专题05 基因工程与蛋白质工程（期末真题汇编，北京专用）高二生物下学期

**基本信息** 聚焦基因工程与蛋白质工程核心考点，精选北京多区县高二期末真题，融合CRISPR/Cas9技术、蛋白质工程AI设计等前沿情境，突出实验探究与综合应用能力考查。 **题型特征** |题型|题量|知识覆盖|命题特色| |----|----|----------|----------| |选择题|30题|基因工程工具（限制酶/载体）、操作过程（PCR/转化）、蛋白质工程原理|结合DNA粗提取、电泳鉴定等实验，考查基本技能（如2题、6题）| |非选择题|25题|基因表达载体构建、CRISPR编辑、蛋白质改造|以“双特异性抗体制备”“工程菌构建”等真实科研情境，考查实验设计与结果分析（如11题、45题）|

专题05 基因工程与蛋白质工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02 基因工程的操作过程 考点03 蛋白质工程 地 城 考点01 基因工程的基本工具 1．（24-25高二下·北京·期末）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，作用机制如图。单链向导RNA（sgRNA）能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。下列相关分析不正确的是（　　） A．对不同目的基因编辑时，需使用不同的sgRNA B．Cas9可催化脱氧核苷酸链上特定氢键的水解 C．sgRNA过短可能因不能准确识别造成错误编辑 D．基因编辑技术可实现对特定基因的定点插入、敲除或替换 2．（24-25高二下·北京·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，不正确的是（　　） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色 C．PCR扩增目的基因时，变性是温度最高的环节 D．凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 3．（24-25高二下·北京延庆·期末）关于化合物分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（　　） A．利用加热后与斐林试剂生成砖红色沉淀的反应鉴定还原糖 B．利用常温条件下与二苯胺试剂呈现紫色的反应来鉴定DNA C．利用不同光合色素在层析液中溶解度的差异分离光合色素 D．利用常温条件下与双缩脲试剂产生紫色反应鉴定蛋白质 4．（24-25高二下·北京·期末）下列关于“DNA的粗提取和鉴定实验”的说法，错误的是（    ） A．通常选用DNA含量较高的组织材料如菜花等 B．研磨液中应含有蛋白质变性剂和DNA酶抑制剂 C．利用蛋白质不溶于95%冷酒精的性质除去杂质 D．溶解的DNA丝状物遇二苯胺试剂沸水浴后变蓝 5．（24-25高二下·北京朝阳·期末）如图表示基因表达载体的构建过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．标记基因的作用是便于筛选含重组DNA的受体细胞 B．DNA连接酶的作用是将目的基因的黏性末端与载体的平末端连接 C．图中目的基因必须包含启动子和终止子才能表达 D．限制酶的作用是将目的基因与载体的切口处直接连接起来 6．（23-24高二下·北京东城·期末）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解细胞→分离 DNA→沉淀 DNA→鉴定。下列叙述不正确的是（　　） A．裂解：利用研磨等方法使细胞破裂释放出DNA 等物质 B．分离：离心后留取上清液可去除不溶于研磨液的物质 C．沉淀：加入95%冷的酒精溶液沉淀得到粗提 DNA D．鉴定：加入二苯胺沸水浴后可见溶液由蓝变为砖红色 7．（23-24高二下·北京东城·期末）某遗传病的正常基因和突变基因单链片段如图1，研究人员拟用PCR 扩增2种基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点如图2）酶切，检测基因突变情况。下列叙述不正确的是（　　） A．PCR 可以用5´-GGCATG-3´作为其中一条引物 B．PCR 反应体系中需要添加耐高温的DNA 聚合酶 C．限制酶酶切后形成的末端为-GATG- D．限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段 8．（23-24高二下·北京东城·期末）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列箭头指向位置属于DNA 连接酶作用位点的是（　　） A． B． C． D． 9．（22-23高二下·北京西城·期末）原核细胞具有防止外来DNA入侵的系统，主要由限制酶和甲基化酶组成。通常限制酶只能识别未甲基化的相关序列。而Dpnl酶却可以特异性识别并切断腺嘌呤甲基化后的GATC序列，因此常被用于PCR后切除大肠杆菌来源的模板DNA。下列相关叙述错误的是（    ） A．限制酶可识别并切割外源DNA，以防止被入侵 B．甲基化修饰可以避免原核细胞自身DNA被切割 C．PCR时应加入甲基化酶，便于Dpnl酶识别并切割 D．该防御系统的形成是原核细胞长期进化的结果 10．（22-23高二下·北京东城·期末）用XhoＩ和SalＩ两种限制酶分别处理同一DNA分子，酶切位点及酶切产物电泳结果如图。以下叙述不正确的是（    ） A．该DNA分子有可能是环状双链结构 B．XhoＩ和SalＩ识别的核苷酸序列不同 C．图2中的酶切产物可用于构建重组DNA D．泳道①中是用SalＩ处理得到的酶切产物 11．（24-25高二下·北京海淀·期末）λT蛋白是一种源于鼠伤寒沙门氏菌的转录阻遏因子，仅在温度低于39℃时结合在P启动子上，抑制下游基因的表达。科研人员尝试利用超声波控制工程菌的蛋白质分泌，实现肿瘤的定向治疗。 (1)科研人员将L基因（表达产物可催化底物生成荧光）连接到启动子P下游，构建出含P-L片段的DNA．进一步构建含P-L片段的重组载体的流程是：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后______；再利用DNA连接酶将P-L片段拼接到载体的切口处。用超声波处理使温度升高到39℃以上时，成功转入重组载体的鼠伤寒沙门氏菌______，则表明超声波控制基因表达系统有效。 (2)A蛋白是肿瘤治疗的新型药物，能引起肿瘤细胞凋亡。科研人员拟将A蛋白基因转入大肠杆菌，构建仅在高于39℃时才能分泌大量A蛋白的工程菌。请参考样例，选用下列元件完成表达载体设计________。可选用的元件：启动子P 启动子J（持续表达启动子） A蛋白基因 T蛋白基因 Y片段（编码信号肽 引导蛋白分泌到细胞外） 终止子 (3)已知工程菌能定位于肿瘤组织中，实现肿瘤治疗。若要将此技术应用于临床，从有效性的角度，需进一步验证______（答出一点）。 (4)有学者认为：从生物安全角度，该技术可能引发“基因污染”。请提出一条改造上述表达载体，解决“基因污染”的思路__________。 12．（24-25高二下·北京顺义·期末）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白质工程——从“海选”到“设计” 从生物体内分离得到的天然酶，在工业生产中催化效率较低。为提高酶功能，科学家通过一定程度上模拟自然选择过程，经多次循环筛选实现对蛋白质功能的改进。第一次循环的操作流程如图1。 随着蛋白质工程的发展，目前可依据蛋白质作用机制与结构信息，改变一种或多种氨基酸，对蛋白质进行“设计”。据此，为增强P酶催化活性，我国科学家将P酶与PY（无催化活性的P祖先蛋白）进行序列比较，发现P酶与底物结合及反应区域的48个氨基酸中有16个是不同的。将PY的16个氨基酸替换，使之与P酶一致，获得的PY突变体（PY-16）具有与P酶相同的催化活性。为确定决定P酶催化活性的关键氨基酸，通过回复突变实验（将PY-16催化结构域中的16个氨基酸分别恢复到与PY相同）评估其突变效应，结果如图2。 科学家进一步根据突变效应的顺序，逐步向PY中添加单个突变，直至累积5个突变的PY-5才检测出与P酶相同的催化活性。通过分析PY-5与底物的结构，提出图3所示的“三点固定”模型解释催化机制。基于该模型利用AI设计出6万多种全新的P酶序列，经筛选发现其中有6种活性比天然P酶高1.3~3.5倍。 (1)基因工程原则上只能生产______的蛋白质，而蛋白质工程通过______基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)关于通过“定向进化”改进酶活性的过程，理解有误的是______。 A．①过程可使用低保真DNA聚合酶 B．①过程产生的基因突变是定向的 C．④过程筛选突变酶依赖于抗生素 D．经①②③④过程即可获得目的基因 (3)请将下列各项排序，以呈现文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路。 ①比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点 ②排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用 ③基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体 ④结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制 对比PY-16与其回复突变结果→______→______→______→______。 (4)天冬氨酸激酶是工业生产赖氨酸的关键酶，但其活性受到赖氨酸抑制。研究表明天冬氨酸激酶存在与赖氨酸结合的调节结构域，基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路______。 13．（24-25高二下·北京丰台·期末）研究者常利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，培育抗病新品种。有人认为转入的Cas9基因等有潜在风险，研究者尝试优化该技术。 (1)转入 CRISPR/Cas9基因后， 会表达形成 sgRNA-Cas9 复合体。sgRNA 能与A 基因序列互补配对，引导Cas9蛋白切割双链DNA 实现A 基因的敲除。Cas9蛋白的作用类似于基因工程基本工具中的_________。 (2)培育过程如图1所示： ①将 CRISPR/Cas9基因导入野生型植株TO: 第一步：将编码sgRNA 的基因和 Cas9 蛋白的基因整合到 Ti质粒上； 第二步：将含 Ti 质粒的溶液滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞/受精卵中。 若整合成功，细胞中通常仅插入一份 T-DNA 拷贝。 ②筛选转基因植物T1：收获种子并种植在含潮霉素的_________培养基上，筛选得到转基因植株T1。T1 的基因型为_________。 ③T1 植株自交得到T2，设计 Cas9基因特异性引物做PCR，PCR 结果为阴性的植株为所需植株，理由是_________。 (3)我国科研团队构建了一种转基因配子自动清除系统（TGAC 系统），该系统如图2所示，按图1方法培育得到植株T1′和T2′。 TGAC 系统发挥机制的原理：植物进行减数分裂通过毒素基因B，在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。为实现这一目的，需要选择特定的启动子，请从下表中选择最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是_________、________、________。可预测转基因元件清除的植株占T2′植株的比例为_________。 启动子 特异性 P1 所有体细胞中表达 P2 花粉发育后期表达 P3 卵细胞特异性表达 P4 极核细胞特异性表达 注：极核细胞和卵细胞是由同一个大孢子细胞有丝分裂产生的，若极核细胞死亡会导致卵细胞受精后无法发育。 (4)对比（2）与（3）分析，TGAC 系统在基因工程的应用与推广中有哪些优势_________? 地 城 考点02 基因工程的操作过程 14．（23-24高二下·北京西城·期末）荒漠植物的 Z 基因与其抗旱性强有关。科学家利用 Z 基因和农杆菌的 Ti 质粒（如图，T-DNA 为可转移的 DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA 能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶 ClaⅠ和 SacⅠ处理 Z 基因 C．可用卡那霉素筛选含重组 Ti 质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 15．（24-25高二下·北京丰台·期末）科学家将人的胰岛素基因导入大肠杆菌，使其能够合成胰岛素。下列有关这两类生物的叙述，正确的是（    ） A．都可以在核糖体上进行转录 B．都是通过有丝分裂进行增殖 C．细胞中核苷酸的种类和数量相同 D．细胞内都能进行基因的表达过程 16．（24-25高二下·北京顺义·期末）PCR扩增目的基因时，可通过设计引物在目的基因两侧引入限制酶识别与酶切位点。应将限制酶识别与酶切位点添加在（    ） A．引物中间 B．引物3'端 C．引物5'端 D．目的基因内部 17．（24-25高二下·北京海淀·期末）PCR是生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。下列有关PCR与人体细胞内DNA分子复制的叙述，不正确的是（　　） A．都需要引物提供延伸起始的3’末端 B．DNA聚合酶催化的最适温度不同 C．复制过程都是边解旋边复制 D．复制方式都是半保留复制 18．（24-25高二下·北京·期末）利用农杆菌的Ti质粒作为载体进行转基因操作获得转基因水稻。下列叙述正确的是（　　） A．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA B．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA C．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上 D．利用农杆菌转化法将重组质粒导入水稻细胞是培育转基因水稻的核心步骤 19．（24-25高二下·北京怀柔·期末）基因工程的主要操作步骤依次是（　　） ①筛选导入目的基因的受体细胞 ②构建基因表达载体 ③使目的基因在受体细胞中成功表达  ④筛选和获取目的基因 ⑤将表达载体导入受体细胞 A．①②③④⑤ B．④②⑤①③ C．④⑤②③① D．③②④⑤① 20．（24-25高二下·北京怀柔·期末）DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，形成标记的DNA—DNA（或标记的DNA—RNA）双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是（　　） ①该人胰岛B细胞中的mRNA     ②该人胰岛A细胞中的mRNA③该人胰岛A细胞中的DNA      ④整合了该人胰岛素基因的酵母菌的染色体DNA A．①③④ B．①②③ C．①②④ D．②③④ 21．（24-25高二下·北京顺义·期末）我国科研团队通过转基因牛乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白。下列叙述正确的是（    ） A．只能从人的乳腺细胞中获取目的基因 B．将目的基因与牛乳腺特异性启动子相连 C．将表达载体显微注射导入牛乳腺细胞 D．生产的人乳铁蛋白无需进行安全性评估 22．（24-25高二下·北京顺义·期末）CAR基因能表达特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体。CAR-T疗法是一种治疗癌症的免疫疗法，技术流程如图。以下说法不正确的是（    ） A．CAR基因需导入到患者细胞毒性T细胞中 B．CAR-T细胞特异性识别肿瘤细胞表面抗原 C．CAR-T细胞通过裂解肿瘤细胞而发挥作用 D．该过程使用了动物细胞培养与核移植技术 23．（24-25高二下·北京昌平·期末）利用PCR技术扩增木糖醇XDH基因，该基因的首、尾部分编码序列如下图所示。相关叙述正确的是（　　） A．变性阶段使用解旋酶将双链DNA解聚为单链 B．以4种核糖核苷酸为原料合成新的DNA链 C．选择引物2和引物3分别与两条单链DNA结合 D．在第一次循环后可以获得目的基因XDH序列 24．（24-25高二下·北京朝阳·期末）以下高中生物学实验中，符合规范操作要求的是（　　） A．鉴定DNA时，需沸水浴加热，使溶解的DNA与二苯胺反应出蓝色 B．检测还原糖时，待测液中先加NaOH溶液混合，再加CuSO4溶液 C．检测蛋白质时，需水浴加热使双缩脲试剂与蛋白质发生显色反应 D．鉴定脂肪时，先用50%的乙醇浸泡组织切片，再用苏丹Ⅲ染液染色 25．（24-25高二下·北京昌平·期末）提取貉不同毛囊数量的基因组DNA进行电泳鉴定，结果如图。相关叙述不正确的是（　　） A．M孔加入指示核酸分子大小的标准参照物 B．电泳结果为单条带说明无外源DNA干扰 C．电泳过程中DNA分子由A侧向B侧移动 D．貉的毛囊数量与DNA提取效果呈正相关 26．（24-25高二下·北京西城·期末）免疫PCR是一种抗原检测技术，其原理如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．图中两种抗体与抗原不同位点特异性结合 B．PCR产物的量与目标抗原的含量正相关 C．检测不同抗原需要用不同的DNA分子 D．该技术特别适用于极微量抗原的检测 27．（24-25高二下·北京西城·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”两个实验的叙述，正确的是（　　） A．可利用DNA溶于酒精而蛋白质不溶于酒精来提取DNA B．用二苯胺试剂鉴定DNA时不需要加热 C．PCR反应体系中需加入解旋酶以解开DNA双链 D．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关 28．（24-25高二下·北京东城·期末）大肠杆菌中的Z酶可催化X-gal水解产生蓝色物质。pUC18质粒（如图甲）中lacZ'编码Z酶的一个片段（α肽）。已知α肽、缺失α肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，同时存在时表现出Z酶活性。将图乙目的基因插入pUC18质粒后导入大肠杆菌，可根据菌落颜色筛选含有重组质粒的受体细胞。下列相关分析不正确的是（    ） A．选用SalⅠ限制酶切割目的基因与pUC18质粒 B．利用DNA连接酶连接目的基因与pUC18质粒获得重组质粒 C．作为受体细胞的大肠杆菌需满足Z酶基因中仅编码α肽的DNA序列缺失 D．在含有X-gal的培养基中培养时，含有重组质粒大肠杆菌的菌落颜色为蓝色 29．（24-25高二下·北京东城·期末）将四种关键基因导入小鼠的成纤维细胞，可获得诱导多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，可分化成神经细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。下列叙述不正确的是（    ） A．应使用显微注射法将四种基因直接注入成纤维细胞 B．导入的四种基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 C．iPS细胞能分化成多种细胞，是基因选择性表达的结果 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 30．（23-24高二下·北京昌平·期末）镰状细胞贫血是由于β-球蛋白基因突变引起的隐性遗传病，该突变导致β-球蛋白基因缺少一个限制酶MstⅡ的识别序列（下图）。为判断待检者的基因组成，下列叙述错误的是（　　） A．利用PCR技术扩增待检者基因的相应片段 B．用限制酶MstⅡ剪切扩增的DNA C．用琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的DNA片段 D．电泳结果出现目标条带即为患者 31．（23-24高二下·北京·期末）新型冠状病毒（SARS-CoV-2）表面的S蛋白由S1和S2两个亚基组成。科研人员制备获得了鼠抗S蛋白特异性单克隆抗体，为分析该单克隆抗体的特异性，将SARS-CoV-2的S蛋白进行电泳得到图A，用该单克隆抗体进行抗原-抗体杂交并显色得到图B。下列表述错误的是（    ） A．该单克隆抗体特异性的识别S蛋白的S2亚基 B．制备单克隆抗体的过程体现了动物细胞膜具有流动性 C．免疫后小鼠体内的浆细胞只产生一种抗S蛋白抗体 D．制备单克隆抗体的过程可用灭活病毒诱导动物细胞融合 32．（23-24高二下·北京海淀·期末）利用逆转录PCR可以对RNA进行检测。逆转录PCR的过程可以分为逆转录和PCR扩增两步。下列有关逆转录PCR的叙述，错误的是（    ） A．需要催化逆转录的酶 B．包含变性-复性-延伸的循环过程 C．可用于HIV的核酸检测 D．两种引物的碱基序列互补配对 33．（23-24高二下·北京朝阳·期末）油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 34．（23-24高二下·北京朝阳·期末）酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamHⅠ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（    ） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamHⅠ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 35．（23-24高二下·北京大兴·期末）下图为获得抗除草剂转基因玉米A 的技术路线，相关叙述错误的是（    ） A．将目的基因插入 T-DNA 中的目的是利用其转移能力 B．诱导出愈伤组织往往需要植物激素的作用 C．若筛选出具有抗生素抗性的农杆菌则说明目的基因转化成功 D．要与普通玉米进行除草剂抗性比较，以确定转基因效果 36．（23-24高二下·北京西城·期末）转基因产品（GMO）标识是为了表明该产品是由转基因生物生产、加工而成的特殊标识。我国《农业转基因生物标识管理办法》中规定对GMO采取强制定性标识。下列说法错误的是（　　） A．检测产品中有无目的基因即可确认是否为GMO B．GMO定性标识是为消费者提供知情权和选择权 C．市场上带有标识的转基因产品都应经过安全检测 D．转基因产品研究工作中要注意防止造成基因污染 37．（22-23高二下·北京朝阳·期末）利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①―④中选择扩增P基因的合适引物组合（    ） A．①② B．①③ C．②③ D．②④ 38．（22-23高二下·北京朝阳·期末）蛛丝蛋白具有优良的特性，有广泛的应用前景。蛛丝蛋白核心结构中有以某氨基酸序列为单元的重复序列，据此设计了氨基酸单元相应的核心DNA片段以用于合成目的基因，借助质粒构建表达载体，使大肠杆菌表达蛛丝蛋白。下列对相关操作及结果叙述错误的是（    ） A．将多个核心DNA片段拼接获得目的基因时，可用到DNA连接酶 B．连接目的基因和载体时，二者需要有相同的黏性末端 C．构建表达载体时，需要限制酶和DNA连接酶 D．表达载体插入大肠杆菌的拟核基因组中，即可表达蛛丝蛋白 39．（24-25高二下·北京朝阳·期末）母乳中的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）在促进新生儿免疫系统发育等方面具有重要作用。为实现2'-FL的高效生物合成，研究者开发了枯草芽孢杆菌工程菌（好氧菌）。 (1)研究者构建含有催化途径I、Ⅱ等关键酶基因的_______，导入枯草芽孢杆菌中，获得工程菌甲。图1显示甲能快速转运葡萄糖，并且优化了______方向，从而显著提高了2'-FL的合成效率。 (2)乳糖充足时，其能与特定的响应型阻遏蛋白结合，使该阻遏蛋白无法与启动子P下游序列L结合，基因转录；乳糖缺乏时，其响应型阻遏蛋白与序列L结合，阻止基因转录。为筛选乳糖响应型阻遏蛋白，研究者将图2所示两种表达载体共同导入枯草芽孢杆菌，并在含有5FdU的培养基中培养。 ①若该菌能在上述培养基中生长，则载体1表达的阻遏蛋白________（能/不能）与载体2上的序列L结合。 ②将上述培养基中存活的菌株转移到________的培养基中，选择________的菌落，获得乳糖响应型阻遏蛋白基因序列。 (3)将乳糖响应型阻遏蛋白基因序列与具有持续表达活性的启动子连接后导入工程菌甲，并将甲的G酶基因启动子替换为启动子P，获得了产量显著提高的工程菌乙。综合上述研究结果，完善图3模型，以解释乙产量提高的原因________。 (4)工程菌乙发酵后期常出现2'-FL产率下降现象，其原因是枯草芽孢杆菌内存在一种ATP敏感型蛋白酶（DegP），当ATP浓度<2mM时，DegP会降解途径I关键酶。请提出一种发酵控制策略，在不改造菌株基因的前提下维持2′-FL高产，并说明原理________（要求：①策略需利用现有发酵参数；②避免添加外源抑制剂）。 40．（24-25高二下·北京海淀·期末）研究者发现一种二倍体的野生马铃薯，与四倍体的栽培马铃薯杂交，培育马铃薯突变体。 (1)栽培马铃薯和野生马铃薯之间存在______，故杂交不能产生可育后代。 (2)野生马铃薯的M基因能够修复错配的DNA，维持基因组稳定。研究者将图1所示的T-DNA导入野生马铃薯细胞中，获得M基因沉默（几乎不表达）的转基因马铃薯（马铃薯B）。 通过该方法使M基因沉默的原理是______。 (3)研究者将马铃薯B、野生马铃薯分别与栽培马铃薯进行体细胞杂交，获得了大量杂种植株。对不同杂种植株的DNA含量进行分析，结果如下图（“x”表示DNA的倍性）。 ①使用______处理两种马铃薯叶片细胞，利用______促进二者融合，进而获得体细胞杂交的植株。 ②杂交一出现大量DNA含量6x以下的个体，推测______ ③杂交二与杂交一比较，说明M基因沉默导致______。 41．（24-25高二下·北京·期末）含镍（Ni）工业废水的处理一直是水污染治理的难题。一类广泛存在于动植物细胞中的金属硫蛋白（MT）具有结合Ni等重金属，并消除重金属对细胞毒害作用的能力。研究者利用MT基因构建转基因大肠杆菌，用以净化工业废水。 (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，经_______可获得大量MTcDNA。 (2)为了进一步提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图1）。利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是_______。 (3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性末端的酶切位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可在上述引物的_______（填“5′”或“3′”）端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和E的酶切位点及相应的酶切序列见图2。 后者步骤如下：①选用_______酶将载体P切开，用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由于载体P′不具表达MT基因的启动子和终止子，其中前者是_______识别并结合的部位，需选用_______酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E连接，构成重组质粒。 (4)将重组质粒导入用_______处理的大肠杆菌中完成转化，随后利用含有_______的培养基筛选出工程菌。 (5)研究者检测MT基因在工程菌的表达量，结果见图3。该结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中Ni的工程菌，下列叙述中能支持该观点的是_______。 A．尚未对MT基因进行碱基序列的测定与比较 B．尚未在个体水平上进行抗原-抗体杂交检测 C．尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定 D．尚未对MT工程菌吸附Ni的能力进行鉴定 42．（24-25高二下·北京·期末）玉米是我国重要的作物，在种植时常因感染禾谷镰刀菌（Fg菌）而患茎腐病，导致产量减少。我国研究者尝试用生物方法进行防治。 (1)研究者取患病玉米病斑和健康组织交界处的组织消毒后，轻压到经过_______法灭菌的固体培养基上，培养基中的氮源可用于合成_______等物质（写出2种即可）。纯培养后鉴定出上述玉米组织中除了存在Fg菌外，还存在哈茨木霉菌（Th菌）。 (2)将健康的玉米种子播种到不同处理的土壤中培养，实验结果证明Th菌对Fg菌有一定的抑制作用，实验组中对土壤的处理为_______。 (3)已知Fg菌具有将双链RNA切割成小片段，并水解其中的一条链的能力。研究者欲利用此原理增强Th菌对Fg菌的抑制作用。 ①T2基因是Fg菌细胞壁合成相关基因。研究者以图1中序列为目的基因构建表达载体，导入Th菌中获得Th-1菌。若T2基因和Ⅰ处序列转录出的RNA存在碱基互补配对关系，可使表达载体生成双链T2-mRNA（dsRNA），则图1中Ⅰ处序列为：_______。 注：内含子是一段不编码蛋白质的核苷酸序列 ②将绿色荧光蛋白标记的dsRNA加入到Fg菌液培养36h。研究者观察到_______，得出Fg菌具有摄取环境中RNA的能力的结论。 ③将Th菌、Th-1菌、Th-2菌（转入无关基因的Th菌）培养液的上清液分别加入到Fg菌液中一段时间，利用电泳检测Fg菌中T2-mRNA和T2蛋白含量。图2所示结果说明_______。 注：rRNA和β-Actin均作为参照 (4)进一步研究证明，Th-1菌具有比Th菌更强的保护玉米免受Fg菌侵害的能力。请结合上述研究阐明Th-1菌具有更强的治疗玉米茎腐病的机理。_______。 43．（24-25高二下·北京房山·期末）水杨酸（SA）是工业废水中的一种污染物，科研人员欲利用基因工程技术制备高效工程菌对其进行治理。 (1)从细胞结构上看，大肠杆菌结构简单，属于________生物，常作为基因工程受体菌。 (2)研究人员将调控蛋白基因（nahR）和红色荧光蛋白基因（mrfp）分别与启动子Pc和Ps连接后，构建表达载体，导入_________处理过的大肠杆菌中，经筛选获得工程菌甲，如图1所示。 当水中存在SA时，SA与调控蛋白结合，促进_______酶识别并结合Ps，沿模板链3′→5′方向转录出mRNA，根据_______可了解SA污染程度。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用，为获得能利用水杨酸的工程菌，利用重叠延伸PCR技术（图2A）将水杨酸羟化酶基因（nahG）与mrfp基因连接成融合基因。 ①学习图2A中所示原理，为图2B选择合适的引物构建融合基因nahG-mrfp________。 ②将融合基因与Ps启动子结合构建表达载体，导入普通大肠杆菌，筛选获得工程菌乙。与甲相比，乙的作用优势主要体现在________。 (4)已知cB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，抗毒蛋白基因的表达可与毒蛋白结合导致毒蛋白失效，欲构建新的表达载体并转入工程菌乙，筛选获得能“自毁”的工程菌。 ①设计工程菌在特定条件下启动“自毁”，该条件是_________。 ②请从A~C中选择启动子填在图3的i和ii处，从D~F中选择基因填在ii处，设计一种可实现①目的的工程菌“自毁”基因表达载体，i、ii、iii处分别为_________。 A．启动子Ps B．启动子Pc C．固定期启动子（菌体达到一定数量方可被激活） D．毒蛋白基因 E．抗毒蛋白基因 F．毒蛋白功能激活基因 44．（24-25高二下·北京通州·期末）学习以下材料，回答问题。 细菌也能“织布”? 在富含碳的培养基中，驹形杆菌可以聚合并分泌线性葡萄糖链，同时这些链可自组装成一个密集且相互连接的纤维素网状结构。这种细菌纤维素生物纺织品的开发，逐渐成为当前研究和应用的新热点。 为了解决细菌纤维素颜色过于单一的问题，科研人员对驹形杆菌进行了基因工程改造，设计和构建出菌株来表达酪氨酸酶1（Tyr1），使该菌株可以将酪氨酸转化为黑色素，如图1所示。在菌株生长过程中，细胞在生长纤维素层时有效地产生酪氨酸酶，在随后的酶促反应中，这些细胞就可以产生黑色素，以实现自然地对纤维素进行染色。 接下来，科研人员为表达Tyr1的工程菌株引入T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7R）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体，原理见图2。通过将450nm的蓝光可控地投射到培养基上，从而触发细菌在生产纤维素时以可控的方式产生黑色素，进而使得生产出的纤维素材料呈现图案。 总的来说，该工程菌株表达酪氨酸酶，细菌生长时可积累黑色素，导致生产的纤维素薄膜呈现出黑色，这种黑色纤维素薄膜可进一步通过干燥、压制等加工制作成产品，比如手袋、布料等，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路。 (1)驹形杆菌可以利用培养基中的碳元素合成纤维素，还可以合成__________等生物大分子。图1的表达载体中金担子素抗性基因的作用是_______。 (2)结合材料信息，以下对该工程菌描述正确的有：_________。 A．驹形杆菌形成的纤维素层也可以作为其细胞壁而发挥支持和保护的作用 B．能够在含有金担子素的培养基中形成菌落的细菌不一定成功导入了Tyr1基因 C．可以通过控制蓝光照射的范围来实现在纤维素层上呈现不同黑色图案的目的 D．T7噬菌体来源的RNA聚合酶也能在工程菌中发挥作用说明该酶不具有专一性 (3)为了实现蓝光控制染色，请对图1的表达载体进行改造_________。 (4)基于该项技术，请你为实现多彩的纤维素材料提出自己的设想_________。 45．（24-25高二下·北京通州·期末）尿素是一种重要的农业肥料，但是必须经过分解才能更好地被植物利用。为获得高效分解尿素的菌种，研究人员做了如下研究。 (1)获取尿素分解菌 ①称取农田土壤样品1g，加入一个盛有_____mL无菌水的三角瓶中，将样品充分打散、混匀，即成10-2稀释液。然后再依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。 ②将10-4、10-5、10-6的稀释液涂布于以_____为唯一氮源、含酚红的培养基上，依据______选择产酶的菌株。经过筛选，最终获得高产脲酶菌株。 (2)为进一步研究脲酶中不同位点氨基酸对其活性的影响，研究人员按照右图所示，对脲酶基因进行了定点诱变（引物B和C中均替换了一个碱基），以得到突变的脲酶基因。 ①如图所示的PCR1、PCR3所需要的引物分别是____、____。 A．引物A B．引物B C．引物C D．引物D E．不加入引物 ②研究人员将含有定点突变脲酶基因的重组质粒和________分别导入大肠杆菌，以判断不同位点氨基酸改变对脲酶活性的影响。 46．（24-25高二下·北京朝阳·期末）全球气候变化导致极端高温天气频发，对粮食作物产量和品质造成严重影响。培育优质高产作物是育种者的目标。 (1)水稻体内淀粉等有机物含量决定产量，淀粉的合成场所是________。淀粉的合成受到光反应产生的________的影响。高温下敏感型水稻胚乳储存物质的稳态被破坏（蛋白质积累减少与淀粉积累增加），胚乳细胞中淀粉粒与蛋白体排列松散，形成垩白（品质劣化指标）。 (2)水稻品种分为粳稻和籼稻，高温会降低粳稻和籼稻的稻米品质，对粳稻品质的负面影响更显著。研究发现QT12、NF-YA8和NF-YC10是响应高温的相关基因，经过相关处理，研究结果如下表。 生物材料 垩白率 粳稻 高 QT12基因敲除粳稻 低 NF-YA8基因敲除粳稻 低 NF-YC10基因敲除粳稻 更高 ①由表可知，高温下QT12、NF-YA8和NF-YC10分别是影响水稻优良品质的______（填“负”或“正”）调控基因。 ②为了证明QT12和NF-YA8在响应高温通路中的位置关系，构建了NF-YA8基因敲除/QT12基因过表达杂交株系，图1证明_____位于_______的上游。 (3)粳稻和耐热籼稻QT12基因启动子序列存在差异，不同类型QT12基因结构如图2（QT12G；QT12基因启动子内部为G，QT12A时则为A）。 为研究高温下NF-YA8、NF-YC10蛋白与QT12基因的结合情况，研究者依据QT12基因启动子序列，制备了QT12G和QT12A探针，分别与相应蛋白混合，结果如图3。 ①分析泳道2、4、5、6可得_______（“NF-YA8”/“NF-YC10”）与_____（“QT12G”/“QT12A”）结合能力强。 ②泳道4、7、8的实验目的是_______。 (4)进一步研究证明高温会减弱NF-YA8蛋白和NF-YC10蛋白间的相互作用。综合以上信息，选择耐热籼稻或粳稻，完善该水稻响应高温的调节机制模型______。 (5)该研究对作物育种的启示是______。 47．（24-25高二下·北京平谷·期末）糖尿病人分泌胰岛素不足，通过体外注射胰岛素的方式治疗，但治疗存在成本高、冷链运输等问题。植物细胞壁的物理屏障能够抵抗消化酶的降解。因此研究者研究利用植物生产一种“口服胰岛素”，以期用于糖尿病的治疗。 (1)科研人员利用基因工程研制“口服胰岛素”，利用以下材料构建基因表达载体。 ①图甲所示结构为_______，其上的壮观霉素抗性基因作为_______，便于重组DNA分子的筛选。 ②利用PCR扩增目的基因（如图乙），应选用的引物组合为_______（选填图乙中的字母），为保证构建正确连接的基因表达载体，在引物中分别加入相应的限制酶的识别序列，请选择合适的限制酶，标记在答题卡图中的引物虚线位置。 ③构建成功的基因表达载体通过基因枪法导入莴苣细胞的叶绿体中，为实现胰岛素基因的高效表达，图甲中启动子最有可能选择_______。 A．人胰岛素基因的启动子 B．莴苣细胞叶绿体中特异性表达基因的启动子 (2)成功转化的莴苣细胞中仅含一个外源基因整合位点，通过_______技术获得TO代莴苣，TO代莴苣自交后，筛选外源基因纯合的T1代莴苣，检测其胰岛素基因的表达量，如下面表格所示。分析无壮观霉素抗性基因的T1代胰岛素蛋白高的原因：_______。 世代 胰岛素（mg/g干重） 有壮观素抗性基因的T0代 4.79 无壮观素抗性基因的T0代 8.58 无壮观素抗性基因的T1代 12.07 (3)为评估“口服胰岛素”的降血糖效果，研究人员给糖尿病小鼠和正常小鼠分别进行如下实验，结果如图丙。 该实验结果表明莴苣生产的口服胰岛素比注射胰岛素更具有优势，体现在_______。 48．（24-25高二下·北京怀柔·期末）β—地中海贫血症是由β珠蛋白基因突变造成红细胞损伤而引起的疾病，近年来科研人员利用CRISPR/Cas9技术实现了对该致病基因的精确编辑，大大提高了基因治疗的精准性。该技术的原理如下图所示，请回答下列问题： 注：CRISPR/Cas9基因编辑系统包括来自于细菌的Cas9内切酶和人工设计改造的向导RNA两个部分。 (1)哺乳动物的红细胞来自于造血干细胞的_________，因此科研人员构建了β—地中海贫血症模型鼠后，取其造血干细胞作为基因编辑的受体细胞。 (2)进入受体细胞的向导RNA能与基因组DNA单链特定区域发生_________，Cas9内切酶则可在PAM序列（几乎存在于所有基因中）上游定点切断磷酸二酯键使DNA断裂，随后用导入的正常β珠蛋白基因片段完成对该基因的修复。 (3)研究表明基因编辑技术也可能引起基因组非靶点的突变，即脱靶。β珠蛋白突变基因的X片段（与靶点紧密连锁）是编辑过程中的常见脱靶位点之一。为确定脱靶现象是否发生，研究人员除对待修复靶点（Y片段）进行测序外，又设计实验对X片段进行测序，过程如图所示： 注：图中“↑”指向的位置为限制酶BglⅡ和MscⅠ的识别和切割的位点 ①将图示片段连接成环状，应选用限制酶______和DNA连接酶。 ②根据Y片段特定序列设计引物（图中的A、B、C、D），应选择引物组合A和D，用于扩增X片段。除扩增模板和引物以外，该反应体系中还应该加入4种足量的dNTP以及___________。 ③若上述实验扩增出的X片段与患病模型大鼠的X片段序列相同，Y片段与正常β珠蛋白基因序列_________（相同/不相同），则支持该靶点完成修复，未发生脱靶现象。 (4)基因编辑技术在生物学中还有很多应用，有人称之为“福音”，也有人称之为“魔鬼”，请对此谈谈你的看法：_________。 49．（24-25高二下·北京西城·期末）科研人员发现一种新的基因组编辑工具—桥接 RNA（bRNA）。bRNA 能够与供体序列和靶标序列特异性结合，在 IS 重组酶作用下，将供体 DNA 与靶标 DNA 重组（图 1）。 (1)bRNA 与供体序列和靶标序列特异性结合，遵循_______原则。 (2)研究者提出假设，bRNA 可与 IS 重组酶特异性结合。为验证假设，用不同浓度的特定序列 bRNA 与一定浓度的 IS 重组酶混合，检测与 bRNA 结合的重组酶的比例。对照组的 RNA 应为_______。 (3)在体外实验中，验证了利用 bRNA 进行 DNA 重组的条件。研究者根据靶标序列和供体序列设计引物（图 2）进行 PCR 扩增，以检验重组是否发生，应选择的引物组合有_______。 (4)为了进一步验证 bRNA 的功能，在大肠杆菌中建立了双质粒重组报告系统（图 3）。请在图 3 中正确位置补充画出 GFP 基因的启动子，使供体质粒与靶标质粒在发生重组时，可检测到 GFP 信号；不发生重组，则没有 GFP 信号。 50．（24-25高二下·北京东城·期末）青蒿素是治疗疟疾的天然产物，在青蒿分泌型腺毛（GSTs）中合成并储存。茉莉酸（JA）能够促进GSTs发育和青蒿素合成，转录因子M3在此过程中起重要作用。 (1)在构建M3基因过表达的青蒿植株中，需将M3与图1所示质粒连接，利用农杆菌转化法导入细胞，使用__________筛选T-DNA成功转入的青蒿细胞。 (2)同时构建了M3基因敲低的青蒿植株，图2结果说明M3在GSTs发育和青蒿素合成中发挥正调控作用，依据是_______________。为进一步得出“JA通过诱导M3基因表达调节GSTs发育和青蒿素合成”这一结论，还需要补充的证据是_________。 (3)研究人员推测“M3通过直接结合D1启动子来增强D1的转录，促进GSTs发育”。若要证明该推测，将图3所示质粒1和质粒2同时导入同一细胞，用______________反映转录因子对该启动子的作用效果。请在图3的①、②、③处填写相应的组成元件。 ①__________②__________③__________ (4)进一步研究发现“M3蛋白通过与H1蛋白相互作用，激活青蒿素合成相关基因的转录”。可利用LUC蛋白的N端（LUCn）和C端（LUCc）两个非活性片段研究蛋白质间的相互作用关系，将LUC蛋白分成LUCn和LUCc，与待测蛋白基因构建融合基因，当LUCn和LUCc组合成有活性的LUC能产生荧光。依据上述原理设计实验验证，需要构建__________两种融合基因导入同一种细胞，再进行后续研究。 (5)综合以上信息，请在答题卡上完善JA促进GSTs发育和青蒿素合成的机制模型_________。 地 城 考点03 蛋白质工程 1．（24-25高二下·北京丰台·期末）干扰素在体外保存相当困难。利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸替换成丝氨酸后，干扰素可以在-70℃的条件下保存半年，相关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程只能生产出自然界中已存在的蛋白质 B．替换氨基酸改造干扰素时利用的原理是基因突变 C．该替换研究中直接操作对象是多肽链上的氨基酸 D．替换后的干扰素仍能抗病毒，说明其结构未改变 2．（24-25高二下·北京平谷·期末）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物等历程。有关叙述错误的是（    ） A．动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C．利用蛋白质工程可直接对胰岛素蛋白进行改造，以满足人类需求 D．高温能破坏胰岛素类似物的空间结构，使其失去相应的功能 3．（24-25高二下·北京·期末）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定性强的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述不正确的是（　　） A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．对N0的改造应该首先设计N1基因中的脱氧核苷酸序列 C．加入该连接肽需要通过改造N0基因实现 D．N1是自然界中不曾存在的新型蛋白质 4．（24-25高二下·北京房山·期末）胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸时会抑制胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。欲利用生物技术获得该物质，则直接操作的对象应为（　　） A．胰岛素的氨基酸序列 B．胰岛素基因 C．第28位的氨基酸 D．胰岛素蛋白 5．（24-25高二下·北京昌平·期末）大肠杆菌表达异源的L-氨基酸脱氨酶（LAAD）可催化L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸，但产生的苯丙酮酸浓度较低，无法满足工业生产的要求。对LAAD进行改造，从而提高它的催化能力。相关叙述不正确的是（　　） A．LAAD在大肠杆菌核糖体合成 B．改造LAAD须分析其三维结构 C．改造LAAD不用考虑密码子简并性 D．改造LAAD的过程属于蛋白质工程 6．（24-25高二下·北京西城·期末）L-天冬酰胺酶是治疗儿童白血病的有效药物，但在临床应用中常引起过敏反应。通过蛋白质工程，将细菌来源的L-天冬酰胺酶某位置赖氨酸更换为丙氨酸后，免疫原性下降2．5倍。此过程中不需要（　　） A．依据预期功能设计L-天冬酰胺酶的高级结构 B．推测预期的L-天冬酰胺酶应有的氨基酸序列 C．改造编码L-天冬酰胺酶的野生型基因或合成新基因 D．直接对L-天冬酰胺酶进行操作以替换相应氨基酸 7．（23-24高二下·北京丰台·期末）近年来，人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，不仅攻克了长期存在的蛋白质结构预测问题，还成功设计了多种新型功能蛋白，为多个领域带来了潜在的生物活性分子。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程需要改造蛋白质分子的所有氨基酸序列 B．蛋白质工程的目标是改造现有蛋白质或创造新蛋白质 C．AI在蛋白质工程中的应用说明不再需要基因工程水平的操作 D．AI设计的蛋白质功能必然超过自然界中发现的任何蛋白质 8．（23-24高二下·北京昌平·期末）绿色荧光蛋白之所以发出绿色荧光，是因为该蛋白中有“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”构成的绿色发光基团。以下分析不合理的是（　　） A．荧光蛋白的荧光特性与氨基酸序列有关 B．荧光蛋白可作为标记信号，用于癌细胞转移的研究 C．高温能破坏荧光蛋白的空间结构，使其失去发光特性 D．蛋白质工程可直接对荧光蛋白进行改造，以满足人类需求 9．（23-24高二下·北京海淀·期末）转基因技术蓬勃发展，社会高度关注转基因技术带来的安全与伦理问题。下列相关叙述，正确的是（    ） A．为避免转基因植物造成基因污染，防止目的基因随花粉扩散 B．近年市面出现的彩椒、紫薯、高甜度南瓜均为转基因商品 C．转基因抗虫棉具有抗棉铃虫的特性，种植后可一直保持抗性 D．转基因技术产品去除目的基因后，属于蛋白质工程的产品 10．（23-24高二下·北京大兴·期末）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，天然的Y 通常需要在低温下保存，若将Y 的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙，可提高其热稳定性。下列说法错误的是（    ） A．蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的需求，对其结构进行设计改造 B．蛋白质工程技术中的操作对象是蛋白质或控制蛋白质合成的基因 C．若要获得编码Y 的基因，可从人的T细胞中提取 RNA，逆转录合成DNA D．经改造后的蛋白质 Y 的热稳定性提高这一性状可遗传 11．（23-24高二下·北京东城·期末）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为材料进行设计和改造，获得了能发黄色荧光的蛋白（YFP），与 GFP 相比，YFP 第 203位苏氨酸变为酪氨酸。下列叙述不正确的是（　　） A．获得 YFP 的技术称为蛋白质工程 B．上述技术的操作对象为相关基因 C．根据氨基酸序列推测的 YFP 基因序列可能不唯一 D．获得 YFP 无需经过转录和翻译的过程 12．（23-24高二下·北京西城·期末）我国科学家将ATP受体与cpEGFP（改造后的绿色荧光蛋白）进行融合，成功开发出监测动物体内ATP动态变化的传感器，其工作原理如图所示。下列说法错误的是（　　） A．ATP传感器的构建是通过蛋白质工程实现的 B．受体与ATP结合后构象改变，发出绿色荧光 C．ATP传感器对ATP的结构类似物应无反应 D．ATP与传感器上受体的结合应是不可逆的 13．（24-25高二下·北京顺义·期末）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白质工程——从“海选”到“设计” 从生物体内分离得到的天然酶，在工业生产中催化效率较低。为提高酶功能，科学家通过一定程度上模拟自然选择过程，经多次循环筛选实现对蛋白质功能的改进。第一次循环的操作流程如图1。 随着蛋白质工程的发展，目前可依据蛋白质作用机制与结构信息，改变一种或多种氨基酸，对蛋白质进行“设计”。据此，为增强P酶催化活性，我国科学家将P酶与PY（无催化活性的P祖先蛋白）进行序列比较，发现P酶与底物结合及反应区域的48个氨基酸中有16个是不同的。将PY的16个氨基酸替换，使之与P酶一致，获得的PY突变体（PY-16）具有与P酶相同的催化活性。为确定决定P酶催化活性的关键氨基酸，通过回复突变实验（将PY-16催化结构域中的16个氨基酸分别恢复到与PY相同）评估其突变效应，结果如图2。 科学家进一步根据突变效应的顺序，逐步向PY中添加单个突变，直至累积5个突变的PY-5才检测出与P酶相同的催化活性。通过分析PY-5与底物的结构，提出图3所示的“三点固定”模型解释催化机制。基于该模型利用AI设计出6万多种全新的P酶序列，经筛选发现其中有6种活性比天然P酶高1.3~3.5倍。 (1)基因工程原则上只能生产______的蛋白质，而蛋白质工程通过______基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)关于通过“定向进化”改进酶活性的过程，理解有误的是______。 A．①过程可使用低保真DNA聚合酶 B．①过程产生的基因突变是定向的 C．④过程筛选突变酶依赖于抗生素 D．经①②③④过程即可获得目的基因 (3)请将下列各项排序，以呈现文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路。 ①比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点 ②排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用 ③基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体 ④结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制 对比PY-16与其回复突变结果→______→______→______→______。 (4)天冬氨酸激酶是工业生产赖氨酸的关键酶，但其活性受到赖氨酸抑制。研究表明天冬氨酸激酶存在与赖氨酸结合的调节结构域，基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路______。 14．（22-23高二下·北京石景山·期末）水蛭的唾液腺可分泌水蛭蛋白，其重要成分为水蛭素，有良好的抗凝血作用。天然水蛭素活性低，科学家拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。 (1)蛋白质工程流程如图1所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质a可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中常利用PCR获取和扩增目的基因。PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种脱氧核苷酸、_______、_______及缓冲液，子链延伸的方向为_______。 (3)研究者将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图2、3所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是_______。 (4)若将改造后的水蛭素基因导入大肠杆菌，可应用_______技术检测，若出现了杂交带，则说明水蛭素基因完成了转录。进一步检测从大肠杆菌中获得的水蛭素，发现其抗凝血活性并不理想，请分析最可能的原因。_______ 15．（24-25高二下·北京·期末）学习以下材料，回答（1）～（3）题。 “双特异性抗体”——单克隆抗体的迭代 利用动物细胞工程技术制造的单克隆抗体在医药领域占有非常重要的地位，近年来已成为多种炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的治疗药物。抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合（见图）。 为进一步提高单克隆抗体的治疗效果，研究者在传统单抗的基础上进行了迭代，制备出了双特异性抗体（BsAb）。BsAb有独特的抗原结合片段，可以与2个不同抗原或同一抗原的2个不同抗原表位相结合。科研人员已经研究了多种制备BsAb的方法，其中一种方法的大致流程是：将2种不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞，然后通过筛选并进行克隆，用以生产BsAb。双杂交瘤细胞的遗传背景来源于两种杂交瘤细胞，可产生2种抗体中的2种H链和2种L链，这些H链、L链的随机组合配对可产生人们所需的BsAb。 与传统的单克隆抗体相比，BsAb的特异性更强，能够更加准确靶向，从而降低脱靶带来的不良反应。更重要的是，BsAb所具备的“双靶点”机制，拓展了治疗维度，提高了治疗效果，展现出其独特的优势。 (1)单克隆抗体制备中涉及的动物细胞融合与动物细胞培养技术对应的原理分别是_______。 (2)已知表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜蛋白，在癌细胞中表达量高；CD3是T细胞表面蛋白，CD3抗体与其结合后可激活信号通路，促进T细胞的免疫效力。 ①结合文中信息，画出既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的示意图。_______（注：EGFR抗体的链用H1、L1表示，CD3抗体的链用H2、L2表示） ②下图为BsAb的制备流程，其中a～c对应的细胞分别是_______。 在上述流程中，“筛选Ⅲ”_______(填“可以”或“不可以”)利用“筛选Ⅰ”中的选择培养基，原因是_______。 ③制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为_______。 (3)请结合文中信息与所学知识，提出制备既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的另一种方法，写出大致思路。______________。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程与蛋白质工程 答案版 地 城 考点01 基因工程基本工具 1．B 2．A 3．B 4．C 5．A 6．D 7．C 8．C 9．C 10．A 11．(1) 用同种限制酶切割含有 P-L 片段的 DNA 出现荧光 (2) (3)超声波对深部肿瘤的穿透性是否足够 / 工程菌是否可以有效抑制肿瘤生长 (4)在重组表达载体中导入“自杀”基因，使转基因工程菌在 A 蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时启动“自杀”基因表达。 12．(1) 自然界中已存在的 改造或合成 (2)BCD (3) ② ① ④ ③ (4)研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性 13．(1)限制酶 (2) 选择 aa 筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染 (3) P4 （或P2） P2 （或 P4） P3 100% (4)该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性 地 城 考点02 基因工程操作过程 14．B 15．D 16．C 17．C 18．C 19．B 20．A 21．B 22．D 23．C 24．A 25．B 26．C 27．D 28．D 29．A 30．D 31．C 32．D 33．D 34．D 35．C 36．A 37．A 38．D 39．(1) 表达载体 代谢流分配 (2) 能 乳糖、不含5FdU 有绿色荧光 (3)低：响应型阻遏蛋白与序列L结合，G酶基因表达受阻，G酶含量少，葡萄糖可直接转化为乳糖，进而转化为2'-FL 高：乳糖与响应型阻遏蛋白结合，G酶基因的转录抑制被解除，G酶表达量增加，葡萄糖被高效转化为葡萄糖-6-磷酸及下游中间产物，为2'-FL合成提供充足前体 (4)分阶段逐步增加葡萄糖的添加量 原理:短时高葡萄糖→糖酵解爆发→ATP显著增加→抑制DegP活性→保护途径I关键酶 40．(1)生殖隔离 (2)M基因编码区反向连接在T-DNA的启动子与终止子之间，转录出的mRNA与内源M基因转录的 mRNA互补配对，使内源M基因无法完成翻译 (3) 纤维素酶和果胶酶 PEG 杂种植株部分染色体（或DNA）丢失 杂种植株染色体（或DNA）丢失产生的变异增多 41．(1)逆转录PCR (2)引物1与引物4 (3) 5' EcoRV RNA聚合酶 XhoⅠ和PstⅠ (4) Ca2+ 卡那霉素 (5)CD 42．(1) 湿热灭菌 蛋白质、核酸（或ATP等） (2)先灭菌再喷洒Fg菌和Th菌 (3) 反向插入的T2基因序列 Fg菌中出现绿色荧光 Th-1菌通过抑制Fg菌T2-mRNA的翻译，抑制T2蛋白的合成 (4)Th-1菌产生的dsRNA被Fg菌摄取，Fg菌将dsRNA切割成小片段，并水解其中的一条链，未被水解的链可与T2-mRNA碱基互补配对，抑制T2蛋白的合成，Fg菌无法合成细胞壁，从而无法存活 43．(1)原核 (2) Ca²⁺（或氯化钙 ） RNA 聚合酶 红色荧光强度 (3) 引物 1、引物 3 可通过荧光（mrfp 基因表达的荧光蛋白）直观鉴定工程菌是否成功表达水杨酸羟化酶 (4) 工程菌达到一定数量 C、E、F 44．(1) 蛋白质、核酸 作为标记基因，便于筛选出导入了表达载体的驹形杆菌 (2)BC (3) (4)引入产生不同颜色色素的酶基因，通过控制不同酶基因 45．(1) 99 尿素 红色圈 (2) AC E 含有未突变脲酶基因的重组质粒 46．(1) 叶绿体基质 ATP和NADPH (2) 负、负、正 NF-YA8 QT12 (3) NF-YA8 QT12G 探究NF-YA10对NF-YA8与QT12G结合程度的影响 (4) (5)通过基因编辑技术将粳稻QT12启动子G突变为A 47．(1) 质粒 标记基因 b、c B (2) 植物组织培养 去除壮观霉素抗性基因后，消除了其对胰岛素基因表达的影响（或消除了基因间相互作用对胰岛素基因表达的抑制 ） (3)降血糖的效果更显著、作用持续时间较长 48．(1)分裂和分化 (2)碱基互补配对 (3) BglⅡ 热稳定DNA聚合酶 相同 (4)说明科学技术能促进人类社会和经济的发展，但也可能对人类的生存和发展带来消极后果，需要受到伦理和法律的约束。 49．(1)碱基互补配对 (2)与实验组RNA浓度相同、长度相同但序列随机的无关RNA (3)②⑦和③⑥ (4) 50．(1)潮霉素 (2) 和野生型相比，M3过表达组GSTs密度和青蒿素含量均增加，而M3敲低组均降低 和野生型相比，JA处理野生型青蒿植株后M3基因的表达水平显著上升 (3) 萤火虫荧光素酶催化产生荧光亮度与海肾荧光素酶催化产生荧光亮度的比值 M3基因 D1启动子 p35S启动子 (4)LUCn-M3融合基因和H1-LUCc融合基因（或LUCn-H1融合基因和M3-LUCc融合基因） (5) 地 城 考点03 蛋白质过程 1．B 2．C 3．B 4．B 5．C 6．D 7．B 8．D 9．A 10．B 11．D 12．D 13．(1) 自然界中已存在的 改造或合成 (2)BCD (3) ② ① ④ ③ (4)研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性 14．(1) mRNA 多肽链 密码子的简并性 (2) 引物 Taq酶 从5’端到3’端 (3) 种类 处理水蛭蛋白的酶种类及时间不同，导致水蛭蛋白空间结构发生不同程度改变 (4) DNA-RNA分子杂交 水蛭素是一种分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工与修饰，而大肠杆菌为原核细胞，没有内质网和高尔基体，无法对水蛭素肽链进行加工与修饰，导致水蛭素结构异常，抗凝血活性低 15．(1)细胞膜的流动性、细胞增殖 (2) 骨髓瘤、分泌EGFR抗体的杂交瘤、分泌CD3抗体的杂交瘤 不可以 无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活 可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞 (3)利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使其能够分别结合EGFR与CD3。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题05 基因工程与蛋白质工程 3大高频考点概览 考点01 基因工程的基本工具 考点02 基因工程的操作过程 考点03 蛋白质工程 地 城 考点01 基因工程的基本工具 1．（24-25高二下·北京·期末）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，作用机制如图。单链向导RNA（sgRNA）能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。下列相关分析不正确的是（　　） A．对不同目的基因编辑时，需使用不同的sgRNA B．Cas9可催化脱氧核苷酸链上特定氢键的水解 C．sgRNA过短可能因不能准确识别造成错误编辑 D．基因编辑技术可实现对特定基因的定点插入、敲除或替换 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、分析题意，单链向导RNA（sgRNA）能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA，由此可知，对不同目的基因编辑时，需使用不同的sgRNA，A正确； B、Cas9蛋白可催化脱氧核苷酸链上磷酸二酯键的水解，B错误； C、sgRNA过短会影响碱基的特异性配对，可能因不能准确识别，造成错误编辑，C正确； D、CRISPR/Cas9基因编辑技术工作原理为向导RNA引导CaS9蛋白到一个特定的基因位点并剪切DNA，可实现对特定基因的定点插入、敲除或替换，D正确。 故选B。 2．（24-25高二下·北京·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，不正确的是（　　） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色 C．PCR扩增目的基因时，变性是温度最高的环节 D．凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 【答案】A 【详解】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性:DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【分析】A、DNA在较高浓度的盐溶液中溶解度较大，而在低浓度盐溶液中溶解度降低；当加入体积分数为95%的冷酒精时，DNA因溶解度更低而析出。选项A描述“利用DNA在酒精中溶解度较大的特性”错误，应为“溶解度较低”，A错误； B、二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下反应生成蓝色物质，此描述符合实验现象，B正确； C、PCR扩增中，变性步骤需高温（约95℃）使DNA双链解开，温度高于退火和延伸阶段，C正确； D、在凝胶电泳中，DNA分子迁移速率与其分子大小（小分子迁移快）和构象（如线状、环状等）有关，D正确。 故选A。 3．（24-25高二下·北京延庆·期末）关于化合物分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（　　） A．利用加热后与斐林试剂生成砖红色沉淀的反应鉴定还原糖 B．利用常温条件下与二苯胺试剂呈现紫色的反应来鉴定DNA C．利用不同光合色素在层析液中溶解度的差异分离光合色素 D．利用常温条件下与双缩脲试剂产生紫色反应鉴定蛋白质 【答案】B 【分析】生物组织中化合物的鉴定： （1）斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变化为砖红色； （2）蛋白质可与双缩脲试剂反应呈紫色； （3）脂肪可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色。 【详解】A、在水浴加热的条件下，还原糖和斐林试剂反应产生砖红色沉淀，A正确； B、在水浴加热的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，B错误； C、光合色素分离的原理是色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，C正确； D、常温条件下，蛋白质可与双缩脲试剂反应呈紫色，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·北京·期末）下列关于“DNA的粗提取和鉴定实验”的说法，错误的是（    ） A．通常选用DNA含量较高的组织材料如菜花等 B．研磨液中应含有蛋白质变性剂和DNA酶抑制剂 C．利用蛋白质不溶于95%冷酒精的性质除去杂质 D．溶解的DNA丝状物遇二苯胺试剂沸水浴后变蓝 【答案】C 【分析】鸡血细胞中含有 DNA可作为提取DNA的生物材料，不可选用哺乳动物成熟的红细胞； DNA不溶于酒精，且 NaCl溶液浓度为0.14 mol/L时DNA溶解度最小，两者均可将 DNA大量析出。 【详解】A、通常选用DNA含量高的材料如菜花、鸡血等，因细胞核大、DNA含量丰富，A正确； B、研磨液中需添加SDS等变性剂裂解细胞膜并变性蛋白质，同时加入EDTA抑制DNA酶活性，防止DNA降解，B正确； C、实验中利用DNA不溶于95%冷酒精的性质使其析出，而部分蛋白质可溶于冷酒精，从而分离DNA。选项C错误地将原理归结为“蛋白质不溶”，实际是DNA析出，C错误； D、DNA与二苯胺试剂在沸水浴条件下发生颜色反应，呈现蓝色，D正确； 故选C。 5．（24-25高二下·北京朝阳·期末）如图表示基因表达载体的构建过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．标记基因的作用是便于筛选含重组DNA的受体细胞 B．DNA连接酶的作用是将目的基因的黏性末端与载体的平末端连接 C．图中目的基因必须包含启动子和终止子才能表达 D．限制酶的作用是将目的基因与载体的切口处直接连接起来 【答案】A 【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 （1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始。 （2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束。 （3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。 【详解】A、目的基因导入受体细胞时，并非一定能够导入，因此，受体细胞是否成功导入了目的基因，需要对受体细胞进行筛选，标记基因的作用就是便于筛选携带目的基因的重组DNA的受体细胞，A正确； B、DNA连接酶的作用是将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端连接，或者将目的基因的平末端与载体的平末端连接，B错误； C、构建到基因表达载体的目的基因可以只是基因的编码区，这种目的基因构建到表达载体后，利用表达载体携带的启动子和终止子也能实现表达，C错误； D、限制酶的作用是识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，D错误。 故选A。 6．（23-24高二下·北京东城·期末）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解细胞→分离 DNA→沉淀 DNA→鉴定。下列叙述不正确的是（　　） A．裂解：利用研磨等方法使细胞破裂释放出DNA 等物质 B．分离：离心后留取上清液可去除不溶于研磨液的物质 C．沉淀：加入95%冷的酒精溶液沉淀得到粗提 DNA D．鉴定：加入二苯胺沸水浴后可见溶液由蓝变为砖红色 【答案】D 【分析】DNA的粗提取和鉴定：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、裂解：倒入研磨液，充分研磨，使细胞破裂释放出DNA 等物质，A正确； B、分离：离心后留取上清液，弃沉淀物，可去除不溶于研磨液的多糖、蛋白质等物质，B正确； C、沉淀：DNA不溶于酒精，加入95%冷的酒精溶液沉淀得到的白色丝状物就是粗提 DNA，C正确； D、鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色，加入二苯胺沸水浴后可见溶液变蓝色，D错误。 故选D。 7．（23-24高二下·北京东城·期末）某遗传病的正常基因和突变基因单链片段如图1，研究人员拟用PCR 扩增2种基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点如图2）酶切，检测基因突变情况。下列叙述不正确的是（　　） A．PCR 可以用5´-GGCATG-3´作为其中一条引物 B．PCR 反应体系中需要添加耐高温的DNA 聚合酶 C．限制酶酶切后形成的末端为-GATG- D．限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段 【答案】C 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段： PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 【详解】A、DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，据此可知，PCR 可以用5´-GGCATG-3´作为其中一条引物，A正确； B、PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲液等，B正确； C、由图2可知，限制酶酶切后形成的末端为平末端，C错误； D、限制酶酶切后突变基因不会形成两个片段，因为从图中可以看出，突变基因发生了碱基对的替换，使得突变基因中没有了该限制酶的识别序列，D正确。 故选C。 8．（23-24高二下·北京东城·期末）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列箭头指向位置属于DNA 连接酶作用位点的是（　　） A． B． C． D． 【答案】C 【分析】1、限制性内切核酸酶：又称限制酶，主要来源于原核生物，能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，切割的结果是形成黏性末端或平末端。 2、DNA连接酶常用T4 DNA连接酶和Ecoli DNA连接酶，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，不过连接平末端的效率低；Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端。 【详解】构建重组质粒需要使用DNA 连接酶，其作用是将限制酶切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，单链DNA中，5'端存在游离的磷酸基团，3'端存在_OH，两个DNA片段之间的磷酸基团和_OH在DNA连接酶作用下形成磷酸二酯键，C正确，ABD错误。 故选C。 9．（22-23高二下·北京西城·期末）原核细胞具有防止外来DNA入侵的系统，主要由限制酶和甲基化酶组成。通常限制酶只能识别未甲基化的相关序列。而Dpnl酶却可以特异性识别并切断腺嘌呤甲基化后的GATC序列，因此常被用于PCR后切除大肠杆菌来源的模板DNA。下列相关叙述错误的是（    ） A．限制酶可识别并切割外源DNA，以防止被入侵 B．甲基化修饰可以避免原核细胞自身DNA被切割 C．PCR时应加入甲基化酶，便于Dpnl酶识别并切割 D．该防御系统的形成是原核细胞长期进化的结果 【答案】C 【分析】表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表现型却发生了改变，如DNA的甲基化，甲基化的基因不能与RNA聚合酶结合，故无法进行转录产生mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。 【详解】A、限制酶能识别特定的脱氧核苷酸序列并催化DNA链中两个特定脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的断裂，原核细胞中限制酶的存在可识别并切割外源DNA，以防止被入侵，从而对自身起到保护作用，A正确； B、甲基化修饰可以避免原核细胞自身DNA被切割，进而保证自身遗传物质的稳定性，B正确； C、Dpnl酶可以特异性识别并切断腺嘌呤甲基化后的GATC序列，常被用于PCR后切除大肠杆菌来源的模板DNA，因此，PCR时应不应加入甲基化酶，否则PCR产物均将被甲基化，均会被Dpnl酶特异性识别并切断，C错误； D、该防御系统的形成是原核细胞在长期进化过程中不断被自然选择的结果，D正确。 故选C。 10．（22-23高二下·北京东城·期末）用XhoＩ和SalＩ两种限制酶分别处理同一DNA分子，酶切位点及酶切产物电泳结果如图。以下叙述不正确的是（    ） A．该DNA分子有可能是环状双链结构 B．XhoＩ和SalＩ识别的核苷酸序列不同 C．图2中的酶切产物可用于构建重组DNA D．泳道①中是用SalＩ处理得到的酶切产物 【答案】A 【分析】据题意可知，该DNA分子上含有2个XhoＩ酶识别位点，3个SalＩ酶识别位点，泳道①中是用SalＩ处理得到的酶切产物，泳道②中是用XhoＩ处理得到的酶切产物。 【详解】AD、据图1可知，该DNA分子上含有2个XhoＩ酶识别位点，3个SalＩ酶识别位点，而图2中用XhoＩ和SalＩ两种限制酶分别处理该DNA分子，泳道①有4种DNA片段，泳道②有3种，泳道①中是用SalＩ处理得到的酶切产物，泳道②中是用XhoＩ处理得到的酶切产物，故该DNA分子是链状DNA分子，不是环状DNA，A错误，D正确； B、酶具有专一性，不同酶识别序列不同，且两种酶的识别位点并不重合，说明XhoＩ和SalＩ识别的核苷酸序列不同，B正确； C、图2中的酶切产物可以与运载体结合，用于构建重组DNA，C正确。 故选A。 11．（24-25高二下·北京海淀·期末）λT蛋白是一种源于鼠伤寒沙门氏菌的转录阻遏因子，仅在温度低于39℃时结合在P启动子上，抑制下游基因的表达。科研人员尝试利用超声波控制工程菌的蛋白质分泌，实现肿瘤的定向治疗。 (1)科研人员将L基因（表达产物可催化底物生成荧光）连接到启动子P下游，构建出含P-L片段的DNA．进一步构建含P-L片段的重组载体的流程是：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后______；再利用DNA连接酶将P-L片段拼接到载体的切口处。用超声波处理使温度升高到39℃以上时，成功转入重组载体的鼠伤寒沙门氏菌______，则表明超声波控制基因表达系统有效。 (2)A蛋白是肿瘤治疗的新型药物，能引起肿瘤细胞凋亡。科研人员拟将A蛋白基因转入大肠杆菌，构建仅在高于39℃时才能分泌大量A蛋白的工程菌。请参考样例，选用下列元件完成表达载体设计________。可选用的元件：启动子P 启动子J（持续表达启动子） A蛋白基因 T蛋白基因 Y片段（编码信号肽 引导蛋白分泌到细胞外） 终止子 (3)已知工程菌能定位于肿瘤组织中，实现肿瘤治疗。若要将此技术应用于临床，从有效性的角度，需进一步验证______（答出一点）。 (4)有学者认为：从生物安全角度，该技术可能引发“基因污染”。请提出一条改造上述表达载体，解决“基因污染”的思路__________。 【答案】(1) 用同种限制酶切割含有 P-L 片段的 DNA 出现荧光 (2) (3)超声波对深部肿瘤的穿透性是否足够 / 工程菌是否可以有效抑制肿瘤生长 (4)在重组表达载体中导入“自杀”基因，使转基因工程菌在 A 蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时启动“自杀”基因表达。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）科研人员将L基因连接到启动子P下游，构建出含P-L片段的DNA，进一步构建含P-L片段的重组载体的流程是：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶切割切割含有 P-L 片段，使其产生相同的黏性末端；再利用DNA连接酶将P-L片段拼接到载体的切口处。用超声波处理使温度升高到39℃以上时，成功转入重组载体的鼠伤寒沙门氏菌细胞中的L基因会正常表达，进而使其表现出荧光，该实验结果表明超声波控制基因表达系统有效。 （2）A蛋白是肿瘤治疗的新型药物，能引起肿瘤细胞凋亡。科研人员拟将A蛋白基因转入大肠杆菌，构建仅在高于39℃时才能分泌大量A蛋白的工程菌。则结合题（1）可知，在构建重组质粒时，需要将目的基因与启动子P融合，即构建含P-A片段的DNA，P启动子能够实现A蛋白在高于39℃时开始表达，又知需要获得大量的A蛋白，因而需要选择启动子J，进而可实现A蛋白的大量表达，由于大肠杆菌是原核生物，不能将蛋白A加工成分泌蛋白分泌出去，因而在目的基因表达载体中需要添加 T蛋白基因 Y片段，此外一个目的基因表达载体中还需要有启动子，因此相应的表达载体需要含有的组件可表示如下：    （3）已知工程菌能定位于肿瘤组织中，实现肿瘤治疗。若要将此技术应用于临床，则需要进一步进行实验的问题有超声波对深部肿瘤的穿透性是否足够 / 工程菌是否可以有效抑制肿瘤生长等。 （4）有学者认为：从生物安全角度，该技术可能引发“基因污染”。为了避免基因污染现象的发生，则需要在重组表达载体中导入“自杀”基因，使转基因工程菌在 A 蛋白含量超过引起肿瘤细胞凋亡的浓度时启动“自杀”基因表达，进而避免了工程菌引起的基因污染。 12．（24-25高二下·北京顺义·期末）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白质工程——从“海选”到“设计” 从生物体内分离得到的天然酶，在工业生产中催化效率较低。为提高酶功能，科学家通过一定程度上模拟自然选择过程，经多次循环筛选实现对蛋白质功能的改进。第一次循环的操作流程如图1。 随着蛋白质工程的发展，目前可依据蛋白质作用机制与结构信息，改变一种或多种氨基酸，对蛋白质进行“设计”。据此，为增强P酶催化活性，我国科学家将P酶与PY（无催化活性的P祖先蛋白）进行序列比较，发现P酶与底物结合及反应区域的48个氨基酸中有16个是不同的。将PY的16个氨基酸替换，使之与P酶一致，获得的PY突变体（PY-16）具有与P酶相同的催化活性。为确定决定P酶催化活性的关键氨基酸，通过回复突变实验（将PY-16催化结构域中的16个氨基酸分别恢复到与PY相同）评估其突变效应，结果如图2。 科学家进一步根据突变效应的顺序，逐步向PY中添加单个突变，直至累积5个突变的PY-5才检测出与P酶相同的催化活性。通过分析PY-5与底物的结构，提出图3所示的“三点固定”模型解释催化机制。基于该模型利用AI设计出6万多种全新的P酶序列，经筛选发现其中有6种活性比天然P酶高1.3~3.5倍。 (1)基因工程原则上只能生产______的蛋白质，而蛋白质工程通过______基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)关于通过“定向进化”改进酶活性的过程，理解有误的是______。 A．①过程可使用低保真DNA聚合酶 B．①过程产生的基因突变是定向的 C．④过程筛选突变酶依赖于抗生素 D．经①②③④过程即可获得目的基因 (3)请将下列各项排序，以呈现文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路。 ①比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点 ②排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用 ③基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体 ④结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制 对比PY-16与其回复突变结果→______→______→______→______。 (4)天冬氨酸激酶是工业生产赖氨酸的关键酶，但其活性受到赖氨酸抑制。研究表明天冬氨酸激酶存在与赖氨酸结合的调节结构域，基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路______。 【答案】(1) 自然界中已存在的 改造或合成 (2)BCD (3) ② ① ④ ③ (4)研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性 【分析】1、基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，但只能生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达形状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 2、蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】（1）基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 （2）A、①过程是利用易错PCR，可使用低保真DNA聚合酶，提高扩增体系碱基发生错配的概率，A正确； B、①过程产生的基因突变是不定向的，B错误； C、④过程是酶活性的鉴定与筛选，可利用酶对底物的分解能力进行筛选，不必使用抗生素，C错误； D、经①②③④过程只能获得催化效率较高的酶，不能获得目的基因，D错误。 故选BCD。 （3）文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路为：对比PY-16与其回复突变结果；排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用；比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点；结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制；基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体，因此，排序为：对比PY-16与其回复突变结果→②→①→④→③。 （4）基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路为：研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性。 13．（24-25高二下·北京丰台·期末）研究者常利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，培育抗病新品种。有人认为转入的Cas9基因等有潜在风险，研究者尝试优化该技术。 (1)转入 CRISPR/Cas9基因后， 会表达形成 sgRNA-Cas9 复合体。sgRNA 能与A 基因序列互补配对，引导Cas9蛋白切割双链DNA 实现A 基因的敲除。Cas9蛋白的作用类似于基因工程基本工具中的_________。 (2)培育过程如图1所示： ①将 CRISPR/Cas9基因导入野生型植株TO: 第一步：将编码sgRNA 的基因和 Cas9 蛋白的基因整合到 Ti质粒上； 第二步：将含 Ti 质粒的溶液滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞/受精卵中。 若整合成功，细胞中通常仅插入一份 T-DNA 拷贝。 ②筛选转基因植物T1：收获种子并种植在含潮霉素的_________培养基上，筛选得到转基因植株T1。T1 的基因型为_________。 ③T1 植株自交得到T2，设计 Cas9基因特异性引物做PCR，PCR 结果为阴性的植株为所需植株，理由是_________。 (3)我国科研团队构建了一种转基因配子自动清除系统（TGAC 系统），该系统如图2所示，按图1方法培育得到植株T1′和T2′。 TGAC 系统发挥机制的原理：植物进行减数分裂通过毒素基因B，在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。为实现这一目的，需要选择特定的启动子，请从下表中选择最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是_________、________、________。可预测转基因元件清除的植株占T2′植株的比例为_________。 启动子 特异性 P1 所有体细胞中表达 P2 花粉发育后期表达 P3 卵细胞特异性表达 P4 极核细胞特异性表达 注：极核细胞和卵细胞是由同一个大孢子细胞有丝分裂产生的，若极核细胞死亡会导致卵细胞受精后无法发育。 (4)对比（2）与（3）分析，TGAC 系统在基因工程的应用与推广中有哪些优势_________? 【答案】(1)限制酶 (2) 选择 aa 筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染 (3) P4 （或P2） P2 （或 P4） P3 100% (4)该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性 【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。 3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）在基因工程中，限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定部位切割DNA分子。由题可知，Cas9蛋白能在sgRNA引导下切割双链DNA实现A基因的敲除，其作用类似于基因工程基本工具中的限制酶。 （2）要筛选转基因植物，需要使用选择培养基，含潮霉素的培养基可筛选出含有潮霉素抗性基因（一般与目的基因同时整合到Ti质粒上）的转基因植株。利用 CRISPR/Cas9 技术靶向编辑或敲除植物的感病基因 A，那么T1的基因型为aa。T1植株自交得到T2 ，若设计Cas9基因特异性引物做PCR，PCR结果为阴性，说明该植株不含Cas9基因。因为我们的目的是敲除感病基因A且避免转入基因的潜在风险，筛选出细胞中不含sgRNA 和Cas9等外源基因的植株，彻底避免植株及后代可能对环境的污染，所以是所需植株。 （3）植物进行减数分裂通过毒素基因B在生殖细胞发育阶段杀死携带转基因元件的配子。要实现这一目的，启动子应在生殖细胞发育阶段发挥作用，且要能作用于花粉和卵细胞相关细胞。P2在花粉发育后期表达，可用于花粉相关；P3在卵细胞特异性表达，可用于卵细胞；对于极核细胞（和卵细胞由同一个大孢子细胞有丝分裂产生），也需要其携带的转基因元件被清除，所以选择P4，因此最佳启动子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是P2、P4、P3，T1'为杂合子（假设为Aa，A为含转基因元件的），自交产生T2' ，正常情况下后代基因型及比例为AA:Aa:aa = 1:2:1。由于携带转基因元件的配子被清除（假设A配子被清除），则实际产生的后代只有aa，所以转基因元件清除的植株占T2'植株的比例为100%。 （4）对比（2）与（3），TGAC系统在基因工程的应用与推广中的优势在于：该系统可以自动清除含有外源基因元件的配子，所得后代全部为非转基因植株，可大大节省时间和人工成本，缩短育种年限，提高转基因产品的安全性。 地 城 考点02 基因工程的操作过程 14．（23-24高二下·北京西城·期末）荒漠植物的 Z 基因与其抗旱性强有关。科学家利用 Z 基因和农杆菌的 Ti 质粒（如图，T-DNA 为可转移的 DNA）构建表达载体，培育抗旱转基因小麦。下列说法错误的是（　　） A．T-DNA 能整合到小麦细胞染色体上 B．可用限制酶 ClaⅠ和 SacⅠ处理 Z 基因 C．可用卡那霉素筛选含重组 Ti 质粒的农杆菌 D．可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状 【答案】B 【详解】A、农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T- DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，A正确； B、限制酶ClaI在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏标记基因卡那霉素抗性基因，限制酶SacI在Ti质粒的T-DNA上没有酶切位点，且会破坏复制起点，不能用限制酶ClaI和SacI处理 Z 基因，B错误； C、农杆菌Ti质粒上存在卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素筛选含重组Ti质粒的农杆菌，C正确； D、荒漠植物的Z基因与其抗旱性强有关，可在个体水平检测小麦是否获得抗旱性状，D正确。 故选B。 15．（24-25高二下·北京丰台·期末）科学家将人的胰岛素基因导入大肠杆菌，使其能够合成胰岛素。下列有关这两类生物的叙述，正确的是（    ） A．都可以在核糖体上进行转录 B．都是通过有丝分裂进行增殖 C．细胞中核苷酸的种类和数量相同 D．细胞内都能进行基因的表达过程 【答案】D 【详解】A、转录是以DNA为模板合成RNA的过程，在真核生物中主要发生在细胞核，原核生物则发生在拟核区；核糖体是翻译的场所，而非转录场所，因此两者均不能在核糖体上进行转录，A错误； B、有丝分裂是真核生物的细胞分裂方式，大肠杆菌作为原核生物通过二分裂增殖，人类体细胞通过有丝分裂增殖，但大肠杆菌不进行有丝分裂，B错误； C、真核和原核细胞均含有DNA和RNA，核苷酸种类均为8种（4种脱氧核苷酸+4种核糖核苷酸），但不同细胞中核酸含量差异大，核苷酸数量不可能相同，C错误； D、细胞内的基因能够进行正常的转录和翻译，因此两者均能进行基因表达，D正确。 故选D。 16．（24-25高二下·北京顺义·期末）PCR扩增目的基因时，可通过设计引物在目的基因两侧引入限制酶识别与酶切位点。应将限制酶识别与酶切位点添加在（    ） A．引物中间 B．引物3'端 C．引物5'端 D．目的基因内部 【答案】C 【详解】A、引物中间需要与模板DNA互补配对，若在此处添加限制酶位点，可能导致引物无法正常结合模板，影响扩增，A错误； B、引物的3'端是DNA聚合酶延伸的起点，必须严格与模板配对，若在此处添加额外序列，会阻碍酶的结合与延伸，B错误； C、引物的5'端不参与与模板的互补配对，添加限制酶位点后，该序列会被整合到扩增产物的两端，确保目的基因两侧含有酶切位点，C正确； D、目的基因内部添加位点会改变基因本身的序列，与题干“两侧引入”的要求矛盾，D错误。 故选C。 17．（24-25高二下·北京海淀·期末）PCR是生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。下列有关PCR与人体细胞内DNA分子复制的叙述，不正确的是（　　） A．都需要引物提供延伸起始的3’末端 B．DNA聚合酶催化的最适温度不同 C．复制过程都是边解旋边复制 D．复制方式都是半保留复制 【答案】C 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR和体内复制均需引物提供3’末端作为延伸起点，因为聚合酶只能结合到3’末端，A正确； B、体内DNA聚合酶最适温度约37℃，而PCR中Taq酶最适温度约72℃，B正确； C、体内DNA复制边解旋边复制，而PCR通过高温完全解旋后再复制，C错误； D、两者均以原DNA链为模板，新链与母链结合，为半保留复制，D正确。 故选C。 18．（24-25高二下·北京·期末）利用农杆菌的Ti质粒作为载体进行转基因操作获得转基因水稻。下列叙述正确的是（　　） A．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于农杆菌的拟核DNA B．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA C．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到水稻细胞的染色体DNA上 D．利用农杆菌转化法将重组质粒导入水稻细胞是培育转基因水稻的核心步骤 【答案】C 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而 对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染 植物细胞后，能将 Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上 。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别 。例如 ，可以将新鲜的从叶片上取下的圆 形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞， 并再生成植株 ；可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 【详解】A、Ti质粒是农杆菌的质粒，属于细胞质中的环状DNA，而拟核DNA是细菌的主要遗传物质，位于拟核区，两者不同，A错误； B、目的基因需插入T-DNA片段内，因为T-DNA能转移至植物细胞并整合到染色体DNA中。若插入T-DNA外，可能导致目的基因无法转移，B错误； C、农杆菌感染植物时，Ti质粒上的T-DNA会转移并整合到植物细胞的染色体DNA中，这是农杆菌转化法的关键机制，C正确； D、基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，而非将重组质粒导入受体细胞，D错误。 故选C。 19．（24-25高二下·北京怀柔·期末）基因工程的主要操作步骤依次是（　　） ①筛选导入目的基因的受体细胞 ②构建基因表达载体 ③使目的基因在受体细胞中成功表达  ④筛选和获取目的基因 ⑤将表达载体导入受体细胞 A．①②③④⑤ B．④②⑤①③ C．④⑤②③① D．③②④⑤① 【答案】B 【分析】基因工程的基本步骤包括目的基因的获取、表达载体的构建、导入受体细胞、筛选及检测表达。 【详解】基因工程主要操作步骤：先筛选和获取目的基因（④），接着构建基因表达载体（②），再将表达载体导入受体细胞（⑤），之后筛选导入目的基因的受体细胞（①），最后使目的基因在受体细胞中成功表达（③），顺序为④②⑤①③ ，B正确，ACD错误。 故选B。 20．（24-25高二下·北京怀柔·期末）DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，形成标记的DNA—DNA（或标记的DNA—RNA）双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是（　　） ①该人胰岛B细胞中的mRNA     ②该人胰岛A细胞中的mRNA③该人胰岛A细胞中的DNA      ④整合了该人胰岛素基因的酵母菌的染色体DNA A．①③④ B．①②③ C．①②④ D．②③④ 【答案】A 【分析】DNA探针通过碱基互补配对与目标单链DNA或RNA结合。需判断各选项中是否存在与胰岛素基因互补的序列。 【详解】A、B、C、D、①胰岛B细胞中胰岛素基因表达，mRNA与探针互补，①正确；②胰岛A细胞不表达胰岛素基因，其mRNA不含互补序列，②错误；③胰岛A细胞的DNA含胰岛素基因（体细胞核DNA相同），③正确；④整合的胰岛素基因与探针互补，④正确，A正确，B、C、D错误。 故选A。 21．（24-25高二下·北京顺义·期末）我国科研团队通过转基因牛乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白。下列叙述正确的是（    ） A．只能从人的乳腺细胞中获取目的基因 B．将目的基因与牛乳腺特异性启动子相连 C．将表达载体显微注射导入牛乳腺细胞 D．生产的人乳铁蛋白无需进行安全性评估 【答案】B 【详解】A、体细胞中含有的基因相同，故目的基因可以从多种细胞中获取，A错误； B、乳腺生物反应器需使目的基因在乳腺细胞中特异性表达，因此需将目的基因与牛乳腺特异性启动子连接，B正确； C、显微注射法通常用于将表达载体导入受精卵而非体细胞（如乳腺细胞），C错误； D、转基因产品需通过毒理学、致敏性等安全性评估，以确保安全，D错误； 故选B。 22．（24-25高二下·北京顺义·期末）CAR基因能表达特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体。CAR-T疗法是一种治疗癌症的免疫疗法，技术流程如图。以下说法不正确的是（    ） A．CAR基因需导入到患者细胞毒性T细胞中 B．CAR-T细胞特异性识别肿瘤细胞表面抗原 C．CAR-T细胞通过裂解肿瘤细胞而发挥作用 D．该过程使用了动物细胞培养与核移植技术 【答案】D 【分析】细胞免疫过程为：（1）感应阶段：抗原呈递细胞摄取和处理抗原，并暴露出其抗原决定簇，然后将抗原呈递给辅助性T细胞；（2）反应阶段：细胞毒性T细胞接受抗原刺激后增殖、分化形成记忆细胞和新的细胞毒性T细胞，同时辅助性T细胞能合成并分泌细胞因子，增强免疫功能。（3）效应阶段：细胞毒性T细胞发挥效应。 【详解】A、CAR-T 疗法的核心是改造患者自身的免疫细胞，使其能特异性识别肿瘤细胞。由于细胞毒性 T 细胞是直接杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，因此需将 CAR 基因导入患者自身的细胞毒性 T 细胞中，使其表达 CAR 受体，A正确； B、CAR 基因表达的受体具有 “特异性识别肿瘤细胞表面抗原” 的功能，这是 CAR-T 细胞能够精准靶向肿瘤细胞的基础。因此，CAR-T 细胞可特异性识别肿瘤细胞表面抗原，B正确； C、CAR-T 细胞本质上是经过基因改造的细胞毒性 T 细胞，其作用机制与天然细胞毒性 T 细胞一致：通过识别肿瘤细胞表面抗原，裂解肿瘤细胞，从而发挥抗癌作用，C正确； D、CAR-T 疗法的主要流程为：从患者体内获取 T 细胞；通过基因工程技术将 CAR 基因导入 T 细胞；对改造后的 CAR-T 细胞进行动物细胞培养，使其大量增殖；将 CAR-T 细胞回输到患者体内。整个过程未涉及核移植技术，D错误。 故选D。 23．（24-25高二下·北京昌平·期末）利用PCR技术扩增木糖醇XDH基因，该基因的首、尾部分编码序列如下图所示。相关叙述正确的是（　　） A．变性阶段使用解旋酶将双链DNA解聚为单链 B．以4种核糖核苷酸为原料合成新的DNA链 C．选择引物2和引物3分别与两条单链DNA结合 D．在第一次循环后可以获得目的基因XDH序列 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、PCR 技术中，变性阶段是通过高温（一般 90 - 95℃）使双链 DNA 解聚为单链，不需要解旋酶，A错误； B、PCR 扩增 DNA，原料是4种脱氧核糖核苷酸，不是核糖核苷酸，B错误； C、由图可以看出，连接有磷酸基团的为5’端，PCR 中，引物需要与模板链的3’端互补配对，方便延伸，所以选择选择引物2和引物3分别与两条单链DNA结合，C正确； D、第一次循环后得到的DNA片段是引物1和引物4结合后延伸的产物，还不是目的基因完整序列，至少要经过3次循环才可能获得目的基因，D错误。 故选C。 24．（24-25高二下·北京朝阳·期末）以下高中生物学实验中，符合规范操作要求的是（　　） A．鉴定DNA时，需沸水浴加热，使溶解的DNA与二苯胺反应出蓝色 B．检测还原糖时，待测液中先加NaOH溶液混合，再加CuSO4溶液 C．检测蛋白质时，需水浴加热使双缩脲试剂与蛋白质发生显色反应 D．鉴定脂肪时，先用50%的乙醇浸泡组织切片，再用苏丹Ⅲ染液染色 【答案】A 【详解】生物组织中化合物的鉴定：（1）斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变化为砖红色（沉淀）。斐林试剂只能检验生物组织中还原糖（如葡萄糖、麦芽糖、果糖）存在与否，而不能鉴定非还原性糖（如淀粉）。（2）蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应。（3）脂肪可用苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）鉴定，呈橘黄色（或红色）。 【分析】A、鉴定DNA时，二苯胺试剂需在沸水浴条件下与DNA反应呈现蓝色。该步骤正确，A正确； B、检测还原糖应使用斐林试剂（需沸水浴）或班氏试剂，而斐林试剂需甲液与乙液等量混合后使用，并非先加NaOH再加CuSO₄（此为双缩脲试剂用法），B错误； C、检测蛋白质时，双缩脲试剂与蛋白质在常温下即可显紫色，无需水浴加热，C错误； D、鉴定脂肪时，苏丹Ⅲ染色后需用50%乙醇洗去浮色，而非染色前浸泡，顺序颠倒，D错误。 故选A。 25．（24-25高二下·北京昌平·期末）提取貉不同毛囊数量的基因组DNA进行电泳鉴定，结果如图。相关叙述不正确的是（　　） A．M孔加入指示核酸分子大小的标准参照物 B．电泳结果为单条带说明无外源DNA干扰 C．电泳过程中DNA分子由A侧向B侧移动 D．貉的毛囊数量与DNA提取效果呈正相关 【答案】B 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、M孔加入DNA分子量标准（Marker），用于对照条带大小，A正确； B、电泳结果单条带仅说明DNA片段大小一致，不能排除外源DNA污染（需设置阴性对照），B错误； C、DNA带负电荷，电泳时由负极（A侧）向正极（B侧）移动，C正确； D、毛囊数量越多，提取的DNA量越多，电泳条带亮度越高，D正确。 故选B。 26．（24-25高二下·北京西城·期末）免疫PCR是一种抗原检测技术，其原理如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．图中两种抗体与抗原不同位点特异性结合 B．PCR产物的量与目标抗原的含量正相关 C．检测不同抗原需要用不同的DNA分子 D．该技术特别适用于极微量抗原的检测 【答案】C 【分析】免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗体上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体会和固定抗体、抗生素形成复合物“固定抗体-抗生素-抗体”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量，即可推知固定抗体上吸附的抗生素的量。 【详解】A、从图中可以看到有捕获抗体和检测抗体-DNA偶联物都能与目标抗原结合，这两种抗体与抗原的不同位点特异性结合，A正确； B、因为PCR扩增的是与抗原结合的检测抗体-DNA偶联物中的DNA，目标抗原含量越高，与之结合的检测抗体-DNA偶联物越多，PCR产物的量也就越多，所以PCR产物的量与目标抗原的含量正相关，B正确； C、检测不同抗原时，由于抗原的特异性不同，与之特异性结合的抗体不同，而检测抗体-DNA偶联物中的抗体与抗原特异性结合，所以可用相同的DNA分子与不同的抗体偶联，C错误； D、该技术通过PCR对与抗原结合的DNA进行扩增，能够将极微量的抗原通过DNA的大量扩增而被检测出来，特别适用于极微量抗原的检测，D正确。 故选C。 27．（24-25高二下·北京西城·期末）关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”两个实验的叙述，正确的是（　　） A．可利用DNA溶于酒精而蛋白质不溶于酒精来提取DNA B．用二苯胺试剂鉴定DNA时不需要加热 C．PCR反应体系中需加入解旋酶以解开DNA双链 D．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关 【答案】D 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精。在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白质则溶于酒精溶液，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质，A错误； B、二苯胺试剂鉴定DNA需在沸水浴条件下显蓝色，因此需要加热，B错误； C、PCR通过高温（95℃左右）使DNA变性解链，无需解旋酶，C错误； D、在凝胶电泳中，DNA分子的大小影响迁移速率，小分子迁移更快，大分子更慢，D正确。 故选D。 28．（24-25高二下·北京东城·期末）大肠杆菌中的Z酶可催化X-gal水解产生蓝色物质。pUC18质粒（如图甲）中lacZ'编码Z酶的一个片段（α肽）。已知α肽、缺失α肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，同时存在时表现出Z酶活性。将图乙目的基因插入pUC18质粒后导入大肠杆菌，可根据菌落颜色筛选含有重组质粒的受体细胞。下列相关分析不正确的是（    ） A．选用SalⅠ限制酶切割目的基因与pUC18质粒 B．利用DNA连接酶连接目的基因与pUC18质粒获得重组质粒 C．作为受体细胞的大肠杆菌需满足Z酶基因中仅编码α肽的DNA序列缺失 D．在含有X-gal的培养基中培养时，含有重组质粒大肠杆菌的菌落颜色为蓝色 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、根据乙图可知，HindIII会破坏目的基因，故选用Sa1I限制酶切割目的基因和pUC18质粒，A正确； B、利用DNA连接酶连接目的基因与pUC18质粒获得重组质粒，B正确； C、已知α肽、缺失α肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，同时存在时表现出Z酶活性，故要想根据菌落颜色筛选含有重组质粒的受体细胞，作为受体细胞的大肠杆菌需满足Z酶基因中仅编码α肽的DNA序列缺失，C正确； D、由图可知，SalⅠ限制酶会破坏pUC18质粒中lacZ'基因，不能合成Z酶，菌落没有颜色，因此，在含有X-gal的培养基中培养时，含有重组质粒大肠杆菌的菌落颜色为白色，D错误。 故选D。 29．（24-25高二下·北京东城·期末）将四种关键基因导入小鼠的成纤维细胞，可获得诱导多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，可分化成神经细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。下列叙述不正确的是（    ） A．应使用显微注射法将四种基因直接注入成纤维细胞 B．导入的四种基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 C．iPS细胞能分化成多种细胞，是基因选择性表达的结果 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 【答案】A 【分析】胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞，iPS与ES细胞一样，可通过定向诱导分化修补某些功能异常的细胞来治疗疾病。 【详解】A、显微注射法通常用于将含有目的基因的载体（如质粒）导入动物细胞，而非直接注入游离的基因片段。直接注入的基因难以整合到宿主基因组中，A错误； B、导入的四种关键基因（如Oct4、Sox2等）可重新编程体细胞，使其恢复分裂能力并转化为iPS细胞，B正确； C、iPS细胞分化为不同细胞是基因选择性表达的结果，符合细胞分化的本质，C正确； D、iPS细胞来源于体细胞，无需破坏胚胎，避免了胚胎干细胞涉及的伦理争议，D正确； 故选A。 30．（23-24高二下·北京昌平·期末）镰状细胞贫血是由于β-球蛋白基因突变引起的隐性遗传病，该突变导致β-球蛋白基因缺少一个限制酶MstⅡ的识别序列（下图）。为判断待检者的基因组成，下列叙述错误的是（　　） A．利用PCR技术扩增待检者基因的相应片段 B．用限制酶MstⅡ剪切扩增的DNA C．用琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的DNA片段 D．电泳结果出现目标条带即为患者 【答案】D 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。 【详解】A、为检测出相应片段，可以利用PCR技术扩增待检者基因的相应片段，A正确； B、突变基因两侧含有MstⅡ基因，因此可以用限制酶MstⅡ剪切扩增的DNA，B正确； C、用限制酶MstⅡ剪切扩增的DNA后，用凝胶电泳分离酶切后的DNA片段，C正确； D、电泳结果出现目标条带说明携带致病基因，不一定就是患者，也有可能是携带者，D错误； 故选D。 31．（23-24高二下·北京·期末）新型冠状病毒（SARS-CoV-2）表面的S蛋白由S1和S2两个亚基组成。科研人员制备获得了鼠抗S蛋白特异性单克隆抗体，为分析该单克隆抗体的特异性，将SARS-CoV-2的S蛋白进行电泳得到图A，用该单克隆抗体进行抗原-抗体杂交并显色得到图B。下列表述错误的是（    ） A．该单克隆抗体特异性的识别S蛋白的S2亚基 B．制备单克隆抗体的过程体现了动物细胞膜具有流动性 C．免疫后小鼠体内的浆细胞只产生一种抗S蛋白抗体 D．制备单克隆抗体的过程可用灭活病毒诱导动物细胞融合 【答案】C 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再通过克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养杂交瘤细胞，最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、由电泳结果可知，图A有S1和S2两个条带，图B只有S2一个条带，且条带比图A宽，说明该单克隆抗体特异性地识别SARS-CoV-2中S蛋白的S2亚基，A正确； B、制备单克隆抗体的过程中，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，细胞融合过程体现了细胞膜具有一定的流动性，B正确； C、免疫后的小鼠体内的浆细胞可能有多种，每一种浆细胞只产生一种特异性抗体，C错误； D、制备单克隆抗体的过程中，可用灭活的病毒诱导动物细胞融合，获得杂交瘤细胞，D正确。 故选C。 32．（23-24高二下·北京海淀·期末）利用逆转录PCR可以对RNA进行检测。逆转录PCR的过程可以分为逆转录和PCR扩增两步。下列有关逆转录PCR的叙述，错误的是（    ） A．需要催化逆转录的酶 B．包含变性-复性-延伸的循环过程 C．可用于HIV的核酸检测 D．两种引物的碱基序列互补配对 【答案】D 【分析】PCR技术过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、逆转录PCR的过程可以分为逆转录（需要催化逆转录的酶）和PCR扩增两步，故逆转录PCR需要催化逆转录的酶，A正确； B、PCR扩增的过程为变性-复性-延伸，故逆转录PCR包含变性-复性-延伸的循环过程，B正确； C、逆转录PCR结合了逆转录和PCR两种技术的优势，能够高效、灵敏地用于HIV的核酸检测，C正确； D、两种引物的碱基序列不能互补配对，否则会形成引物二聚体，进而影响目的基因的扩增，D错误。 故选D。 33．（23-24高二下·北京朝阳·期末）油菜是我国的重要油料作物，其生长受到核盘菌引起的菌核病威胁。科研人员试图培育抗菌核病的转基因油菜新品种，其抗性机理如下图所示，相关叙述正确的是（    ） A．将含防御基因的基因表达载体导入核盘菌后，侵染油菜获得转基因植株 B．核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因表达出相应蛋白质抵御核盘菌侵染 C．未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能合成转录因子B，不启动防御基因表达 D．转基因油菜中的启动子pB属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、将含防御基因的基因表达载体导入农杆菌后，侵染油菜获得转基因植株，A错误； B、分析题图可知，核盘菌侵染转基因油菜后，启动防御基因转录出小干扰RNA抵御核盘菌侵染，而非表达出蛋白质，B错误； C、未受到核盘菌侵染时，油菜细胞不能激活细胞内的转录因子B，导致防御基因不能表达，C错误； D、转基因油菜中的启动子pB只有在核盘菌侵染时才能激活目的基因的表达，属于诱导型启动子，能够精确调控防御基因的表达，D正确。 故选D。 34．（23-24高二下·北京朝阳·期末）酵母人工染色体pYAC2是以酵母菌为受体细胞构建基因文库时的常用载体。下图为pYAC2的结构示意图，导入受体细胞前用限制酶BamHⅠ切割可使其成为线性的染色体。pYAC2适配的受体菌菌落呈红色，sup4基因表达能够抑制其性状表现，使菌落呈白色。相关叙述错误的是（    ） A．导入pYAC2的受体菌能够在不含色氨酸的培养基中生存 B．用BamHⅠ切割pYAC2后，TEL端粒序列位于染色体的两端 C．着丝粒序列CEN4的存在可防止pYAC2在细胞分裂中丢失 D．将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选白色菌落 【答案】D 【分析】载体：除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。质粒作为载体的条件：①有一个至多个限制酶酶切位点；②进入受体细胞后能自我复制或整合到宿主细胞DNA上进行同步复制；③有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 【详解】A、pYAC2上含有TRP1（色氨酸合成酶基因），导入pYAC2的受体菌能够合成色氨酸，能够在不含色氨酸的培养基中生存，A正确； B、pYAC2上有两个BamHⅠ切割位点，用BamHⅠ切割后，pYAC2成为线性的染色体，TEL端粒序列位于染色体的两端，B正确； C、着丝粒是确保细胞分裂时染色体正确分离的重要结构，pYAC2上的CEN4（着丝粒序列）可防止pYAC2在细胞分裂中丢失，C正确； D、分析题图可知，目的基因插入会破坏sup4基因，导致sup4基因不能表达，故pYAC2适配的受体菌菌落仍呈红色，将带有目的基因的重组pYAC2导入受体菌后应挑选红色菌落，D错误。 故选D。 35．（23-24高二下·北京大兴·期末）下图为获得抗除草剂转基因玉米A 的技术路线，相关叙述错误的是（    ） A．将目的基因插入 T-DNA 中的目的是利用其转移能力 B．诱导出愈伤组织往往需要植物激素的作用 C．若筛选出具有抗生素抗性的农杆菌则说明目的基因转化成功 D．要与普通玉米进行除草剂抗性比较，以确定转基因效果 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、农杆菌中Ti质粒上的T-DNA具有很强的转移能力，因此将目的基因插入 T-DNA 中的目的是利用其转移能力，并整合到宿主细胞染色体DNA上，A正确； B、诱导出愈伤组织往往需要生长素和细胞分裂素的参与，B正确； C、若筛选出具有抗生素抗性的玉米细胞则说明目的基因转化成功，C错误； D、欲判断抗除草剂转基因玉米的效果，需要与普通玉米进行除草剂抗性比较，D正确。 故选C。 36．（23-24高二下·北京西城·期末）转基因产品（GMO）标识是为了表明该产品是由转基因生物生产、加工而成的特殊标识。我国《农业转基因生物标识管理办法》中规定对GMO采取强制定性标识。下列说法错误的是（　　） A．检测产品中有无目的基因即可确认是否为GMO B．GMO定性标识是为消费者提供知情权和选择权 C．市场上带有标识的转基因产品都应经过安全检测 D．转基因产品研究工作中要注意防止造成基因污染 【答案】A 【分析】基因工程（重组DNA技术）的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定 【详解】A、检测产品中有无目的基因不可以确认是否为GMO，还需检测目的基因是否转录出mRNA ，是否翻译出蛋白质，此外，还需要进行个体生物学水平的鉴定，A错误； B、GMO定性标识是为了表明该产品是由转基因生物生产、加工而成的特殊标识，为消费者提供知情权和选择权，B正确； C、市场上带有标识的转基因产品都应经过安全检测，符合相应标准后才能上市，C正确； D、转基因产品研究工作中要注意防止造成基因污染，防止基因污染的方法有很多，如科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起导入植物中，防止转基因花粉的传播，D正确。 故选A。 37．（22-23高二下·北京朝阳·期末）利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①―④中选择扩增P基因的合适引物组合（    ） A．①② B．①③ C．②③ D．②④ 【答案】A 【分析】利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA复制，PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3＇端通过碱基互补配对结合。 【详解】PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3＇端通过碱基互补配对结合，故引物分别为①②，不是③④，A符合题意，BCD不符合题意。 故选A。 38．（22-23高二下·北京朝阳·期末）蛛丝蛋白具有优良的特性，有广泛的应用前景。蛛丝蛋白核心结构中有以某氨基酸序列为单元的重复序列，据此设计了氨基酸单元相应的核心DNA片段以用于合成目的基因，借助质粒构建表达载体，使大肠杆菌表达蛛丝蛋白。下列对相关操作及结果叙述错误的是（    ） A．将多个核心DNA片段拼接获得目的基因时，可用到DNA连接酶 B．连接目的基因和载体时，二者需要有相同的黏性末端 C．构建表达载体时，需要限制酶和DNA连接酶 D．表达载体插入大肠杆菌的拟核基因组中，即可表达蛛丝蛋白 【答案】D 【分析】基因表达载体的构建：①过程：一般用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 【详解】A、DNA连接酶可将两个不同的DNA片段连接在一起，因此将多个核心DNA片段拼接获得目的基因时，可用到DNA连接酶，A正确； B、目的基因和载体需要通过碱基互补配对拼接在一起，因此连接目的基因和载体时，二者需要有相同的黏性末端，B正确； C、构建表达载体时，需要使用限制酶切割，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA，C正确； D、表达载体插入大肠杆菌的拟核基因组中，并不一定能表达蛛丝蛋白，还需要进行抗原抗体检测看蛛丝蛋白基因是否进行了表达，D错误。 故选D。 39．（24-25高二下·北京朝阳·期末）母乳中的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）在促进新生儿免疫系统发育等方面具有重要作用。为实现2'-FL的高效生物合成，研究者开发了枯草芽孢杆菌工程菌（好氧菌）。 (1)研究者构建含有催化途径I、Ⅱ等关键酶基因的_______，导入枯草芽孢杆菌中，获得工程菌甲。图1显示甲能快速转运葡萄糖，并且优化了______方向，从而显著提高了2'-FL的合成效率。 (2)乳糖充足时，其能与特定的响应型阻遏蛋白结合，使该阻遏蛋白无法与启动子P下游序列L结合，基因转录；乳糖缺乏时，其响应型阻遏蛋白与序列L结合，阻止基因转录。为筛选乳糖响应型阻遏蛋白，研究者将图2所示两种表达载体共同导入枯草芽孢杆菌，并在含有5FdU的培养基中培养。 ①若该菌能在上述培养基中生长，则载体1表达的阻遏蛋白________（能/不能）与载体2上的序列L结合。 ②将上述培养基中存活的菌株转移到________的培养基中，选择________的菌落，获得乳糖响应型阻遏蛋白基因序列。 (3)将乳糖响应型阻遏蛋白基因序列与具有持续表达活性的启动子连接后导入工程菌甲，并将甲的G酶基因启动子替换为启动子P，获得了产量显著提高的工程菌乙。综合上述研究结果，完善图3模型，以解释乙产量提高的原因________。 (4)工程菌乙发酵后期常出现2'-FL产率下降现象，其原因是枯草芽孢杆菌内存在一种ATP敏感型蛋白酶（DegP），当ATP浓度<2mM时，DegP会降解途径I关键酶。请提出一种发酵控制策略，在不改造菌株基因的前提下维持2′-FL高产，并说明原理________（要求：①策略需利用现有发酵参数；②避免添加外源抑制剂）。 【答案】(1) 表达载体 代谢流分配 (2) 能 乳糖、不含5FdU 有绿色荧光 (3)低：响应型阻遏蛋白与序列L结合，G酶基因表达受阻，G酶含量少，葡萄糖可直接转化为乳糖，进而转化为2'-FL 高：乳糖与响应型阻遏蛋白结合，G酶基因的转录抑制被解除，G酶表达量增加，葡萄糖被高效转化为葡萄糖-6-磷酸及下游中间产物，为2'-FL合成提供充足前体 (4)分阶段逐步增加葡萄糖的添加量 原理:短时高葡萄糖→糖酵解爆发→ATP显著增加→抑制DegP活性→保护途径I关键酶 【分析】基因工程的基本操作步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建（核心）、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）在基因工程中，要将目的基因（催化途径I、Ⅱ等关键酶基因）导入受体细胞（枯草芽孢杆菌），需要先构建基因表达载体。从图1可以看到，葡萄糖有不同的代谢途径，工程菌甲优化了代谢流分配，使得更多的葡萄糖朝着合成2'-FL的方向进行代谢，从而显著提高2'-FL的合成效率。 （2）已知H基因编码产物可将无毒化合物5FdU转化为致死的细胞毒性化合物，且H基因与绿色荧光蛋白基因共同转录、独立翻译。载体2中启动子P下游序列L与响应型阻遏蛋白结合情况会影响基因转录。若菌能在含有5FdU的培养基中生长，说明H基因没有表达产生将5FdU转化为致死化合物的产物，即载体1表达的阻遏蛋白与载体2上的序列L结合了，阻止了H基因转录。将上述培养基中存活的菌株转移到不含5FdU的培养基中，因为在含有5FdU的培养基中存活的菌株表达的阻遏蛋白能与序列L结合。当转移到不含5FdU的培养基后，对于乳糖响应型阻遏蛋白，在乳糖存在时，它应与乳糖结合而不与序列L结合，从而使H基因和绿色荧光蛋白基因转录表达，所以选择有绿色荧光的菌落，就可以获得乳糖响应型阻遏蛋白基因序列。 （3）将乳糖响应型阻遏蛋白基因序列与具有持续表达活性的启动子连接后导入工程菌甲，并将甲的G酶基因启动子替换为启动子P，获得了产量显著提高的工程菌乙，根据题意分析乙产量提高的原因是：当乳糖含量低时：响应型阻遏蛋白与序列L结合，G酶基因表达受阻，G酶含量少，葡萄糖可直接转化为乳糖，进而转化为2'-FL；当乳糖含量高时：乳糖与响应型阻遏蛋白结合，G酶基因的转录抑制被解除，G酶表达量增加，葡萄糖被高效转化为葡萄糖-6-磷酸及下游中间产物，为2'-FL合成提供充足前体。 （4）在不改造菌株基因的前提下维持2′-FL高产，其原理是分阶段逐步增加葡萄糖的添加量 原理:短时高葡萄糖→糖酵解爆发→ATP显著增加→抑制DegP活性→保护途径I关键酶，以维持2′-FL高产。 40．（24-25高二下·北京海淀·期末）研究者发现一种二倍体的野生马铃薯，与四倍体的栽培马铃薯杂交，培育马铃薯突变体。 (1)栽培马铃薯和野生马铃薯之间存在______，故杂交不能产生可育后代。 (2)野生马铃薯的M基因能够修复错配的DNA，维持基因组稳定。研究者将图1所示的T-DNA导入野生马铃薯细胞中，获得M基因沉默（几乎不表达）的转基因马铃薯（马铃薯B）。 通过该方法使M基因沉默的原理是______。 (3)研究者将马铃薯B、野生马铃薯分别与栽培马铃薯进行体细胞杂交，获得了大量杂种植株。对不同杂种植株的DNA含量进行分析，结果如下图（“x”表示DNA的倍性）。 ①使用______处理两种马铃薯叶片细胞，利用______促进二者融合，进而获得体细胞杂交的植株。 ②杂交一出现大量DNA含量6x以下的个体，推测______ ③杂交二与杂交一比较，说明M基因沉默导致______。 【答案】(1)生殖隔离 (2)M基因编码区反向连接在T-DNA的启动子与终止子之间，转录出的mRNA与内源M基因转录的 mRNA互补配对，使内源M基因无法完成翻译 (3) 纤维素酶和果胶酶 PEG 杂种植株部分染色体（或DNA）丢失 杂种植株染色体（或DNA）丢失产生的变异增多 【分析】植物体细胞杂交技术： 1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。 2、过程：（1）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（2）细胞融合完成的标志是新的细胞壁的生成。（3）植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束。（4）杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。 3、意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 【详解】（1）栽培马铃薯是四倍体，野生马铃薯是二倍体，两者杂交后代是三倍体，三倍体进行减数分裂时会联会紊乱，很难形成正常的配子，即其是不可育的，由此可知，栽培马铃薯和野生马铃薯之间存在生殖隔离，故杂交不能产生可育后代。 （2）分析图1可知M基因编码区反向连接在T-DNA 的启动子与终止子之间，转录出的mRNA与内源M基因转录的mRNA互补配对，使内源M基因无法完成翻译，导致M基因无法正常表达，从而实现基因沉默。 （3）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁得到原生质体。聚乙二醇（PEG）是常用的促融合剂，可诱导原生质体融合，故使用纤维素酶和果胶酶处理两种马铃薯叶片细胞得到原生质体，利用PEG促进二者融合，进而获得体细胞杂交的植株。杂交一中杂种植株的DNA含量集中在5x-6x（野生马铃薯2x+栽培马铃薯4x=6x)，但出现大量低于6x的个体，说明部分染色体在细胞分裂过程中丢失。 杂交二中马铃薯B的M基因被沉默，导致DNA修复能力下降，基因组不稳定，因此杂种植株的DNA含量范围更广（6x-8x），且与杂交一相比，染色体丢失现象更显著。 41．（24-25高二下·北京·期末）含镍（Ni）工业废水的处理一直是水污染治理的难题。一类广泛存在于动植物细胞中的金属硫蛋白（MT）具有结合Ni等重金属，并消除重金属对细胞毒害作用的能力。研究者利用MT基因构建转基因大肠杆菌，用以净化工业废水。 (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，经_______可获得大量MTcDNA。 (2)为了进一步提高工程菌MT蛋白的产量，将MT基因与外源表达增强元件连接（图1）。利用PCR检测连接是否成功，可选择的引物组合是_______。 (3)将改造后的目的基因进行PCR扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E只有能产生黏性末端的酶切位点。为了能够将MT基因与载体E相连，可在上述引物的_______（填“5′”或“3′”）端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和E的酶切位点及相应的酶切序列见图2。 后者步骤如下：①选用_______酶将载体P切开，用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由于载体P′不具表达MT基因的启动子和终止子，其中前者是_______识别并结合的部位，需选用_______酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E连接，构成重组质粒。 (4)将重组质粒导入用_______处理的大肠杆菌中完成转化，随后利用含有_______的培养基筛选出工程菌。 (5)研究者检测MT基因在工程菌的表达量，结果见图3。该结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中Ni的工程菌，下列叙述中能支持该观点的是_______。 A．尚未对MT基因进行碱基序列的测定与比较 B．尚未在个体水平上进行抗原-抗体杂交检测 C．尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定 D．尚未对MT工程菌吸附Ni的能力进行鉴定 【答案】(1)逆转录PCR (2)引物1与引物4 (3) 5' EcoRV RNA聚合酶 XhoⅠ和PstⅠ (4) Ca2+ 卡那霉素 (5)CD 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，经逆转录（反转录）和PCR技术可获得大量MT - cDNA。首先通过逆转录过程，以mRNA为模板合成cDNA，然后利用PCR技术对cDNA进行扩增。 （2）要检测MT基因与外源表达增强元件是否连接成功，应选择能扩增出包含连接部位的引物组合。观察可知，引物1和4可以扩增出包含表达增强元件和MT基因连接区域的片段。 （3） PCR扩增时，子链是从5'端向3'端延伸的，为了在扩增片段末端添加能产生黏性末端的限制酶识别序列，应在引物的5'端添加。 选用EcoR V酶将载体P切开，因为EcoR V酶切后产生平末端，可与PCR扩增得到的平末端MT基因连接。 启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动基因转录。观察可知，选用XhoⅠ和PstⅠ酶组合对载体P和载体E进行酶切，这样可以将MT基因从重组质粒P'切下，并将载体E切开，便于连接。 （4）将重组质粒导入大肠杆菌时，常用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于吸收重组质粒。由可知，载体E上含有卡那霉素抗性基因，所以随后利用含有卡那霉素的培养基筛选导入重组质粒的大肠杆菌。 （5）A、对MT基因进行碱基序列的测定与比较，主要是为了确认基因的正确性，但即使基因序列正确，也不能直接表明工程菌就具有较强吸附废水中Ni的能力，A错误；    B、 抗原 - 抗体杂交是在分子水平检测目的蛋白是否表达，而不是在个体水平，且即使检测到蛋白表达，也不能直接说明其能较强吸附Ni，B错误； C、尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定，若蛋白活性低，即便MT基因在工程菌中有表达，也无法有效吸附废水中的Ni，能支持无法说明成功构建能较强吸附废水中Ni的工程菌这一观点，C正确；    D、尚未对MT工程菌吸附Ni的能力进行鉴定，直接表明不能确定工程菌是否能较强吸附Ni，能支持该观点，D正确。   故选CD。 42．（24-25高二下·北京·期末）玉米是我国重要的作物，在种植时常因感染禾谷镰刀菌（Fg菌）而患茎腐病，导致产量减少。我国研究者尝试用生物方法进行防治。 (1)研究者取患病玉米病斑和健康组织交界处的组织消毒后，轻压到经过_______法灭菌的固体培养基上，培养基中的氮源可用于合成_______等物质（写出2种即可）。纯培养后鉴定出上述玉米组织中除了存在Fg菌外，还存在哈茨木霉菌（Th菌）。 (2)将健康的玉米种子播种到不同处理的土壤中培养，实验结果证明Th菌对Fg菌有一定的抑制作用，实验组中对土壤的处理为_______。 (3)已知Fg菌具有将双链RNA切割成小片段，并水解其中的一条链的能力。研究者欲利用此原理增强Th菌对Fg菌的抑制作用。 ①T2基因是Fg菌细胞壁合成相关基因。研究者以图1中序列为目的基因构建表达载体，导入Th菌中获得Th-1菌。若T2基因和Ⅰ处序列转录出的RNA存在碱基互补配对关系，可使表达载体生成双链T2-mRNA（dsRNA），则图1中Ⅰ处序列为：_______。 注：内含子是一段不编码蛋白质的核苷酸序列 ②将绿色荧光蛋白标记的dsRNA加入到Fg菌液培养36h。研究者观察到_______，得出Fg菌具有摄取环境中RNA的能力的结论。 ③将Th菌、Th-1菌、Th-2菌（转入无关基因的Th菌）培养液的上清液分别加入到Fg菌液中一段时间，利用电泳检测Fg菌中T2-mRNA和T2蛋白含量。图2所示结果说明_______。 注：rRNA和β-Actin均作为参照 (4)进一步研究证明，Th-1菌具有比Th菌更强的保护玉米免受Fg菌侵害的能力。请结合上述研究阐明Th-1菌具有更强的治疗玉米茎腐病的机理。_______。 【答案】(1) 湿热灭菌 蛋白质、核酸（或ATP等） (2)先灭菌再喷洒Fg菌和Th菌 (3) 反向插入的T2基因序列 Fg菌中出现绿色荧光 Th-1菌通过抑制Fg菌T2-mRNA的翻译，抑制T2蛋白的合成 (4)Th-1菌产生的dsRNA被Fg菌摄取，Fg菌将dsRNA切割成小片段，并水解其中的一条链，未被水解的链可与T2-mRNA碱基互补配对，抑制T2蛋白的合成，Fg菌无法合成细胞壁，从而无法存活 【分析】灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；③培养基、无菌水等使用湿热灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 【详解】（1）固体培养基采用湿热灭菌法灭菌，培养基中的氮源是微生物生长所必需的营养物质之一，它可用于合成蛋白质、核酸（或ATP等）等物质。 （2）为了探究Th菌对Fg菌的抑制作用，研究者将健康的玉米种子播种到不同处理的土壤中培养，实验组中对土壤的处理为先灭菌再喷洒Fg菌和Th菌。 （3）T2基因和Ⅰ处序列转录出的RNA存在碱基互补配对关系，可使表达载体生成双链T2-mRNA（dsRNA），根据碱基互补配对原则，可以推断出图1中Ⅰ处序列为反向插入的T2基因序列。 研究者将绿色荧光蛋白标记的dsRNA加入到Fg菌液中培养36h。如果观察到Fg菌中出现绿色荧光，则可以得出Fg菌具有摄取环境中RNA的能力的结论。 为了进一步验证Th−1菌对Fg菌的抑制作用，研究者将Th菌、Th−1菌、Th−2菌（转入无关基因的Th菌）培养液的上清液分别加入到Fg菌液中一段时间，并利用电泳检测Fg菌中T2−mRNA和T2蛋白含量。由图2观察到，与Th菌和Th−2菌相比，Th-1菌组中T2蛋白明显减少，而T2-mRNA没有明显变化，说明Th-1菌通过抑制Fg菌T2-mRNA的翻译，抑制T2蛋白的合成。 （4）Th-1菌具有比Th菌更强的保护玉米免受Fg菌侵害的能力，综上所述，Th-1菌具有更强的治疗玉米茎腐病的机理为Th-1菌产生的dsRNA被Fg菌摄取，Fg菌将dsRNA切割成小片段，并水解其中的一条链，未被水解的链可与T2-mRNA碱基互补配对，抑制T2蛋白的合成，Fg菌无法合成细胞壁，从而无法存活。 43．（24-25高二下·北京房山·期末）水杨酸（SA）是工业废水中的一种污染物，科研人员欲利用基因工程技术制备高效工程菌对其进行治理。 (1)从细胞结构上看，大肠杆菌结构简单，属于________生物，常作为基因工程受体菌。 (2)研究人员将调控蛋白基因（nahR）和红色荧光蛋白基因（mrfp）分别与启动子Pc和Ps连接后，构建表达载体，导入_________处理过的大肠杆菌中，经筛选获得工程菌甲，如图1所示。 当水中存在SA时，SA与调控蛋白结合，促进_______酶识别并结合Ps，沿模板链3′→5′方向转录出mRNA，根据_______可了解SA污染程度。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用，为获得能利用水杨酸的工程菌，利用重叠延伸PCR技术（图2A）将水杨酸羟化酶基因（nahG）与mrfp基因连接成融合基因。 ①学习图2A中所示原理，为图2B选择合适的引物构建融合基因nahG-mrfp________。 ②将融合基因与Ps启动子结合构建表达载体，导入普通大肠杆菌，筛选获得工程菌乙。与甲相比，乙的作用优势主要体现在________。 (4)已知cB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，抗毒蛋白基因的表达可与毒蛋白结合导致毒蛋白失效，欲构建新的表达载体并转入工程菌乙，筛选获得能“自毁”的工程菌。 ①设计工程菌在特定条件下启动“自毁”，该条件是_________。 ②请从A~C中选择启动子填在图3的i和ii处，从D~F中选择基因填在ii处，设计一种可实现①目的的工程菌“自毁”基因表达载体，i、ii、iii处分别为_________。 A．启动子Ps B．启动子Pc C．固定期启动子（菌体达到一定数量方可被激活） D．毒蛋白基因 E．抗毒蛋白基因 F．毒蛋白功能激活基因 【答案】(1)原核 (2) Ca²⁺（或氯化钙 ） RNA 聚合酶 红色荧光强度 (3) 引物 1、引物 3 可通过荧光（mrfp 基因表达的荧光蛋白）直观鉴定工程菌是否成功表达水杨酸羟化酶 (4) 工程菌达到一定数量 C、E、F 【分析】基因工程的基本步骤包括筛选目的基因、基因表达载体构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中目的基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 【详解】（1）大肠杆菌无核膜包被的细胞核，属于原核生物，常作基因工程受体菌。 （2）导入前大肠杆菌需用Ca²⁺（或氯化钙 ） 处理，使其成为感受态细胞。SA 与调控蛋白结合，促进RNA 聚合酶识别启动子，转录 mRNA；通过红色荧光强度反映 SA 污染程度（mrfp 表达与荧光关联 ）。 （3）图 2B 构建融合基因，需让nahG与mrfp连接，两条模板链应位于同一条单链上。引物 2 与引物4 可碱基互补配对（如图 2A 原理，引物间互补实现基因片段连接），用引物 1 、3扩增nahG-mrfp融合基因。甲无荧光标记，乙因mrfp基因表达荧光蛋白，若水杨酸羟化酶基因（nahG ）表达，荧光可直观呈现，便于检测工程菌功能，体现作用优势。 （4）结合 “固定期启动子（菌体达到一定数量方可被激活 ）”，设定该条件使工程菌数量达标后启动 “自毁” 程序，这样可以利用细菌生长周期中稳定期的启动子特性，结合毒素-抗毒素系统，实现工程菌在完成任务（如增殖到一定数量、发挥功能后 ）的 “自毁”，避免基因扩散等风险 。i 选固定期启动子（C ），保证菌体数量达标才启动；ii 填抗毒蛋白基因（E ），iii 填毒蛋白功能激活基因（F ）。工程菌增殖到一定数量，固定期启动子激活，抗毒蛋白先表达维持存活；后续毒蛋白功能激活基因启动，毒蛋白生效使工程菌 “自毁”，实现特定条件下自毁。 44．（24-25高二下·北京通州·期末）学习以下材料，回答问题。 细菌也能“织布”? 在富含碳的培养基中，驹形杆菌可以聚合并分泌线性葡萄糖链，同时这些链可自组装成一个密集且相互连接的纤维素网状结构。这种细菌纤维素生物纺织品的开发，逐渐成为当前研究和应用的新热点。 为了解决细菌纤维素颜色过于单一的问题，科研人员对驹形杆菌进行了基因工程改造，设计和构建出菌株来表达酪氨酸酶1（Tyr1），使该菌株可以将酪氨酸转化为黑色素，如图1所示。在菌株生长过程中，细胞在生长纤维素层时有效地产生酪氨酸酶，在随后的酶促反应中，这些细胞就可以产生黑色素，以实现自然地对纤维素进行染色。 接下来，科研人员为表达Tyr1的工程菌株引入T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7R）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体，原理见图2。通过将450nm的蓝光可控地投射到培养基上，从而触发细菌在生产纤维素时以可控的方式产生黑色素，进而使得生产出的纤维素材料呈现图案。 总的来说，该工程菌株表达酪氨酸酶，细菌生长时可积累黑色素，导致生产的纤维素薄膜呈现出黑色，这种黑色纤维素薄膜可进一步通过干燥、压制等加工制作成产品，比如手袋、布料等，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路。 (1)驹形杆菌可以利用培养基中的碳元素合成纤维素，还可以合成__________等生物大分子。图1的表达载体中金担子素抗性基因的作用是_______。 (2)结合材料信息，以下对该工程菌描述正确的有：_________。 A．驹形杆菌形成的纤维素层也可以作为其细胞壁而发挥支持和保护的作用 B．能够在含有金担子素的培养基中形成菌落的细菌不一定成功导入了Tyr1基因 C．可以通过控制蓝光照射的范围来实现在纤维素层上呈现不同黑色图案的目的 D．T7噬菌体来源的RNA聚合酶也能在工程菌中发挥作用说明该酶不具有专一性 (3)为了实现蓝光控制染色，请对图1的表达载体进行改造_________。 (4)基于该项技术，请你为实现多彩的纤维素材料提出自己的设想_________。 【答案】(1) 蛋白质、核酸 作为标记基因，便于筛选出导入了表达载体的驹形杆菌 (2)BC (3) (4)引入产生不同颜色色素的酶基因，通过控制不同酶基因 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）生物大分子有核酸、蛋白质和多糖，都含有碳元素，因此驹形杆菌可以利用培养基中的碳元素合成纤维素，还可以合成蛋白质、核酸（RNA、DNA）等生物大分子。图1的表达载体中金担子素抗性基因属于标记基因，因此金担子素抗性基因的作用是作为标记基因，便于筛选出导入了表达载体的驹形杆菌。 （2）A、细菌细胞壁的成分时肽聚糖，不是纤维素，A错误； B、导入了重组质粒和普通质粒的细菌都可以在含有金担子素的培养基中形成菌落，因此能够在含有金担子素的培养基中形成菌落的细菌不一定成功导入了Tyr1基因，B正确； C、由于蓝光可以诱导酪氨酸酶的表达，从而产生黑色素，通过控制蓝光照射的范围，就可以控制黑色素产生的区域，进而实现在纤维素层上呈现不同黑色图案的目的，C正确； D、T7噬菌体来源的RNA聚合酶只能识别T7启动子，具有高度的专一性，它在工程菌中发挥作用是因为工程菌中存在T7启动子，D错误。 故选BC。 （3）T7RN端-nMag基因和pMag-T7RC端基因表达后，在蓝光照射下，T7R的N端-nMag与T7R的C端结合，导致无活性的T7R变成有活性的T7R，结合题干信息，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7R）识别启动子PT7使基因Tyr1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶1，酪氨酸酶1从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，从而实现蓝光控制染色。如图所示： （4）要实现多彩的纤维素材料，可以引入不同的酶基因，这些酶基因可以催化产生不同颜色的色素。例如，引入产生红色色素的酶基因、产生黄色色素的酶基因等，通过控制不同酶基因的表达，就可以得到不同颜色的纤维素材料。同时，还可以通过控制不同酶基因的表达时间和空间，实现多种颜色的组合，从而得到多彩的纤维素材料。 45．（24-25高二下·北京通州·期末）尿素是一种重要的农业肥料，但是必须经过分解才能更好地被植物利用。为获得高效分解尿素的菌种，研究人员做了如下研究。 (1)获取尿素分解菌 ①称取农田土壤样品1g，加入一个盛有_____mL无菌水的三角瓶中，将样品充分打散、混匀，即成10-2稀释液。然后再依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。 ②将10-4、10-5、10-6的稀释液涂布于以_____为唯一氮源、含酚红的培养基上，依据______选择产酶的菌株。经过筛选，最终获得高产脲酶菌株。 (2)为进一步研究脲酶中不同位点氨基酸对其活性的影响，研究人员按照右图所示，对脲酶基因进行了定点诱变（引物B和C中均替换了一个碱基），以得到突变的脲酶基因。 ①如图所示的PCR1、PCR3所需要的引物分别是____、____。 A．引物A B．引物B C．引物C D．引物D E．不加入引物 ②研究人员将含有定点突变脲酶基因的重组质粒和________分别导入大肠杆菌，以判断不同位点氨基酸改变对脲酶活性的影响。 【答案】(1) 99 尿素 红色圈 (2) AC E 含有未突变脲酶基因的重组质粒 【分析】由图可知，PCR1由引物A和引物C扩增得到，PCR2由引物B和引物D扩增得到，PCR3由PCR1和PCR2结合后各自延伸得到。 【详解】（1）①由题意可知，称取农田土壤样品1g，加入无菌水后得到10-2稀释液，说明加入无菌水体积为99mL。 ②欲获取尿素分解菌，应将稀释液涂布于一尿素为唯一氮源、含酚红的培养基上，尿素分解菌产生脲酶，分解尿素，是培养基呈碱性，从而导致菌落周围出现红色圈，脲酶产量越多、活性越高，红色圈越大，可根据红色圈的大小选择产酶的菌株。 （2）①根据PCR1和PCR3的长度可知，PCR1需要引物A和引物C，PCR3不需要引物，直接用PCR1和PCR2的产物互补后即可在Taq酶的催化下延伸得到PCR3。 ②研究定点突变是否提高脲酶的活性，可将含有定点突变脲酶基因的重组质粒和含有未突变脲酶基因的重组质粒分别导入大肠杆菌，提取相关大肠杆菌产生的脲酶，对比二者活性，以判断不同位点氨基酸改变对脲酶活性的影响。 46．（24-25高二下·北京朝阳·期末）全球气候变化导致极端高温天气频发，对粮食作物产量和品质造成严重影响。培育优质高产作物是育种者的目标。 (1)水稻体内淀粉等有机物含量决定产量，淀粉的合成场所是________。淀粉的合成受到光反应产生的________的影响。高温下敏感型水稻胚乳储存物质的稳态被破坏（蛋白质积累减少与淀粉积累增加），胚乳细胞中淀粉粒与蛋白体排列松散，形成垩白（品质劣化指标）。 (2)水稻品种分为粳稻和籼稻，高温会降低粳稻和籼稻的稻米品质，对粳稻品质的负面影响更显著。研究发现QT12、NF-YA8和NF-YC10是响应高温的相关基因，经过相关处理，研究结果如下表。 生物材料 垩白率 粳稻 高 QT12基因敲除粳稻 低 NF-YA8基因敲除粳稻 低 NF-YC10基因敲除粳稻 更高 ①由表可知，高温下QT12、NF-YA8和NF-YC10分别是影响水稻优良品质的______（填“负”或“正”）调控基因。 ②为了证明QT12和NF-YA8在响应高温通路中的位置关系，构建了NF-YA8基因敲除/QT12基因过表达杂交株系，图1证明_____位于_______的上游。 (3)粳稻和耐热籼稻QT12基因启动子序列存在差异，不同类型QT12基因结构如图2（QT12G；QT12基因启动子内部为G，QT12A时则为A）。 为研究高温下NF-YA8、NF-YC10蛋白与QT12基因的结合情况，研究者依据QT12基因启动子序列，制备了QT12G和QT12A探针，分别与相应蛋白混合，结果如图3。 ①分析泳道2、4、5、6可得_______（“NF-YA8”/“NF-YC10”）与_____（“QT12G”/“QT12A”）结合能力强。 ②泳道4、7、8的实验目的是_______。 (4)进一步研究证明高温会减弱NF-YA8蛋白和NF-YC10蛋白间的相互作用。综合以上信息，选择耐热籼稻或粳稻，完善该水稻响应高温的调节机制模型______。 (5)该研究对作物育种的启示是______。 【答案】(1) 叶绿体基质 ATP和NADPH (2) 负、负、正 NF-YA8 QT12 (3) NF-YA8 QT12G 探究NF-YA10对NF-YA8与QT12G结合程度的影响 (4) (5)通过基因编辑技术将粳稻QT12启动子G突变为A 【分析】基因是具有遗传效应的 DNA 片段，真核生物基因结构较为复杂，主要包括以下部分： （1）编码区：分为外显子和内含子。外显子：能编码蛋白质的序列，在转录后形成的前体 mRNA 经过加工（剪切内含子、连接外显子）后，外显子对应的序列会保留在成熟 mRNA 中，参与蛋白质的合成。内含子：不能编码蛋白质的序列，位于外显子之间，在转录后的加工过程中会被剪切掉，不参与蛋白质的合成。 （2）非编码区：位于编码区的上游和下游，虽然不直接编码蛋白质，但对基因的表达调控具有重要作用上游非编码区：包含启动子等调控序列，启动子是 RNA 聚合酶结合的位点，能启动基因的转录。此外，还有一些其他的调控元件，如增强子等，可增强基因的转录效率。下游非编码区：包含终止子，其功能是终止基因的转录。 【详解】（1）绿色植物通过光合作用在暗反应阶段生成淀粉等有机物，而暗反应阶段在叶绿体基质完成。淀粉合成依赖光反应产生的 ATP 和 NADPH，光反应通过水的光解和电子传递链生成 ATP 和 NADPH，为暗反应中C3的还原。 （2）①QT12 和 NF-YA8 为负调控基因：敲除这两个基因后，垩白率显著降低，说明它们在高温下促进垩白形成，抑制优质品质的维持。NF-YC10 为正调控基因：敲除 NF-YC10 后垩白率更高，表明其对优质品质起正向调控作用。 ②由图1可知NF-YA8基因敲除/QT12 过表达杂交株的垩白率恢复至野生型水平，而NF-YA8基因敲除株垩白率低，表明QT12基因的表达受NF-YA8基因的调控，因此NF-YA8位于QT12上游。 （3）①泳道 5（NF-YA10+QT12G探针）和泳道 6（QT12G 探针）形成对照，两泳道均为形成阻滞带，表明NF-YA10未与QT12G探针结合，泳道 2（NF-YA8+QT12A探针）和泳道 4（NF-YA8+QT12G 探针）形成对照，泳道 4形成的阻滞带较大，表明NF-YA8与QT12G 探针结合能力更强。 ②泳道 4（NF-YA8+QT12G 探针）、泳道 7（NF-YA8+NF-YA10-1x+QT12G 探针）和泳道 8（NF-YA8+YA10-2x+QT12G 探针）形成对照，自变量为NF-YA10蛋白的含量，可以探究NF-YA10对NF-YA8与QT12G结合程度的影响。 （4）耐热籼稻的 QT12 启动子为 A （QT12A），在高温条件下与 NF-YA8 结合能力弱，使得QT12 处于低表达状态，水稻胚乳储存物质处于稳态，垩白率低。粳稻的 QT12 启动子为 G （QT12G），在高温条件下与 NF-YA8 结合能力强，使得QT12 处于高表达状态，水稻胚乳储存物质的稳态被破坏（蛋白质积累减少与淀粉积累增加），胚乳细胞中淀粉粒与蛋白体排列松散，垩白率升高。 （5）耐热籼稻的 QT12 启动子为 A （QT12A），在高温条件下与 NF-YA8 结合能力弱，使得QT12 处于低表达状态，垩白率低，因此可通过基因编辑技术将粳稻QT12的启动子G突变为A。 47．（24-25高二下·北京平谷·期末）糖尿病人分泌胰岛素不足，通过体外注射胰岛素的方式治疗，但治疗存在成本高、冷链运输等问题。植物细胞壁的物理屏障能够抵抗消化酶的降解。因此研究者研究利用植物生产一种“口服胰岛素”，以期用于糖尿病的治疗。 (1)科研人员利用基因工程研制“口服胰岛素”，利用以下材料构建基因表达载体。 ①图甲所示结构为_______，其上的壮观霉素抗性基因作为_______，便于重组DNA分子的筛选。 ②利用PCR扩增目的基因（如图乙），应选用的引物组合为_______（选填图乙中的字母），为保证构建正确连接的基因表达载体，在引物中分别加入相应的限制酶的识别序列，请选择合适的限制酶，标记在答题卡图中的引物虚线位置。 ③构建成功的基因表达载体通过基因枪法导入莴苣细胞的叶绿体中，为实现胰岛素基因的高效表达，图甲中启动子最有可能选择_______。 A．人胰岛素基因的启动子 B．莴苣细胞叶绿体中特异性表达基因的启动子 (2)成功转化的莴苣细胞中仅含一个外源基因整合位点，通过_______技术获得TO代莴苣，TO代莴苣自交后，筛选外源基因纯合的T1代莴苣，检测其胰岛素基因的表达量，如下面表格所示。分析无壮观霉素抗性基因的T1代胰岛素蛋白高的原因：_______。 世代 胰岛素（mg/g干重） 有壮观素抗性基因的T0代 4.79 无壮观素抗性基因的T0代 8.58 无壮观素抗性基因的T1代 12.07 (3)为评估“口服胰岛素”的降血糖效果，研究人员给糖尿病小鼠和正常小鼠分别进行如下实验，结果如图丙。 该实验结果表明莴苣生产的口服胰岛素比注射胰岛素更具有优势，体现在_______。 【答案】(1) 质粒 标记基因 b、c B (2) 植物组织培养 去除壮观霉素抗性基因后，消除了其对胰岛素基因表达的影响（或消除了基因间相互作用对胰岛素基因表达的抑制 ） (3)降血糖的效果更显著、作用持续时间较长 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取，构建基因表达载体（含目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法、基因枪法等）；目的基因的检测和鉴定（分子水平、个体水平）。 【详解】（1） ①图甲所示结构为质粒，质粒是一种小型环状双链DNA分子，在基因工程中常作为载体，其上的壮观霉素抗性基因作为标记基因，标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选，含有重组质粒的受体细胞能够在含有壮观霉素的培养基上生长，而不含重组质粒的细胞不能生长。 ②PCR技术扩增目的基因时，引物应与模板链的3'端结合，且子链的延伸方向是5'到3'，所以应选用的引物组合为b、c。 ③构建成功的基因表达载体导入莴苣细胞的叶绿体中，为实现胰岛素基因的高效表达，应选择莴苣细胞叶绿体中特异性表达基因的启动子，因为人胰岛素基因的启动子在植物叶绿体中可能无法有效启动转录，而莴苣细胞叶绿体中特异性表达基因的启动子更适应叶绿体中的转录环境，B正确，A错误。 故选B。 （2）成功转化的莴苣细胞中仅含一个外源基因整合位点，通过植物组织培养技术，将含有外源基因的莴苣细胞培养成TO代莴苣，植物组织培养技术可以实现植物细胞的全能性，将单个细胞培养成完整的植株。无壮观霉素抗性基因的T1代胰岛素蛋白高，原因可能是去除了壮观霉素抗性基因后，消除了抗性基因对胰岛素基因表达的影响（或消除了基因间的相互作用对胰岛素基因表达的抑制 ），使得胰岛素基因能够更高效地表达。 （3）观察图丙可知，与注射胰岛素相比，口服胰岛素后：血糖下降的幅度较大，说明其降血糖的效果更显著，血糖下降后能在较长时间内保持相对稳定的水平，体现了其作用持续时间较长。 48．（24-25高二下·北京怀柔·期末）β—地中海贫血症是由β珠蛋白基因突变造成红细胞损伤而引起的疾病，近年来科研人员利用CRISPR/Cas9技术实现了对该致病基因的精确编辑，大大提高了基因治疗的精准性。该技术的原理如下图所示，请回答下列问题： 注：CRISPR/Cas9基因编辑系统包括来自于细菌的Cas9内切酶和人工设计改造的向导RNA两个部分。 (1)哺乳动物的红细胞来自于造血干细胞的_________，因此科研人员构建了β—地中海贫血症模型鼠后，取其造血干细胞作为基因编辑的受体细胞。 (2)进入受体细胞的向导RNA能与基因组DNA单链特定区域发生_________，Cas9内切酶则可在PAM序列（几乎存在于所有基因中）上游定点切断磷酸二酯键使DNA断裂，随后用导入的正常β珠蛋白基因片段完成对该基因的修复。 (3)研究表明基因编辑技术也可能引起基因组非靶点的突变，即脱靶。β珠蛋白突变基因的X片段（与靶点紧密连锁）是编辑过程中的常见脱靶位点之一。为确定脱靶现象是否发生，研究人员除对待修复靶点（Y片段）进行测序外，又设计实验对X片段进行测序，过程如图所示： 注：图中“↑”指向的位置为限制酶BglⅡ和MscⅠ的识别和切割的位点 ①将图示片段连接成环状，应选用限制酶______和DNA连接酶。 ②根据Y片段特定序列设计引物（图中的A、B、C、D），应选择引物组合A和D，用于扩增X片段。除扩增模板和引物以外，该反应体系中还应该加入4种足量的dNTP以及___________。 ③若上述实验扩增出的X片段与患病模型大鼠的X片段序列相同，Y片段与正常β珠蛋白基因序列_________（相同/不相同），则支持该靶点完成修复，未发生脱靶现象。 (4)基因编辑技术在生物学中还有很多应用，有人称之为“福音”，也有人称之为“魔鬼”，请对此谈谈你的看法：_________。 【答案】(1)分裂和分化 (2)碱基互补配对 (3) BglⅡ 热稳定DNA聚合酶 相同 (4)说明科学技术能促进人类社会和经济的发展，但也可能对人类的生存和发展带来消极后果，需要受到伦理和法律的约束。 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）哺乳动物红细胞来自造血干细胞的分裂和分化（细胞分化形成不同细胞类型，造血干细胞分化出红细胞）。 （2）向导RNA和基因组DNA单链互补，发生碱基互补配对（RNA和DNA单链之间通过碱基配对结合）。 （3）将片段连成环状，需要切割两端的BglⅡ位点（因为两端都是BglⅡ，这样切割后两端黏性末端互补，才能环化）。PCR反应除扩增模板和引物以外，该反应体系中还应该加入4种足量的dNTP以及热稳定DNA聚合酶。若未脱靶，Y片段（修复靶点）应该被修复成正常序列，所以Y片段与正常β珠蛋白基因序列相同。 （4）基因编辑技术是福音，可精准治疗遗传病等；也是魔鬼，存在脱靶、伦理争议等风险，需规范应用，说明科学技术能促进人类社会和经济的发展，但也可能对人类的生存和发展带来消极后果，需要受到伦理和法律的约束。 49．（24-25高二下·北京西城·期末）科研人员发现一种新的基因组编辑工具—桥接 RNA（bRNA）。bRNA 能够与供体序列和靶标序列特异性结合，在 IS 重组酶作用下，将供体 DNA 与靶标 DNA 重组（图 1）。 (1)bRNA 与供体序列和靶标序列特异性结合，遵循_______原则。 (2)研究者提出假设，bRNA 可与 IS 重组酶特异性结合。为验证假设，用不同浓度的特定序列 bRNA 与一定浓度的 IS 重组酶混合，检测与 bRNA 结合的重组酶的比例。对照组的 RNA 应为_______。 (3)在体外实验中，验证了利用 bRNA 进行 DNA 重组的条件。研究者根据靶标序列和供体序列设计引物（图 2）进行 PCR 扩增，以检验重组是否发生，应选择的引物组合有_______。 (4)为了进一步验证 bRNA 的功能，在大肠杆菌中建立了双质粒重组报告系统（图 3）。请在图 3 中正确位置补充画出 GFP 基因的启动子，使供体质粒与靶标质粒在发生重组时，可检测到 GFP 信号；不发生重组，则没有 GFP 信号。 【答案】(1)碱基互补配对 (2)与实验组RNA浓度相同、长度相同但序列随机的无关RNA (3)②⑦和③⑥ (4) 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：（1）检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；（2）检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）bRNA 与供体序列和靶标序列特异性结合均是通过碱基互补配对实现的，因此遵循碱基互补配对原则。 （2）实验目的是验证bRNA 可与 IS 重组酶特异性结合，自变量是不同种类的RNA，实验组设计为不同浓度的特定序列 bRNA 与一定浓度的 IS 重组酶混合，因此对照组的RNA应为与实验组RNA浓度相同、长度相同但序列随机的无关RNA。 （3）PCR扩增时，子链是从引物的3'开始的，若靶标序列在前，供体序列连接在后，则要检验重组是否发生，可以选择引物组合为②⑦；若供体序列在前，靶标序列连接在后，则要检验重组是否发生，可以选择引物组合为③⑥。 （4）本实验的目的是验证bRNA的功能，根据题意，只有发生重组时，才能检测到GFP信号，所以需要将GFP基因置于IS重组酶基因的下游，且启动子位于IS重组酶基因的上游，故图示如下： 50．（24-25高二下·北京东城·期末）青蒿素是治疗疟疾的天然产物，在青蒿分泌型腺毛（GSTs）中合成并储存。茉莉酸（JA）能够促进GSTs发育和青蒿素合成，转录因子M3在此过程中起重要作用。 (1)在构建M3基因过表达的青蒿植株中，需将M3与图1所示质粒连接，利用农杆菌转化法导入细胞，使用__________筛选T-DNA成功转入的青蒿细胞。 (2)同时构建了M3基因敲低的青蒿植株，图2结果说明M3在GSTs发育和青蒿素合成中发挥正调控作用，依据是_______________。为进一步得出“JA通过诱导M3基因表达调节GSTs发育和青蒿素合成”这一结论，还需要补充的证据是_________。 (3)研究人员推测“M3通过直接结合D1启动子来增强D1的转录，促进GSTs发育”。若要证明该推测，将图3所示质粒1和质粒2同时导入同一细胞，用______________反映转录因子对该启动子的作用效果。请在图3的①、②、③处填写相应的组成元件。 ①__________②__________③__________ (4)进一步研究发现“M3蛋白通过与H1蛋白相互作用，激活青蒿素合成相关基因的转录”。可利用LUC蛋白的N端（LUCn）和C端（LUCc）两个非活性片段研究蛋白质间的相互作用关系，将LUC蛋白分成LUCn和LUCc，与待测蛋白基因构建融合基因，当LUCn和LUCc组合成有活性的LUC能产生荧光。依据上述原理设计实验验证，需要构建__________两种融合基因导入同一种细胞，再进行后续研究。 (5)综合以上信息，请在答题卡上完善JA促进GSTs发育和青蒿素合成的机制模型_________。 【答案】(1)潮霉素 (2) 和野生型相比，M3过表达组GSTs密度和青蒿素含量均增加，而M3敲低组均降低 和野生型相比，JA处理野生型青蒿植株后M3基因的表达水平显著上升 (3) 萤火虫荧光素酶催化产生荧光亮度与海肾荧光素酶催化产生荧光亮度的比值 M3基因 D1启动子 p35S启动子 (4)LUCn-M3融合基因和H1-LUCc融合基因（或LUCn-H1融合基因和M3-LUCc融合基因） (5) 【分析】基因工程的基本操作程序： 1、目的基因的获取：获取目的基因的方法包括从基因文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因和人工合成目的基因。 2、基因表达载体的构建：基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，以及使目的基因能够表达和发挥作用而构建的。它通常包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等组件 3、将目的基因导入受体细胞：转化是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。导入方法取决于受体细胞的类型，例如，将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞等。 4、目的基因的检测与鉴定：目的基因的检测与鉴定是确认目的基因是否已经成功导入受体细胞，并且是否能够正常表达的关键步骤。这通常包括分子水平的检测（如DNA分子杂交、分子杂交和抗原—抗体杂交技术）以及个体生物学水平的鉴定（如生物抗虫或抗病的鉴定等）。 【详解】（1）农杆菌转化法中，Ti质粒的T-DNA可携带目的基因转移并整合到受体细胞染色体DNA上。由图1可知，该质粒的T-DNA中含有潮霉素抗性基因，所以使用潮霉素筛选T-DNA成功转入的青蒿细胞。因为只有成功转入含潮霉素抗性基因T-DNA的细胞才能在含潮霉素的培养基上存活。 （2）从图2可以看出，与野生型相比，M3敲低组的GSTs密度和青蒿素含量均低于野生型，而M3过表达组的GSTs密度和青蒿素含量均高于野生型。这表明M3基因表达量降低时，GSTs发育和青蒿素合成受到抑制；M3基因表达量升高时，GSTs发育和青蒿素合成增强，所以说明M3在GSTs发育和青蒿素合成中发挥正调控作用。要得出“JA通过诱导M3基因表达调节GSTs发育和青蒿素合成”这一结论，需要补充的证据是检测不同浓度JA处理下野生型青蒿中M3基因的表达量，并且要检测在敲低M3基因的青蒿植株中添加JA后，GSTs发育和青蒿素合成是否仍然受影响。若和野生型相比，JA处理野生型青蒿植株后M3基因的表达水平显著上升，则可进一步支持该结论。 （3）要证明“M3通过直接结合D1启动子来增强D1的转录，促进GSTs发育”这一推测，将质粒1和质粒2同时导入同一细胞，因为LUC基因表达萤火虫荧光素酶，其表达产物可催化底物发出荧光，所以萤火虫荧光素酶催化产生荧光亮度与海肾荧光素酶催化产生荧光亮度的比值反映转录因子对该启动子的作用效果。①对于质粒1，由于要研究M3对D1启动子的作用，所以①处应填M3基因。这样当M3存在时，可以作用于D1启动子，进而影响后续相关过程。对于质粒2，②处应填D1启动子，目的是让LUC基因在D1启动子的调控下表达，通过LUC基因表达情况来反映D1启动子的转录情况；③处应填p35S启动子，作为内参启动子，保证实验体系稳定，驱动REN基因表达，排除实验干扰。 （4）要验证“M3与H1相互作用激活转录”，利用LUC蛋白片段互补实验：需构建 M3−LUCn、H1−LUCc 两种融合基因。导入细胞后，若M3与H1互作，LUCn和LUCc会靠近形成有活性的LUC，产生荧光，以此证明两者相互作用 。 （5）JA促进 GSTs 发育和青蒿素合成的机制模型为：JA可能通过某种信号途径诱导M3蛋白表达，M3蛋白一方面直接结合D1启动子，增强D1的转录，促进GSTs发育；另一方面 M3 蛋白与H1蛋白相互作用，激活青蒿素合成相关基因的转录，进而促进青蒿素合成。模型如图所示：。 地 城 考点03 蛋白质工程 1．（24-25高二下·北京丰台·期末）干扰素在体外保存相当困难。利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸替换成丝氨酸后，干扰素可以在-70℃的条件下保存半年，相关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程只能生产出自然界中已存在的蛋白质 B．替换氨基酸改造干扰素时利用的原理是基因突变 C．该替换研究中直接操作对象是多肽链上的氨基酸 D．替换后的干扰素仍能抗病毒，说明其结构未改变 【答案】B 【详解】A、蛋白质工程通过改造基因来合成自然界不存在的蛋白质，而传统基因工程只能生产已有蛋白质，A错误； B、替换氨基酸需通过修改基因序列实现，属于人工诱导的基因突变，B正确； C、蛋白质工程直接操作对象是基因，而非多肽链上的氨基酸，C错误； D、替换氨基酸导致干扰素结构改变，但关键功能区域未受影响，故仍能抗病毒，D错误。 故选B。 2．（24-25高二下·北京平谷·期末）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物等历程。有关叙述错误的是（    ） A．动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞 B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C．利用蛋白质工程可直接对胰岛素蛋白进行改造，以满足人类需求 D．高温能破坏胰岛素类似物的空间结构，使其失去相应的功能 【答案】C 【分析】胰岛素是由胰脏内的胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。 【详解】A、胰岛素属于分泌蛋白，由胰岛B细胞的核糖体合成，经内质网、高尔基体加工后通过胞吐释放，A正确； B、胰岛素的化学本质是蛋白质，其基本原料是氨基酸，B正确； C、蛋白质工程通过改造或合成基因来间接改造蛋白质，而非直接对蛋白质进行修饰，C错误； D、高温会破坏胰岛素类似物的空间结构（如二硫键断裂），导致其功能丧失，D正确。 故选C。 3．（24-25高二下·北京·期末）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定性强的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述不正确的是（　　） A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．对N0的改造应该首先设计N1基因中的脱氧核苷酸序列 C．加入该连接肽需要通过改造N0基因实现 D．N1是自然界中不曾存在的新型蛋白质 【答案】B 【分析】蛋白质工程：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、N₁与N₀的氨基酸序列差异会导致空间结构改变，从而影响热稳定性，A正确； B、蛋白质工程需先设计目标蛋白结构，再推导相应基因的脱氧核苷酸序列，B错误； C、连接肽的加入需通过基因改造实现，即修改N0基因以插入连接肽的编码序列。改造后的基因经转录和翻译才能合成N1。因此，加入连接肽必须通过改造N0基因实现，C正确； D、N₁通过人为设计基因序列合成，自然界中不存在，D正确。 故选B。 4．（24-25高二下·北京房山·期末）胰岛素B链的第28位氨基酸替换为天冬氨酸时会抑制胰岛素聚合，从而获得速效胰岛素类似物。欲利用生物技术获得该物质，则直接操作的对象应为（　　） A．胰岛素的氨基酸序列 B．胰岛素基因 C．第28位的氨基酸 D．胰岛素蛋白 【答案】B 【详解】A、直接修改胰岛素的氨基酸序列在技术上不可行，因为蛋白质的氨基酸序列由基因控制，无法直接操作已合成的蛋白质，A错误； B、蛋白质工程的核心是改造基因，通过改变胰岛素基因的碱基序列，使表达产物发生相应改变，B正确； C、直接替换第28位的氨基酸无法实现，因生物体内无法直接修改已合成的蛋白质中的特定氨基酸，C错误； D、直接操作胰岛素蛋白无法改变其结构，且无法遗传到后代，D错误。 故选B。 5．（24-25高二下·北京昌平·期末）大肠杆菌表达异源的L-氨基酸脱氨酶（LAAD）可催化L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸，但产生的苯丙酮酸浓度较低，无法满足工业生产的要求。对LAAD进行改造，从而提高它的催化能力。相关叙述不正确的是（　　） A．LAAD在大肠杆菌核糖体合成 B．改造LAAD须分析其三维结构 C．改造LAAD不用考虑密码子简并性 D．改造LAAD的过程属于蛋白质工程 【答案】C 【分析】蛋白质工程的基本流程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、LAAD化学本质是蛋白质，蛋白质的合成场所是核糖体，大肠杆菌是原核生物，有核糖体，A正确； B、蛋白质的功能依赖其三维结构，改造LAAD需分析其结构以确定修饰位点，B正确； C、密码子简并性指不同密码子编码同一种氨基酸，若改造LAAD需改变氨基酸序列，则需调整对应密码子；若仅优化表达效率，需选择宿主偏好的密码子，因此需考虑简并性，C错误； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。依题意，要提高LAAD的催化能力，需对其结构进行改造，对其进行改造的过程就属于蛋白质工程，D正确。 故选C。 6．（24-25高二下·北京西城·期末）L-天冬酰胺酶是治疗儿童白血病的有效药物，但在临床应用中常引起过敏反应。通过蛋白质工程，将细菌来源的L-天冬酰胺酶某位置赖氨酸更换为丙氨酸后，免疫原性下降2．5倍。此过程中不需要（　　） A．依据预期功能设计L-天冬酰胺酶的高级结构 B．推测预期的L-天冬酰胺酶应有的氨基酸序列 C．改造编码L-天冬酰胺酶的野生型基因或合成新基因 D．直接对L-天冬酰胺酶进行操作以替换相应氨基酸 【答案】D 【详解】蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。 【分析】A．蛋白质工程需先根据预期功能设计目标蛋白的高级结构，因为结构决定功能，A错误； B．设计高级结构后，需推测对应的氨基酸序列以确定如何修改基因，B错误； C．根据新氨基酸序列需改造或合成新基因，通过基因表达获得目标蛋白，C错误； D．蛋白质工程通过基因修饰间接改变蛋白质，直接操作蛋白质无法遗传且技术难度大，因此D描述的步骤不需要，D正确； 故选D。 7．（23-24高二下·北京丰台·期末）近年来，人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，不仅攻克了长期存在的蛋白质结构预测问题，还成功设计了多种新型功能蛋白，为多个领域带来了潜在的生物活性分子。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程需要改造蛋白质分子的所有氨基酸序列 B．蛋白质工程的目标是改造现有蛋白质或创造新蛋白质 C．AI在蛋白质工程中的应用说明不再需要基因工程水平的操作 D．AI设计的蛋白质功能必然超过自然界中发现的任何蛋白质 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，A错误； B、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，B正确； C、人工智能（AI）技术在蛋白质工程领域的应用取得了显著成果，但蛋白质工程的操作最终还必须通过改造或合成基因来完成，仍然需要基因工程水平的操作，C错误； D、AI设计的蛋白质功能不一定超过自然界中发现的蛋白质，D错误。 故选B。 8．（23-24高二下·北京昌平·期末）绿色荧光蛋白之所以发出绿色荧光，是因为该蛋白中有“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”构成的绿色发光基团。以下分析不合理的是（　　） A．荧光蛋白的荧光特性与氨基酸序列有关 B．荧光蛋白可作为标记信号，用于癌细胞转移的研究 C．高温能破坏荧光蛋白的空间结构，使其失去发光特性 D．蛋白质工程可直接对荧光蛋白进行改造，以满足人类需求 【答案】D 【分析】蛋白质的基本单位是氨基酸，蛋白质的结构多样性取决于氨基酸种类、数量、排列顺序以及蛋白质的空间结构。蛋白质的结构决定蛋白质的功能。高温、强酸、强碱会使蛋白质的空间结构改变，这种改变是不可逆的。 【详解】A、蛋白中有“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”构成的绿色发光基团，说明荧光蛋白的荧光特性与氨基酸序列有关，A正确； B、荧光蛋白可作为标记信号，通过观察荧光可判断癌细胞的转移情况，B正确； C、高温能破坏荧光蛋白的空间结构，从而使蛋白质失去发光特性，C正确； D、蛋白质工程改造的控制蛋白质合成的基因，D错误。 故选D。 9．（23-24高二下·北京海淀·期末）转基因技术蓬勃发展，社会高度关注转基因技术带来的安全与伦理问题。下列相关叙述，正确的是（    ） A．为避免转基因植物造成基因污染，防止目的基因随花粉扩散 B．近年市面出现的彩椒、紫薯、高甜度南瓜均为转基因商品 C．转基因抗虫棉具有抗棉铃虫的特性，种植后可一直保持抗性 D．转基因技术产品去除目的基因后，属于蛋白质工程的产品 【答案】A 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 【详解】A、 基因污染指对原生物种基因库非预期或不受控制的基因流动。 如转基因植物中的目的基因可能随花粉扩散，造成基因污染，A正确； B、近年市面出现的彩椒、紫薯、高甜度南瓜是航天育种的结果，B错误； C、虽然转基因抗虫棉具有抗棉铃虫的特性，但由于导入的抗虫基因的数目和位置不定，所以种植后可能出现性状分离，不能一直保持抗性，C错误； D、蛋白质工程是通过 物理、化学、生物 和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质， 转基因技术产品去除目的基因后，没有合成新蛋白，不属于蛋白质工程的产品，D错误。 故选A。 10．（23-24高二下·北京大兴·期末）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，天然的Y 通常需要在低温下保存，若将Y 的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙，可提高其热稳定性。下列说法错误的是（    ） A．蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的需求，对其结构进行设计改造 B．蛋白质工程技术中的操作对象是蛋白质或控制蛋白质合成的基因 C．若要获得编码Y 的基因，可从人的T细胞中提取 RNA，逆转录合成DNA D．经改造后的蛋白质 Y 的热稳定性提高这一性状可遗传 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及与其生理功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，以满足人类生产和生活的需求，A正确； B、蛋白质工程技术中的操作对象是基因，B错误； C、由于人的T细胞可以合成Y蛋白，故可以从人的T细胞中提取mRNA，经过逆转录合成cDNA，来获取目的基因，C正确； D、经改造后的蛋白质Y的热稳定性提高这一性状可遗传，因为本质上改造的是基因，D正确。 故选B。 11．（23-24高二下·北京东城·期末）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因为材料进行设计和改造，获得了能发黄色荧光的蛋白（YFP），与 GFP 相比，YFP 第 203位苏氨酸变为酪氨酸。下列叙述不正确的是（　　） A．获得 YFP 的技术称为蛋白质工程 B．上述技术的操作对象为相关基因 C．根据氨基酸序列推测的 YFP 基因序列可能不唯一 D．获得 YFP 无需经过转录和翻译的过程 【答案】D 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。蛋白质工程的操作对象是基因，因而被称为第二代基因工程。 【详解】A、科研人员以GFP 基因为材料进行设计和改造，获得了能发黄色荧光的蛋白，该技术称为蛋白质工程，A正确； B、上述技术涉及到蛋白质工程，其操作对象为相关基因，即需要对相关基因进行修饰和合成，B正确； C、由于密码子具有简并性，因此，根据氨基酸序列推测的 YFP 基因序列可能不唯一，C正确； D、基因表达过程包括转录和翻译两个步骤，YFP的化学本质是蛋白质，其合成过成需要经过转录和翻译两个步骤，D错误。 故选D。 12．（23-24高二下·北京西城·期末）我国科学家将ATP受体与cpEGFP（改造后的绿色荧光蛋白）进行融合，成功开发出监测动物体内ATP动态变化的传感器，其工作原理如图所示。下列说法错误的是（　　） A．ATP传感器的构建是通过蛋白质工程实现的 B．受体与ATP结合后构象改变，发出绿色荧光 C．ATP传感器对ATP的结构类似物应无反应 D．ATP与传感器上受体的结合应是不可逆的 【答案】D 【分析】分析题图可知，ATP受体与cpEGFP融合后与ATP结合，cpEGFP发出绿色荧光，可据此监测动物体内ATP动态变化。 【详解】A、将ATP受体与cpEGFP（改造后的绿色荧光蛋白）进行融合，该过程依赖蛋白质工程技术，需要通过设计相应的氨基酸序列来改造相关基因，A正确； B、由题图可知，ATP与ATP受体结合后构象改变，与之融合的cpEGFP发出绿色荧光，B正确； C、ATP传感器能监测动物体内ATP动态变化，与受体的特异性有关，故对ATP的结构类似物应无反应，C正确； D、ATP传感器监测动物体内ATP动态变化，说明ATP与传感器上受体的结合应是可逆的，D错误。 故选D。 13．（24-25高二下·北京顺义·期末）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 蛋白质工程——从“海选”到“设计” 从生物体内分离得到的天然酶，在工业生产中催化效率较低。为提高酶功能，科学家通过一定程度上模拟自然选择过程，经多次循环筛选实现对蛋白质功能的改进。第一次循环的操作流程如图1。 随着蛋白质工程的发展，目前可依据蛋白质作用机制与结构信息，改变一种或多种氨基酸，对蛋白质进行“设计”。据此，为增强P酶催化活性，我国科学家将P酶与PY（无催化活性的P祖先蛋白）进行序列比较，发现P酶与底物结合及反应区域的48个氨基酸中有16个是不同的。将PY的16个氨基酸替换，使之与P酶一致，获得的PY突变体（PY-16）具有与P酶相同的催化活性。为确定决定P酶催化活性的关键氨基酸，通过回复突变实验（将PY-16催化结构域中的16个氨基酸分别恢复到与PY相同）评估其突变效应，结果如图2。 科学家进一步根据突变效应的顺序，逐步向PY中添加单个突变，直至累积5个突变的PY-5才检测出与P酶相同的催化活性。通过分析PY-5与底物的结构，提出图3所示的“三点固定”模型解释催化机制。基于该模型利用AI设计出6万多种全新的P酶序列，经筛选发现其中有6种活性比天然P酶高1.3~3.5倍。 (1)基因工程原则上只能生产______的蛋白质，而蛋白质工程通过______基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)关于通过“定向进化”改进酶活性的过程，理解有误的是______。 A．①过程可使用低保真DNA聚合酶 B．①过程产生的基因突变是定向的 C．④过程筛选突变酶依赖于抗生素 D．经①②③④过程即可获得目的基因 (3)请将下列各项排序，以呈现文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路。 ①比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点 ②排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用 ③基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体 ④结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制 对比PY-16与其回复突变结果→______→______→______→______。 (4)天冬氨酸激酶是工业生产赖氨酸的关键酶，但其活性受到赖氨酸抑制。研究表明天冬氨酸激酶存在与赖氨酸结合的调节结构域，基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路______。 【答案】(1) 自然界中已存在的 改造或合成 (2)BCD (3) ② ① ④ ③ (4)研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性 【分析】1、基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，但只能生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达形状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 2、蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】（1）基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 （2）A、①过程是利用易错PCR，可使用低保真DNA聚合酶，提高扩增体系碱基发生错配的概率，A正确； B、①过程产生的基因突变是不定向的，B错误； C、④过程是酶活性的鉴定与筛选，可利用酶对底物的分解能力进行筛选，不必使用抗生素，C错误； D、经①②③④过程只能获得催化效率较高的酶，不能获得目的基因，D错误。 故选BCD。 （3）文中科学家通过“理性设计”改造P酶的研究思路为：对比PY-16与其回复突变结果；排除G111、N119、F251和V307对P酶活性的关键作用；比对PY-16和PY-12回复突变效应，确定核心催化位点；结构解析T114、F123与M248决定P酶活性的催化机制；基于模型设计新序列，筛选高催化活性的酶突变体，因此，排序为：对比PY-16与其回复突变结果→②→①→④→③。 （4）基于“理性设计”原则提出改造天冬氨酸激酶以提高赖氨酸产量的思路为：研究赖氨酸与天冬氨酸激酶调节结构域的关键氨基酸，设计天冬氨酸激酶调节结构域的氨基酸序列，改变相对应的核苷酸序列，从而改变该酶的空间结构，使其不再与赖氨酸结合；同时不影响催化结构域的结构和活性。 14．（22-23高二下·北京石景山·期末）水蛭的唾液腺可分泌水蛭蛋白，其重要成分为水蛭素，有良好的抗凝血作用。天然水蛭素活性低，科学家拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。 (1)蛋白质工程流程如图1所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质a可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中常利用PCR获取和扩增目的基因。PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种脱氧核苷酸、_______、_______及缓冲液，子链延伸的方向为_______。 (3)研究者将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图2、3所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的_______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是_______。 (4)若将改造后的水蛭素基因导入大肠杆菌，可应用_______技术检测，若出现了杂交带，则说明水蛭素基因完成了转录。进一步检测从大肠杆菌中获得的水蛭素，发现其抗凝血活性并不理想，请分析最可能的原因。_______ 【答案】(1) mRNA 多肽链 密码子的简并性 (2) 引物 Taq酶 从5’端到3’端 (3) 种类 处理水蛭蛋白的酶种类及时间不同，导致水蛭蛋白空间结构发生不同程度改变 (4) DNA-RNA分子杂交 水蛭素是一种分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工与修饰，而大肠杆菌为原核细胞，没有内质网和高尔基体，无法对水蛭素肽链进行加工与修饰，导致水蛭素结构异常，抗凝血活性低 【分析】蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。 【详解】（1）根据蛋白质工程的基本流程，b是氨基酸序列多肽链，a是mRNA。由于不同密码子可能对应同一种氨基酸（即密码子的简并性），因此物质a（mRNA）可能不同，但合成的蛋白质空间构象却相同。 （2）PCR扩增时，反应体系中需要加入模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）及缓冲液。引物的作用是使Taq酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，故子链延伸的方向是从子链的5’端到3’端。　　　　　　　 （3）分析曲线图可知，酶甲、酶乙处理，水解产物中的肽含量都随着酶解时间的延长而逐渐升高，且两种酶作用下差别不大；经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先升高而后保持相对稳定；经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升而后有所下降，且酶甲处理后的产物的抗凝血活性最终高于酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性。据此推测两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是对水蛭蛋白进行酶解时的酶的种类及反应时间不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。 （4）从分子水平检测水蛭素基因是否完成了转录，可通过DNA-RNA分子杂交的方法，若出现了杂交带，则说明水蛭素基因完成了转录。水蛭素是一种分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工与修饰，而大肠杆菌为原核细胞，没有内质网和高尔基体，无法对水蛭素肽链进行加工与修饰，导致水蛭素结构异常，抗凝血活性低，因此可能出现从大肠杆菌中获得的水蛭素其抗凝血活性并不理想。 15．（24-25高二下·北京·期末）学习以下材料，回答（1）～（3）题。 “双特异性抗体”——单克隆抗体的迭代 利用动物细胞工程技术制造的单克隆抗体在医药领域占有非常重要的地位，近年来已成为多种炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的治疗药物。抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合（见图）。 为进一步提高单克隆抗体的治疗效果，研究者在传统单抗的基础上进行了迭代，制备出了双特异性抗体（BsAb）。BsAb有独特的抗原结合片段，可以与2个不同抗原或同一抗原的2个不同抗原表位相结合。科研人员已经研究了多种制备BsAb的方法，其中一种方法的大致流程是：将2种不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞，然后通过筛选并进行克隆，用以生产BsAb。双杂交瘤细胞的遗传背景来源于两种杂交瘤细胞，可产生2种抗体中的2种H链和2种L链，这些H链、L链的随机组合配对可产生人们所需的BsAb。 与传统的单克隆抗体相比，BsAb的特异性更强，能够更加准确靶向，从而降低脱靶带来的不良反应。更重要的是，BsAb所具备的“双靶点”机制，拓展了治疗维度，提高了治疗效果，展现出其独特的优势。 (1)单克隆抗体制备中涉及的动物细胞融合与动物细胞培养技术对应的原理分别是_______。 (2)已知表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜蛋白，在癌细胞中表达量高；CD3是T细胞表面蛋白，CD3抗体与其结合后可激活信号通路，促进T细胞的免疫效力。 ①结合文中信息，画出既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的示意图。_______（注：EGFR抗体的链用H1、L1表示，CD3抗体的链用H2、L2表示） ②下图为BsAb的制备流程，其中a～c对应的细胞分别是_______。 在上述流程中，“筛选Ⅲ”_______(填“可以”或“不可以”)利用“筛选Ⅰ”中的选择培养基，原因是_______。 ③制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为_______。 (3)请结合文中信息与所学知识，提出制备既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的另一种方法，写出大致思路。______________。 【答案】(1)细胞膜的流动性、细胞增殖 (2) 骨髓瘤、分泌EGFR抗体的杂交瘤、分泌CD3抗体的杂交瘤 不可以 无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活 可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞 (3)利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使其能够分别结合EGFR与CD3。 【分析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】（1）动物细胞融合依据细胞膜具有流动性；动物细胞培养是为了让细胞增殖，获得大量细胞或细胞产物。 （2）抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合，既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的抗体因由EGFR抗体一条链和CD3抗体的一条链用组成，其示意图为： 分别用EGFR蛋白和CD3蛋白进行免疫小鼠，已免疫的小鼠分离出B淋巴细胞与a细胞（骨髓瘤细胞）进行融合，分别获得能分泌EGFR抗体的杂交瘤和分泌CD3抗体的杂交瘤；筛选Ⅰ为选择培养基筛出杂交瘤细胞，筛选Ⅲ是为了筛出，既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的特定融合的杂交瘤细胞，而且无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活。制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞。 （3）可利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使得既有既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的区域。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $