子的简并性，不同碱基对的改变可能编码同一氨基酸，导致基因不同但表达产物相同，因此改造过程可能获得多种Y基因，这些基因表达得到的Y蛋白相同，D正确。 故选B。 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)酶的热稳定性是指酶在高温条件下保持其结构和功能稳定性的能力。D1-PGI和 G3-PGI都是磷酸葡萄糖异构酶，两者仅有 5个氨基酸差异。常温下二者催化效率相当，但在 50℃环境下后者的热稳定性比前者强。进一步研究发现，单一位点的氨基酸替换都不足以解释 D1PGI和 G3-PGI间的热稳定性差异。下列叙述错误的是（    ） A．50℃环境下 D1-PGI的催化活性比 G3-PGI低 B．可用蛋白质工程实现单一位点的氨基酸替换 C．5个氨基酸同时替换才会影响酶的空间结构 D．酶热稳定性增强是一种对高温环境的适应策略 【答案】C 【详解】酶的活性受温度、pH的影响，高温、强酸、强碱均会导致酶变性失活。可以通过蛋白质工程获得热稳定性强的蛋白质。 【分析】A、在50℃高温下，G3-PGI的热稳定性强于D1-PGI，因此D1-PGI的酶活性因结构破坏而降低，A正确； B、蛋白质工程可通过定点诱变技术改变特定氨基酸，实现单一位点替换，B正确； C、题干仅说明单一位点替换不足以解释热稳定性差异，但单个替换仍可能轻微影响空间结构，C错误； D、酶热稳定性增强是长期自然选择形成的适应性特征，D正确。 故选C。 6．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，使其在pH=6时的活力提高了10倍。下列说法正确的是（　　） A．需要通过改造基因实现对蛋白质中氨基酸的替换 B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有独特的优势 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息 【答案】A 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、蛋白质工程通过修改基因中的碱基序列，从而改变蛋白质的氨基酸序列，实现对蛋白质的定向改造，因此必须通过基因改造实现氨基酸替换，A正确； B、蛋白质工程可以改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，该成果能培育新品种，但不能产生新物种，B错误； C、经蛋白质工程改造后的酶是通过基因重组产生的，其性状由改变的基因控制，能够遗传给后代，因此该性状是可遗传的，C错误； D、蛋白质工程的最终目的是获得满足人类需求的蛋白质，获取基因序列是达成该目的的手段，而非最终目标，D错误。 故选A。 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)基因编辑的困难在于精准地将DNA片段插入基因组的特定位置。近期，我国科学家发现R2逆转座子可将DNA片段特异性插入目的DNA区域，但插入效率较低。科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入。R2逆转座子和DNA片段插入过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．R2逆转座子也有DNA连接酶的活性 B．合成第二条DNA链的模板是R2 RNA C．插入的目的序列应设计在R2 RNA中 D．可通过改造R2蛋白结构提高插入效率 【答案】B 【分析】以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。 【详解】A、结合图示可以看出，R2逆转座子不仅具有逆转录酶活性，也有DNA连接酶的活性，A正确； B、结合图示可以看出，合成第二条DNA链的模板是合成的第一条DNA链，B错误； C、插入的目的序列应设计在R2 RNA中，因为目标序列需要通过逆转录过程获得，而R2 RNA是逆转录的模板，C正确； D、题意显示，科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入，该过程可通过改造R2蛋白的基因实现，进而实现对R2蛋白结构的改变，D正确。 故选B。 8．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)蛋白质工程是基因工程的延伸，又称为第二代基因工程。下列关于基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是（    ） A．蛋白质工程可通过定点突变技术，在不改变氨基酸序列的情况下优化蛋白质功能 B．蛋白质工程通常需要通过X射线衍射技术来分析目标蛋白质的晶体结构 C．蛋白质工程的操作过程中，需要先合成mRNA，后合成基因 D．蛋白质工程的实施，充分体现了功能决定结构的科学思想 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。 【详解】A、基因中定点突变会改变基因中的碱基序列，进而会影响蛋白质中氨基酸的排列顺序，A错误； B、蛋白质工程通常需要通过X射线衍射技术来分析目标蛋白质的晶体结构，建立蛋白质三维模型后，然后才能设计预期蛋白质的功能，B正确； C、蛋白质工程的操作过程中，只需要推导出mRNA的碱基序列即可，无需先合成mRNA，C错误； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要，故蛋白质工程的实施，充分体现了结构决定功能的科学思想，D错误。 故选B。 9．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)中国科学家研发的全球首个AI蛋白质生成大模型NewOrigin（中文名“达尔文”）正式在世界人工智能大会亮相。它能通过AI学习蛋白质中氨基酸序列和蛋白质功能间的对应关系来设计新的蛋白质，为蛋白质工程的发展提供了新方向，在生物医药领域也有较好的应用前景。下列叙述不正确的是（    ） A．蛋白质工程需从设计预期的蛋白质功能出发，目前的AI可帮助人们设计出自然界没有的蛋白质 B．NewOrigin在蛋白质工程广泛应用后将仍需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良 C．对蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术 D．AI技术在生物医药领域的应用会涉及到众多的法规和伦理问题。例如，如何处理AI决策中的错误和责任、以及如何避免AI技术加剧医疗不平等等问题 【答案】C 【分析】蛋白质工程概念及基本原理（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）（2）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。（3）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。（4）基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。而利用AI技术对蛋白质数据进行分析，预测患者体内某些蛋白质的三维结构，可帮助人们设计出自然界没有的蛋白质，A正确； B、NewOrigin能通过AI学习蛋白质中氨基酸序列和蛋白质功能间的对应关系来设计新的蛋白质，在蛋白质工程广泛应用后将仍需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良，B正确； C、对蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于针对蛋白质进行的药物生产，不是对原有蛋白质进行改造，不属于蛋白质工程技术，C错误； D、人工智能在生物医药领域的应用确实会涉及众多法规和伦理问题。例如，当AI做出决策出现错误时，责任如何界定；在医疗资源分配等方面，如何避免AI技术加剧医疗不平等的现象等。这些都是在推广和应用AI技术于生物医药领域时需要考虑和解决的重要问题，D正确。 故选C。 10．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B．上述表达载体的构建过程主要利用了基因突变的生物学原理 C．为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的3'端添加同种限制酶酶切位点 D．鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 【答案】D 【分析】单克隆抗体的制备： 1、细胞来源：B淋巴细胞：能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖；骨髓瘤细胞：不产生专一性抗体，体外能无限繁殖； 2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体； 3、两次次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞(去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞)；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群； 4、两次抗体检测：专一抗体检验阳性； 5、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取； 6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。 【详解】A、由图可知，鼠一人嵌合抗体含有4条肽链，因此至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的V区决定，A错误； B、表达载体的构建过程主要利用了基因重组的生物学原理，不是基因突变，B错误； C、子链延伸只能从5′端向3′端，为避免自身环化和反向链接，应使用两种不同的限制酶进行酶切，因此应在两条引物的5′端添加不同的限制酶酶切位点，C错误； D、鼠-人嵌合抗体是对鼠源抗体改造，即对蛋白质改造，属于蛋白质工程；将基因表达载体导入动物细胞（Sp2/0细胞 ）常用显微注射法，D正确。 故选D。 11．(24-25高二下·福建三明·期末)Cry蛋白是苏云金杆菌的主要杀虫蛋白。研究人员利用基因的定点突变技术将Cry蛋白第282位的丙氨酸和第283位的亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（    ） A．对Cry蛋白的氨基酸序列或结构进行改造，可改造Cry蛋白的功能 B．Cry蛋白的毒性提高了7倍的原因是该技术直接改变了Cry蛋白的空间结构 C．该技术从预期蛋白质的功能出发，设计出相应基因的碱基序列 D．利用该技术对Cry蛋白进行改造属于蛋白质工程 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质的结构决定功能，对Cry蛋白的氨基酸序列或结构进行改造，可改造Cry蛋白的功能，A正确； B、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，对Cry蛋白的改造是通过改造Cry蛋白的相关基因来实现的，B错误； C、改造Cry蛋白应从Cry蛋白的结构和功能出发设计其特有的结构，并改造或合成相关基因，C正确； D、蛋白质工程的基础是基因工程，需要改造或合成相关的基因，合成更强的蛋白质，D正确。 故选B。 12．(23-24高二下·福建漳州·期末)研究发现，胰岛素进入血液循环后容易被降解，糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，提高了胰岛素在患者体内的稳定性，延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行改造或合成 B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一 C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发 D．蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，因此蛋白质工程难度很大 【答案】C 【分析】蛋白质工程的基本流程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终要利用基因工程上来解决蛋白质的合成，因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质，A正确； B、氨基酸序列差异，导致胰岛素的空间结构有所改变，影响了它的功能，因此氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一，B正确； C、胰岛素属于蛋白质，改造胰岛素应首先从预期的蛋白质功能出发，C错误； D、多数蛋白质除具有一级结构（即氨基酸顺序）外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的，因此实施蛋白质工程的难度很大，D正确。 故选C。 13．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可以利用现有蛋白质数据库以及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构及功能。下列说法错误的是（    ） A．AI可帮助人们更深入了解蛋白质的结构与功能关系 B．AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则 C．可通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质 D．AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质 【答案】B 【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，蛋白质工程能对现有的蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质；而基因工程原则上能生产自然界已有的蛋白质。 2、蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【详解】A、AI可以利用现有蛋白质数据库帮助人们更深入了解蛋白质的结构与功能关系，A正确； B、AI对新型蛋白质的预测应从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，B错误； C、对蛋白质的改造是通过改造或合成基因来完成的，C正确； D、AI可用于蛋白质工程，帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质，D正确。 故选B。 二、非选择题 14．(24-25高二下·福建福州第一中学·期末)乳酸菌无氧呼吸过程中第一阶段产生的丙酮酸会在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下产生乳酸，科学家通过改造LDH能够高效地生产高纯度的苯乳酸。 (1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因，需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，可用于生产苯乳酸。 ①先将LDH基因片段连入载体中形成环状质粒，如图。 将突变后的序列设计在引物1中，以环状质粒为PCR的______，再向体系中加入四种脱氧核苷酸（dNTP）、______酶、______以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因，PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有______。 A．5'—TGACTGACTAACACTCGGAC—3' B．5'—TGACTGACAACCACTCGGAC—3' C．5'—TGACTGACGATCACTCGGAC—3' D．5'—TGACTGACGAGCACTCGGAC—3' ②上述PCR产物为______状DNA分子，改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧，需要用______酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。 (2)产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与，现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息，先用限制酶__________切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶__________切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 (3)上述科学实践属于生物工程中的__________工程。 【答案】(1) 模板 耐高温的DNA聚合酶 四种脱氧核苷酸 AD 链 DNA连接 (2) NdeI和XhoⅠ NcoⅠ和BamHI (3) 蛋白质 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】（1）①分析题意可知，科学家拟通过PCR技术扩增LDH基因。其模板是环状质粒，需要四种游离的脱氧核苷酸（dNTP）作为原料，利用耐高温的DNA聚合酶催化该过程，同时还需要加入引物2和引物1。由于亮氨酸的密码子为CUX、UUA、UUG，根据碱基互补配对原则，引物中相同位点（对应题干方框中的“GTA”）对应位点的碱基序列应该是XAG、TAA、CAA（注意方向），其他序列与图中序列相同，AD符合要求，BC不符合要求。故选AD。 ②题干中扩增得到的PCR产物为链状DNA分子，需要用DNA连接酶将产物两端连接，获得含有mLDH基因的质粒。 （2）分析题图可知，质粒1中的mLDH基因适合用NcoⅠ和BamHⅠ切割，质粒2中的FDH适合用XbaⅠ或NdeⅠ和XhoⅠ切割，而空载体中XbaⅠ位点位于启动子中，故不宜选用XbaⅠ。因此，应先用NdeI和XhoⅠ酶切质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物；再用NcoⅠ和BamHI酶切质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 （3）由分析可知，题干的科学实践中，先设计需要的蛋白质再改造出相应的基因，这属于生物工程中的蛋白质工程。 15．(24-25高二下·福建福州福清·期末)水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是__________，物质b是__________。 (2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与__________的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过__________导入哺乳动物的__________。 (3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点）__________。 (4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用__________生产的水蛭素活性更高，原因是__________。 (5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用__________通过__________技术进行检测。 【答案】(1) 多肽链 mRNA (2) 乳腺蛋白基因 显微注射法 受精卵 (3) 突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料 (4) 乳腺生物反应器 大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对水蛭素进行加工，而乳腺生物反应器产生的水蛭素可经过加工具有活性 (5) 抗水蛭素的抗体 抗原-抗体杂交 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。 【详解】（1）蛋白质工程的基本思路是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因。根据这个流程，物质a是多肽链，它是根据预期蛋白质结构推测出的氨基酸序列连接而成的，物质b是mRNA，基因转录形成mRNA，再由mRNA翻译形成蛋白质。 （2）将改造后的水蛭素基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵。 （3）突变具有不定向性突变率低，需要大量处理实验材料。 （4）利用乳腺生物反应器生产的水蛭素活性更高。原因是大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，无法对水蛭素进行加工修饰；而乳腺生物反应器是真核生物细胞，有内质网和高尔基体等细胞器，能够对水蛭素进行加工修饰，使其空间结构更接近天然水蛭素，从而具有更高的活性 （5）检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用抗水蛭素的抗体通过抗原-抗体杂交技术进行检测。 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题15 基因工程 9大高频考点概览 考点01 DNA重组技术的基本工具 考点02 DNA的粗提取及鉴定 考点03 电泳鉴定 考点04 目的基因的筛选与获取 考点05 基因表达载体的构建 考点06 将目的基因导入受体细胞 考点07 目的基因的检测与鉴定 考点08 基因工程的应用 考点09 蛋白质工程 地 城 考点01 DNA重组技术的基本工具 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)将一段编码序列（CDS）插入到一个载体上，将该载体命名为pVN2024。如图A所示，将CDS插入到载体的SacⅡ位点，该位点位于lacZ基因的MCS区（含多个酶切位点），CDS的终止子上游0.8kb处有一个PstI的酶切位点。为确认CDS的大小和插入方向，科研人员用不同的限制酶切割重组质粒并进行电泳，结果如图B。下列叙述正确的是（    ） （A图为载体示意图，方框内表示载体中限制酶识别位点）；（B图为不同限制酶切割产物的电泳示意图，M为标准电泳条带） A．SpeI酶切可用于判断CDS插入的方向 B．CDS插入时方向与lacZ基因的方向相同 C．CDS长度为2.6kb，在距一端0.5kb处有一个EcoRI识别位点 D．若重组质粒同时用EcoRI和SpeI酶切，电泳能检测到5个不同条带 2．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（    ） 注：箭头表示识别序列中切断部位。 A．KpnI和Acc65I切割形成的黏性末端不同 B．BamHI与MboI切割后的产物可以通过DNA连接酶连接，连接后序列可能无法被BamHI再次切开 C．用EcoRI和HhaI切割获取的目的基因含有4个游离的磷酸基团，其切割过程会有4个磷酸二酯键被水解 D．若只用EcoRI限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接，切割后的质粒和目的基因都可能自我环化 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a完全切割，再把得到的产物用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述正确的是（　　） A．限制酶a和b切出的DNA片段能相互连接后可被限制酶a识别切割 B．限制酶切割DNA分子一次可断开1个磷酸二酯键产生1分子水 C．仅用限制酶b切割该DNA分子可得到三种不同的DNA片段 D．该DNA上含有3个a酶的切割位点，5个b酶的切割位点 4．(24-25高二下·福建南平·期末)某科研小组通过PCR技术获得含有目的基因的DNA片段，并用限制酶（如图1）进行酶切，获得了带有黏性末端的DNA片段（如图2），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列相关叙述，错误的是（　　） A．上述PCR过程所用引物序列之一为5'-AGCTAGCAATGCTC…-3' B．限制酶SpeⅠ和限制酶NheⅠ酶切产物具有相同的黏性末端 C．DNA连接酶可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 D．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ 或者 NheⅠ和CfoⅠ 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)TALEN技术利用 TALE蛋白识别目标 DNA序列，用 FokI二聚体切断 DNA，机理见下图。TALE蛋白需根据靶基因的序列进行人工合成，其二连氨基酸 （NI、NG、HD、NN）与四种碱基有恒定的对应关系：NI识别 A、NG识别 T、HD识别 C、NN 识别 G。下列叙述错误的是（    ） A．FokI二聚体作用的化学键是磷酸二酯键 B．FokI二聚体切割 DNA后形成的末端是黏性末端 C．TALE蛋白的左臂氨基酸序列需与右臂序列不同 D．TALE蛋白识别目标序列时遵循碱基互补配对原则 6．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)植物的花色由 D/d 基因控制，存在 D基因时开红花，否则开白花。研究人员将1个控制蓝色色素合成的B基因(蓝色叠加红色呈紫色，蓝色叠加白色呈淡蓝色)导入到 D/d基因所在的染色体上，并获得转基因幼苗若干。用同一种限制酶分别对未转基因植株和转基因幼苗甲、乙、丙、丁的 D/d基因酶切，凝胶电泳结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．图Ⅱ中未转基因植株的基因型为 Dd B．B基因中不含该限制酶的酶切位点 C．幼苗甲开紫花，乙均开淡蓝色花 D．幼苗丙中B基因插入到了基因d所在片段中 7．(24-25高二下·福建三明·期末)下表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是（    ） 限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ -G↓GATCC- KpnⅠ -GGTAC↓C- EcoRⅠ -C↓AATTC- Sau3AⅠ -↓GATC- HindⅡ -GTY↓RAC- SmaⅠ -CCC↓GGG- 注：Y为C或T，R为A或G。 A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 D．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 8．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)将具有抗肿瘤作用的细胞因子IFNγ基因连接到Egr-1基因启动子上后，利用Egr-1基因启动子的放射诱导性，在X射线等电离辐射诱导下，启动Egr-1基因启动子，进而诱导与其连接的IFNγ基因表达。这样在肿瘤部位可以通过射线和IFNγ的双重作用杀伤肿瘤细胞。图示为重组质粒的构建过程，下列叙述正确的是（　　） A．重组质粒上的Egr-1基因启动子可以被肿瘤细胞核糖体识别 B．通过PCR扩增cDNA进行30轮时，共需要消耗的引物数量为230个 C．将外源IFNγ基因送入到肿瘤细胞的载体还可以是动物的病毒 D．T4DNA连接酶能连接质粒和IFNγ基因双链之间的氢键和磷酸二酯键 9．(24-25高二下·福建百校·期末)某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用a酶切割，把得到的产物用b酶切割，得到的DNA片段大小如下表所示。a酶和b酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法错误的是（　　） a酶切割产物（ bp） b酶再次切割产物（ bp） 2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；300；200 A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列均为3个 B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接 C．限制酶将一个DNA分子切成两个片段需要消耗两个水分子 D．用a酶切割与线性DNA分子具有相同碱基序列的质粒，一定能得到4种切割产物 10．(23-24高二下·福建南平·期末)研究表明，DNA 连接酶能够封闭DNA双螺旋骨架上的切口（图a），却无法封闭缺口（图b ），下列相关叙述，正确的是（　　） A．DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成 B．DNA 单链发生缺失，在DNA 聚合酶作用下沿缺口3'→5'方向修复 C．DNA 连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的 DNA 分子 D．DNA 连接酶封闭切口时，需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列 11．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（    ） A．该DNA分子和质粒上均含有酶的一个切割位点和酶的一个切割位点 B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系 C．用T4D NA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来 D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子 二、非选择题 12．(23-24高二下·福建泉州·期末)生长激素在治疗激素分泌过少的矮小症方面有积极的作用，为了批量生产生长激素，可以采用转基因技术将控制生长激素合成的基因转移到微生物细胞内。请回答下列相关问题： (1)该技术流程的核心步骤是____。 (2)①获取生长激素基因时可以使用PCR技术扩增，该技术的一个循环中所需温度最低的步骤是____。下表是用于扩增的两种引物序列，请据表回答相关问题： 引物名称 引物序列（5'-3'） 引物1 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 引物2 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 引物1对应的模板链序列（5'-3'）为____。 ②下图为生长激素基因的部分序列，请问引物1和引物2分别对应的位置____。 A．I和Ⅱ  B．Ⅱ和Ⅲ  C．Ⅲ和Ⅳ  D．I和Ⅳ ③假设加入的模板数为a，引物能与模板上唯一基因序列特异性结合，理论上n次循环需要消耗引物2的数量是____。 (3)若目的基因用限制酶切割后形成如图1所示的末端，则切割质粒载体（图2所示）应选择使用的限制酶是____。 地 城 考点02 DNA的粗提取及鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)酒精在生物实验中扮演着重要角色。下列关于酒精叙述，错误的是（　　） A．“检测生物组织中的脂肪”实验中，50%的酒精溶液洗去浮色 B．“植物的组织培养”实验中，70%的酒精对外植体进行灭菌 C．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，95%的冷酒精溶液不能溶解DNA D．“探究酵母菌呼吸类型”实验中，可通过检测是否产生酒精进行判断 2．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)生物实验技术是生命科学研究的核心工具，涵盖从分子到生态水平的多种方法。下列相关叙述正确的是（　　） A．用放射性同位素15N标记氨基酸的方法，可用于研究细胞器在合成蛋白质过程中结构与功能上的关系 B．艾弗里的肺炎链球菌体外转化实验中，向S型细菌的细胞提取物中加入不同的酶进行处理体现了“加法原理” C．在统计个体较大、种群分布范围较小的物种的种群密度时，可以使用逐个计数的方法 D．向提取到的DNA溶液中加入二苯胺试剂后，溶液即可呈现明显的蓝色 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验操作，下列相关叙述正确的是（　　） A．实验I，在肝脏研磨液的上清液中加入等量预冷的酒精溶液粗提取DNA B．实验I，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水浴，用于鉴定DNA C．实验II，可用生理盐水配制的琼脂糖凝胶作为DNA电泳的介质 D．实验II，在凝胶载样缓冲液中加入核酸染料可使DNA被检测出 4．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 C．DNA的粗提取与鉴定实验不要求对实验结果精确定量 D．动、植物细胞DNA的提取无需在无菌条件下进行 5．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验I）和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验II）的实验操作，下列相关叙述正确的是（　　） A．实验I，将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并沸水浴，用于鉴定DNA B．实验II，凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关 C．实验I，在离心后肝脏研磨液的沉淀物中加入等量冷却的酒精溶液粗提取DNA D．实验II，在紫外灯下观察DNA条带的分布及粗细程度可评价扩增是否成功 6．(23-24高二下·福建厦门·期末)下列叙述中，实验过程与结果或结论均正确的是（    ） 选项 实验过程 结果或结论 A 利用水绵和需氧细菌进行实验，在黑暗中用极细的光束照射水绵 细菌只向叶绿体被光束照射到的部位集中，说明叶绿体能吸收光能用于光合作用放氧 B 在离体叶绿体的悬浮液中加入铁盐或其他氧化剂（悬浮液中有H2O没有CO2） 叶绿体在光照下释放出O2，说明光合作用释放的O2中的O全部来自水 C 用无水乙醇分离菠菜叶片中的色素 滤纸条上有4条不同颜色的色素带，从上到下依次为黄色、橙黄色、蓝绿色、黄绿色 D 向兔血中加入预冷的酒精进行DNA粗提取 溶液中出现的白色丝状物即为粗提取的DNA A．A B．B C．C D．D 7．(23-24高二下·福建漳州·期末)下列有关“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度与 NaCl浓度无关 B．酵母、菜花和哺乳动物的成熟红细胞都可作为提取 DNA 的材料 C．在溶有 DNA 的滤液中加入木瓜蛋白酶，可分解其中的杂质蛋白 D．鉴定 DNA时，将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴加热 8．(23-24高二下·福建南平·期末)某同学用改良的方法进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，具体操作如下，相关说法错误的是（　　） 流程 具体操作 裂解 香蕉去皮剪碎，加入食盐水及5滴洗洁精（替代研磨液）， 充分研磨 分离 在研磨液中加入2g嫩肉粉（有效成分是木瓜蛋白酶）， 混合均匀后适温加热 沉淀 冷却后加入等体积、预冷的体积分数为 95%的酒精； 静置后挑取白色絮状析出物 鉴定 加入二苯胺试剂 A．研磨的目的是裂解细胞膜，同时释放出DNA 等物质 B．适温加热可以加快嫩肉粉对多糖和蛋白质的水解 C．预冷的体积分数为95%的酒精能溶解某些蛋白质 D．沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会呈现蓝色 9．(23-24高二下·福建泉州·期末)下列关于DNA粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的叙述错误的是（　　） A．新鲜的鸡血、大蒜、洋葱等都可作为DNA粗提取的实验材料 B．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质 C．PCR技术是通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 D．DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象和凝胶浓度有关 地 城 考点03 电泳鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)质粒P有2个EcoRI、1个SacI、1个BamH三种限制酶的酶切位点。BamH酶切位点位于两个EcoRI酶切位点正中间，以下是不同酶切产物的电泳图谱：泳道①是未酶切的质粒P电泳条带。②到④分别为三种酶单酶切质粒P产物的电泳条带，⑤到⑦为双酶切质粒P产物的条带。以下说法正确的是（    ） A．电泳时片段移动方向是从正极到负极 B．图中②、③分别是SacI和EcoRI的酶切产物 C．泳道⑦为SacI和EcoRI酶切产物 D．泳道①②表明酶切后质粒P碱基数增大 2．(24-25高二下·福建三明·期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA”实验的叙述，错误的是（    ） A．香蕉研磨后离心取上清液，加入95%的冷酒精，有利于DNA析出 B．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 C．配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料 D．电泳鉴定DNA时，应先将PCR扩增产物与含有指示剂的凝胶载样缓冲液混合 3．(24-25高二下·福建龙岩·期末)关于DNA粗提取及电泳鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔，并沿多个方向搅拌 B．鉴定DNA时，将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴 C．电泳实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 4．(24-25高二下·福建宁德·期末)双脱氧测序法是一种用于确定DNA序列的经典方法，其原理是在DNA复制过程中引入特殊的化学物质——ddNTP来中断DNA链的延伸。ddNTP与dNTP均能遵循碱基互补配对原则，结合在延伸的子链上，当ddNTP结合在子链上时，DNA合成终止。PCR产物变性后电泳检测，可确定序列信息，通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．电泳时产物的片段越小，迁移速率越快 B．患者该段序列中某位点的碱基T突变为C C．5＇—CTACCCGTGAT—3＇为对照个体的一段序列 D．ddNTP导致DNA合成终止的原因是3＇端无—OH，无法形成磷酸二酯键 5．(24-25高二下·福建三明·期末)与哺乳动物睡眠节律调控有关的基因发生突变会导致睡眠紊乱，利用PCR技术可扩增基因。下列说法错误的是（    ） A．扩增时要一对能与基因一段碱基序列互补配对的短单链核酸为引物 B．当温度超过90℃时，磷酸二酯键断裂，双链DNA解聚为单链 C．为了激活耐高温DNA聚合酶的活性，PCR反应缓冲液中一般要添加 D．扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)研究发现，HIV通过细胞膜上的A蛋白侵染人体细胞，同时发现若A基因缺失了32个特定碱基对会导致A蛋白异常，从而aa个体天然免疫HIV。现为了快速辨别甲、乙、丙个体的基因型，用引物F和R分别对三人的基因组进行PCR，每组PCR产物都分为两份，一份直接电泳，一份用ApoI酶切割后电泳，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．2号加样孔中的样品均为PCR产物直接电泳结果 B．乙个体两个加样孔条带一致可能是ApoI酶失活导致 C．测序比对3和4号条带可获得a基因缺失的序列 D．DNA分子迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析正确的是（    ） 注：“－”表示未添加，“+”表示添加，指示探针的浓度很低 A．条带1越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强 B．显示条带2就说明O2蛋白与P无法结合 C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合 D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同 二、非选择题 8．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)无核葡萄品质优良，但抗寒性差。我国科学家以中国野生葡萄资源中抗寒性最强的山葡萄为材料，对抗寒基因Va的功能展开相关研究。 (1)通过前期研究结果，科研人员推测Va基因的产物可能为转录因子。转录因子是一类特定的蛋白，可以调控______与启动子的结合。 (2)研究者预通过PCR扩增Va基因，可通过分析Va蛋白的氨基酸序列，依据这些氨基酸所对应的_____推测mRNA序列以确定DNA序列，进而设计特异性引物，并在引物的_______端添加特定限制酶的识别序列。以山葡萄基因组DNA为模板进行PCR，利用______凝胶电泳分离并纯化DNA片段。 (3)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是______。 A．DNA模板被其他葡萄细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Va基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Va基因序列高度相似的其他基因 (4)为进一步验证Va基因的转录激活功能，科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中（图1）。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①敲除GAL4的原因是_____。科学家运用CRISPR/Cas9基因编辑系统（图2）实现对GAL4的敲除，sgRNA（一种小RNA）有引导作用，使Cas9酶在配对区域定点切割，导致基因丧失功能，因此sgRNA序列必须以_______为设计依据。如果要获得基因敲除酵母AH109菌株，应用_____法导入CRISPR/Cas9基因表达载体。 ②为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的_____组，此外还需额外添加______，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ③研究人员运用GAL4基因和pCG质粒构建了pG-GAL4重组载体，并将其导入酵母菌作为对照组1，那么实验组的处理是导入______。另外，还需设置一个对照组2，即导入______，然后将上述三组酵母菌同时接种于同一块平板的三个区域。 ④预测实验组和对照组1、2的菌落生成及颜色情况分别是：______、有菌落和蓝色和______。 9．(24-25高二下·福建南平·期末)疟疾是由疟原虫引起的一种疾病，氯喹是治疗非耐药疟疾的常用药物。为实现精准治疗，需进行抗性筛查，以便筛选出适合使用氯喹治疗的患者。已知疟原虫获得对氯喹的抗性与pfcrt基因突变有关。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2四种备选引物，用于扩增目的基因的片段，如图甲所示。回答下列问题： (1)用PCR扩增疟原虫的DNA，用于耐药基因分析。PCR过程每次循环一般包括_______三个步骤。 (2)据图甲可知，pfcrt基因突变导致该部位相应的密码子由_______转变为_______。 (3)图乙为利用F1、F2、R1和R2引物扩增pfcrt基因后，电泳分离扩增产物的部分结果。 ①PCR过程使用不同的引物，对比泳道1、2、3的结果，推测泳道3内无条带的原因可能是引物_______不能与模板正常结合，导致PCR产物的量过低，电泳时无法分离出准确的结果。 ②与泳道1相比，泳道2中增加了条带的数量。这可能与引物R2的性质有关。为减少此种现象的发生，设计引物R2时，应满足：_______ A．引物R2与基因的特异性结合位点只有一个 B．引物R2与特异性结合位点的结合足够稳定 C．引物R2与引物F1不存在互补序列 D．引物R2的内部不能存在互补序列 E．引物R2最适的复性温度与引物F1的最适复性温度差异明显 (4)现由4份患者血样处理后获得pfcrt基因进行PCR，产物用限制酶ApoI处理，电泳结果如图丙。 综合上述信息，可初步判断来自氯喹非耐药疟疾患者的血样是_______，判断理由是：_______。 10．(23-24高二下·福建厦门·期末)无植物中的碳苷黄酮类化合物具有明显的抗糖尿病功效。水稻中的CYP93G2基因（大小为1557bp）在碳苷黄酮类化合物的生物合成中发挥重要作用研究人员将该基因转入番茄，使其在番茄果实中特异性表达，以获得含有抗糖尿病有效成分的可食用番茄。 请回答： (1)过程①和②需要用到的酶分别为________、________。将目的基因与克隆载体A连接后导入经______（填物质）处理的大肠杆菌细胞，从而实现对目的基因的克隆。 (2)实验中使用的p2A11启动子应具备的特点是________。 (3)用农杆菌介导番茄转化时，T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的______上。以被侵染的番茄茎段作为外植体，经过______过程形成植株。 (4)用PCR等技术鉴定目的基因是否成功导入番茄，结果如图所示。据此判断，样本______（填序号）为非转基因植株，无法进一步使用。其余样本还需进行基因测序，原因是_______。 (5)经鉴定，转基因番茄果实中成功表达了碳苷黄酮类化合物，上市前还需进行哪些研究__________（答出1点即可）。 地 城 考点04 目的基因的筛选与获取 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)下列关于PCR扩增DNA的叙述，错误的是（    ） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 C．复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合 D．引物序列过短，使PCR产物特异性较差 2．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。 下列推测不合理的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合具有特异性 B．淬灭基团与荧光基团间距离影响荧光强度 C．CT值越小则提取到的病毒RNA含量越低 D．病毒发生单个碱基的突变可能不影响检测结果 3．(24-25高二下·福建福州福清·期末)PCR可看作生物体外特殊的DNA复制过程。如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链延伸的基础。下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录，核酸酶H可将杂交双链中的DNA水解，为PCR提供原料 B．PCR扩增时反应体系需加入模板、RNA引物、含Mg²⁺的缓冲液等成分 C．③为变性，使用90-95℃的高温处理是为断开引物与模板间形成的氢键 D．⑤为延伸，温度控制在70-75℃之间以提高相关酶活性，缩短延伸时间 4．(24-25高二下·福建宁德·期末)引物的设计是PCR技术的重要环节，下列叙述错误的是（　　） A．需要根据目的基因的完整碱基序列来设计引物 B．引物的长度不能过短，否则会影响PCR扩增产物的特异性 C．引物的作用是使DNA聚合酶能够从其3＇端开始连接脱氧核苷酸 D．引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员采用 PCR技术扩增 M、N基因，然后用限制酶 Smal （识别序列为一 GGG↓CCC—）切割，再用 DNA连接酶将其连接成融合基因，最后构建出基因表达载体，如下图所示. 下列叙述错误的是（    ） A．引物 2和引物 4的 5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列 B．引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列 C．建议用 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因 D．用PCR鉴定目的基因是否导入受体细胞应选择引物 2和引物3 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)疟疾是由疟原虫引起的一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，临床上可用氯喹治疗。研究发现部分疟原虫的Pfcrt基因发生突变，会导致该蛋白的其中一个赖氨酸改变为苏氨酸，从而获得对氯喹的抗性。现有1～5号共5份血样，处理后利用PCR扩增Pfcrt基因。产物用限制酶Apol处理，酶解产物的电泳结果如图所示。下列说法错误的是（    ） A．1号个体的电泳检测结果支持该患者可用氯喹进行治疗 B．2号无条带是因为Pfcrt基因上无限制酶ApoI识别位点 C．3号和4号个体为氯喹抗性患者，应考虑其他治疗方案 D．5号个体可能被多种疟原虫感染，氯喹的治疗效果不佳 7．(24-25高二下·福建三明·期末)F1、F2、R1和R2是扩增基因片段的四种引物，它们与模板链结合的位置如图。M基因可能正向或反向插入质粒中，选用不同引物组合对基因扩增和电泳，可对M基因的插入情况进行鉴定。则可选用的引物组合是（    ） A．F2和R2、F2和R1 B．F1和R2、F2和R1 C．F1和R1、F2和R1 D．F1和R1、F2和R2 8．(23-24高二下·福建漳州·期末)利用PCR 技术扩增下图的一个P基因，下列说法错误的是（　　） A．PCR 扩增过程中，循环4轮共需要引物数为32 B．利用PCR 技术扩增图中的P基因，需要选择引物b、c C．PCR 扩增过程中，至少需要经过3轮循环后才能产生双链等长的P 基因 D．在延伸时，DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 9．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)多溴联苯醚（分子式C12H5Br4O，简称BDE-47）是一种电子垃圾分解后产生的环境污染物，进入人体会对神经系统、生殖系统等产生毒害。为了提高好氧细菌的降解效率，将GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因导入WT-G受体菌，构建成基因工程菌1、2、3，如图是对三种菌相关基因的电泳结果。下列叙述错误的是（　　） A．由图可知，工程菌2为降解BDE-47能力强的目的菌株 B．从GB-2细菌内获取的BDE-47降解基因可通过PCR技术进行扩增 C．将含有BDE-47降解基因的重组质粒导入WT-G受体菌时，用Ca2+处理会增大导入率 D．若要增加筛选GB-2细菌的可能性，应从多溴联苯醚污染区取样并进行菌体培养 10．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述正确的是（    ） A．导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3’-端进行子链合成 C．若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列 D．利用显微注射法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上 二、多选题 11．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)下图为某DNA片段的结构示意图，其中L和R 表示方向，①和②代表DNA 的两条链，③和④为 PCR 所需的引物。下列叙述正确的是（    ） A．①链的复制方向为R→L，②链的复制方向为L→R B．所选择的两个引物（③和④）的碱基序列应当互补配对 C．若以该DNA 为模板，并进行PCR扩增n次，则一共需要2n⁺¹个引物 D．若要在新合成的DNA 中添加限制酶的识别序列，则需要在引物的5'端进行设计 三、非选择题 12．(24-25高二下·福建百校·期末)胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如图所示。请据图回答下列问题： 已知HindⅢ的识别序列及切割位点为5′－A↓AGCTT－3′；EcoRⅠ的识别序列及切割位点为5′－G↓AATTC－3′；BamHⅠ的识别序列及切割位点为5′－G↓GATCC－3′。 (1)若从动物细胞中直接提取kit基因的mRNA，需通过______酶获得cDNA。目的基因与质粒连接后可以导入到不同物种细胞中表达出同种蛋白质，说明不同生物密码子______。 (2)②过程需要使用的限制酶为______。已知kit部分基因（如下所示）且基因上并无质粒中相关限制酶识别序列，为使基因与质粒成功连接，利用PCR技术扩增kit基因时需要设计一对引物，这对引物的序列分别是______________________（从引物5′端开始书写，只写前12个碱基即可）。 5′－CGGGATCCA………………AGAATTCCG－3′ 3′－GCCCTAGGT………………TCTTAAGGC－5′（模板链） (3)为了使重组质粒更易进入大肠杆菌，可以用______处理大肠杆菌，筛选转化成功的大肠杆菌时，培养基中需添加______。可通过______技术检测胶原蛋白是否表达，若结果呈阳性，说明_____________。 (4)与动物细胞相比，利用大肠杆菌生产胶原蛋白的优点是______（写出1点）。大肠杆菌生产的胶原蛋白一般不具备天然状态下的活性，原因是______________________。 13．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)人体内的t－PA蛋白能高效降解血栓，然而为心梗患者注射大剂量的基因工程t－PA会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的t－PA改良蛋白，显著降低出血的副作用。改良过程如图，图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列，回答下列问题： (1)科学家将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t－PA突变蛋白的生物技术手段属于__________范畴。获得性能优良的t－PA突变蛋白的正确顺序是________________（选择正确编号并排序）。 ①t－PA蛋白功能分析和结构设计②借助定点突变改造t－PA基因序列③检验t－PA蛋白的结构和功能④设计t－PA蛋白氨基酸序列和基因序列⑤利用工程菌发酵合成t－PA蛋白 (2)已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t－PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b中该突变位点的碱基是____________________，引物c中该突变位点的碱基是____________________。 (3)据图可知，PCR3时，需要的引物是__________，引物的作用是__________。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因________________（答两点）。 (4)若获得的t－PA突变基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶__________切开，才能与t－PA突变基因高效连接。 (5)mlacZ表达产物会分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种在含有______________的培养基上进行筛选，含重组质粒的大肠杆菌应具有的表型是____________________。 14．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)我国科研团队从水稻中筛选出能调控耐高温性状的关键基因QT12，并将QT12基因导入水稻品种“华占”，获得的改良品种在高温下产量与品质均提升。回答下列问题： (1)科研团队利用PCR扩增QT12基因，引物是扩增过程的关键。根据QT12基因设计的四种引物如图所示，选用的引物组合应为______（选填“a”“b”“c”或“d”），理由是______。 (2)构建基因表达载体时，需要将QT12基因与启动子、终止子等连接，其中启动子的作用是______。若以质粒DNA分子为运载体，质粒上有标记的潮霉素抗性基因，则利用抗生素可初步筛选出含重组载体的水稻细胞，方法是______。 (3)将含QT12基因的表达载体导入水稻细胞后，需要通过______技术将单个细胞培育成完整植株。现要验证水稻的改良品种在高温下表现出更高的产量，请简要叙述实验思路和预期结果：______。为避免改良品种推广时发生基因污染，最好将目的基因导入细胞的______（填“细胞核”或“细胞质”），降低通过花粉扩散的风险。 15．(23-24高二下·福建厦门·期末)泡菜母水中含有丰富的微生物，这些微生物是多轮使用后选择出来的，具有较好的发酵性能。研究人员欲从泡菜母水中分离优质乳酸菌种，流程如下。 请回答： (1)步骤①使用的MRS培养基应为_________（填“固体”或“液体”）培养基。步骤②应采用_________法进行接种，可根据_________初步判断其为产乳酸的微生物，并将之选出。 (2)16S rDNA编码细菌核糖体16S rRNA，具有高度保守性，可用于菌种鉴定。提取初步筛选出的产乳酸微生物的DNA作为模板，依据_________的序列设计引物进行PCR扩增，利用_________技术检测PCR产物，并对目标条带对应的PCR样品纯化后测序，比对序列确定了3种乳酸菌L1、L2、L3。 (3)泡菜制作过程中需要使用高浓度盐水进行浸泡，其主要目的是_________。因此，需要对L1、L2、I3菌株进行耐盐能力鉴定，从中筛选出耐盐能力强的菌株，请设计一个实验结果记录表________。（ 泡菜制作时，盐水浓度通常为5%-20% ；培养24h后检测OD值作为菌株生长情况的指标） 地 城 考点05 基因表达载体的构建 一、单选题 1．(23-24高二下·福建厦门·期末)研究人员拟利用下图所示的目的基因片段和质粒构建基因表达载体。下列相关叙述错误的是（    ） 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA AGATC↑T A．应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒 B．应选用T4 DNA连接酶连接目的基因与质粒 C．重组表达载体能被XbalⅠ识别并切割 D．目的基因以β链为模板链进行转录 2．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（    ） A．用限制性内切核酸酶EcoRⅠ和DNA 连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上 3．(24-25高二下·福建百校·期末)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图，PmeI、BamHI、SpeI、SacI为不同限制酶），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法错误的是（    ） A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因 B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeI和BamHI C．sfp和idgS基因表达时不是以T-DNA的同一条链为模板进行转录 D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上 二、非选择题 4．(24-25高二下·福建三明·期末)抗凋亡因子Bcl-xL能与促凋亡蛋白Bax结合，阻止细胞凋亡。蛋白Bad能与Bcl-xL结合，释放Bax。为研究线粒体中p53蛋白与细胞凋亡的关系，研究人员利用pCMV-EGFP质粒，构建了pCMV-EGFP-p53、pCMV-EGFP-Bad和pCMV-EGFP-p53-Bad基因表达载体（EGFP代表增强型荧光蛋白基因）。图1为pCMV-EGFP-p53-Bad基因表达载体构建过程和部分限制酶切割位点。 (1)基因工程的核心步骤是___________，该步骤的目的是______________。 (2)PCR扩增Bad基因时引物的作用是______，图2所示引物不适合用于PCR，原因是____________。 (3)若Bad基因的α链为转录的模板链，则在引物1和引物2的_____（5'端或3'端）添加的限制酶分别是_______，在pCMV-EGFP-p53-Bad表达载体中，EGFP的主要作用是______________。 (4)研究人员将pCMV-EGFP质粒及上述三种基因表达载体导入肝细胞，分析细胞的死亡率相对值及细胞内Bcl-xL的含量，结果如图3。据图分析推测p53与Bad蛋白在调控细胞死亡过程中可能存在_______关系（填“协同”或“拮抗”），判断依据是___________。 5．(23-24高二下·福建南平·期末)瘦素是一种由脂肪组织分泌的肽类激素，参与脂肪代谢的调节。科研人员改造了 P载体并进一步构建瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况，为肥胖患者的治疗提供新思路。瘦素基因及P载体的结构如下图所示，P载体上含有能在真核细胞中表达的绿色荧光蛋白基因（GFP）。回答问题。 (1)运用PCR 技术扩增瘦素基因应选择图中的引物________，PCR 每次循环一般分为变性→复性→_______。 (2)利用琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定时，结合上图分析，应选用_______分别对瘦素基因的PCR 产物、P载体和重组质粒进行切割，以确定重组质粒是否构建成功。若重组质粒构建成功，则电泳结果应为________（填“甲”或“乙”）图，理由是________。 (3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中的表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中的表达则具有卡那霉素抗性。本实验为筛选出转化成功的细胞，应在培养基中添加_______。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，原因可能是Kanʳ/Ncor抗性基因在真核细胞与原核细胞中具有________，驱动基因转录出不同的 mRNA；同时从细胞结构上分析，由于_______，导致Kanr/Neor在原核细胞中翻译出的多肽仅能进行简单的修饰和加工。 (4)分析P 载体插入绿色荧光蛋白基因（GFP）的目的是_______。 6．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)已知镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常；而人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。回答下列问题： (1)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作______（填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作______。 (2)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____，以其作为模板，在_____酶的作用下反（逆）转录合成cDNA．cDNA与载体需在限制酶和______酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (3)如图为“乙肝基因工程疫苗”的生产和使用过程，质粒中lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X－gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色。图中过程①有两种限制酶选择方案，它们分别是_____或_____。 (4)获取目的基因的方法除了图中用酶切的方法从细胞中分离以外，还可以通过_____来获得。据图可知，该目的基因的具体功能是______。 (5)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入____，培养一段时间挑选出____色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 7．(24-25高二下·福建宁德·期末)科研人员利用基因工程改造大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌。图1表示利用PCR技术获取胰岛素基因（①②③④表示相关引物的部分序列），图2表示质粒的结构。 注：1.图中限制酶的识别序列和切割位点为：BamHⅠ：5＇—G↓GATCC-3＇，EcoRⅠ：5＇—G↓AATTC—3＇，SalⅠ：5＇—G↓TCGAC—3＇；2.LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色。 回答下列问题： (1)从__________细胞中提取mRNA，经__________过程得到cDNA，然后设计引物并利用PCR技术扩增胰岛素基因。 (2)根据图1判断__________链为胰岛素基因转录的模板链。已知胰岛素基因α链的部分碱基序列为5＇—TTTAAA—3＇，强启动子α链的部分碱基序列为5＇—GCTG…CATG—3＇，为确保胰岛素基因与质粒正向连接，利用PCR扩增胰岛素基因时，基因上游应选__________（填“①”或“②”或“③”或“④”）作为引物，其部分碱基序列为__________。（填序号） A．5＇—GGATCCCGAC…GTACAAATTT—3＇ B．5＇—GGATCCGCTG…CATGTTTAAA—3＇ C．5＇—GTCGACGCTG…CATGTTTAAA—3＇ D．5＇—GTCGACCGAC…GTACAAATTT—3＇ (3)将构建的基因表达载体与经__________处理的大肠杆菌，在适宜的条件下共培养一段时间，再接种到含__________的培养基上培养，筛选出呈__________色的菌落，即可得所需菌落。 (4)从上述工程菌的培养液中可以提取到胰岛素原，经鉴定该胰岛素原无生物活性。从大肠杆菌的结构分析，胰岛素原无生物活性的主要原因是__________。 地 城 考点06 将目的基因导入受体细胞 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T-DNA插入的具体位置。下列叙述正确的是（    ） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物，T-DNA存在于其拟核上 B．将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列 D．若用PCR技术扩增循环n次，需要2n-1个引物 2．(24-25高二下·福建泉州四校联盟·期末)科研工作者将从某真菌中获得的C1酶基因（可编码纤维素酶）与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入大肠杆菌，以期短期内获得大量纤维素酶。下列相关叙述错误的是（    ） A．将重组质粒导入大肠杆菌前，需要先用Ca²⁺处理大肠杆菌 B．从真菌中克隆得到Cl酶基因的过程中需要用到PCR技术 C．为实现高效连接，可用同一种限制酶切割Cl酶基因和HT质粒两端的碱基序列 D．从大肠杆菌中获得的纤维素酶的空间结构可能不同于从真菌中获得的 3．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)下图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（　　） A．基因工程的操作程序中核心步骤是目的基因的筛选与获取 B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．农杆菌转化法是指上图中的②→③的过程 D．基因工程的原理是基因重组，其变异为定向变异 4．(23-24高二下·福建泉州·期末)下列关于目的基因导入受体细胞的叙述错误的是（　　） A．目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化 B．可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使它能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重组的基因表达载体导入其中 C．可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 D．农杆菌只能侵染单子叶植物和裸子植物 二、非选择题 5．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。 (1)利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物的____________（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是_____，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是__________。 (2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5'-__________-3'和5'_______-3'（引物长度均为12个碱基）。 (3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入Ti质粒的_______上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入________，从而使其得以维持稳定和表达。 (4)乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。 正常植株 转基因A植株 转基因B植株 AC酶 ATGL酶 ①在分子水平上，用_____方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述表格结果。 ②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是________。 6．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁重要组成部分，其功能障碍可导致主动脉瘤。M蛋白（与肌肉收缩相关，由M基因控制合成）在SMC中含量高，其他细胞中几乎不存在。科研团队为获得血管SMC被特异性标记的模型鼠，开展了系列实验。 (1)获得融合基因：如图1所示，利用_________技术获得Cre重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因（CE）。欲得到大量完整的CE基因，该技术的最后一个环节应选用引物_________。 (2)构建基因表达载体：为保证CE在SMC中特异性表达，需将CE插入小鼠的____基因的启动子之后。已知CE基因的连接处有XbaI的识别序列，图2为用于构建CE基因表达载体的质粒的部分示意图。据图可知，可用限制酶________对载体质粒进行双酶切，在CE融合基因的两端分别添加限制酶________的识别序列。 (3)将目的基因导入受体细胞：将构建成功的表达载体通过________法导入小鼠的_______作为受体细胞，培养后获得小鼠A。 (4)获得CE杂合小鼠C：构建含Stop和tdT的表达载体并获得小鼠B，让小鼠A与B进行杂交，获得同时含有以上基因的CE杂合小鼠C，如图3。 在外源药物T的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre重组酶能导致loxP位点间的序列丢失。用药物T饲喂小鼠C后，借助一定的技术手段可观察到________。 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)斑马鱼是一种常用的模式动物，具有体外受精、体外　发育、胚胎透明等诸多优势。研究人员建立一种绿色荧光蛋白（EGFP）在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达的转基因斑马鱼品系，为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。请回答: (1)基因表达载体的构建 ①研究人员构建了如图1所示基因表达载体，其中Tol2序列 可携带ttn.2启动子和EGFP基因随机插入染色体DNA的任意位点;ttn.2启动子的作用是__________。 ②构建完成的表达载体导入大肠杆菌感受态细胞，在含_____________的平板上培养一段时间后挑选单菌落，扩大培养后提取质粒DNA并通过酶切、测序验证是否构建成功。若构建成功，则用限制酶StuI切割后进行琼脂糖凝胶电泳，将观察到_____个条带。 (2)将表达载体导入受体细胞通常使用__________法将构建好的表达载体导入斑马鱼的受精卵中。 (3)反向PCR鉴定整合位点 ①通过反向PCR扩增并对产物进行测序（如图2），再将测序结果与基因序列数据库中已知斑马鱼DNA序列进行比对，可以判断出目的片段所插入的染色体及所在的位置。已知目的片段的一条单链序列为:5＇-GCAATGCGTAGCCTCT.............AACTATGCGCTCATGA-3＇（虚线处省略了部分核苷酸序列），则在步骤Ⅲ中选用的PCR引物是__________。 A．5＇-TTGATACGCGAGTACT-3＇ B．5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇ C． 5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇ D．5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇ ②对成功导入上述表达载体的3个斑马鱼品系的反向PCR产物进行电泳，结果如图3。据图分析，出现图中现象的原因最可能是__________。 8．(24-25高二下·金太阳福建福州八县（，区）协作校·期末)科研人员利用农杆菌转化法，将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育抗虫杨树。利用含Pin-Ⅱ的DNA分子和Ti质粒构建基因表达载体的过程如图所示，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neoR表示新霉素抗性基因，箭头表示限制酶的酶切位点，相关酶的识别位点如表所示。回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，应该选择的引物是________，引物的作用是________。为使Pin-Ⅱ与Ti质粒正确连接，应在所选引物的5′端分别添加限制酶________的识别序列。 (2)为了更好地将表达载体导入农杆菌，一般要先用________处理农杆菌细胞，目的是________。 (3)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染杨树后，应在含________的培养基中进行筛选。为检测转基因杨树的Pin-Ⅱ是否成功表达出相应蛋白质，常用的方法是________。 地 城 考点07 目的基因的检测与鉴定 一、单选题 1．(24-25高二下·福建泉州鲤城区福建泉州第七中学·期末)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析正确的是（    ） A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗虫蛋白，则可能是抗虫基因能翻译，但不能转录 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因无法表达 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中 D．若经C检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白和无Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入受体细胞 2．(24-25高二下·福建福州福清·期末)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错误的是（　　） A．可用PCR技术检测抗冻基因在受体细胞中是否转录 B．选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶III C．利用PCR从海鱼中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物 D．要用含有卡那霉素的选择培养基筛选含抗冻基因的番茄细胞 3．(24-25高二下·福建三明·期末)一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸（密码子:ACA）换成丝氨酸（密码子:UCU），能显著降低其诱发出血的副作用。下列说法正确的是（    ） A．改造后的基因中决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为TCT B．构建重组质粒时需要选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒pCLY11 C．使用T4DNA连接酶不能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 4．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．基因工程核心步骤需要的工具酶有DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶 C．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 5．(24-25高二下·福建三明·期末)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组 B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶 C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞 D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜 二、非选择题 6．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)MS2噬菌体是一种RNA病毒，其遗传物质由控制合成A蛋白、衣壳蛋白（CP）、复制酶（REP）等蛋白的基因组成。A蛋白和CP与MS2噬菌体颗粒（VLPs）的形成相关，颗粒中含REP，缺乏REP时噬菌体不能增殖形成噬菌斑。将逆转录得到的MS2基因组中的REP基因拆分成REP-a和REP-b基因片段，并将REP-a基因与X基因融合，将REP-b基因与Y基因融合，若X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用，则会使REP-a蛋白与REP-b蛋白相互靠近并具备完整的REP活性，相关过程如下图。回答下列问题： (1)若要通过PCR融合REP-a基因与X基因，关键是设计具有______（填“互补末端”或“不同末端”）的引物，使PCR产物在末端形成重叠链，在随后的PCR扩增中重叠链作为模板延伸，将两个片段拼接成一个完整的融合基因。重叠PCR中_______过程所需温度最低。若两个片段具有相同且合适的酶切位点，则可以借助_______酶将两个片段连接起来。 (2)质粒1中包含重组MS2噬菌体基因组，其中的REP基因编码区由REP-a基因与X基因替换，不含______段。质粒1的表达产物________与转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs。 (3)将得到的VLPs侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主，并观察是否形成_________，图中培养基出现阳性结果，则说明__________。 7．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)研究表明，基因S参与水稻盐碱胁迫的应答过程，该基因过表达可降低水稻植株对盐碱胁迫的敏感性。现利用基因S获得过表达基因SP（由强启动子驱动S基因的编码区过表达），从而培育耐盐碱水稻新品种。请回答下列问题： (1)如图1所示，可利用________技术从水稻基因组DNA中扩增目的基因S，欲使获得的基因S两端携带限制酶识别序列，需要在引物的________端添加。 (2)构建如图基因表达载体时，需用________酶切割目的基因和质粒，酶切后质粒上保留的黏性末端序列分别为5＇-________-3＇和5＇-________-3＇。潮霉素抗性基因和基因S转录时的模板链________（填“是”或“不是”）同一条链。 (3)据信息可知，过表达基因SP由________（答出2部分）组成。可使用________筛选转化成功的水稻愈伤组织细胞。 (4)已知水稻细胞中也存在基因S，由于其启动子为普通启动子而无法高效表达，导致水稻无法耐盐碱。现获得有上述抗生素抗性水稻甲～丁，为进一步鉴定甲～丁的基因型，通过PCR技术将相应启动子与基因S整体扩增出来，应选择图2中的引物组合是________。部分序列信息及可选用的酶切位点如图3所示，PCR产物利用KpnⅠ完全酶切后的电泳结果如图4所示。据图可判断甲的基因型为________。 8．(24-25高二下·福建福州福建师大附中·期末)为构建效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1中的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录出来的短链RNA与目的基因发生碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，能敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 (1)大肠杆菌的LacZ基因表达产物能使X-gal分解产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因。大肠杆菌在含_______的培养基上（添加了X-gal）培养，出现_______色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 (2)Cas9的表达量与敲除效率有关，但表达过量会对大肠杆菌产生毒性。为评估毒性和敲除效率，分别用ABCDE启动子对Cas9进行转录，结果如图2。其结果表明，启动子_____对细胞毒性最小。综合考量敲除效率和毒性，应选择启动子______作用于该系统。 (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在LacZ基因被成功敲除的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为_____（填选项）。 A．含有质粒1和质粒2  B．只有质粒1 C．只有质粒2         D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板中筛选出质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，请简要写出实验设计思路并预测实验结果。________。 9．(24-25高二下·福建莆田·期末)西瓜是重要的经济作物，西瓜果实中C基因编码的C蛋白会影响西瓜的品质。科研工作者利用PCR和Gibson无缝克隆技术（三酶协同）构建了C-GFP基因表达载体，并进行了相关研究。实验流程如下： (1)PCR的每次循环一般分为______三步。过程②中设计引物3和引物4的序列时，应根据______两端的序列进行设计。 (2)Gibson无缝克隆技术中用到的三酶分别是T5核酸外切酶、DNA聚合酶和______。 (3)将构建的C-GFP基因表达载体转入农杆菌，培养筛选获得6个农杆菌单菌落，用PCR技术对其进行DNA检测，处理如下。 组别 编号1-6 对照组1 对照组2 模板 1-6菌落中农杆菌DNA ______ 普通农杆菌DNA PCR反应 PCR反应体系必需物质 琼脂糖凝胶电泳结果 对照组1的模板是______，基于上述实验结果______，（填“能”或“不能”）判定2号、5号农杆菌成功表达了C-GFP融合蛋白，原因是______。 (4)实验结果显示，转化成功的果实细胞能观测到细胞质和细胞核均发出绿色荧光。据此推测，通过构建上述基因表达载体获得C-GFP融合蛋白的目的是________。 10．(24-25高二下·福建福州福清·期末)农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草（一种沉水植物）染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图1所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题： (1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据__________设计特异性引物序列。在PCR中，引物的作用是使__________酶能够从引物的__________端开始连接脱氧核苷酸。 (2)将基因mpd和ophc2拼接成融合基因。在转录时，融合基因共用__________，因而基因mpd的a链的5'端与基因ophc2的__________（填“a链”或“b链”）的3'端相连。 (3)为构建融合基因，并确保融合基因按照正确的方向插入图2质粒pBI121中，在图1引物的5'端加入特定的限制酶切割位点。已知引物2上加入BamHI位点，其余三种引物加入的分别是：引物1加入______位点，引物3加入______位点，引物4加入______位点。 (4)将受体细胞接种到添加__________的培养基中进行培养，将筛选出的受体细胞经植物组织培养技术获得植株。还需在__________水平检测转基因苦草降解有机磷农药的能力，简要写出实验思路：__________。 地 城 考点08 基因工程的应用 一、单选题 1．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（　　） A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌 B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株 C．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗 D．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛 2．(24-25高二下·福建龙岩·期末)下列有关基因工程应用的说法，错误的是（    ） A．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于基因工程的应用 B．将药用蛋白基因导入到动物乳腺细胞中，可培育出乳腺生物反应器 C．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质 D．相比天然产物提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高 二、非选择题 3．(24-25高二下·福建厦门·期末)研究人员构建了远红光可控的分泌肿瘤坏死因子 （TNF）的工程细胞，并将其植入肿瘤切除部位，有效调动机体局部的免疫反应，为癌症治疗提供新思路。调控原理和主要模块的部分结构如图 1。 回答下列问题： (1)构建模块 1和模块 2的过程需使用____酶。 (2)为使远红光的诱导效果更高效，启动子 1应为____（填“诱导型启动子”或“持续表达型启动子”）。在远红光照射下，____（填物质）可激活启动子 PF促进 TNF 合成与分泌。 (3)研究人员测定了多个工程细胞在黑暗条件和远红光照射下的 TNF分泌量，结果如图 2据图分析，应选用____号工程细胞开展后续动物实验，理由是____。 (4)研究人员希望工程细胞在远红光照射下能同时分泌 TNF、IFN两种免疫活性物质，以增强疗效。请据此要求提出一个改造模块 2的简单思路____。 4．(24-25高二下·福建龙岩·期末)除草剂的有效成分草甘膦能够专一地抑制EPSP合酶的活性，从而使植物体内多种代谢途径受到影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，它在除掉杂草的同时也会使作物受损。解决这个问题的方法之一就是培育抗草甘膦的作物。科研人员尝试用薤白（草本植物）EPSP合酶基因培育抗草甘膦烟草，下图为重组Ti质粒示意图，请回答下列问题。 农杆菌菌株 潮霉素 卡那霉素 E 敏感性 抗性 L 抗性 敏感性 (1)为获取EPSP合酶基因，可以从薤白细胞中提取总mRNA，经过________过程获得cDNA并利用PCR扩增。PCR反应缓冲溶液中一般要添加用于激活DNA聚合酶。复性温度下发生的扩增过程是____________。 (2)Ti质粒与EPSP合酶基因构建重组Ti质粒后，将重组Ti质粒导入受体菌，结合表分析，在适宜温度下，将含目的基因表达载体的溶液与CaCl2处理过的______________(填“E”或“L”)农杆菌混合并培养筛选转化成功的农杆菌。下列可以采用的筛选转化成功的农杆菌的方法是________。 A．提取农杆菌的DNA，酶切后电泳 B．在显微镜下观察是否有绿色荧光 C．在培养基中添加潮霉素 D．提取农杆菌的DNA进行PCR (3)如何在个体水平鉴定转基因烟草具有抗草甘膦的特性，请写出实验思路____________。 (4)科研人员发现重组Ti质粒导入烟草的数量不等，且发现绿色荧光强度越大的烟草对草甘膦抗性越强，据此可为抗草甘膦作物的培育提供进一步的研究思路是______________。 5．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员研究了R基因来提高酵母的絮凝能力。 (1)啤酒生产中，酵母菌产酒过程的反应式为：_______。 (2)科研人员利用基因工程技术获得R基因被敲除的酵母菌菌株。 ①构建含有卡那霉素抗性基因和R基因上、下游序列的打靶DNA序列，用LiC1处理酵母菌，使其处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态，以实现_______。打靶DNA序列上的卡那霉素抗性基因通过同源重组机制，替换了酵母菌基因组中的R基因（如图1）。这种机制与减数分裂中的__________过程机制相似，都属于基因重组。 ②利用含有卡那霉素的培养基获得单菌落。挑取单菌落，利用PCR技术进行扩增，以确定酵母细胞的R基因是否被成功敲除，供选择的引物如图1所示。除引物1、4组合外，还可以选用的引物组合有_______，请在答题纸上画出用引物1、4组合进行PCR时敲除和未敲除对应的电泳结果，要求标出每个电冰条带对应的DNA片段长度________。 (3)科研人员对野生菌株和R基因敲除菌株的酒精发酵能力和絮凝能力进行了测定，结果如下表。 菌株\指标 酒精发酵能力 絮凝能力 野生菌株 4.5% 63.06% R基因敲除菌株 4.5% 83.12% ①检测酒精发酵能力时，将菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，11℃静置发酵7天。发酵期间，每个锥形瓶应注意保持________条件和定时排气。 ②实验结果表明，获得的R基因敲除菌株符合生产需求，依据是_______。 (4)科研人员进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制。 ①将R基因敲除菌株和野生菌株分别用________水进行稀释。将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30μg/mL钙荧光白（细胞壁组装抑制剂）的YPD平板培养（培养酵母菌的常用培养基）上，培养适当时间后结果如图2。 ②综合上述实验结果，推测R基因敲除菌株絮凝能力变化的原因是_______。 (5)若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：_______。 6．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。研究发现，叶用莴苣（俗称生菜）细胞中的FANCM蛋白能够阻止减数分裂过程中交叉互换的发生，科学家借助CRISPR/Cas9基因编辑技术（原理如图1所示），研发出人工FANCM基因驱动系统，从而在叶用莴苣中实现了外部引入的基因多代遗传。图2表示利用基因驱动技术获得FANCM突变基因的过程，利用同源定向修复功能，可以使另一条同源染色体上也插入基因驱动元件，从而获得FANCM基因纯合突变体。 (1)图1中组成gRNA的单体是，gRNA的作用是_____________，为确定图2中基因驱动元件是否完整插入FANCM基因，最好选择的两组引物是_____________（从图2中P1-P4四种引物中选择）进行PCR。 (2)图2中科研人员首先构建了基因驱动元件，将其导入叶用莴苣细胞中，需要将其DNA序列插入到Ti质粒的T-DNA内部，原因是_____________，为提高导入成功率，常利用_____________处理农杆菌。 (3)用FANCM基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达7%的植株为纯合突变体。请解释纯合突变体产生的原因是_____________。 (4)利用基因驱动技术获得FANCM基因突变纯合体，在叶用莴苣遗传育种中的应用价值是_____________。 (5)遗传学家研究发现，基因驱动技术几乎可以百分之百地使突变基因在该种群群体之间传播，某些生物学家曾提出把这种技术应用于消灭一些入侵物种，从而保护那些濒危物种，一些遗传学家立即呼吁增强这种技术的管制。请从生物技术安全性的角度简要谈谈你对该技术的看法。____________________。 7．(24-25高二下·福建龙岩·期末)某科研团队致力于研究植物细胞工程在提高作物抗逆性方面的应用。已知基因A与植物的抗盐能力密切相关，该团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对某植物的愈伤组织进行基因编辑，期望增强其抗盐能力。实验过程如下，请回答相关问题 (一)愈伤组织的获取与处理： (1)在获取愈伤组织的过程中，幼嫩叶片切块在培养基上先经过_______________过程形成愈伤组织，该过程中细胞的分化程度______(填“升高”或“降低”或“不变”)。生长素和细胞分裂素在该过程中起重要作用，当生长素与细胞分裂素的比值_____________(填“较高”或“较低”或“适中”)时，有利于愈伤组织的形成。将获得的愈伤组织平均分为两组，A组不做处理；B组利用CRISPR-Cas9技术对基因A进行编辑。 (二)抗盐能力检测： (2)将两组愈伤组织分别转移到含有_____________的培养基上继续培养，一段时间后，观察并统计愈伤组织的生长情况，以评估其抗盐能力。实验结果如图显示，结果说明：在相同NaCl浓度下，____________。 (3)利用CRISPR-Cas9技术对基因A进行编辑时，Cas9蛋白可识别特定的DNA序列并切割DNA,可推测Cas9蛋白类似于基因工程基本工具中_____________的作用。与传统的诱变育种相比，基因编辑技术的优点是_________(答出一点即可)。 (三)基因表达检测： 进一步对两组愈伤组织中与抗盐相关的基因B表达水平进行检测，结果如图所示，已知基因B编码的蛋白质对细胞内脯氨酸的合成有影响。 (4)请根据实验结果进行分析，两组实验中愈伤组织生长状况差异产生的原因可能是：基因A被编辑后，使实验组中____________增强了抗盐性。 地 城 考点09 蛋白质工程 一、单选题 1．(24-25高二下·福建漳州第一中学·期末)干扰素是动物细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，可对抗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，错误的是（　　） A．构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能 B．改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 C．上述技术环节中，有些需要通过基因工程实现 D．新的干扰素基因应插入质粒上的起始密码子和终止密码子之间 2．(24-25高二下·福建泉州四校联考·期末)科学家利用AI技术从头设计了具有高效催化活性和新型折叠结构的丝氨酸水解酶。下列叙述错误的是（    ） A．AI技术设计该酶不用考虑肽键形成方式 B．AI技术设计该酶首先考虑基因碱基序列 C．该酶形成折叠结构需氨基酸间形成氢键 D．该酶的设计生产需利用蛋白质工程技术 3．(24-25高二下·福建南平·期末)科研人员通过蛋白质工程将脂肪酶的第113位氨基酸由Ala变为Gly，第74位氨基酸由Leu变为Asn后，脂肪酶活力大幅度提高。下列相关叙述，错误的是（　　） A．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 B．上述氨基酸序列的改变利用了基因的定点突变技术来进行碱基的增添 C．脂肪酶的改造可借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型 D．脂肪酶预期的蛋白质结构的设计需要中心法则提供理论支持 4．(24-25高二下·福建福州福清·期末)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），天然的Y通常需要在低温下保存，若将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙，可提高其热稳定性。下列说法错误的是（　　） A．改造蛋白质Y的过程需替换的碱基对不超过3对 B．获得改造的蛋白质Y属于蛋白质工程，没有用到基因工程技术 C．可从人的T细胞中提取mRNA，逆转录合成cDNA，以获得Y基因 D．改造过程可能获得多种Y基因，这些基因表达得到的Y蛋白相同 5．(24-25高二下·福建厦门·期末)酶的热稳定性是指酶在高温条件下保持其结构和功能稳定性的能力。D1-PGI和 G3-PGI都是磷酸葡萄糖异构酶，两者仅有 5个氨基酸差异。常温下二者催化效率相当，但在 50℃环境下后者的热稳定性比前者强。进一步研究发现，单一位点的氨基酸替换都不足以解释 D1PGI和 G3-PGI间的热稳定性差异。下列叙述错误的是（    ） A．50℃环境下 D1-PGI的催化活性比 G3-PGI低 B．可用蛋白质工程实现单一位点的氨基酸替换 C．5个氨基酸同时替换才会影响酶的空间结构 D．酶热稳定性增强是一种对高温环境的适应策略 6．(24-25高二下·福建福州平潭第一中学·期末)枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，使其在pH=6时的活力提高了10倍。下列说法正确的是（　　） A．需要通过改造基因实现对蛋白质中氨基酸的替换 B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有独特的优势 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息 7．(24-25高二下·福建泉州南安第一中学·期末)基因编辑的困难在于精准地将DNA片段插入基因组的特定位置。近期，我国科学家发现R2逆转座子可将DNA片段特异性插入目的DNA区域，但插入效率较低。科学家利用蛋白质工程等技术将R2逆转座子改造后，实现了在哺乳动物细胞中高效插入。R2逆转座子和DNA片段插入过程如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．R2逆转座子也有DNA连接酶的活性 B．合成第二条DNA链的模板是R2 RNA C．插入的目的序列应设计在R2 RNA中 D．可通过改造R2蛋白结构提高插入效率 8．(24-25高二下·福建福州马尾一中等六校·期末)蛋白质工程是基因工程的延伸，又称为第二代基因工程。下列关于基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是（    ） A．蛋白质工程可通过定点突变技术，在不改变氨基酸序列的情况下优化蛋白质功能 B．蛋白质工程通常需要通过X射线衍射技术来分析目标蛋白质的晶体结构 C．蛋白质工程的操作过程中，需要先合成mRNA，后合成基因 D．蛋白质工程的实施，充分体现了功能决定结构的科学思想 9．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)中国科学家研发的全球首个AI蛋白质生成大模型NewOrigin（中文名“达尔文”）正式在世界人工智能大会亮相。它能通过AI学习蛋白质中氨基酸序列和蛋白质功能间的对应关系来设计新的蛋白质，为蛋白质工程的发展提供了新方向，在生物医药领域也有较好的应用前景。下列叙述不正确的是（    ） A．蛋白质工程需从设计预期的蛋白质功能出发，目前的AI可帮助人们设计出自然界没有的蛋白质 B．NewOrigin在蛋白质工程广泛应用后将仍需要借助基因工程手段改造蛋白质，使得产品更优良 C．对蛋白质数据进行分析，能够预测患者体内某些蛋白质的三维结构以便设计新药物，该过程属于蛋白质工程技术 D．AI技术在生物医药领域的应用会涉及到众多的法规和伦理问题。例如，如何处理AI决策中的错误和责任、以及如何避免AI技术加剧医疗不平等等问题 10．(24-25高二下·福建泉州十校·期末)抗体结构分为可变区（V区）和恒定区（C区），与抗原特异性结合的区域为CDR区，位于V区中。在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而削弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体，主要流程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．鼠—人嵌合抗体至少含有4个游离氨基，其抗体特异性由肽链的C区决定 B．上述表达载体的构建过程主要利用了基因突变的生物学原理 C．为提高嵌合基因与载体的连接效率，扩增时应在两条引物的3'端添加同种限制酶酶切位点 D．鼠—人嵌合抗体的研制过程属于蛋白质工程，图中转染细胞的方法可能是显微注射法 11．(24-25高二下·福建三明·期末)Cry蛋白是苏云金杆菌的主要杀虫蛋白。研究人员利用基因的定点突变技术将Cry蛋白第282位的丙氨酸和第283位的亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是（    ） A．对Cry蛋白的氨基酸序列或结构进行改造，可改造Cry蛋白的功能 B．Cry蛋白的毒性提高了7倍的原因是该技术直接改变了Cry蛋白的空间结构 C．该技术从预期蛋白质的功能出发，设计出相应基因的碱基序列 D．利用该技术对Cry蛋白进行改造属于蛋白质工程 12．(23-24高二下·福建漳州·期末)研究发现，胰岛素进入血液循环后容易被降解，糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，提高了胰岛素在患者体内的稳定性，延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是（　　） A．蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行改造或合成 B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否稳定的原因之一 C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发 D．蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，因此蛋白质工程难度很大 13．(24-25高二下·福建福州福9校·期末)基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可以利用现有蛋白质数据库以及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构及功能。下列说法错误的是（    ） A．AI可帮助人们更深入了解蛋白质的结构与功能关系 B．AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则 C．可通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质 D．AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质 二、非选择题 14．(24-25高二下·福建福州第一中学·期末)乳酸菌无氧呼吸过程中第一阶段产生的丙酮酸会在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下产生乳酸，科学家通过改造LDH能够高效地生产高纯度的苯乳酸。 (1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因，需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，可用于生产苯乳酸。 ①先将LDH基因片段连入载体中形成环状质粒，如图。 将突变后的序列设计在引物1中，以环状质粒为PCR的______，再向体系中加入四种脱氧核苷酸（dNTP）、______酶、______以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因，PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有______。 A．5'—TGACTGACTAACACTCGGAC—3' B．5'—TGACTGACAACCACTCGGAC—3' C．5'—TGACTGACGATCACTCGGAC—3' D．5'—TGACTGACGAGCACTCGGAC—3' ②上述PCR产物为______状DNA分子，改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧，需要用______酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。 (2)产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与，现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息，先用限制酶__________切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶__________切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 (3)上述科学实践属于生物工程中的__________工程。 15．(24-25高二下·福建福州福清·期末)水蛭是我国传统中药材，主要药理成分水蛭素（由65个氨基酸组成的单链多肽）为水蛭蛋白中的重要成分，具有良好的抗凝血作用。研究人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素，提高其抗凝血活性。请回答下列问题： (1)蛋白质工程基本思路如下图所示，物质a是__________，物质b是__________。 (2)若通过乳腺生物反应器生产水蛭素，简要实验思路为：将改造后的水蛭素基因与__________的启动子重组在一起，构建好的表达载体通过__________导入哺乳动物的__________。 (3)与该方法相比，诱变育种的缺点是（写出两点）__________。 (4)除乳腺生物反应器外，也可利用大肠杆菌为受体生产水蛭素，其中用__________生产的水蛭素活性更高，原因是__________。 (5)为检测受体细胞中的水蛭素基因是否翻译，可用__________通过__________技术进行检测。 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $