专题03 动物细胞工程（期末真题汇编，北京专用）高二生物下学期

**基本信息** 聚焦动物细胞工程三大核心考点，精选北京多区期末及模拟试题，以细胞培养肉、单克隆抗体药物等前沿情境为载体，突出科学思维与实验探究能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|约40题|动物细胞培养（如细胞培养肉制备条件）、单克隆抗体制备（如M病毒抗体筛选）、细胞核移植（如克隆猴技术流程）|以科技前沿情境（如双特异性抗体、iPS细胞）创设问题，考查基础操作（如CO₂作用）与原理分析（如接触抑制机制）| |非选择题|约20题|跨考点综合（如外泌体抗衰老实验设计、单抗药物制备流程）|注重实验探究（如第36题双抗作用机制验证）与图表分析（如细胞生长曲线解读），贴合高考命题趋势|

专题03 动物细胞工程 3大高频考点概览 考点01 动物细胞培养 考点02 单克隆抗体制备 考点03 细胞核移植 地 城 考点01 动物细胞培养 1．（24-25高二下·北京丰台·期末）科学家通过体外培养鸡的干细胞，得到100%细胞培养肉，在色香味以及营养角度与传统鸡肉相差无几。相关叙述错误的是（    ） A．需要先使用胰蛋白酶等处理干细胞 B．后期需诱导干细胞分化成肌肉细胞 C．需置于95%O2+5%CO2混合气体环境 D．未来可根据个人口感或需求实现定制肉 2．（24-25高二下·北京房山·期末）甲流试纸中的一种特异性抗体是针对甲流病毒核蛋白（NP）的抗体。下列关于该单克隆抗体制备过程的叙述，正确的是（　　） A．需利用100%O2培养箱培养细胞 B．需要制备导入NP基因的小鼠 C．筛选过程利用了抗原－抗体结合的原理 D．筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞 3．（24-25高二下·北京丰台·期末）某次动物细胞培养时，调控pH的CO₂耗尽，培养基由初始的淡红色转为黄色。据此推测，使培养基呈淡红色的是（    ） A．酸碱指示剂 B．氨基酸 C．血清 D．糖类 4．（24-25高二下·北京海淀·期末）关于动物细胞培养，下列叙述正确的是（　　） A．获得的动物组织需用胃蛋白酶分散细胞 B．所培养的细胞一般悬浮生长或贴壁生长 C．培养期间需通入5%的CO2以刺激细胞呼吸 D．培养过程中需密闭培养瓶以保证无菌环境 5．（24-25高二下·北京·期末）MDCK细胞是从犬肾脏组织中分离培育建立的细胞系，MDCK细胞对流感病毒易感。下列关于利用悬浮培养技术培养MDCK细胞的相关叙述，不正确的是（　　） A．悬浮培养MDCK细胞可有效避免贴壁生长与接触抑制现象 B．培养MDCK细胞时，需要为其创造95%空气和5%CO2的气体环境 C．培养MDCK细胞时，为减少杂菌污染需定期更换培养液 D．MDCK细胞可用于流感病毒的扩增及特性等研究 6．（24-25高二下·北京怀柔·期末）下列关于动植物细胞融合的叙述不正确的是（　　） A．融合过程都需要无菌操作 B．融合前都需要制备原生质体 C．都体现了细胞膜的流动性 D．都可以使远缘杂交成为可能 7．（24-25高二下·北京西城·期末）将适应贴壁培养的aMDCK细胞进行驯化，获得适应悬浮培养的sMDCK细胞。相同条件下两种细胞的生长差异如图，对其分析错误的是（　　） A．aMDCK细胞的生长不受接触抑制的影响 B．168h后sMDCK细胞密度下降可能与营养不足、有害代谢产物积累有关 C．sMDCK细胞更有可能实现高密度培养 D．驯化可能改变了MDCK细胞的基因表达 8．（24-25高二下·北京东城·期末）细胞悬浮培养是将细胞接种于液体培养基中并保持良好分散状态的培养方式，广泛应用于生物制药、细胞生物学研究等领域。下列相关叙述错误的是（    ） A．悬浮培养可增加细胞与培养液的接触，促进营养物质吸收 B．若培养密度过大，会出现有害代谢产物积累使分裂受阻 C．对动物细胞进行悬浮培养时通常不会发生接触抑制现象 D．对动物细胞进行悬浮培养不需传代，适合规模化培养 9．（2024·北京海淀·二模）研究者将M病毒膜蛋白注射小鼠，分离小鼠脾细胞并将其与S细胞融合，通过筛选获得单个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。下列相关叙述正确的是（    ） A．用完全培养液培养M病毒，通过离心可获得膜蛋白作为抗原 B．可用M病毒膜蛋白多次免疫小鼠，以获得更多的浆细胞 C．S细胞应具备产生抗体和无限增殖的能力 D．体外培养单个杂交瘤细胞获得大量抗体体现了细胞的全能性 10．（23-24高二下·北京朝阳·期末）我国科研工作者运用生物打印技术将肌腱干细胞和骨髓间充质干细胞以分层方式分布在支架中，制备了下图所示的可用于肌腱与骨组织界面再生的多细胞支架。相关叙述正确的是（    ） A．同一个体的肌腱细胞与骨细胞的形态、结构和功能差异是基因选择性缺失的结果 B．肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞能自我更新和分化为成年动物体内的任何一种细胞 C．体外培养两种干细胞均需要无菌无毒、36.5℃左右、pH7.2～7.4和适宜渗透压条件 D．利用多细胞支架治疗肌腱断裂可保证异体来源的细胞移植不引起免疫排斥 11．（23-24高二下·北京大兴·期末）人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞培养。下列有关动物细胞培养的叙述错误的是（    ） A．动物细胞培养的环境需要O₂，也需要一定浓度的CO₂ B．动物细胞培养是动物细胞工程的基础，培养时需保证无菌、无毒的环境 C．培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 D．动物细胞培养的原理是动物细胞的全能性 12．（23-24高二下·北京东城·期末）为缓解饲养动物带来的环境、经济压力，与传统肉类感官特性相似的“细胞培养肉”引发人们关注。其生产流程如下图，以下叙述不正确的是（　　） A．技术应用了干细胞能分化成其他类型细胞的原理 B．体外培养干细胞时需置于 CO2培养箱以促进细胞呼吸 C．生物反应器扩大生产时培养基需加入动物血清等物质 D．细胞培养肉进入市场销售前还需进行安全性评估 13．（23-24高二下·北京东城·期末）动物细胞培养和植物组织培养技术都是细胞工程的基础性技术，两种技术都（　　） A．能实现大量获得细胞产物 B．以细胞的全能性为技术原理 C．需要使用液体培养基 D．使用酶将组织分散为细胞 14．（23-24高二下·北京西城·期末）动物细胞培养分为贴壁培养和悬浮培养。科学家尝试驯化贴壁依赖性细胞——犬肾脏细胞（MDCK），使其能悬浮培养，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A．贴壁细胞在生长增殖时会出现接触抑制现象 B．细胞活率反映驯化过程中MDCK的适应程度 C．MDCK先适应悬浮培养环境再开始大量增殖 D．悬浮培养不需进行传代，适合规模化培养 15．（22-23高二下·北京海淀·期末）敲除大鼠心肌细胞H的T基因，对照组与敲除组的H细胞在培养瓶中贴壁生长，检测两组细胞的数量变化，结果如图所示。下列相关叙述不合理的是（    ） A．体外培养H细胞需要添加动物血清 B．可用胰蛋白酶处理H细胞便于计数 C．敲除T基因的H细胞失去了分裂能力 D．提高T基因表达可能促进心脏损伤修复 16．（22-23高二下·北京石景山·期末）下图为幼鼠肾脏上皮细胞培养过程示意图，已知肾脏上皮细胞属于需要贴附于某些基质表面才能生长增殖的细胞。下列叙述不正确的是 （    ） A．甲→乙过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 B．丙过程会出现细胞贴壁和接触抑制现象 C．丙、丁过程均要在无菌、无毒的环境下进行 D．丁过程为传代培养，细胞都能进行无限增殖 17．（23-24高二下·北京西城·期末）临床常采用化疗方法治疗癌症。化疗药物通过影响DNA合成、损伤DNA等方式杀伤肿瘤细胞，长期使用易导致肿瘤细胞产生耐药性。科研人员以消化道恶性肿瘤——结直肠癌（CRC）组织为材料，期望通过分析耐药机制找到新的治疗靶点。 (1)从CRC病人体内取出肿瘤组织，用___酶处理得到单个细胞进行体外培养。细胞分离和培养均需在___环境下进行。 (2)通过多次给CRC细胞施加化疗药物5-FU，得到耐药性癌细胞（DR），检测发现DR中LGR4蛋白表达量显著高于CRC细胞。为探究LGR4的作用，研究者用LGR4正常表达和低表达的CRC细胞进行相关实验，检测DNA损伤程度，结果如图1。实验结果表明LGR4参与耐药性的形成，判断的依据是___。 (3)LGR4是细胞膜上的受体蛋白，被激活后可调控细胞增殖、分化相关信号通路。研究者尝试制备LGR4抗体作为治疗耐药性的药物。 ①向小鼠体内注射___对其进行免疫，之后取___细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过系列筛选获得杂交瘤细胞，生产高亲和力的抗体。 ②在化疗的基础上，将上述抗体应用于DR的抗药性治疗，请在图2中补全实验分组的处理并图示预期结果___（用“+”或“-”表示添加或不添加）。 (4)进一步研究表明，LGR4被激活后会促进S基因的转录，S基因表达产物是细胞死亡的抑制因子。综合上述结果和信息，分析施加LGR4抗体缓解耐药性的分子机制___。 18．（22-23高二下·北京东城·期末）乙肝由乙型肝炎病毒（HBV）引起。我国科学家由于在此领域做出重要贡献而获得了布隆伯格奖。 (1)HBV由一层包膜和一个含DNA分子的核衣壳组成，包膜上pre-SI区域是病毒进入细胞的关键结构。HBV能感染的动物只有人、猩猩和树鼩，且只能侵染肝细胞，原因是_____。 (2)将树鼩肝脏细胞剪碎后经_____处理进行体外培养，加入_____肽段后经检测确定细胞膜上与该肽段特异性结合的是NTCP蛋白。 (3)人的NTCP也可与该肽段特异性结合。为验证NTCP在肝细胞感染HBV中的作用，设计一种能与NTCP的mRNA互补结合的siRNA，加入可被HBV侵染的人HepaRG细胞中（如图1），先后检测HBV侵染前细胞中NTCP mRNA量、HBV侵染细胞一段时间后HBV的RNA量，结果如图2。 ①加入siRNA的目的是_____。甲组（对照组）细胞中加入的是等量_____。 ②实验表明NTCP是肝细胞感染HBV的关键受体，判断依据是_____。 (4)为进一步验证上述结论，利用不易被HBV感染的HepG2细胞进行实验（如图3）。 ①表中a、b处分别为_____。 组别 实验材料 实验处理 导入受体细胞的质粒 抑制HBV感染的药物 1 HepG2细胞 空质粒 b 2 a 不加入 3 加入 ②实验处理后分别在第4、10天检测病毒含量的相对值（如图4），结果支持（3）结论。请在图4中画出处理后10天的柱状图_____。 19．（24-25高二下·北京顺义·期末）细胞在衰老过程中会逐渐退出细胞周期。科学家以小鼠为材料，研究胚胎干细胞产生的外泌体（HE）对细胞衰老的影响，为缓解与衰老相关的疾病提供了新的治疗策略。 (1)体外培养小鼠细胞时，需用胰蛋白酶处理组织块，目的是获得______。处理后的初次培养称为______，分瓶后的细胞逐渐丧失分裂能力，走向衰老。 (2)科研人员用胚胎干细胞分泌的HE处理培养至50代的细胞，检测细胞衰老标志物SA-β和S期（DNA复制）细胞的比例，结果如图。 实验结果表明______。 (3)进一步研究发现HE中富含miR-302b（一种miRNA）。为确定其主要作用靶点，科研人员开展以下研究。 ①用HE处理小鼠细胞，发现三个细胞周期抑制基因C1、C2、C3的表达发生显著变化。 ②借助生物信息学工具测算miR-302b与Cl、C2、C3的mRNA相互作用的最小自由能ΔG（kcal/mol）分别为-12.84、-6.1、-6.2。（形成氢键越多，ΔG越低，无关序列ΔG约-4~-7） 请基于上述结果，提出假说解释miR-302b调控细胞周期的机理______。 (4)为验证上述假设，科研人员将荧光素酶基因与miR-302b基因连接，转染野生型和靶基因突变体细胞，裂解细胞后加入底物，检测荧光强度。当miR-302b与靶基因mRNA结合后，荧光素酶mRNA被降解，导致荧光值下降。若实验结果为______，则支持上述假设。 受体细胞 荧光强度相对值 对照组（仅导入荧光素酶基因） 实验组 野生型 1.5 A 靶基因突变体 B (5)基于上述研究成果，研究人员设计了一款含miR-302b的保健品，请评估其安全风险______。 20．（24-25高二下·北京西城·期末）外泌体是细胞分泌的内含多种生物活性分子的囊泡。研究表明，干细胞外泌体（Exos）有抗衰老功能。为研究其抗衰老机理，以成纤维细胞和小鼠为材料开展了实验。 (1)在体外培养成纤维细胞时，需要保证环境条件__________。对贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要的材料用具有__________（多选）。 A．胰蛋白酶溶液        B．细胞培养液     C．PEG            D．CO2培养箱 (2)成纤维细胞在传代30次（PDL30）时处于年轻状态，在PDL50时完全衰老。用Exos处理成纤维细胞，72h后检测细胞中DNA含量（图1），以及细胞周期抑制因子基因Cdkn1a和Ccng2的表达（图2）。 ① 细胞周期停滞是衰老细胞的基本特征。 图1结果表明Exos可逆转衰老细胞的细胞周期停滞，促进细胞增殖，依据是______。 ② 综合图1和图2结果推测，Exos使衰老细胞恢复活力的机理是__________。 (3)实验表明，Exos中的miR-302b（一种非编码小RNA）在抗衰老中发挥了关键作用。miR-302b可与靶基因mRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合，诱导其降解或抑制mRNA的__________，从而调控靶基因表达。 (4)双荧光素酶报告基因技术可用于检验miR-302b的靶基因。其中，萤火虫荧光素酶可催化荧光素氧化发出黄绿色光，海肾荧光素酶可催化腔肠素氧化发出蓝光。将图3所示含有两种荧光素酶基因的表达载体与miR-302b共同转入成纤维细胞系，一段时间后裂解细胞，分别检测两种荧光的强度。并以海肾荧光素酶基因作为内参基因，来校正不同组之间细胞数目、裂解效率的差异。 ① 为研究Cdkn1a是否为miR-302b的靶基因，研究者克隆出Cdkn1a基因中3'UTR序列对应片段，将其插入载体中，插入位置应为图3中的__________位点。 ② 实验结果为__________，说明Cdkn1a是miR-302b的靶基因。 地 城 考点02 单克隆抗体制备 21．（24-25高二下·北京海淀·期末）人正常乳腺细胞与人乳腺癌细胞表面有部分相同的膜蛋白。科研人员设计下图所示流程，生产针对人乳腺癌细胞的单克隆抗体。 下列叙述不正确的是（　　） A．过程①从小鼠体内分离得到多种针对人正常乳腺细胞的抗体 B．过程②使用选择培养基和抗原 - 抗体杂交筛选特定杂交瘤细胞 C．抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞必须在小鼠体外进行扩大培养 D．该单克隆抗体可与毒素连接实现对乳腺癌细胞的特异性杀伤 22．（24-25高二下·北京·期末）科学家以水稻（2n=24）和稗草（2n=54）为材料，利用植物体细胞杂交技术获得了具有稗草抗逆性（如耐盐、抗除草剂）的水稻，流程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．获得原生质体时，需要在低渗溶液中用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 B．原生质体融合前需用胰蛋白酶处理，以获得有活力的原生质体 C．可以用离心、聚乙二醇或灭活病毒诱导两种原生质体融合 D．该技术打破水稻与稗草之间的物种界限，实现了远缘杂交育种 23．（24-25高二下·北京顺义·期末）小分子化合物丁香酚对鲜活水产品有麻醉效果，可提高运输存活率。科研人员制备抗丁香酚单克隆抗体，用于检测水产品中残存的丁香酚，流程如图。下列描述错误的是（    ） A．①过程抗原被小鼠抗原呈递细胞摄取 B．②过程需要使用特定的选择培养基 C．甲既能产生抗丁香酚抗体又能无限增殖 D．③目的是为杂交瘤细胞提供营养和环境 24．（24-25高二下·北京顺义·期末）科研人员模拟胚胎发育过程中的信号通路和微环境，成功诱导iPSC（诱导多能干细胞）成为功能性心肌细胞，用于心肌细胞的修复和再生。下列叙述正确的是（    ） A．此过程需借助动物细胞融合技术 B．iPSC与心肌细胞的基因组成不同 C．此过程中发生了细胞分裂和分化 D．胚胎发育的微环境不影响基因表达 25．（24-25高二下·北京朝阳·期末）动物细胞工程技术在生物制药和物种繁育等领域广泛应用。下列相关叙述错误的是（　　） A．病人体细胞诱导为iPS细胞后直接植入体内，可用于治疗 B．动物细胞培养中的接触抑制现象可防止细胞过度增殖 C．动物组织经胰蛋白酶处理后，初次培养的细胞即原代细胞 D．B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得能增殖并分泌抗体的细胞 26．（24-25高二下·北京西城·期末）以甲型流感病毒NA蛋白为抗原，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。相关叙述错误的是（　　） A．需要先用NA蛋白免疫小鼠 B．进行抗体类型筛选后的B淋巴细胞才可用于诱导融合 C．经选择培养的杂交瘤细胞还需克隆化培养和抗体检测 D．该单克隆抗体可用于甲型流感病毒的检测 27．（23-24高二下·北京石景山·期末）单克隆抗体在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。下列叙述正确的是（　　） A．将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成的细胞均为杂交瘤细胞 B．单克隆抗体是不同于天然抗体的人工合成生物分子 C．将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合，可特异性识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞 D．将某灭活病原体作为疫苗接种人体后，能产生针对抗原的单克隆抗体 28．（23-24高二下·北京·期末）新型冠状病毒（SARS-CoV-2）表面的S蛋白由S1和S2两个亚基组成。科研人员制备获得了鼠抗S蛋白特异性单克隆抗体，为分析该单克隆抗体的特异性，将SARS-CoV-2的S蛋白进行电泳得到图A，用该单克隆抗体进行抗原-抗体杂交并显色得到图B。下列表述错误的是（    ） A．该单克隆抗体特异性的识别S蛋白的S2亚基 B．制备单克隆抗体的过程体现了动物细胞膜具有流动性 C．免疫后小鼠体内的浆细胞只产生一种抗S蛋白抗体 D．制备单克隆抗体的过程可用灭活病毒诱导动物细胞融合 29．（23-24高二下·北京海淀·期末）植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术的共性是（    ） A．均出现贴壁生长现象 B．融合细胞的染色体组数均增加 C．均需用胰蛋白酶处理 D．均可用灭活的病毒诱导细胞融合 30．（22-23高二下·北京朝阳·期末）科学家将某些诱导基因转入小鼠成纤维细胞中成功获取诱导多能干细胞，这类细胞可用于一系列的研究，具体过程如下图所示。 以下说法错误的是（    ） A．过程实质是基因的选择性表达 B．过程可用聚乙二醇诱导细胞融合 C．培养诱导多能干细胞时，需要定期更换培养液 D．可将丁细胞注射到小鼠脾脏中提取单克隆抗体 31．（22-23高二下·北京海淀·期末）利用动物细胞融合方法，以SARS病毒棘突蛋白作为抗原制备出单克隆抗体（抗体D）。下图为使用不同抗体抑制病毒感染细胞的检测结果。下列相关叙述不正确的是（    ） A．对照抗体应不与SARS病毒特异性结合 B．将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，可获得大量抗体D C．检测抗体效果时需将SARS病毒与细胞混合一段时间后再加入抗体 D．抗体D需达到一定浓度才有明显抑制效果 32．（22-23高二下·北京东城·期末）牛的雄性胚胎中有特异性H-Y抗原。在牛早期胚胎培养液中添加H-Y单克隆抗体，筛选出所需胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列叙述不正确的是（    ） A．用H-Y抗原免疫母牛也可获得相应抗体 B．分泌HY单抗的是单一细胞形成的细胞群 C．可在囊胚期取样滋养层进行性别鉴别 D．鉴别后选取雄性胚胎进行胚胎移植 33．（24-25高二下·北京东城·期末）将四种关键基因导入小鼠的成纤维细胞，可获得诱导多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，可分化成神经细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。下列叙述不正确的是（    ） A．应使用显微注射法将四种基因直接注入成纤维细胞 B．导入的四种基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 C．iPS细胞能分化成多种细胞，是基因选择性表达的结果 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 34．（23-24高二下·北京西城·期末）骨骼干细胞（SSC）具有自我更新能力和分化潜能，在骨骼发育中起重要作用。2024年我国科学家鉴定出首个位于长骨干骺端的骨骼干细胞群。下列说法错误的是（　　） A．SSC属于成体干细胞 B．SSC具有无限增殖能力 C．培养SSC需要提供O2和CO2 D．SSC可应用于骨骼的再生和修复 35．（22-23高二下·北京东城·期末）干眼症是由于泪液分泌减少导致的眼睛干涩病症。将有关基因导入已分化的体细胞获得诱导多能干细胞（iPS细胞），培养iPS细胞得到的眼结膜组织可分泌泪液成分“粘液素”，有望治疗干眼症。下列说法不正确的是（    ） A．导入的基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 B．利用iPS细胞获得眼结膜组织时，应加入分化抑制因子 C．利用iPS细胞治疗人类疾病理论上可避免免疫排斥反应 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 36．（24-25高二下·北京朝阳·期末）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 双特异性抗体：激活T细胞双信号通路的新型肿瘤免疫疗法 近年来，肿瘤免疫治疗领域取得了突破性进展，双特异性抗体（BsAb）技术因其独特的双靶点识别能力成为研究热点。与传统单克隆抗体相比，BsAb不仅识别肿瘤特异性抗原（TSA），还能直接激活T细胞，具有更强的细胞毒性效应（图1）。 T细胞识别、杀伤靶细胞的能力取决于一系列协调的相互作用。其中最重要的是T细胞受体复合体（TCR，包括相关的CD3等结构）对靶细胞的识别和结合（“信号1”），但这种结合通常是低亲和力的。因此，成功触发信号1需要在T细胞与靶细胞界面处聚集许多TCR复合体，这个界面被称为免疫突触。T细胞的激活和增殖还需要通过与共刺激受体（如CD28）的额外相互作用提供“信号2”，两种信号共同促进T细胞的完全活化和功能发挥。 免疫突触的形成可通过荧光标记技术动态观测：利用不同波长（如488nm激发绿色荧光蛋白标记“TSA1×CD3”BsAb）的激光共聚焦显微镜，捕捉T细胞与靶细胞接触区域的空间重组过程，生成细胞图像（图2）。 在BsAb的研发过程中，研究者首先利用特异性抗原重复刺激小鼠，通过单细胞分离与克隆培养获取浆细胞；随后利用逆转录PCR技术扩增抗体可变区基因；最关键的是通过蛋白质工程对抗体重链进行定向改造，经过细胞表达与纯化，对抗体的功能进行验证。研究者设计了针对高表达特异性抗原MUC16的卵巢癌的BsAb，在体外和体内实验均取得了显著效果，为癌症治疗提供了新的思路和方法。 (1)抗体的分子本质是由_______条多肽构成的________。 (2)制备“MUC16×CD28”双特异性抗体（BsAb）的过程如下：①将分离的_______分别注入小鼠体内进行免疫；②取免疫小鼠的______与骨髓瘤细胞诱导融合；③筛选能分泌抗MUC16或抗CD28的______细胞株；④通过______技术对抗体重链进行定向改造，避免重链错误配对。 (3)若肿瘤细胞下调MUC16表达，推测其对免疫突触形成和免疫监视效果的影响______。 (4)研究人员向裸鼠体内植入表达荧光素酶（遇底物D-荧光素后可发光）的卵巢癌细胞后，注入不同类型抗体，定量检测发光强度，最终证实“MUC16×CD28通过MUC16×CD3激活T细胞”的结论。请完善实验方案并预期实验结果______。 (5)从生命信息观分析T细胞双信号调控对维持稳态的意义______。 37．（24-25高二下·北京昌平·期末）猪伪狂犬病毒（PRV）是严重危害养殖业的一种病原体，也存在着向人类传播的风险。为制备抗PRV的单克隆抗体，科研人员进行系列实验。 (1)PRV诱导免疫反应的糖蛋白主要有gB、gC和gD。 ①为筛选制备抗PRV单克隆抗体的________，需比较3种蛋白引发免疫应答的能力：将小鼠分为五组，分别注射3种蛋白、PBS缓冲液和灭活疫苗，第28天测定各组小鼠产生抗体的相对数量，结果如图1。 ②为获得产生抗PRV抗体效果理想的B淋巴细胞，可用gD免疫多只小鼠，选择__________的小鼠，从其脾中得到B淋巴细胞。 (2)将上述B淋巴细胞与________（甲）融合，并接种至含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的HAT培养基。动物细胞合成DNA有D和S途径，但甲只有D途径，途径如图2。 HAT培养基能筛选出目标融合细胞的原因是__________。 (3)由于_________，因此还需对（2）获得的细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 (4)将（3）获得的细胞注射到小鼠腹腔内增殖。从小鼠腹水中获得的单克隆抗体，需纯化后才能使用，原因是__________。 38．（23-24高二下·北京丰台·期末）双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体。PSMA是癌细胞的一种表面抗原。T细胞有效激活依赖于T细胞的表面受体CD28在癌细胞与T细胞结合部位的聚集。科研人员尝试构建双特异性抗体PSMA×CD28（简称“PC双抗”）来治疗癌症，制备过程如图1，PC双抗的结构及作用机理如图2。 (1)制备PC双抗的过程中，用到的动物细胞工程技术主要有___（答出2点）。 (2)制备PC双抗时，应先将___（物质X）分别注射到小鼠体内再分离出B淋巴细胞。将B淋巴细胞分别与小鼠的骨髓瘤细胞融合，常用的诱导融合方法有___。之后筛选得到两种杂交瘤细胞，再诱导两种细胞融合，成功融合的杂交瘤细胞表达两种L链和两种H链。据图2分析，杂交瘤细胞A×B会产生多种抗体，原因是___。因此还需通过筛选才能获得PC双抗。 (3)科研人员将某种癌细胞和T细胞共同培养，加入不同抗体后检测T细胞活化水平，结果如图3，结果说明___。进一步分析发现，这种癌细胞大量表达PD-L1，识别结合T细胞表面的PD-1受体，从而___T细胞活化。为了有更好的治疗效果，请利用已有的PC双抗提出一种新的治疗手段___。 39．（23-24高二下·北京昌平·期末）手足口病由多种肠道病毒感染引起，主要表现为手、足和口腔黏膜等处疱疹，柯萨奇病毒A组2型（CV-A2）是引发该病的主要病原体之一、制备抗CV-A2的单克隆抗体，对检测和治疗手足口病具有重要意义。 (1)将纯化的CV-A2抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的_____细胞，利用_____诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得13株杂交瘤细胞。 (2)科研人员对上述13株杂交瘤细胞再进一步筛选，通过抗CV-A2单抗特异性分析结果可知（图1），应选择第_____株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体，理由是_____。 (3)科研人员使用高、中、低3个浓度的CV-A2抗原稀释液，对不同温度下放置3d的抗CV-A2单抗进行检测，图2结果表明单抗稳定性良好。判断依据是：在37℃和4℃的条件下放置3d后，各稀释液浓度下的检测值_____。 (4)制备的抗CV-A2单抗在检测和治疗手足口病方面的具体应用是_____（写出1条即可）。 40．（23-24高二下·北京海淀·期末）黄曲霉毒素（AFB）是黄曲霉（一种真菌）产生的具有极强致癌力的代谢产物。为准确检测食品中残留的AFB，科研人员开展下列研究。 (1)科研人员利用小鼠制备抗AFB的单克隆抗体（AFB单抗），过程如图1。杂交瘤细胞需进行步骤Ⅱ_____和Ⅲ_______检测，经过多次筛选。 (2)食品中的有害残留毒素还可能有黄绿青霉素（CIT）、伏马菌素（FB）。若想确认上述流程获得的AFB单抗具有极强的特异性，应补充的检测和结果是__________。 (3)科研人员拟将抗AFB单抗固定在一种新材料上，制备为“检测探针”。已知材料M稳定性、发光性能等方面有明显优势，但它很难与抗体结合；物质P可以提高材料M对抗体的亲和力。制备检测探针的流程如图2，探针发光性能与物质P的浓度关系如图3。 依据图3结果，科研人员选择物质P的浓度为0.8mg/mL作为生产检测探针的条件，原因是在该浓度下，探针发光性能与更高浓度时______，而该浓度可节省成本。 (4)科研人员制备定量检测AFB的免疫试纸，如图4。测定样品前，先配制一系列不同浓度的AFB标准溶液，分别与等量“MP-抗AFB单抗探针”混合均匀，滴至加样处。 科研人员测定了T线、C线的发光值，从而绘制出特定范围AFB浓度的线性标准曲线_________（选填字母），作为后续检测食品中是否含有AFB的参照曲线。 41．（23-24高二下·北京朝阳·期末）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 阿尔茨海默病早期诊断的新技术 阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统的退行性病变。血浆外泌体是由活细胞分泌到血液中的囊泡。与健康人相比，AD患者血浆外泌体上蛋白质Aβ1-42含量显著升高，可作为AD诊断的生物标志物。我国科研人员开发了检测血浆外泌体Aβ1-42水平的新技术——免疫磁珠外泌体聚合酶链式反应（iMEP）技术。 研究者首先将抗Aβ1-42抗体与DNA单链1结合成DNA-抗体偶联物，然后除去未偶联成功的游离抗体，获得纯化的DNA-抗体偶联物，纯化过程如下：单链1上的片段b通过碱基互补配对与预先偶联了纳米颗粒（SA）的单链2上的片段b*结合，偶联物随纳米颗粒沉淀。沉淀物溶解后再加入单链3，单链3与单链1竞争性杂交结合单链2，因此可将DNA-抗体偶联物从纳米颗粒上替换下来（图1）。 CD63是外泌体表面特异性高表达的蛋白，且AD患者外泌体CD63含量与健康人相同。研究者将抗CD63抗体固定在磁珠上，抗体-磁珠偶联物能够结合血液外泌体，使其富集。再利用DNA-抗体偶联物结合外泌体表面的Aβ1-42,最后利用实时荧光定量PCR技术对DNA-抗体偶联物中的DNA进行指数扩增。PCR体系中含有荧光染料，该染料在游离状态不发光，与双链DNA结合后发出荧光，根据产物荧光强度可计算DNA模板量（图2）。 iMEP技术能够灵敏地检测血液样本AD生物标志物的含量，还可以扩展到检测外泌体上其他生物标志物，因此有可能成为复杂临床环境中疾病筛查和进展监测的新工具。 (1)制备抗Aβ1-42单克隆抗体时，多次注射_______到小鼠体内，从小鼠的脾脏中获得B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞诱导融合后，先筛选得到杂交瘤细胞，再进行______培养和抗体检测，得到能分泌抗Aβ1-42抗体的杂交瘤细胞。 (2)图1中DNA单链1的5’和3’末端碱基序列为：5’-CATGTT…CGACTA-3’，则DNA单链3的5’末端碱基序列应为__________，沉淀物溶解后加入的DNA单链3的量应_______（多于/等于/少于）溶液中DNA单链1的量。 (3)研究人员用iMEP技术检测比较健康人与AD患者血液样本外泌体中Aβ1-42含量，下列关于该实验的叙述正确的是_______ A．应在两类样本的外泌体CD63总量相等的条件下检测Aβ1-42含量 B．如果DNA-抗体偶联物中混有游离抗体，会导致检测值偏小 C．PCR扩增的模板是单链，因此PCR体系中只需要加入一种引物 D．AD患者血液样本PCR扩增终产物的荧光强度显著高于健康人 (4)iMEP技术的优点之一是灵敏度高，其高灵敏度的原因是________。 (5)在iMEP技术中，同时使用两种DNA-抗体偶联物，并将PCR产物检测环节更改为电泳检测，可以同时检测两种生物标志物分子。此时使用的两种DNA-抗体偶联物之间的区别是_________。 42．（23-24高二下·北京大兴·期末）学习以下材料,回答(1)~(4)题。 不断发展的单克隆抗体技术 1975年，生物学家创造了利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的技术。自1986年全球首个鼠源单抗药物上市以来，单抗药物治疗方向不断发展，覆盖肿瘤、心血管疾病、自身免疫病、神经性疾病和抗感染等各个领域。 最早期的单克隆抗体均为鼠源单抗，在理论研究及实践应用中发挥了重要作用。然而，鼠源单抗作为异源蛋白，在人体内活性低，稳定性差；且容易让人产生免疫反应——人抗鼠抗体反应(HAMA)而被清除。第二代人鼠嵌合单抗是从杂交瘤细胞分离出鼠源抗体可变区基因，与人源抗体恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生的。如下图.人源基因序列编码的氨基酸序列占整个抗体的大部分，降低了单抗的HAMA 反应。最新一代单抗是全人源单克隆抗体，氨基酸序列均由人源基因编码，进入人体内后发生超敏或排斥反应的可能性最低。目前制备全人源单克隆抗体的技术包括转基因鼠技术、抗体库技术以及单个B细胞技术等。 转基因鼠技术是将优化的人源抗体合成基因导入到本身不能合成抗体的免疫缺陷鼠的基因组中，在对转基因鼠进行特定抗原免疫后，后续流程与传统单抗制备方法一致，产生的抗体均由插入的人源抗体基因序列编码，也保证了单抗的抗原特异性和结合亲和力。 噬菌体展示技术是抗体库技术中的一种，将所选抗体库中抗体的可变区基因，与噬菌体壳蛋白基因构成融合基因，随着子代噬菌体重组，相关氨基酸序列会显示在噬菌体表面，从而筛选出抗体库中与特定抗原结合亲和力高的抗体基因。 单个B 细胞技术可从患者或接种疫苗人群的外周血中，根据抗原和细胞表面标记物筛选出单个B细胞，再利用逆转录 PCR 等技术直接获得抗体合成基因。单个B细胞技术的优点是只需少量细胞就可以快速高效地筛选出潜在的单克隆抗体，在新发、突发传染病等紧急事件中，可以快速获得针对病原微生物的高亲和力抗体。 (1)上述技术中，除噬菌体展示技术外，大多需要在________箱中进行动物细胞培养。当培养瓶中贴壁生长的细胞出现________现象时，用________酶处理后进行传代培养。 (2)传统方法通过杂交瘤细胞制备单抗时，需向小鼠注射________，再从小鼠脾脏中取已免疫的B细胞，与骨髓瘤细胞混合后，诱导细胞融合。对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和_________，多次筛选后才能获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 (3)文中提到的新技术中，不需要利用动物细胞融合技术的有________；需要使用基因工程技术的有_________。 A．人鼠嵌合单抗技术  B．转基因鼠技术   C．噬菌体展示技术 D．单个 B细胞技术 (4)下面是利用单个 B细胞技术，针对某新型病原体表面的抗原X，制备单克隆抗体的技术路径，请结合材料补充“_”上的内容。 采集康复者外周血→筛选能够结合 X 的 B 细胞→提取________→_________→根据抗体基因通用序列设计引物进行 PCR→获得_________基因→________→导入受体细胞→获得抗 X 的单克隆抗体。 43．（22-23高二下·北京石景山·期末）A型塞内卡病毒（SVA）会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度，研究人员尝试开发一种快速、准确检测SVA病毒的方法。 (1)VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA 诊断的靶蛋白。用纯化的VP1多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的_______融合，常用方法有PEG融合法、电融合法和_______。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板克隆化培养和抗体检测筛选出能够_______的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体——2E10和3E4。 (2)为进一步确定2E10和3E4在VP1上的结合位点，将VP1蛋白截为4段（VP1-1~VP1-4），电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如下图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是_______（填“相同”或“不同”）的，依据是_______。 (3)用SVA感染小鼠肾脏细胞后，37℃培养24小时，去垢剂处理增加细胞膜的通透性，将处理后的细胞分为两组，固定在介质上，分别加入2E10和3E4，一段时间后冲洗掉未结合的抗体，然后依次加入酶标抗体和底物，酶标抗体与鼠源抗体结合后可催化底物发出绿色荧光。对照组应选择_______细胞，其余处理与实验组一致，如果实验结果为_______，则证明制备的单克隆抗体具有特异性。 (4)用获得的2种单克隆抗体制作快速检测SVA病毒的试纸条，如下图所示。当待测样品滴入样品垫后会沿着试纸条向右扩散，结合垫处含有过量胶体金标记的2E10，也可向右扩散，当胶体金颗粒聚集时才会出现可见条带，检测线、质控线处包埋固定的抗体依次是3E4和山羊抗鼠IgG（可特异性结合各种鼠源抗体）。 在检测过程中，试纸上可发生待测病毒抗原与抗体结合的区域是_______。病毒检测阳性的结果为检测线和质控线处均出现条带，请解释条带形成的原因_______。 44．（24-25高二下·北京丰台·期末）学习以下材料， 回答（1） ~ （4） 题。 噬菌体展示技术筛选单克隆抗体 噬菌体展示技术可以将外源基因整合到噬菌体基因组，使蛋白或多肽展示在噬菌体表面。此技术可通过构建噬菌体抗体库，筛选出高亲和力抗体以识别特定抗原。 噬菌体展示技术的第一步：需要构建含有抗体基因的噬菌体库，过程如图1所示。免疫动物后，获取B细胞，分别扩增抗体基因的重链可变区序列（VH）和轻链可变区序列（VL），通过接头序列（G4S）连接成VH-G4S-VL融合基因。这些基因序列被整合到编码噬菌体蛋白的质粒（噬菌粒）中，再导入大肠杆菌中，通常每个细菌含一个噬菌粒。大肠杆菌最终会释放出展示抗体的噬菌体。若实验室已有抗体基因文库，则无需免疫动物，构建噬菌体库的时间可缩短至两天左右。 噬菌体展示技术的第二步：淘选出与目标抗原结合能力强的噬菌体，过程如图 2 所示。将尾部展示抗体的噬菌体加到固定化的抗原中，经过两次目的不同的洗脱后，利用得到的噬菌体侵染大肠杆菌得到子代噬菌体。这样的淘选过程需要重复3~4轮，耗时一周左右，可从容量百亿的基因文库中快速筛选阳性噬菌体，再结合其他技术手段筛选出与目标抗原结合能力最强的阳性噬菌体单克隆。获取其中的抗体基因序列，将其导入特 定细胞中，大量表达出人类所需抗体。 噬菌体展示技术与传统制备单抗的技术相比，周期短，成本低，可以大规模筛选，在药物研发中应用广泛。 (1)构建抗体基因文库时，从动物体中获取B细胞，提取mRNA 通过_________过程生成cDNA，利用PCR 技术获取 VH-G4S-VL 融合基因。请参照下图中的基因模式图画出 PCR 的目标产物，填入方框中_________。 (2)针对噬菌体展示技术，下列叙述错误的是_。 A．该技术所需的B细胞可从动物脾脏中获取 B．噬菌粒作为载体，在噬菌体中实现抗体基因的表达 C．将抗体基因连接到噬菌粒上需要用到DNA 聚合酶 D．可直接从筛选获得的阳性噬菌体的尾部截取抗体蛋白用于生产 (3)图2中两次洗脱的目的分别是_________；淘选过程重复3~4轮的目的是_________。 (4)研究者利用噬菌体展示技术成功筛选到抗丙肝病毒抗体，为验证抗体的有效性，进行相关实验。其中，实验组先加入适量的细胞培养液和__________，然后加入_________，混匀一小时后，再加入_________，一段时间后检测宿主细胞中的病毒相对值。将实验组所测结果与对照组对比评估抗体活性。请选择下列选项前的字母填入横线处。 a.丙肝病毒液b.宿主细胞悬液c.一定稀释度的抗丙肝病毒抗体 45．（24-25高二下·北京平谷·期末）N1亚型禽流感病毒引发禽流感，对家禽养殖业造成重大损失。NA是N1亚型禽流感病毒表面的糖蛋白，在病毒附着和入侵阶段发挥作用，制备抗NA的单克隆抗体，对检测和治疗禽流感有重要意义。 (1)将纯化的NA抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的_____细胞，利用_______诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得4株特定的杂交瘤细胞。 (2)科研人员对上述4株杂交瘤细胞再进一步筛选，通过抗NA单抗特异性分析结果可知（如下表）： 组别 不同亚型禽流感病毒 N1亚型 N2亚型 N3亚型 N4亚型 第一株细胞上清液 +++ + - - 第二株细胞上清液 + - - - 第三株细胞上清液 ++ - - - 第四株细胞上清液 ++++ - - - NP单抗 + + + + 注：NP蛋白是不同亚型禽流感病毒的核心结构蛋白，“+”表示特异性结合，“-”表示不结合，“+”越多，表示与抗原结合的单抗含量高， ①NP单抗组是对照组，设计对照组的意义是_______。 ②应选择第_____株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体，理由是_________。 (3)制备的抗NA单抗在检测和治疗禽流感方面的具体应用是_______。（写出1条即可） 46．（24-25高二下·北京·期末）学习以下材料，回答（1）～（3）题。 “双特异性抗体”——单克隆抗体的迭代 利用动物细胞工程技术制造的单克隆抗体在医药领域占有非常重要的地位，近年来已成为多种炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的治疗药物。抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合（见图）。 为进一步提高单克隆抗体的治疗效果，研究者在传统单抗的基础上进行了迭代，制备出了双特异性抗体（BsAb）。BsAb有独特的抗原结合片段，可以与2个不同抗原或同一抗原的2个不同抗原表位相结合。科研人员已经研究了多种制备BsAb的方法，其中一种方法的大致流程是：将2种不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞，然后通过筛选并进行克隆，用以生产BsAb。双杂交瘤细胞的遗传背景来源于两种杂交瘤细胞，可产生2种抗体中的2种H链和2种L链，这些H链、L链的随机组合配对可产生人们所需的BsAb。 与传统的单克隆抗体相比，BsAb的特异性更强，能够更加准确靶向，从而降低脱靶带来的不良反应。更重要的是，BsAb所具备的“双靶点”机制，拓展了治疗维度，提高了治疗效果，展现出其独特的优势。 (1)单克隆抗体制备中涉及的动物细胞融合与动物细胞培养技术对应的原理分别是_______。 (2)已知表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜蛋白，在癌细胞中表达量高；CD3是T细胞表面蛋白，CD3抗体与其结合后可激活信号通路，促进T细胞的免疫效力。 ①结合文中信息，画出既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的示意图。_______（注：EGFR抗体的链用H1、L1表示，CD3抗体的链用H2、L2表示） ②下图为BsAb的制备流程，其中a～c对应的细胞分别是_______。 在上述流程中，“筛选Ⅲ”_______(填“可以”或“不可以”)利用“筛选Ⅰ”中的选择培养基，原因是_______。 ③制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为_______。 (3)请结合文中信息与所学知识，提出制备既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的另一种方法，写出大致思路。______________。 47．（24-25高二下·北京房山·期末）生物制药时常用转入抗体基因的卵巢细胞大规模生产单克隆抗体。为探究表观遗传对该过程的影响，科研人员展开相关研究。 (1)卵巢细胞内染色体的主要成分是________，体外培养卵巢细胞时，需在培养基中添加_______等特殊成分，以满足细胞对某些生长因子的需求。 (2)研究人员选择转入ADM抗体基因的卵巢细胞（CHO-ADM）进行实验。利用溶解于DMSO的表观遗传抑制剂（I-4）处理CHO-ADM，结果如图1。 ①据图分析，对照组应采用_______处理。 ②研究人员最终选择浓度为2μmol/L的I-4开展进一步研究，理由是：_______。 (3)进一步研究I-4对细胞周期和表观遗传相关蛋白乙酰化的影响，结果如图2、图3所示。 ①据图2分析，2μmol/L的I-4处理将CHO-ADM细胞增殖抑制在________期。 ②HDAC蛋白可以去除组蛋白上的乙酰基，使染色质结构变得紧密，从而使基因不易表达。为证明I-4能抑制HDAC的表达，分别用HDAC抑制剂SAHA和I-4处理卵巢细胞，结果如图3。请在图3“I-4”相应位置绘出能证明上述结论的结果________。 (4)结合以上研究，从物质与能量和表观遗传两个角度阐述I-4提高CHO-ADM细胞单克隆抗体产量的作用机制________。 48．（24-25高二下·北京怀柔·期末）肾细胞癌是常见的泌尿系统肿瘤。近年来分子靶向治疗成为了晚期肾癌的重要治疗手段，针对靶点制备相应的单克隆抗体对肾癌治疗有重要意义。 (1)体内出现癌细胞时，非特异性免疫中的吞噬细胞可以吞噬、处理癌细胞，特异性免疫中的 _________免疫发挥主要的抗肿瘤作用。 (2)SFRP2蛋白是部分肿瘤细胞高表达的一种分泌型糖蛋白，推测其与肿瘤的增殖、迁移密切相关，科研人员针对该靶点制备相应的单克隆抗体（SFRP2 mAb）用于后续研究。 ①将SFRP2蛋白作为抗原制成悬液，皮下注射给5只小鼠，重复免疫3次后取血清检测，选择_________的小鼠备用。 ②取上述备用小鼠的脾脏，用胰蛋白酶处理后制成单细胞悬液，在相关试剂的诱导下与骨髓瘤细胞融合，加入HAT选择培养基，铺于96孔板中，并置于_________培养箱培养。 ③融合10天后，利用抗原抗体_________的原理筛选能产生SFRP2蛋白特异性抗体的细胞进行克隆化培养，提取并纯化该抗体。 (3)为研究SFRP2 mAb对肾癌细胞的影响，研究者进行了系列实验。 实验一：将肾癌细胞分为4组，接种于细胞培养板上，培养获得单层细胞，用硬物在培养板表面以垂直方向划宽度约１ｍｍ划痕清除该区域细胞，接下来用不同浓度的_________处理各组，48小时后显微观察拍照，实验结果如图1； 实验二：将肾癌细胞分为4组进行培养，并用SFRP2 mAb进行处理，48小时后，多次取样检测各组细胞数量并计算平均值，实验组细胞数量平均值分别为A1、A2……对照组细胞数量平均值为B，则实验组1细胞抑制率的数学表达式为： B-A1/B，进一步推算各组细胞抑制率，结果如图2. 由以上系列实验结果可知，随SFRP2 mAb浓度的增加，细胞划痕宽度变宽，细胞增殖抑制率提高，说明________。 49．（24-25高二下·北京东城·期末）表皮生长因子受体（EGFR）结构如图1，可与配体表皮生长因子（EGF）结合促进细胞增殖，其突变或过表达可驱动肿瘤发生。研究人员通过制备EGFR单抗治疗癌症。 (1)研究人员将EGFR全长蛋白注射到小鼠体内，分离出B淋巴细胞后诱导其与小鼠的_________细胞融合，经筛选及克隆化培养，最终获得EGFR单抗。利用EGFR单抗治疗癌症的机理是_________。 (2)将EGFR单抗与癌细胞混合后发现，其阻断癌细胞增殖的效率低下。研究人员进而将全长EGFR改成EGFR的_________重新制备，获得的单抗抑制癌细胞增殖效果明显提升。 (3)利用新制备的EGFR单抗治疗癌症，病人会出现耐药性。检测发现耐药病人癌细胞中的Met基因（编码另一种生长因子的受体）拷贝数增多。推测耐药性的产生可能是该基因扩增导致的，理由是_________。 (4)研究人员进一步构建了EGFR-Met双特异性抗体（如图2）。不同类型抗体的Fc段都可与杀伤细胞（如NK细胞）表面的Fc受体结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，称为抗体依赖—细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。检测EGFR-Met双特异性抗体的作用效果。其中实验组应选用的实验材料是_________（填字母）。 a.EGFR单抗  b.EGFR-Met双特异性抗体  c.无关抗体  d.NK细胞  e.癌细胞  f.B细胞 结果表明双特异性抗体的ADCC活性相比EGFR单抗更高。请在图3中补充实验组和空白对照组的结果__________。 (5)将该双特异性抗体开发成药物用于EGFR靶点耐药患者的治疗，请提出需进一步研究的问题________。 50．（23-24高二下·北京东城·期末）人类腺病毒55型（HAdV55）是我国流行的主要呼吸道病原体之一。目前尚无特异性治疗方法。为解决这一问题，我国科学家通过不同方法制备抗 HAdV55单克隆抗体。 (1)通过细胞工程技术制备单克隆抗体，从接种_____的小鼠中获取脾脏细胞，采用_____处理诱导与骨髓瘤细胞融合，筛选出相应的_____细胞，大量培养获得单克隆抗体。为研究抗体的特异性，用抗体与感染不同类型腺病毒的细胞提取物进行杂交检测，结果如图1。分析实验结果可知_____。 (2)如图2，HAdV55通过其表面蛋白与细胞表面受体结合，进入细胞形成囊泡，最终被溶酶体水解。然而某些病毒可以逃离囊泡，释放进入细胞质并最终到达细胞核进行复制。 据图2，抗 HAdV55抗体的作用机制分为两种：机制一是阻断_____；机制二是阻断病毒逃离囊泡，释放至细胞质和细胞核。科研人员通过基因工程制备出3 种抗 HAdV55单克隆抗体A、B和C。为探明几种抗体的作用和作用机制，用抗体处理细胞，在病毒感染后的不同时间点测量囊泡或细胞质中的病毒含量，实验结果如图3。请据此判断能通过机制一发挥作用的单克隆抗体是_____，并说明理由_____。 地 城 考点03 单克隆抗体制备 51．（24-25高二下·北京海淀·期末）我国科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴“中中”“华华”，攻克了灵长类动物克隆的技术难题，过程如下图。下列叙述不正确的是（　　） A．采集的卵母细胞需在体外培养到MⅡ期后再显微操作去核 B．重构胚形成后需进一步激活才可继续完成分裂和发育进程 C．克隆猴的诞生体现出动物细胞的细胞核具有全能性 D．胚胎移植前需要使用免疫抑制剂处理代孕猴 52．（24-25高二下·北京延庆·期末）克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，下列相关叙述错误的是（　　） A．过程①选用的一般为减数分裂Ⅱ中期的次级卵母细胞 B．过程②需要向发育培养液中加入抗生素和动物血清 C．过程③需将胚胎移入经同期发情处理的受体母牛子宫内 D．细胞培养中需提供5%CO2，目的是调节培养液的渗透压 53．（23-24高二下·北京昌平·期末）动物细胞工程技术在动物育种中有着广泛的应用，下列叙述错误的是（　　） A．试管动物和克隆动物都是通过无性生殖方式产生 B．早期胚胎发育经过卵裂、桑葚胚、囊胚等阶段 C．三种动物的培育过程都需要动物细胞培养技术 D．转基因技术为动物育种提供了改良性状的新途径 54．（23-24高二下·北京·期末）试管牛技术和核移植技术已应用于培育良种牛。下列相关叙述错误的是（    ） A．试管牛技术和核移植技术均可实现良种牛的大量克隆 B．试管牛技术和核移植技术培育良种牛均需进行胚胎移植 C．进行胚胎移植可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力 D．需要注射促性腺激素促进供卵牛超数排卵 55．（23-24高二下·北京朝阳·期末）克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，相关叙述正确的是（    ） A．生殖性克隆动物与其供核亲本的遗传物质组成和性状完全相同 B．生殖性克隆人严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用 C．生殖性克隆和治疗性克隆都应用了体细胞核移植和胚胎移植技术 D．取自体的细胞核进行治疗性克隆，可治疗镰状细胞贫血等遗传病 56．（23-24高二下·北京大兴·期末）我国科学家利用基因编辑技术，获得一只生物节律核心基因敲除的猕猴。取其成纤维细胞与去核的卵母细胞融合，将发育形成的早期胚胎植入代孕雌猴，获得5只克隆猴，用于研究节律机制。以下叙述错误的是（    ） A．克隆猴基因组成差异小，作为实验动物便于研究 B．可用灭活的病毒诱导去核卵母细胞和成纤维细胞融合 C．克隆猴的遗传物质全部来自猕猴的成纤维细胞 D．克隆猴的获得体现了动物体细胞的细胞核具有全能性 57．（23-24高二下·北京西城·期末）为培育富含多聚不饱和脂肪酸的转基因奶牛，科研人员将相关合成基因转到甲牛成纤维细胞中，利用乙牛的卵母细胞，通过核移植技术构建转基因重构胚，由代孕母牛丙生产转基因克隆牛。下列说法正确的是（　　） A．通常用完整卵细胞作为核移植的受体细胞 B．重构胚在体外发育为早期胚胎不需提供营养 C．通过胚胎移植技术将早期胚胎转入丙牛子宫 D．转基因克隆牛的遗传物质与甲牛完全相同 58．（22-23高二下·北京西城·期末）体细胞核移植技术具有广泛的应用前景，流程如下图。下列叙述正确的是（    ） A． ①②③④⑤产生的子代只含一个亲本的遗传物质 B．④胚胎移植前，需对受体注射促性腺激素促进排卵 C．⑥取囊胚滋养层细胞进行检测，可减少对胚胎的损伤 D．①②③⑦⑧为生殖性克隆，可获得所需组织、细胞 59．（23-24高二下·北京海淀·期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 中国渔业育种的“双星” “中国克隆之父”童第周先生，上个世纪60年代在我国开创了鱼类的细胞核移植研究。鱼类的受精卵分裂过程，可在低倍镜下直接观察。童先生的实验过程如下图。 中国科学院院士——朱作言先生，在参与童先生的研究中发现，细胞质通过影响细胞核来改变生物性状的作用比较有限。因此，他提出将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变。 1984年，朱先生的团队培育出世界上首例转基因鲤鱼，早于美国3年。上世纪80年代末期，该团队克隆出草鱼与生长有关的基因和鲤鱼肌动蛋白基因（能表达出肌肉组织中的重要蛋白质）的启动子序列，将两者进行重组，注射到鲤鱼受精卵中，得到快速生长的基因改良鲤鱼，经过6代选育，培育了“冠鲤”品系。该品系生长迅速，生活周期缩短，食物转换效率高。一般鲤鱼在长江中下游需要两年的养殖周期，冠鲤养殖仅需一年。 为进行安全评估，朱先生的团队专门构建了100亩的人工池塘，持续实验5年时间。自然演化过程中的5年很短，但实验表明，“冠鲤”在野外环境中的生存力、繁殖力和竞争力较差，在自然选择中，冠鲤处于弱势。即便是这样，研究团队也没有将其释放到野外自然水体，而是等待我国政府监管部门审批。 水产养殖业是农业的重要组分，它的繁荣发展直接影响食品安全和人民生活水平。一路走来，我国科学家致力于渔业育种的研究从未止步，对世界的贡献有目共睹。 (1)童第周先生和朱作言先生的育种研究，从生命层次的角度看，分别属于___________水平。 (2)文中图示过程获得的杂交鱼更接近于________鱼的性状，该过程不包括__________。 a．有丝分裂b．减数分裂c．细胞分化d．细胞凋亡e．胚胎移植 (3)获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是_________。 (4)请从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点，并利用生物学原理或文中信息阐述支持该观点的依据，请按照下图结构填写在相应的序号位置______________。 60．（23-24高二下·北京大兴·期末）生殖性克隆和治疗性克隆是两个重要的工程技术，下图是小鼠相关的研究过程。 (1)核移植之前，卵母细胞要培养至_______期；可通过_______法使两细胞融合，形成重构胚。与胚胎细胞核移植相比，图示移植方式难度________。 (2)根据发育时期判断，图中早期胚胎是_______胚，其中的a将发育为________。胚胎移植之前，需要对代孕母鼠进行_______处理。 (3)图中过程⑥的实质是_______。过程③和过程⑦中不会出现免疫排斥反应的是________，为避免另一个过程出现免疫排斥反应，可以从________中取小鼠成纤维细胞。 (4)B技术是________性克隆。我国政府“不赞成、不允许、不支持、不接受”将________(填图中字母)技术应用于人类。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 动物细胞工程 答案版 地 城 考点01 动物细胞培养 1．C 2．C 3．A 4．B 5．C 6．B 7．A 8．D 9．B 10．C 11．D 12．B 13．A 14．D 15．C 16．D 17．(1) 胰蛋白/胶原蛋白 无菌无毒 (2)与LGR4正常表达组相比，低表达组在持续施加5-FU 药物后，荧光团的拖尾严重/细胞DNA损伤明显 (3) LGR4 B淋巴 (4)LGR4抗体与LGR4结合，使LGR4不能被激活，S基因表达产物减少，对细胞死亡的抑制作用减弱，使癌细胞在化疗药物使用时更多死亡 18．(1)人、猩猩和树鼩的肝细胞表面有HBV受体 (2) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 pre-S1 (3) 与NTCP mRNA结合后抑制翻译（抑制表达） 不与NTCP mRNA互补结合的RNA 乙组的NTCP mRNA含量和HBV的RNA含量均明显低于甲组，即siRNA抑制NTCP表达时HBV的感染率也降低 (4) 含NTCP基因的质粒；不加入    19．(1) 单个细胞 原代培养 (2)HE能改善细胞衰老，促进细胞有丝分裂 (3)miR-302b通过与C1 mRNA结合抑制C1基因的表达，解除对细胞周期的抑制 (4)A＜1.5、B≈1.5 (5)可能增加患癌风险 20．(1) 无菌无毒 ABD (2) 与PDL30-对照组相比，PDL50-对照组处于S期细胞的比例较少；PDL50-Exos处理组S期细胞比例明显多于PDL50-对照 Exos抑制了衰老细胞中Cdkn1a和Ccng2的表达，进而逆转细胞周期停滞 (3)翻译 (4) A 表达载体中转入了3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系黄绿光/蓝光的比值显著小于对照组（未转入3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系） 地 城 考点02 单克隆抗体制备 21．C 22．D 23．B 24．C 25．A 26．B 27．C 28．C 29．B 30．D 31．C 32．D 33．A 34．B 35．B 36．(1) 4 蛋白质 (2) MUC16抗原和CD28抗原 B淋巴细胞 杂交瘤 蛋白质工程 (3)MUC16减少导致TCR结合位点不足,免疫突触结构松散，双信号无法有效激活T细胞，肿瘤细胞逃避免疫监视 (4)实验方案①制备裸鼠（无胸腺，缺乏内源性T细胞，需外源补充），向其体内植入表达荧光素酶（遇底物D-荧光素后可发光）的卵巢癌细胞后,构建卵巢癌模型鼠，随机均分成甲、乙、丙、丁四组；②甲组不补充T细胞，注射适量的无关抗体；乙组补充适量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体；丙组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD3抗体；丁组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体和MUC16×CD3抗体；③在相同且适宜的条件下培养一段时间，定量检测肿瘤细胞的发光度。 预期实验结果  发光度为甲组≈乙组>丙组>丁组 (5)T细胞同时接受信号1和信号2才能完全活化，确保准确识别抗原,避免免疫监视过度，导致正常细胞受损 37．(1) 最佳抗原（或免疫原） 抗体相对数量最高 (2) 骨髓瘤细胞 只有融合细胞（B淋巴细胞+骨髓瘤细胞）能通过补救途径合成DNA并存活 (3)融合细胞可能产生多种抗体（或存在未融合的B淋巴细胞） (4)腹水中含杂蛋白（如小鼠自身抗体、细胞代谢产物），需纯化提高抗体纯度 38．(1)动物细胞融合、动物细胞培养 (2) PSMA、CD28 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法 L链和H链随机组合，产生多种抗体 (3) PC双抗不能有效激活T细胞 抑制 将PC双抗与PD-L1单抗联合使用 39．(1) 骨髓瘤 PEG/灭活病毒/电脉冲 (2) 4 第4株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体特异性强且含量最高 (3)无显著差异 (4)检测：可应用于手足口病感染病毒类型的检测/病毒感染的早期诊断；治疗：注射抗CV-A2单抗治疗手足口病/抗CV-A2单抗可作为治疗性抗体 40．(1) 克隆化培养 抗体（阳性） (2)AFB单抗与黄绿青霉素（或“CIT”）、伏马菌素（或“FB”）进行抗原-抗体杂交，结果为不能杂交（或“阴性”“无杂交带”） (3)差异较小（或“相近”） (4)D 41．(1) Aβ1-42 克隆化 (2) CGACTA… 多于 (3)ABD (4)抗CD63抗体-磁珠偶联物能够富集血液中外泌体；抗Aβ1-42单抗灵敏度高；实时荧光定量PCR能够放大信号 (5)抗体不同；DNA单链长度不同 42．(1) CO₂培养 接触抑制 胰蛋白(胶原蛋白) (2) 特定抗原 抗体检测 (3) CD ABCD (4) 总 RNA 逆转录得到cDNA 抗X抗体的 构建基因表达载体 43．(1) B淋巴细胞与骨髓瘤细胞 灭活病毒诱导法 产生抗VP1抗体（或产生特异性抗体） (2) 不同 2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合 (3) 未感染SVA的正常小鼠肾脏细胞 对照组细胞均无绿色荧光，实验组细胞均出现绿色荧光 (4) 结合垫和检测线 样品中VP1蛋白与金标2E10结合，向右扩散又与检测线处的3E4结合产生条带，过量的2E10与质控线处的山羊抗鼠IgG结合产生条带 44．(1) 逆转录 (2)BCD (3) 洗去未结合的噬菌体、洗脱与抗原结合的噬菌体 高倍富集阳性噬菌体 (4) c a b 45．(1) 骨髓瘤 PEG/灭活病毒/电脉冲 (2) 作为对照，排除无关抗体对实验结果的干扰，确定抗NA单抗的特异性 四 与N1亚型禽流感病毒的NA抗原结合能力最强，且特异性强 (3)利用抗原 - 抗体杂交原理，检测禽类组织样液中是否含有N1亚型禽流感病毒（或用抗NA单抗治疗N1亚型禽流感患者） 46．(1)细胞膜的流动性、细胞增殖 (2) 骨髓瘤、分泌EGFR抗体的杂交瘤、分泌CD3抗体的杂交瘤 不可以 无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活 可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞 (3)利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使其能够分别结合EGFR与CD3。 47．(1) DNA 和蛋白质 血清（或血浆 ） (2) 等量 DMSO 2μmol/L 时 ADM 产量最高 (3) G1 I-4 组 HDAC 条带浅于 SAHA 组 (4)I-4 阻滞细胞于 G1 期积累物质能量，抑制 HDAC 增强组蛋白乙酰化，促进抗体基因表达 48．(1)细胞 (2) 血清抗体浓度高 CO2恒温 特异性结合 (3) SFRP2 mAb 可显著抑制肾癌细胞的迁移和增殖 49．(1) 骨髓瘤 EGFR单抗可与EGF竞争结合EGFR，降低EGF对细胞增殖的促进作用 (2)胞外区域 (3)Met基因扩增，表达出的Met蛋白增加，Met途径的作用增强，使癌细胞产生耐药性 (4) bde (5)药物对耐药肿瘤的抑制效果如何；药物对人体是否有副作用等 50．(1) HAdV55 PEG（或灭活的病毒） 杂交瘤 单克隆抗体仅与HAdV55结合，而不与其他类型腺病毒结合，具有良好的特异性 (2) 病毒表面蛋白与受体结合 抗体C 抗体C处理后细胞质中病毒相对数量低于无关抗体组，说明抗体对病毒有抑制作用；但囊泡中病毒含量较低，说明不是通过机制二发挥作用 地 城 考点03 细胞核移植 51．D 52．D 53．A 54．A 55．B 56．C 57．C 58．C 59．(1)细胞水平和分子 (2) 草 e (3)使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产 (4)①支持②外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康； ①支持②生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍； ①反对②生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 60．(1) 减数分裂Ⅱ中期(MII期) 电融合(灭活的病毒等) 高 (2) 囊 胎儿的各种组织 同期发情 (3) 基因的选择性表达 ③ 帕金森病模型鼠 (4) 治疗 A 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题03 动物细胞工程 3大高频考点概览 考点01 动物细胞培养 考点02 单克隆抗体制备 考点03 细胞核移植 地 城 考点01 动物细胞培养 1．（24-25高二下·北京丰台·期末）科学家通过体外培养鸡的干细胞，得到100%细胞培养肉，在色香味以及营养角度与传统鸡肉相差无几。相关叙述错误的是（    ） A．需要先使用胰蛋白酶等处理干细胞 B．后期需诱导干细胞分化成肌肉细胞 C．需置于95%O2+5%CO2混合气体环境 D．未来可根据个人口感或需求实现定制肉 【答案】C 【详解】A、胰蛋白酶用于分散细胞，使干细胞分离成单细胞悬液以便培养，A正确； B、干细胞需诱导分化为肌肉细胞才能形成类似肌肉的组织，B正确； C、动物细胞培养的气体环境通常为95%空气和5%CO₂（维持pH），而非95%O₂，高浓度O₂可能抑制细胞呼吸，C错误； D、通过调控干细胞分化可定制肉质，符合技术发展前景，D正确。 故选C。 2．（24-25高二下·北京房山·期末）甲流试纸中的一种特异性抗体是针对甲流病毒核蛋白（NP）的抗体。下列关于该单克隆抗体制备过程的叙述，正确的是（　　） A．需利用100%O2培养箱培养细胞 B．需要制备导入NP基因的小鼠 C．筛选过程利用了抗原－抗体结合的原理 D．筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞 【答案】C 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞，诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、动物细胞培养的气体环境为95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的PH），A错误； B、制备单克隆抗体需用NP蛋白免疫小鼠，使其B细胞产生相应抗体，而非直接导入NP基因，B错误； C、第二次筛选需用抗原检测抗体是否分泌，利用了抗原-抗体特异性结合的原理，C正确； D、单克隆抗体由单一杂交瘤细胞克隆产生，只能分泌一种抗体，D错误。 故选C。 3．（24-25高二下·北京丰台·期末）某次动物细胞培养时，调控pH的CO₂耗尽，培养基由初始的淡红色转为黄色。据此推测，使培养基呈淡红色的是（    ） A．酸碱指示剂 B．氨基酸 C．血清 D．糖类 【答案】A 【详解】A、酸碱指示剂（如酚红）在培养基中用于显示pH变化，酸性时呈淡红色，中性/弱碱性时变黄，A正确； B、氨基酸是培养基中的营养成分，用于细胞代谢，不直接参与pH指示，B错误； C、血清提供生长因子等物质，但不会直接导致颜色变化，C错误； D、糖类作为碳源参与细胞呼吸，代谢产物可能影响pH，但颜色变化由指示剂直接反映，D错误。 故选A。 4．（24-25高二下·北京海淀·期末）关于动物细胞培养，下列叙述正确的是（　　） A．获得的动物组织需用胃蛋白酶分散细胞 B．所培养的细胞一般悬浮生长或贴壁生长 C．培养期间需通入5%的CO2以刺激细胞呼吸 D．培养过程中需密闭培养瓶以保证无菌环境 【答案】B 【分析】动物细胞培养的条件：（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物．（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质．（3）温度和PH．（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（CO2的作用是维持培养液的PH）。 【详解】A、动物细胞培养中分散组织通常使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶，A错误； B、动物细胞在培养时，大多数正常细胞会贴附在培养器皿表面生长（贴壁生长），而少数细胞（如某些癌细胞）可能悬浮生长，B正确； C、培养时通入5% CO₂的主要作用是维持培养液的pH，C错误； D、动物细胞培养需在含有95%空气和5% CO₂的开放环境中进行，以保证氧气供应和pH稳定，D错误。 故选B。 5．（24-25高二下·北京·期末）MDCK细胞是从犬肾脏组织中分离培育建立的细胞系，MDCK细胞对流感病毒易感。下列关于利用悬浮培养技术培养MDCK细胞的相关叙述，不正确的是（　　） A．悬浮培养MDCK细胞可有效避免贴壁生长与接触抑制现象 B．培养MDCK细胞时，需要为其创造95%空气和5%CO2的气体环境 C．培养MDCK细胞时，为减少杂菌污染需定期更换培养液 D．MDCK细胞可用于流感病毒的扩增及特性等研究 【答案】C 【分析】动物细胞培养过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。 【详解】A、悬浮培养的细胞在液体培养基中自由生长，无需贴附于固定表面，因此可避免贴壁生长及接触抑制现象，A正确； B、动物细胞培养通常需要5%CO₂的气体环境以维持培养液pH，而氧气浓度与空气相近（约21%），选项B中“95%空气”指正常空气比例，与5%CO₂共同构成气体环境，B正确； C、定期更换培养液的主要目的是补充营养物质并清除代谢废物，而非减少杂菌污染（污染需通过无菌操作和抗生素预防），C错误； D、MDCK细胞对流感病毒易感，可作为宿主细胞用于病毒扩增及特性研究，D正确。 故选C。 6．（24-25高二下·北京怀柔·期末）下列关于动植物细胞融合的叙述不正确的是（　　） A．融合过程都需要无菌操作 B．融合前都需要制备原生质体 C．都体现了细胞膜的流动性 D．都可以使远缘杂交成为可能 【答案】B 【分析】动物细胞融合与植物体细胞杂交相比，诱导融合的方法、所用的技术手段、所依据的原理均不完全相同，且动物细胞融合只能形成杂种细胞，而植物细胞融合能形成杂种个体。 【详解】A、动植物细胞融合均需在无菌条件下进行，避免微生物污染，A正确； B、动物细胞无细胞壁，可直接诱导融合，无需制备原生质体；而植物细胞需去除细胞壁形成原生质体后才能融合，B错误； C、细胞融合依赖细胞膜的流动性，这是两者的共同原理，C正确； D、细胞融合技术可打破生殖隔离，实现远缘杂交，如制备杂种细胞，D正确。 故选B。 7．（24-25高二下·北京西城·期末）将适应贴壁培养的aMDCK细胞进行驯化，获得适应悬浮培养的sMDCK细胞。相同条件下两种细胞的生长差异如图，对其分析错误的是（　　） A．aMDCK细胞的生长不受接触抑制的影响 B．168h后sMDCK细胞密度下降可能与营养不足、有害代谢产物积累有关 C．sMDCK细胞更有可能实现高密度培养 D．驯化可能改变了MDCK细胞的基因表达 【答案】A 【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 【详解】A、从图中可以看出随培养时间的延长，aMDCK细胞密度变化不大，有接触抑制，A错误； B、168h后sMDCK细胞密度下降可能与营养不足、有害代谢产物积累有关，B正确； C、随着培养时间延长，sMDCK细胞的密度增大，说明更有可能实现高密度培养，C正确； D、MDCK细胞驯化变成sMDCK细胞后，其细胞密度明显发生变换，说明驯化可能改变了MDCK细胞的基因表达D 故选A。 8．（24-25高二下·北京东城·期末）细胞悬浮培养是将细胞接种于液体培养基中并保持良好分散状态的培养方式，广泛应用于生物制药、细胞生物学研究等领域。下列相关叙述错误的是（    ） A．悬浮培养可增加细胞与培养液的接触，促进营养物质吸收 B．若培养密度过大，会出现有害代谢产物积累使分裂受阻 C．对动物细胞进行悬浮培养时通常不会发生接触抑制现象 D．对动物细胞进行悬浮培养不需传代，适合规模化培养 【答案】D 【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 【详解】A、悬浮培养使细胞分散于培养液中，充分接触培养基，利于吸收营养，A正确； B、高密度培养时，代谢废物（如乳酸、氨等）积累会抑制细胞分裂，B正确； C、接触抑制发生于贴壁生长的细胞，悬浮培养的细胞因分散而不受此限制，C正确； D、悬浮培养的细胞增殖后仍需分瓶传代（如更换新鲜培养基），否则会因密度过大导致死亡，D错误。 故选D。 9．（2024·北京海淀·二模）研究者将M病毒膜蛋白注射小鼠，分离小鼠脾细胞并将其与S细胞融合，通过筛选获得单个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。下列相关叙述正确的是（    ） A．用完全培养液培养M病毒，通过离心可获得膜蛋白作为抗原 B．可用M病毒膜蛋白多次免疫小鼠，以获得更多的浆细胞 C．S细胞应具备产生抗体和无限增殖的能力 D．体外培养单个杂交瘤细胞获得大量抗体体现了细胞的全能性 【答案】B 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、M病毒必须寄生在活细胞中才能完成生命活动，故不能用动物细胞培养液培养M病毒，A错误； B、可用M病毒膜蛋白（抗原）多次免疫小鼠，以获得更多的能产生特异性抗体的浆细胞，B正确； C、S细胞不是杂交瘤细胞，具有无限繁殖的特点，不具有产生抗体的特点，C错误； D、体外培养单个杂交瘤细胞由于没有发育完整有机体或分化为任何细胞，因此不能体现细胞的全能性，D错误。 故选B。 10．（23-24高二下·北京朝阳·期末）我国科研工作者运用生物打印技术将肌腱干细胞和骨髓间充质干细胞以分层方式分布在支架中，制备了下图所示的可用于肌腱与骨组织界面再生的多细胞支架。相关叙述正确的是（    ） A．同一个体的肌腱细胞与骨细胞的形态、结构和功能差异是基因选择性缺失的结果 B．肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞能自我更新和分化为成年动物体内的任何一种细胞 C．体外培养两种干细胞均需要无菌无毒、36.5℃左右、pH7.2～7.4和适宜渗透压条件 D．利用多细胞支架治疗肌腱断裂可保证异体来源的细胞移植不引起免疫排斥 【答案】C 【分析】动物细胞培养：指从动物细胞中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。动物细胞培养的条件：①营养：一般用液体培养基，要添加血清，以补充动物细胞所需的未知营养物质；②无菌无毒的环境：培养液定期更换以清除代谢物，防止代谢物积累对细胞自身造成危害；③温度、PH和渗透压：温度为36.5±0.5℃、PH为7.2~7.4。④气体环境：95%空气和5%CO2。 【详解】A、同一个体的肌腱细胞与骨细胞的遗传物质相同，但形态、结构和功能存在差异，这是基因选择性表达的结果，A错误； B、肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不能分化为成年动物体内的任何一种细胞，B错误； C、体外培养两种干细胞均需要提供适宜的条件，如无菌、无毒的环境；营养物质；适宜的温度、pH和渗透压：温度为36.5±0.5℃、PH为7.2~7.4；适宜的气体环境等，C正确； D、肌腱与骨组织界面再生的多细胞支架所利用的肌腱干细胞和骨髓间充质干细胞可来源于病人本身，将它用于病人体内，理论上可以避免发生免疫排斥反应，而不能保证异体来源的细胞移植不引起免疫排斥，D错误。 故选C。 11．（23-24高二下·北京大兴·期末）人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞培养。下列有关动物细胞培养的叙述错误的是（    ） A．动物细胞培养的环境需要O₂，也需要一定浓度的CO₂ B．动物细胞培养是动物细胞工程的基础，培养时需保证无菌、无毒的环境 C．培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 D．动物细胞培养的原理是动物细胞的全能性 【答案】D 【分析】动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。一般来说，动物细胞培养需要满足的条件有：营养；无菌、无毒的环境；适宜的温度、pH和渗透压；气体环境（通常采用培养皿或松盖培养瓶，将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养）。 【详解】A、动物细胞培养时，一般要在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养，A正确； B、动物细胞培养是动物细胞工程的基础，培养时需保证无菌、无毒的环境，以防止杂菌污染，B正确； C、培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清，C正确； D、动物细胞培养的原理是细胞增殖（有丝分裂），D错误。 故选D。 12．（23-24高二下·北京东城·期末）为缓解饲养动物带来的环境、经济压力，与传统肉类感官特性相似的“细胞培养肉”引发人们关注。其生产流程如下图，以下叙述不正确的是（　　） A．技术应用了干细胞能分化成其他类型细胞的原理 B．体外培养干细胞时需置于 CO2培养箱以促进细胞呼吸 C．生物反应器扩大生产时培养基需加入动物血清等物质 D．细胞培养肉进入市场销售前还需进行安全性评估 【答案】B 【分析】动物细胞培养的条件：①营养：一般用液体培养基，要添加血清，以补充动物细胞所需的未知营养物质；②无菌无毒的环境：培养液定期更换以清除代谢物，防止代谢物积累对细胞自身造成危害；③温度、PH和渗透压：温度为36.5±0.5℃、PH为7.2~7.4。④气体环境：95%空气和5%CO2。 【详解】A、分析题图可知，干细胞分化成了肌肉细胞和脂肪细胞，说明技术应用了干细胞能分化成其他类型细胞的原理，A正确； B、体外培养干细胞时需置于含95%空气和5%CO2的培养箱中，其中O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH，B错误； C、生物反应器扩大生产时培养基需加入动物血清等物质，以满足动物细胞对未知营养物质的需求，C正确； D、细胞培养肉进入市场销售前还需进行安全性评估，符合相应标准才能上市，D正确。 故选B。 13．（23-24高二下·北京东城·期末）动物细胞培养和植物组织培养技术都是细胞工程的基础性技术，两种技术都（　　） A．能实现大量获得细胞产物 B．以细胞的全能性为技术原理 C．需要使用液体培养基 D．使用酶将组织分散为细胞 【答案】A 【分析】1、植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术，其原理为植物细胞的全能性。植物组织培养中细胞表现出全能性的条件为：离体、严格的无菌条件、适宜的培养条件及适宜浓度和比例的激素。 2、动物细胞培养：指从动物细胞中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 【详解】A、动物细胞培养的可获得大量的细胞或细胞产物，生产实践中可将外植体脱分化获得愈伤组织，再经过细胞分裂可获得大量细胞进而获得大量细胞产物，即动物细胞培养和植物组织培养技术都能实现大量获得细胞产物，A正确； B、动物细胞培养过程中没有发育成完整个体，也没有分化成其他各种细胞，没有体现细胞的全能性，B错误； C、植物组织培养技术使用固体培养基，动物细胞培养一般使用液体培养基，C错误； D、植物组织培养技术不需要用酶将组织分散成细胞，动物细胞培养需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将组织分散为细胞，D错误。 故选A。 14．（23-24高二下·北京西城·期末）动物细胞培养分为贴壁培养和悬浮培养。科学家尝试驯化贴壁依赖性细胞——犬肾脏细胞（MDCK），使其能悬浮培养，结果如图所示。下列说法错误的是（　　） A．贴壁细胞在生长增殖时会出现接触抑制现象 B．细胞活率反映驯化过程中MDCK的适应程度 C．MDCK先适应悬浮培养环境再开始大量增殖 D．悬浮培养不需进行传代，适合规模化培养 【答案】D 【分析】动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。 【详解】A、贴壁细胞随着细胞的生长和增殖会出现接触抑制现象，从而停止生长和分裂，A正确； B、该实验的目的将贴壁依赖性的MDCK驯化为能悬浮培养的细胞，细胞活率为因变量，反映驯化过程中MDCK的适应程度，B正确； C、由题图可知，随着驯化时间的延长，细胞活率先下降后增加，说明MDCK先适应悬浮培养环境再开始大量增殖，C正确； D、培养过程中由于营养物质的消耗及代谢废物的积累，不利于细胞增殖，故悬浮培养也需进行传代，D错误。 故选D。 15．（22-23高二下·北京海淀·期末）敲除大鼠心肌细胞H的T基因，对照组与敲除组的H细胞在培养瓶中贴壁生长，检测两组细胞的数量变化，结果如图所示。下列相关叙述不合理的是（    ） A．体外培养H细胞需要添加动物血清 B．可用胰蛋白酶处理H细胞便于计数 C．敲除T基因的H细胞失去了分裂能力 D．提高T基因表达可能促进心脏损伤修复 【答案】C 【分析】对照组与敲除组的区别是有无T基因，相同培养时间内，对照组的H细胞数量多于敲除组，说明T基因的存在能促进细胞的分裂。 【详解】A、动物细胞培养时常加入动物血清，因此体外培养H细胞需要添加动物血清，A正确； B、可用胰蛋白酶处理H细胞使其分离为单细胞，便于计数，B正确； C、随着时间的延长，敲除组的H细胞数量依然增加了，说明敲除T基因的H细胞仍然有分裂能力，C错误； D、对照组含有T基因，相同培养时间内，对照组的细胞数量多于敲除组，说明T基因能促进细胞分裂，因此提高T基因表达可能促进心脏损伤修复，D正确。 故选C。 16．（22-23高二下·北京石景山·期末）下图为幼鼠肾脏上皮细胞培养过程示意图，已知肾脏上皮细胞属于需要贴附于某些基质表面才能生长增殖的细胞。下列叙述不正确的是 （    ） A．甲→乙过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 B．丙过程会出现细胞贴壁和接触抑制现象 C．丙、丁过程均要在无菌、无毒的环境下进行 D．丁过程为传代培养，细胞都能进行无限增殖 【答案】D 【分析】原代培养 ：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)或机械方法处理，分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养；传代培养：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代，即将分瓶之后的培养称为传代培养。 【详解】A、甲→乙过程表示将组织块分散成单个细胞，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，A正确； B、丙过程表示原代培养，对于需要贴附于某些基质表面才能生长增殖的细胞而言，在培养过程中会出现细胞贴壁和接触抑制现象，B正确； C、细胞培养丙（原代培养）、丁（传代培养）均需要营造无菌、无毒的培养环境，C正确； D、丁过程是传代培养过程，该过程少部分细胞遗传物质可能发生了变化，进而无限繁殖，D错误。 故选D。 17．（23-24高二下·北京西城·期末）临床常采用化疗方法治疗癌症。化疗药物通过影响DNA合成、损伤DNA等方式杀伤肿瘤细胞，长期使用易导致肿瘤细胞产生耐药性。科研人员以消化道恶性肿瘤——结直肠癌（CRC）组织为材料，期望通过分析耐药机制找到新的治疗靶点。 (1)从CRC病人体内取出肿瘤组织，用___酶处理得到单个细胞进行体外培养。细胞分离和培养均需在___环境下进行。 (2)通过多次给CRC细胞施加化疗药物5-FU，得到耐药性癌细胞（DR），检测发现DR中LGR4蛋白表达量显著高于CRC细胞。为探究LGR4的作用，研究者用LGR4正常表达和低表达的CRC细胞进行相关实验，检测DNA损伤程度，结果如图1。实验结果表明LGR4参与耐药性的形成，判断的依据是___。 (3)LGR4是细胞膜上的受体蛋白，被激活后可调控细胞增殖、分化相关信号通路。研究者尝试制备LGR4抗体作为治疗耐药性的药物。 ①向小鼠体内注射___对其进行免疫，之后取___细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过系列筛选获得杂交瘤细胞，生产高亲和力的抗体。 ②在化疗的基础上，将上述抗体应用于DR的抗药性治疗，请在图2中补全实验分组的处理并图示预期结果___（用“+”或“-”表示添加或不添加）。 (4)进一步研究表明，LGR4被激活后会促进S基因的转录，S基因表达产物是细胞死亡的抑制因子。综合上述结果和信息，分析施加LGR4抗体缓解耐药性的分子机制___。 【答案】(1) 胰蛋白/胶原蛋白 无菌无毒 (2)与LGR4正常表达组相比，低表达组在持续施加5-FU 药物后，荧光团的拖尾严重/细胞DNA损伤明显 (3) LGR4 B淋巴 (4)LGR4抗体与LGR4结合，使LGR4不能被激活，S基因表达产物减少，对细胞死亡的抑制作用减弱，使癌细胞在化疗药物使用时更多死亡 【分析】细胞一般要经过生长、增殖、衰老、凋亡的生命历程。细胞分化的根本原因是基因的选择性表达。细胞凋亡有利于多细胞生物体完成正常发育，维持内部环境的稳定，抵御外界各种因素的干扰。细胞癌变的原因是在致癌因子的作用下，细胞中原癌基因和抑癌基因发生突变，导致正常细胞的生长和分裂失控。癌症的发生不是单一基因突变的结果，至少在一个细胞中发生5~6个基因突变，才出现癌细胞的所有特点。 【详解】（1）细胞的分离和培养，从CRC(结直肠癌)病人体内取出肿瘤组织，首先需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理得到单个细胞。这些酶能够分解细胞外基质和细胞间的粘连蛋白，从而使组织分解为单个细胞。细胞分离和培养都需要在无菌无毒的环境下进行，以避免细胞受到微生物污染和有害物质的影响。 （2）通过多次给CRC细胞施加化疗药物5-FU，得到耐药性癌细胞(DR)。研究发现，DR中LGR4蛋白表达量显著高于CRC细胞。为探究LGR4的作用，研究者用LGR4正常表达和低表达的CRC细胞进行相关实验，检测DNA损伤程度。实验结果表明，与LGR4正常表达组相比，低表达组在持续施加5-FU药物后，荧光团的拖尾严重，即细胞DNA损伤明显。这说明LGR4参与耐药性的形成。 （3）研究者尝试制备LGR4抗体作为治疗耐药性的药物。向小鼠体内注射LGR4对其进行免疫之后取B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过系列筛选获得杂交瘤细胞生产高亲和力的抗体。 在化疗的基础上将上述抗体应用于DR的抗药性治疗，预期结果是通过添加LGR4抗体，使得LGR4不能被激活，从而减少S基因表达产物，对细胞死亡的抑制作用减弱，使癌细胞在化疗药物使用时更多死亡。故预期结果如图所示： （4）LGR4被激活后会促进S基因的转录，S基因表达产物是细胞死亡的抑制因子。施加LGR4抗体后，LGR4抗体与LGR4结合，使LGR4不能被激活，S基因表达产物减少，对细胞死亡的抑制作用减弱，使癌细胞在化疗药物使用时更多死亡，这是缓解耐药性的分子机制。 18．（22-23高二下·北京东城·期末）乙肝由乙型肝炎病毒（HBV）引起。我国科学家由于在此领域做出重要贡献而获得了布隆伯格奖。 (1)HBV由一层包膜和一个含DNA分子的核衣壳组成，包膜上pre-SI区域是病毒进入细胞的关键结构。HBV能感染的动物只有人、猩猩和树鼩，且只能侵染肝细胞，原因是_____。 (2)将树鼩肝脏细胞剪碎后经_____处理进行体外培养，加入_____肽段后经检测确定细胞膜上与该肽段特异性结合的是NTCP蛋白。 (3)人的NTCP也可与该肽段特异性结合。为验证NTCP在肝细胞感染HBV中的作用，设计一种能与NTCP的mRNA互补结合的siRNA，加入可被HBV侵染的人HepaRG细胞中（如图1），先后检测HBV侵染前细胞中NTCP mRNA量、HBV侵染细胞一段时间后HBV的RNA量，结果如图2。 ①加入siRNA的目的是_____。甲组（对照组）细胞中加入的是等量_____。 ②实验表明NTCP是肝细胞感染HBV的关键受体，判断依据是_____。 (4)为进一步验证上述结论，利用不易被HBV感染的HepG2细胞进行实验（如图3）。 ①表中a、b处分别为_____。 组别 实验材料 实验处理 导入受体细胞的质粒 抑制HBV感染的药物 1 HepG2细胞 空质粒 b 2 a 不加入 3 加入 ②实验处理后分别在第4、10天检测病毒含量的相对值（如图4），结果支持（3）结论。请在图4中画出处理后10天的柱状图_____。 【答案】(1)人、猩猩和树鼩的肝细胞表面有HBV受体 (2) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 pre-S1 (3) 与NTCP mRNA结合后抑制翻译（抑制表达） 不与NTCP mRNA互补结合的RNA 乙组的NTCP mRNA含量和HBV的RNA含量均明显低于甲组，即siRNA抑制NTCP表达时HBV的感染率也降低 (4) 含NTCP基因的质粒；不加入    【分析】动物细胞培养过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中(原代培养)→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液(传代培养)→放入二氧化碳培养箱培养。 【详解】（1）因为人、猩猩和树鼩的肝细胞表面有HBV受体，故HBV能感染的动物只有人、猩猩和树鼩，且只能侵染肝细胞。 （2）取树鼩肝脏细胞剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞后进行体外培养，NTCP蛋白能与pre-S1肽段特异性结合，故加入pre-S1肽段后经检测确定细胞膜上与该肽段特异性结合的是NTCP蛋白。 （3）siRNA与NTCP mRNA结合后抑制翻译（抑制表达）。分析题意可知，自变量是是否加入与NTCP mRNA互补结合的RNA，故甲组（对照组）细胞中加入的是等量不与NTCP mRNA互补结合的RNA。因为乙组的NTCP mRNA含量和HBV的RNA含量均明显低于甲组，即siRNA抑制NTCP表达时HBV的感染率也降低，故NTCP是肝细胞感染HBV的关键受体。 （4）为验证NTCP是肝细胞感染HBV的关键受体，利用不易被HBV感染的HepG2细胞进行实验，则组别1是空白对照，导入的是空质粒，不加入抑制HBV感染的药物，组别2、3是实验组，导入含NTCP基因的质粒。若结果支持（3）结论，实验处理后组别1、2第4、10天病毒很低且没有变化，而组别2的病毒逐渐升高。 19．（24-25高二下·北京顺义·期末）细胞在衰老过程中会逐渐退出细胞周期。科学家以小鼠为材料，研究胚胎干细胞产生的外泌体（HE）对细胞衰老的影响，为缓解与衰老相关的疾病提供了新的治疗策略。 (1)体外培养小鼠细胞时，需用胰蛋白酶处理组织块，目的是获得______。处理后的初次培养称为______，分瓶后的细胞逐渐丧失分裂能力，走向衰老。 (2)科研人员用胚胎干细胞分泌的HE处理培养至50代的细胞，检测细胞衰老标志物SA-β和S期（DNA复制）细胞的比例，结果如图。 实验结果表明______。 (3)进一步研究发现HE中富含miR-302b（一种miRNA）。为确定其主要作用靶点，科研人员开展以下研究。 ①用HE处理小鼠细胞，发现三个细胞周期抑制基因C1、C2、C3的表达发生显著变化。 ②借助生物信息学工具测算miR-302b与Cl、C2、C3的mRNA相互作用的最小自由能ΔG（kcal/mol）分别为-12.84、-6.1、-6.2。（形成氢键越多，ΔG越低，无关序列ΔG约-4~-7） 请基于上述结果，提出假说解释miR-302b调控细胞周期的机理______。 (4)为验证上述假设，科研人员将荧光素酶基因与miR-302b基因连接，转染野生型和靶基因突变体细胞，裂解细胞后加入底物，检测荧光强度。当miR-302b与靶基因mRNA结合后，荧光素酶mRNA被降解，导致荧光值下降。若实验结果为______，则支持上述假设。 受体细胞 荧光强度相对值 对照组（仅导入荧光素酶基因） 实验组 野生型 1.5 A 靶基因突变体 B (5)基于上述研究成果，研究人员设计了一款含miR-302b的保健品，请评估其安全风险______。 【答案】(1) 单个细胞 原代培养 (2)HE能改善细胞衰老，促进细胞有丝分裂 (3)miR-302b通过与C1 mRNA结合抑制C1基因的表达，解除对细胞周期的抑制 (4)A＜1.5、B≈1.5 (5)可能增加患癌风险 【分析】动物细胞培养是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 【详解】（1）体外培养小鼠细胞时，组织块由多个细胞紧密连接而成。用胰蛋白酶处理组织块，可分解细胞间的蛋白质（如胶原蛋白 ），使细胞分散，获得单个细胞 ，便于后续培养。处理后的细胞初次进行的培养称为原代培养 。 （2）左图（SA - β - gal 阳性率 ）：第 50 代细胞（衰老细胞 ）的 SA - β - gal 阳性率显著高于第 30 代细胞（年轻细胞 ）；而 “第 50 代细胞 + HE” 组的 SA - β - gal 阳性率明显低于 “第 50 代细胞” 组 。右图（S 期细胞比例 ）：第 50 代细胞的 S 期（DNA 复制期 ）细胞比例显著低于第 30 代细胞；而 “第 50 代细胞 + HE” 组的 S 期细胞比例明显高于 “第 50 代细胞” 组 。 综合两图可知：HE 能降低细胞衰老标志 SA - β - gal 的阳性率，提高 S 期细胞比例，说明 HE 可延缓细胞衰老。 （3）已知 “形成氢键越多，ΔG 越低；无关序列 ΔG 约 - 4~ - 7” ，而 miR - 302b 与 C1 的 mRNA 相互作用的 ΔG（ - 12.84 ）远低于与 C2、C3 的 ΔG（ - 6.1、 - 6.2 ），且低于无关序列的 ΔG 。这说明 miR - 302b 与 C1 的 mRNA 结合形成的氢键更多，结合更紧密、特异性更强 。细胞周期抑制基因 C1 的表达变化显著，且 miR - 302b 与 C1 的 mRNA 作用最强，因此假说为：miR - 302b 主要通过与细胞周期抑制基因 C1 的 mRNA 结合，抑制其表达，从而调控细胞周期，延缓细胞衰老 （注：若结合 C2 或 C3 也可，但 C1 的 ΔG 最低，是最可能的主要靶点 ）。 （4）实验原理：若 miR - 302b 与靶基因 mRNA 结合，荧光素酶 mRNA 会被降解，荧光值下降；若靶基因突变，miR - 302b 无法结合，荧光素酶 mRNA 不被降解，荧光值高 。 野生型细胞（靶基因正常）中，miR-302b 与靶基因 mRNA 结合，荧光素酶 mRNA 被降解，实验组荧光强度（A ）低于对照组 。 靶基因突变体细胞（靶基因异常）中，miR-302b 无法与靶基因 mRNA 结合，荧光素酶 mRNA 不被降解 ，实验组荧光强度（B ）接近对照组，且高于野生型实验组 。 （5）miR - 302b 可调控细胞周期，若过量摄入，可能会干扰正常细胞的周期调控 ，导致细胞异常增殖（如诱发肿瘤 ）。 人体与小鼠的生理机制存在差异，miR - 302b 在人体中的作用效果、代谢途径尚不明确，可能引发未知的副作用 。 20．（24-25高二下·北京西城·期末）外泌体是细胞分泌的内含多种生物活性分子的囊泡。研究表明，干细胞外泌体（Exos）有抗衰老功能。为研究其抗衰老机理，以成纤维细胞和小鼠为材料开展了实验。 (1)在体外培养成纤维细胞时，需要保证环境条件__________。对贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要的材料用具有__________（多选）。 A．胰蛋白酶溶液        B．细胞培养液     C．PEG            D．CO2培养箱 (2)成纤维细胞在传代30次（PDL30）时处于年轻状态，在PDL50时完全衰老。用Exos处理成纤维细胞，72h后检测细胞中DNA含量（图1），以及细胞周期抑制因子基因Cdkn1a和Ccng2的表达（图2）。 ① 细胞周期停滞是衰老细胞的基本特征。 图1结果表明Exos可逆转衰老细胞的细胞周期停滞，促进细胞增殖，依据是______。 ② 综合图1和图2结果推测，Exos使衰老细胞恢复活力的机理是__________。 (3)实验表明，Exos中的miR-302b（一种非编码小RNA）在抗衰老中发挥了关键作用。miR-302b可与靶基因mRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合，诱导其降解或抑制mRNA的__________，从而调控靶基因表达。 (4)双荧光素酶报告基因技术可用于检验miR-302b的靶基因。其中，萤火虫荧光素酶可催化荧光素氧化发出黄绿色光，海肾荧光素酶可催化腔肠素氧化发出蓝光。将图3所示含有两种荧光素酶基因的表达载体与miR-302b共同转入成纤维细胞系，一段时间后裂解细胞，分别检测两种荧光的强度。并以海肾荧光素酶基因作为内参基因，来校正不同组之间细胞数目、裂解效率的差异。 ① 为研究Cdkn1a是否为miR-302b的靶基因，研究者克隆出Cdkn1a基因中3'UTR序列对应片段，将其插入载体中，插入位置应为图3中的__________位点。 ② 实验结果为__________，说明Cdkn1a是miR-302b的靶基因。 【答案】(1) 无菌无毒 ABD (2) 与PDL30-对照组相比，PDL50-对照组处于S期细胞的比例较少；PDL50-Exos处理组S期细胞比例明显多于PDL50-对照 Exos抑制了衰老细胞中Cdkn1a和Ccng2的表达，进而逆转细胞周期停滞 (3)翻译 (4) A 表达载体中转入了3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系黄绿光/蓝光的比值显著小于对照组（未转入3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系） 【分析】细胞周期是指连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止所经历的全过程。体外培养细胞需要无菌无毒、适宜的营养、温度和PH、使用含95%空气和5% CO₂的混合气体。 【详解】（1）在体外培养细胞时，需要保证无菌、无毒、适宜的温度和pH、营养充足、气体环境适宜等环境条件。 对贴壁生长的细胞进行传代培养时，需要用胰蛋白酶溶液使细胞分散开来，还需要细胞培养液为细胞提供营养物质，同时要在CO2培养箱中维持适宜的pH和气体环境。PEG一般用于细胞融合，在此处不需要。所以答案为ABD。 （2）①观察图1，与PDL30-对照组相比，PDL50-对照组处于S期细胞的比例较少；PDL50-Exos处理组S期细胞比例明显多于PDL50-对照，这表明Exos可逆转衰老细胞的细胞周期停滞，促进细胞增殖。 ②由图2可知，与PDL50 - 对照相比，PDL50 - Exos处理组中细胞周期抑制因子基因Cdkn1a和Ccng2表达的蛋白减少，结合图1中Exos促进细胞增殖的结果，推测Exos抑制了衰老细胞中Cdkn1a和Ccng2的表达，进而逆转细胞周期停滞，从而促进细胞增殖，恢复活力。 （3）miR - 302b可与靶基因mRNA的3非翻译区（3UTR）结合，诱导其降解或抑制mRNA的翻译，从而调控靶基因表达。 （4）①要研究Cdkn1a是否为miR - 302b的靶基因，因为miRNA是通过与靶基因的3'UTR区域结合来发挥作用的，而萤火虫荧光素酶基因用于检测目的基因（这里假设与Cdkn1a关联）的表达情况，所以应将Cdkn1a基因中3'UTR序列对应片段插入到萤火虫荧光素酶基因的下游，即图3中的A位点。这样如果miR - 302b能与插入的3'UTR序列结合，就会影响萤火虫荧光素酶基因的表达，从而通过荧光强度变化体现出来。 ②实验结果为表达载体中转入了3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系黄绿光/蓝光的比值显著小于对照组（未转入3'UTR序列对应片段的成纤维细胞系），则说明Cdkn1a是miR-302b的靶基因。 地 城 考点02 单克隆抗体制备 21．（24-25高二下·北京海淀·期末）人正常乳腺细胞与人乳腺癌细胞表面有部分相同的膜蛋白。科研人员设计下图所示流程，生产针对人乳腺癌细胞的单克隆抗体。 下列叙述不正确的是（　　） A．过程①从小鼠体内分离得到多种针对人正常乳腺细胞的抗体 B．过程②使用选择培养基和抗原 - 抗体杂交筛选特定杂交瘤细胞 C．抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞必须在小鼠体外进行扩大培养 D．该单克隆抗体可与毒素连接实现对乳腺癌细胞的特异性杀伤 【答案】C 【分析】单克隆抗体的制备：（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞；（2）获得杂交瘤细胞：①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体；（3）克隆化培养和抗体检测；（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖；（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。 【详解】A、过程①从小鼠体内分离得到的是多种抗体，因为人正常乳腺细胞不仅仅提供一种抗原，A正确； B、过程②使用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再用抗原 - 抗体杂交技术筛选出特定杂交瘤细胞，B正确； C、抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞可在小鼠体外进行扩大培养，也可在小鼠腹水（体内）中培养，C错误； D、该单克隆抗体特异性识别并结合乳腺癌细胞，与毒素连接后可实现特异性杀伤，D正确。 故选C。 22．（24-25高二下·北京·期末）科学家以水稻（2n=24）和稗草（2n=54）为材料，利用植物体细胞杂交技术获得了具有稗草抗逆性（如耐盐、抗除草剂）的水稻，流程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．获得原生质体时，需要在低渗溶液中用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 B．原生质体融合前需用胰蛋白酶处理，以获得有活力的原生质体 C．可以用离心、聚乙二醇或灭活病毒诱导两种原生质体融合 D．该技术打破水稻与稗草之间的物种界限，实现了远缘杂交育种 【答案】D 【分析】植物体细胞杂交技术是将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。该技术能克服远缘杂交不亲和的障碍，为培育新品种提供了新途径。 【详解】A、植物细胞壁主要成分为纤维素和果胶，需用纤维素酶和果胶酶去除。但原生质体无细胞壁保护，在低渗溶液中会因吸水破裂，因此需在等渗或适宜的高渗溶液中处理， A错误； B、胰蛋白酶的作用是分解动物细胞间的蛋白质，使动物细胞分散，而植物原生质体制备无需胰蛋白酶，B错误； C、灭活病毒是动物细胞融合的诱导方法，不适用于植物原生质体融合，原生质体融合的诱导方法包括，物理法：离心、振动、电融合等；化学法：聚乙二醇（PEG）融合法，C错误； D、水稻和稗草属于不同物种，存在生殖隔离（远缘杂交不亲和），植物体细胞杂交技术通过融合二者的原生质体，直接获得杂种细胞并培育成植株，打破了物种界限，实现了远缘杂交育种， D正确。 故选D。 23．（24-25高二下·北京顺义·期末）小分子化合物丁香酚对鲜活水产品有麻醉效果，可提高运输存活率。科研人员制备抗丁香酚单克隆抗体，用于检测水产品中残存的丁香酚，流程如图。下列描述错误的是（    ） A．①过程抗原被小鼠抗原呈递细胞摄取 B．②过程需要使用特定的选择培养基 C．甲既能产生抗丁香酚抗体又能无限增殖 D．③目的是为杂交瘤细胞提供营养和环境 【答案】B 【分析】单克隆抗体制备过程中有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，使用特定的选择培养基（如 HAT 培养基）进行筛选；第二次采用抗原 - 抗体特异性结合的原理，筛选出能产生与丁香酚特异性结合抗体的杂交瘤细胞。 【详解】A、①过程抗原被小鼠抗原呈递细胞摄取，随后激活B细胞，A正确； B、②过程属于第二次筛选，采用抗原 - 抗体特异性结合的原理，筛选出能产生与丁香酚特异性结合抗体的杂交瘤细胞，B错误； C、甲是经筛选的杂交瘤细胞，继承了 B 细胞 “分泌抗丁香酚抗体” 和骨髓瘤细胞 “无限增殖” 的特性，C正确； D、③是将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，利用小鼠腹腔的营养和环境 ，让细胞增殖并分泌抗体，最终从腹水中获取高浓度单克隆抗体，D正确。 故选B。 24．（24-25高二下·北京顺义·期末）科研人员模拟胚胎发育过程中的信号通路和微环境，成功诱导iPSC（诱导多能干细胞）成为功能性心肌细胞，用于心肌细胞的修复和再生。下列叙述正确的是（    ） A．此过程需借助动物细胞融合技术 B．iPSC与心肌细胞的基因组成不同 C．此过程中发生了细胞分裂和分化 D．胚胎发育的微环境不影响基因表达 【答案】C 【详解】细胞分化的实质是基因的选择性表达，细胞分化的过程中DNA不变，RNA和蛋白质会发生改变。 【分析】A、动物细胞融合技术用于将不同细胞融合，而iPSC分化为心肌细胞属于细胞分化，无需细胞融合，A错误； B、iPSC与心肌细胞由同一来源细胞重编程或分化而来，基因组成相同，但基因表达情况不同，B错误； C、iPSC诱导为心肌细胞需通过细胞分裂增加数量，并通过分化形成特定功能细胞，C正确； D、胚胎微环境中的信号通路可调控基因选择性表达，直接影响细胞分化方向，D错误。 故选C。 25．（24-25高二下·北京朝阳·期末）动物细胞工程技术在生物制药和物种繁育等领域广泛应用。下列相关叙述错误的是（　　） A．病人体细胞诱导为iPS细胞后直接植入体内，可用于治疗 B．动物细胞培养中的接触抑制现象可防止细胞过度增殖 C．动物组织经胰蛋白酶处理后，初次培养的细胞即原代细胞 D．B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得能增殖并分泌抗体的细胞 【答案】A 【分析】动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物工程技术的基础。 【详解】A、iPS细胞（诱导多能干细胞）具有多向分化潜能，但直接植入体内可能因未定向分化而异常增殖形成肿瘤，需先体外诱导分化成特定细胞后再移植，A错误； B、接触抑制是动物细胞贴壁生长时，相邻细胞接触后停止分裂的现象，可防止细胞过度增殖，B正确； C、原代细胞指从动物组织经胰蛋白酶分散后初次培养的细胞，描述符合定义，C正确； D、B细胞与骨髓瘤细胞融合后，需通过两次筛选（杂交瘤细胞筛选和抗体分泌检测）获得能增殖并分泌抗体的杂交瘤细胞，D正确。 故选A。 26．（24-25高二下·北京西城·期末）以甲型流感病毒NA蛋白为抗原，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。相关叙述错误的是（　　） A．需要先用NA蛋白免疫小鼠 B．进行抗体类型筛选后的B淋巴细胞才可用于诱导融合 C．经选择培养的杂交瘤细胞还需克隆化培养和抗体检测 D．该单克隆抗体可用于甲型流感病毒的检测 【答案】B 【详解】单克隆抗体：由单个B淋巴细胞进行无性繁殖形成的细胞系所产生出的化学性质单一、特异性强的抗体。 A．制备单克隆抗体时，需用特定抗原（NA蛋白）免疫小鼠，小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞，A正确； B．B淋巴细胞在诱导融合前未经过抗体类型筛选，抗体筛选是在细胞融合后对杂交瘤细胞进行的，B错误； C．选择培养后的杂交瘤细胞需通过克隆化培养（保证单细胞来源）和抗体检测，以筛选出能分泌目标抗体的细胞群，C正确； D．单克隆抗体特异性强，可与甲型流感病毒的NA蛋白结合，因此可用于病毒检测，D正确； 故选B。 27．（23-24高二下·北京石景山·期末）单克隆抗体在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。下列叙述正确的是（　　） A．将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成的细胞均为杂交瘤细胞 B．单克隆抗体是不同于天然抗体的人工合成生物分子 C．将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合，可特异性识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞 D．将某灭活病原体作为疫苗接种人体后，能产生针对抗原的单克隆抗体 【答案】C 【分析】1、单克隆抗体是指由单个B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合成的杂交瘤细胞，进行进行有丝分裂增殖形成的细胞系所产生出的化学性质单一、特异性强的抗体。2、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。3、单克隆抗体的作用：①作为诊断试剂：（最广泛的用途）具有准确、高效、简易、快速的优点；②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症等。 【详解】A、将 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成的细胞不都为杂交瘤细胞，还可能有未融合的 B 淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞以及 B 淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞，只有 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的细胞才是杂交瘤细胞，A错误； B、单克隆抗体不是人工合成的生物分子，而是通过细胞融合技术产生的，其化学本质与天然抗体相同，B错误； C、将细胞毒素类药物与单克隆抗体结合，可特异性识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞。因为单克隆抗体能特异性地识别肿瘤细胞表面的抗原，将细胞毒素类药物带到肿瘤细胞所在位置，从而精准地杀伤肿瘤细胞，C正确； D、将某灭活病原体作为疫苗接种人体后，能产生针对抗原的多种抗体，而不是单克隆抗体。单克隆抗体是通过特定的技术手段制备的，疫苗接种引起的免疫反应产生的是多克隆抗体，D错误。 故选C。 28．（23-24高二下·北京·期末）新型冠状病毒（SARS-CoV-2）表面的S蛋白由S1和S2两个亚基组成。科研人员制备获得了鼠抗S蛋白特异性单克隆抗体，为分析该单克隆抗体的特异性，将SARS-CoV-2的S蛋白进行电泳得到图A，用该单克隆抗体进行抗原-抗体杂交并显色得到图B。下列表述错误的是（    ） A．该单克隆抗体特异性的识别S蛋白的S2亚基 B．制备单克隆抗体的过程体现了动物细胞膜具有流动性 C．免疫后小鼠体内的浆细胞只产生一种抗S蛋白抗体 D．制备单克隆抗体的过程可用灭活病毒诱导动物细胞融合 【答案】C 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再通过克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养杂交瘤细胞，最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、由电泳结果可知，图A有S1和S2两个条带，图B只有S2一个条带，且条带比图A宽，说明该单克隆抗体特异性地识别SARS-CoV-2中S蛋白的S2亚基，A正确； B、制备单克隆抗体的过程中，将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，细胞融合过程体现了细胞膜具有一定的流动性，B正确； C、免疫后的小鼠体内的浆细胞可能有多种，每一种浆细胞只产生一种特异性抗体，C错误； D、制备单克隆抗体的过程中，可用灭活的病毒诱导动物细胞融合，获得杂交瘤细胞，D正确。 故选C。 29．（23-24高二下·北京海淀·期末）植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术的共性是（    ） A．均出现贴壁生长现象 B．融合细胞的染色体组数均增加 C．均需用胰蛋白酶处理 D．均可用灭活的病毒诱导细胞融合 【答案】B 【分析】植物体细胞杂交技术是先用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞的细胞壁，获得原生质体，然后诱导两个原生质体融合，形成杂种细胞，再利用植物组织培养技术，将杂种细胞培育成杂种植株。 【详解】 A、动物细胞培养过程中会出现贴壁生长现象，而植物体细胞杂交技术过程中不会出现贴壁生长现象，A错误； B、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术得到的融合细胞的染色体组数均增加，B正确； C、植物体细胞杂交技术过程中不需要用胰蛋白酶处理，C错误； D、植物体细胞杂交技术过程中不能用灭活的病毒诱导细胞融合，D错误。 故选B。 30．（22-23高二下·北京朝阳·期末）科学家将某些诱导基因转入小鼠成纤维细胞中成功获取诱导多能干细胞，这类细胞可用于一系列的研究，具体过程如下图所示。 以下说法错误的是（    ） A．过程实质是基因的选择性表达 B．过程可用聚乙二醇诱导细胞融合 C．培养诱导多能干细胞时，需要定期更换培养液 D．可将丁细胞注射到小鼠脾脏中提取单克隆抗体 【答案】D 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠洋注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获得已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨骼瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、过程②将多能干细胞诱导其分化产生不同细胞的过程，是基因选择性表达的过程，A正确； B、过程③两细胞融合成杂交细胞的过程，可用聚乙二醇诱导细胞融合，B正确； C、培养诱导多能干细胞时，需要定期更换培养液，防止代谢产物积累对自身造成危害，C正确； D、经过筛选过的丁细胞注射到小鼠腹腔中，从腹水中提取单克隆抗体，D错误。 故选D。 31．（22-23高二下·北京海淀·期末）利用动物细胞融合方法，以SARS病毒棘突蛋白作为抗原制备出单克隆抗体（抗体D）。下图为使用不同抗体抑制病毒感染细胞的检测结果。下列相关叙述不正确的是（    ） A．对照抗体应不与SARS病毒特异性结合 B．将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，可获得大量抗体D C．检测抗体效果时需将SARS病毒与细胞混合一段时间后再加入抗体 D．抗体D需达到一定浓度才有明显抑制效果 【答案】C 【分析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】A、由图可知，加入对照抗体后病毒感染率基本不变，说明对照抗体不与SARS病毒特异性结合，不能抑制病毒感染细胞，A正确； B、抗体检测呈阳性，说明该杂交瘤细胞能产生相应的抗体D，因此将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，可从小鼠腹水获取大量单克隆抗体D，B正确； C、检测抗体效果时，需先将SARS病毒与抗体混合，再让其侵染细胞，观察病毒感染细胞的效果，C错误； D、据图分析，当抗体D达到一定浓度后，感染率下降明显，抑制效果才明显，D正确。 故选C。 32．（22-23高二下·北京东城·期末）牛的雄性胚胎中有特异性H-Y抗原。在牛早期胚胎培养液中添加H-Y单克隆抗体，筛选出所需胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列叙述不正确的是（    ） A．用H-Y抗原免疫母牛也可获得相应抗体 B．分泌HY单抗的是单一细胞形成的细胞群 C．可在囊胚期取样滋养层进行性别鉴别 D．鉴别后选取雄性胚胎进行胚胎移植 【答案】D 【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理（选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体。用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理）；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存（对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段）；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。 【详解】A、H-Y抗原免疫母牛，使其体内产生体液免疫，产生相应的浆细胞，获得相应的抗体，A正确； B、单克隆抗体是由杂交瘤细胞分泌的，杂交瘤细胞是由B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的，是单一细胞形成的细胞群，B正确； C、可在囊胚期取样滋养层进行性别鉴别，C正确； D、实验目的是利用乳腺生物反应器进行生物制药，所以应该选取雌性胚胎进行胚胎移植，D错误。 故选D。 33．（24-25高二下·北京东城·期末）将四种关键基因导入小鼠的成纤维细胞，可获得诱导多能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，可分化成神经细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。下列叙述不正确的是（    ） A．应使用显微注射法将四种基因直接注入成纤维细胞 B．导入的四种基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 C．iPS细胞能分化成多种细胞，是基因选择性表达的结果 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 【答案】A 【分析】胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞，iPS与ES细胞一样，可通过定向诱导分化修补某些功能异常的细胞来治疗疾病。 【详解】A、显微注射法通常用于将含有目的基因的载体（如质粒）导入动物细胞，而非直接注入游离的基因片段。直接注入的基因难以整合到宿主基因组中，A错误； B、导入的四种关键基因（如Oct4、Sox2等）可重新编程体细胞，使其恢复分裂能力并转化为iPS细胞，B正确； C、iPS细胞分化为不同细胞是基因选择性表达的结果，符合细胞分化的本质，C正确； D、iPS细胞来源于体细胞，无需破坏胚胎，避免了胚胎干细胞涉及的伦理争议，D正确； 故选A。 34．（23-24高二下·北京西城·期末）骨骼干细胞（SSC）具有自我更新能力和分化潜能，在骨骼发育中起重要作用。2024年我国科学家鉴定出首个位于长骨干骺端的骨骼干细胞群。下列说法错误的是（　　） A．SSC属于成体干细胞 B．SSC具有无限增殖能力 C．培养SSC需要提供O2和CO2 D．SSC可应用于骨骼的再生和修复 【答案】B 【分析】成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。造血干细胞是发现最早、研究最多应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。 【详解】A、成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，骨骼干细胞（SSC）具有自我更新能力和分化潜能，在骨骼发育中起重要作用，故SSC属于成体干细胞，A正确； B、SSC属于成体干细胞，可以分裂分化，但不具有无限增殖的能力，B错误； C、培养SSC需要提供O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH，C正确； D、有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，SSC具有自我更新能力和分化潜能可应用于骨骼的再生和修复，D正确。 故选B。 35．（22-23高二下·北京东城·期末）干眼症是由于泪液分泌减少导致的眼睛干涩病症。将有关基因导入已分化的体细胞获得诱导多能干细胞（iPS细胞），培养iPS细胞得到的眼结膜组织可分泌泪液成分“粘液素”，有望治疗干眼症。下列说法不正确的是（    ） A．导入的基因具有促使体细胞恢复分裂能力的作用 B．利用iPS细胞获得眼结膜组织时，应加入分化抑制因子 C．利用iPS细胞治疗人类疾病理论上可避免免疫排斥反应 D．iPS细胞可在一定程度上避免胚胎干细胞涉及的伦理问题 【答案】B 【分析】胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞，iPS与ES细胞一样，可通过定向诱导分化修补某些功能异常的细胞来治疗疾病。 【详解】A、根据题文，导入的基因能促使已分化的体细胞成为诱导多能干细胞（iPS细胞），体细胞无分裂能力，而干细胞是一类有分裂能力的细胞，故导入的基因能促使已分化的体细胞恢复分裂能力，A正确； B、iPS可分化为多种细胞，加入分化诱导因子才能获得相应的组织或器官，B错误； C、iPS细胞可以来自于病人自身，诱导成的组织进行移植，可以避免免疫排斥反应，C正确； D、iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，只需对体细胞进行操作及适当的培养即可，没有伦理学的问题，D正确。 故选B。 36．（24-25高二下·北京朝阳·期末）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 双特异性抗体：激活T细胞双信号通路的新型肿瘤免疫疗法 近年来，肿瘤免疫治疗领域取得了突破性进展，双特异性抗体（BsAb）技术因其独特的双靶点识别能力成为研究热点。与传统单克隆抗体相比，BsAb不仅识别肿瘤特异性抗原（TSA），还能直接激活T细胞，具有更强的细胞毒性效应（图1）。 T细胞识别、杀伤靶细胞的能力取决于一系列协调的相互作用。其中最重要的是T细胞受体复合体（TCR，包括相关的CD3等结构）对靶细胞的识别和结合（“信号1”），但这种结合通常是低亲和力的。因此，成功触发信号1需要在T细胞与靶细胞界面处聚集许多TCR复合体，这个界面被称为免疫突触。T细胞的激活和增殖还需要通过与共刺激受体（如CD28）的额外相互作用提供“信号2”，两种信号共同促进T细胞的完全活化和功能发挥。 免疫突触的形成可通过荧光标记技术动态观测：利用不同波长（如488nm激发绿色荧光蛋白标记“TSA1×CD3”BsAb）的激光共聚焦显微镜，捕捉T细胞与靶细胞接触区域的空间重组过程，生成细胞图像（图2）。 在BsAb的研发过程中，研究者首先利用特异性抗原重复刺激小鼠，通过单细胞分离与克隆培养获取浆细胞；随后利用逆转录PCR技术扩增抗体可变区基因；最关键的是通过蛋白质工程对抗体重链进行定向改造，经过细胞表达与纯化，对抗体的功能进行验证。研究者设计了针对高表达特异性抗原MUC16的卵巢癌的BsAb，在体外和体内实验均取得了显著效果，为癌症治疗提供了新的思路和方法。 (1)抗体的分子本质是由_______条多肽构成的________。 (2)制备“MUC16×CD28”双特异性抗体（BsAb）的过程如下：①将分离的_______分别注入小鼠体内进行免疫；②取免疫小鼠的______与骨髓瘤细胞诱导融合；③筛选能分泌抗MUC16或抗CD28的______细胞株；④通过______技术对抗体重链进行定向改造，避免重链错误配对。 (3)若肿瘤细胞下调MUC16表达，推测其对免疫突触形成和免疫监视效果的影响______。 (4)研究人员向裸鼠体内植入表达荧光素酶（遇底物D-荧光素后可发光）的卵巢癌细胞后，注入不同类型抗体，定量检测发光强度，最终证实“MUC16×CD28通过MUC16×CD3激活T细胞”的结论。请完善实验方案并预期实验结果______。 (5)从生命信息观分析T细胞双信号调控对维持稳态的意义______。 【答案】(1) 4 蛋白质 (2) MUC16抗原和CD28抗原 B淋巴细胞 杂交瘤 蛋白质工程 (3)MUC16减少导致TCR结合位点不足,免疫突触结构松散，双信号无法有效激活T细胞，肿瘤细胞逃避免疫监视 (4)实验方案①制备裸鼠（无胸腺，缺乏内源性T细胞，需外源补充），向其体内植入表达荧光素酶（遇底物D-荧光素后可发光）的卵巢癌细胞后,构建卵巢癌模型鼠，随机均分成甲、乙、丙、丁四组；②甲组不补充T细胞，注射适量的无关抗体；乙组补充适量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体；丙组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD3抗体；丁组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体和MUC16×CD3抗体；③在相同且适宜的条件下培养一段时间，定量检测肿瘤细胞的发光度。 预期实验结果  发光度为甲组≈乙组>丙组>丁组 (5)T细胞同时接受信号1和信号2才能完全活化，确保准确识别抗原,避免免疫监视过度，导致正常细胞受损 【分析】1、双特异性抗体（BsAb）能同时识别肿瘤特异性抗原和 T 细胞，通过聚集 TCR 形成免疫突触触发 T 细胞激活的 “信号 1”，还可能提供 “信号 2”，相比传统单克隆抗体，可更直接高效地激活 T 细胞，增强对肿瘤细胞的杀伤效果。 2、用紫色标记细胞核、绿色标记 “TSA1×CD3”BsAb，再用激光共聚焦显微镜观察，紫色染料能紧紧抓住细胞核1、DNA，在显微镜下显紫色，能帮研究者快速找到细胞位置，确定T细胞和靶细胞接触的方位；BsAb 聚集于免疫突触界面，绿色荧光能实时显示其在接触区域的簇集过程，双荧光（紫色 + 绿色）在图像中形成鲜明对比，使细胞核的结构定位与免疫突触功能分子的动态分布得以清晰区分。 3、在 BsAb 研发中，研究者先用特异性抗原刺激小鼠，经单细胞分离克隆获浆细胞，再用逆转录 PCR 扩抗体可变区基因，通过蛋白质工程改造抗体重链，经细胞表达纯化后验证功能。针对高表达 MUC16 的卵巢癌设计的 BsAb，在体外和体内实验效果显著，为癌症治疗提供新思路。 【详解】（1）从图中看出抗体是典型的“Y”形抗体，有2条重链和2条轻链组成的4条多肽构成的蛋白质； （2）制备“MUC16×CD28”双特异性抗体（BsAb）和单克隆抗体很相似，不同的是将MUC16和CD28两种抗原分别注入小鼠体内获得免疫鼠，从免疫鼠体内分离出B淋巴细胞和骨髓瘤细胞诱导融合，经过两次筛选，筛选出能分泌抗MUC16或抗CD28的杂交瘤细胞，再通过蛋白质工程定向改造抗体的重链，防止其错误配对； （3）T细胞识别、杀伤靶细胞的能力取决于一系列协调的相互作用。其中最重要的是T细胞受体复合体（TCR，包括相关的CD3等结构）对靶细胞的识别和结合（“信号1”），成功触发信号1需要在T细胞与靶细胞界面处聚集许多TCR复合体，这个界面被称为免疫突触，由题得知MUC16是一种卵巢癌高表达特异性抗原，T细胞能识别并结合特定的抗原，它的表达量减少，T细胞受体复合体TCR结合位点不足，形成的免疫突触结构松散，影响了信号1和信号2的作用，无激活T细胞，免疫监视效果减弱，癌细胞容易逃逸； （4）实验方案①制备裸鼠（无胸腺，缺乏内源性T细胞，需外源补充），向其体内植入表达荧光素酶（遇底物D-荧光素后可发光）的卵巢癌细胞后,构建卵巢癌模型鼠，随机均分成甲、乙、丙、丁四组；②甲组不补充T细胞，注射适量的无关抗体；乙组补充适量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体；丙组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD3抗体；丁组补充等量的T细胞，注射等量的MUC16×CD28抗体和MUC16×CD3抗体；③在相同且适宜的条件下培养一段时间，定量检测肿瘤细胞的发光度。 实验结果发光强度与存活的肿瘤细胞数量呈正相关 —— 细胞越多，发光越强；细胞被 T 细胞杀伤越多，发光越弱。甲组肿瘤发光最强，无 T 细胞攻击，肿瘤自然生长；乙组发光强度≈对照组→仅MUC16×CD28抗体无法激活 T 细胞；丙组荧光强度中等，（CD3）激活部分 T 细胞，杀伤力较弱；丁组发光强度最弱，“MUC16×CD28通过MUC16×CD3激活T细胞”，双抗体同时作用，癌细胞大量杀死，荧光强度最弱。所以发光度为：甲组≈乙组>丙组>丁组。 （5）由题意可知，T细胞双信号调控对维持稳态的意义为：T细胞同时接受信号1和信号2才能完全活化，确保准确识别抗原,避免免疫监视过度，导致正常细胞受损。 37．（24-25高二下·北京昌平·期末）猪伪狂犬病毒（PRV）是严重危害养殖业的一种病原体，也存在着向人类传播的风险。为制备抗PRV的单克隆抗体，科研人员进行系列实验。 (1)PRV诱导免疫反应的糖蛋白主要有gB、gC和gD。 ①为筛选制备抗PRV单克隆抗体的________，需比较3种蛋白引发免疫应答的能力：将小鼠分为五组，分别注射3种蛋白、PBS缓冲液和灭活疫苗，第28天测定各组小鼠产生抗体的相对数量，结果如图1。 ②为获得产生抗PRV抗体效果理想的B淋巴细胞，可用gD免疫多只小鼠，选择__________的小鼠，从其脾中得到B淋巴细胞。 (2)将上述B淋巴细胞与________（甲）融合，并接种至含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的HAT培养基。动物细胞合成DNA有D和S途径，但甲只有D途径，途径如图2。 HAT培养基能筛选出目标融合细胞的原因是__________。 (3)由于_________，因此还需对（2）获得的细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 (4)将（3）获得的细胞注射到小鼠腹腔内增殖。从小鼠腹水中获得的单克隆抗体，需纯化后才能使用，原因是__________。 【答案】(1) 最佳抗原（或免疫原） 抗体相对数量最高 (2) 骨髓瘤细胞 只有融合细胞（B淋巴细胞+骨髓瘤细胞）能通过补救途径合成DNA并存活 (3)融合细胞可能产生多种抗体（或存在未融合的B淋巴细胞） (4)腹水中含杂蛋白（如小鼠自身抗体、细胞代谢产物），需纯化提高抗体纯度 【分析】单克隆抗体制备的核心是通过细胞融合技术将能产生特异性抗体的 B 淋巴细胞（如小鼠脾细胞）与骨髓瘤细胞融合，形成既能分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，进而通过筛选和培养获得大量单一类型的抗体。 【详解】（1）题目旨在筛选能有效诱导产生抗 PRV 抗体的物质，而 gB、gC、gD 是 PRV 诱导免疫反应的关键糖蛋白，通过比较它们引发免疫应答的能力，可确定最适合作为制备单克隆抗体的抗原。gD 经实验验证引发免疫应答的能力最强（结合图 1 逻辑，推测其诱导产生的抗体相对数量最多）。选择血清中抗 gD 抗体效价最高的小鼠，其脾脏中能产生抗 gD 抗体的 B 淋巴细胞数量更多、活性更强，更易获得目标细胞。 （2）未融合的骨髓瘤细胞仅含D途径（被A阻断），未融合的 B 淋巴细胞虽有 S 途径，但体外不能无限增殖，最终死亡，融合细胞（杂交瘤细胞）同时具备 B 淋巴细胞的 S 途径和骨髓瘤细胞的增殖能力，可利用 HAT 中的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）通过 S 途径合成 DNA，从而存活。 （3）融合后的细胞可能包含多种杂交瘤细胞（分泌不同抗体），或未完全筛选干净的未融合细胞 / 同种融合细胞，因此需通过克隆化培养获得单一细胞来源的克隆，并检测抗体特异性，确保获得能分泌所需抗体的细胞。 （4）小鼠腹水中获取的抗体粗提物中，除目标单克隆抗体外，还含有小鼠腹腔内的其他蛋白质、细胞碎片等杂质，这些杂质可能影响抗体的特异性或引发副作用，因此需纯化。 38．（23-24高二下·北京丰台·期末）双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体。PSMA是癌细胞的一种表面抗原。T细胞有效激活依赖于T细胞的表面受体CD28在癌细胞与T细胞结合部位的聚集。科研人员尝试构建双特异性抗体PSMA×CD28（简称“PC双抗”）来治疗癌症，制备过程如图1，PC双抗的结构及作用机理如图2。 (1)制备PC双抗的过程中，用到的动物细胞工程技术主要有___（答出2点）。 (2)制备PC双抗时，应先将___（物质X）分别注射到小鼠体内再分离出B淋巴细胞。将B淋巴细胞分别与小鼠的骨髓瘤细胞融合，常用的诱导融合方法有___。之后筛选得到两种杂交瘤细胞，再诱导两种细胞融合，成功融合的杂交瘤细胞表达两种L链和两种H链。据图2分析，杂交瘤细胞A×B会产生多种抗体，原因是___。因此还需通过筛选才能获得PC双抗。 (3)科研人员将某种癌细胞和T细胞共同培养，加入不同抗体后检测T细胞活化水平，结果如图3，结果说明___。进一步分析发现，这种癌细胞大量表达PD-L1，识别结合T细胞表面的PD-1受体，从而___T细胞活化。为了有更好的治疗效果，请利用已有的PC双抗提出一种新的治疗手段___。 【答案】(1)动物细胞融合、动物细胞培养 (2) PSMA、CD28 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法 L链和H链随机组合，产生多种抗体 (3) PC双抗不能有效激活T细胞 抑制 将PC双抗与PD-L1单抗联合使用 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再通过克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养杂交瘤细胞，最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）结合单克隆抗体的制备过程可知，制备PC双抗的过程中，用到的动物细胞工程技术主要有动物细胞融合和动物细胞培养技术。 （2）制备双特异性抗体PSMA×CD28，则抗原是CD28和PSMA，将两种物质分别注射到小鼠体内，分离出B淋巴细胞，将B淋巴细胞分别和小鼠的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，再诱导杂交瘤细胞融合。诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法。成功融合的细胞会表达两种L链和两种H链，所需的双特异性抗体PSMA×CD28是特定的L链和H链结合形成的，由于L链和H链随机组合而产生多种抗体，因此还需要进行筛选，才能获得所需的抗体。 （3）该实验的自变量是加入抗体的种类，因变量是T细胞的活化水平（用IL-2浓度表示）。由图可知，两组实验T细胞的活化水平差别不大，说明PC双抗不能有效激活T细胞。进一步分析发现，这种癌细胞大量表达PD-L1，识别结合T细胞表面的PD-1受体，从而抑制细胞活化，中和PC双抗所起的作用。为了有更好的治疗效果，可将PC双抗与PD-L1单抗联合使用，从而有效激活T细胞。 39．（23-24高二下·北京昌平·期末）手足口病由多种肠道病毒感染引起，主要表现为手、足和口腔黏膜等处疱疹，柯萨奇病毒A组2型（CV-A2）是引发该病的主要病原体之一、制备抗CV-A2的单克隆抗体，对检测和治疗手足口病具有重要意义。 (1)将纯化的CV-A2抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的_____细胞，利用_____诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得13株杂交瘤细胞。 (2)科研人员对上述13株杂交瘤细胞再进一步筛选，通过抗CV-A2单抗特异性分析结果可知（图1），应选择第_____株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体，理由是_____。 (3)科研人员使用高、中、低3个浓度的CV-A2抗原稀释液，对不同温度下放置3d的抗CV-A2单抗进行检测，图2结果表明单抗稳定性良好。判断依据是：在37℃和4℃的条件下放置3d后，各稀释液浓度下的检测值_____。 (4)制备的抗CV-A2单抗在检测和治疗手足口病方面的具体应用是_____（写出1条即可）。 【答案】(1) 骨髓瘤 PEG/灭活病毒/电脉冲 (2) 4 第4株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体特异性强且含量最高 (3)无显著差异 (4)检测：可应用于手足口病感染病毒类型的检测/病毒感染的早期诊断；治疗：注射抗CV-A2单抗治疗手足口病/抗CV-A2单抗可作为治疗性抗体 【分析】单克隆抗体的制备是将骨髓瘤细胞与浆细胞结合，经过选择培养基的筛选得到杂交瘤细胞，经专一抗体检测后，培养能产生特定抗体的杂交瘤细胞，即可得单克隆抗体。 【详解】（1）骨髓瘤细胞具有无限增殖的能力，将纯化的CV-A2抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，利用PEG/灭活病毒/电脉冲诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得13株杂交瘤细胞。 （2）分析图可知，纵坐标吸光度大小反应与抗原结合的单抗含量高低，所以第4株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体特异性强且含量最高，应选择第4株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体。 （3）分析图2可知，无论是在37℃还是在4℃的条件下放置3d后，三种浓度的CV-A2抗原稀释液中，检测值的大小相差不大（无显著差异）。 （4）制备的抗CV-A2单抗在检测和治疗手足口病方面的具体应用是：检测：可应用于手足口病感染病毒类型的检测/病毒感染的早期诊断；治疗：注射抗CV-A2单抗治疗手足口病/抗CV-A2单抗可作为治疗性抗体。 40．（23-24高二下·北京海淀·期末）黄曲霉毒素（AFB）是黄曲霉（一种真菌）产生的具有极强致癌力的代谢产物。为准确检测食品中残留的AFB，科研人员开展下列研究。 (1)科研人员利用小鼠制备抗AFB的单克隆抗体（AFB单抗），过程如图1。杂交瘤细胞需进行步骤Ⅱ_____和Ⅲ_______检测，经过多次筛选。 (2)食品中的有害残留毒素还可能有黄绿青霉素（CIT）、伏马菌素（FB）。若想确认上述流程获得的AFB单抗具有极强的特异性，应补充的检测和结果是__________。 (3)科研人员拟将抗AFB单抗固定在一种新材料上，制备为“检测探针”。已知材料M稳定性、发光性能等方面有明显优势，但它很难与抗体结合；物质P可以提高材料M对抗体的亲和力。制备检测探针的流程如图2，探针发光性能与物质P的浓度关系如图3。 依据图3结果，科研人员选择物质P的浓度为0.8mg/mL作为生产检测探针的条件，原因是在该浓度下，探针发光性能与更高浓度时______，而该浓度可节省成本。 (4)科研人员制备定量检测AFB的免疫试纸，如图4。测定样品前，先配制一系列不同浓度的AFB标准溶液，分别与等量“MP-抗AFB单抗探针”混合均匀，滴至加样处。 科研人员测定了T线、C线的发光值，从而绘制出特定范围AFB浓度的线性标准曲线_________（选填字母），作为后续检测食品中是否含有AFB的参照曲线。 【答案】(1) 克隆化培养 抗体（阳性） (2)AFB单抗与黄绿青霉素（或“CIT”）、伏马菌素（或“FB”）进行抗原-抗体杂交，结果为不能杂交（或“阴性”“无杂交带”） (3)差异较小（或“相近”） (4)D 【分析】由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有增殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。 (1)小问详解： 基因的表达包含转录和翻译，FB1进入细胞后能与tRNA结合形成复合物，抑制tRNA与某些氨基酸结合，从而抑制基因表达的翻译过程。碱基对的增添、缺失、替换被称为基因突变。(2)小问详解： ①根据题意可知，参与合成完全抗原的物质应该为大分子物质，即ab为大分子物质满足条件，cde为小分子物质，不满足条件。②融合形成杂交细胞的目的是为了获得相应的抗体，故最终应该选择能够产生抗AFB1抗体的杂交瘤细胞。③由于AFB1与其他黄曲霉素在结构上有相似性，抗AFB1抗体能与其他黄曲霉素发生一定反应，但较AFB1的反应弱。根据交叉反应的结果可看出，3G1的特异性最强，故应选择3G1抗体的杂交瘤细胞培养以获得大量的该抗体用于检测。(3)小问详解： 可从种植玉米的土壤中分离并纯化以香豆素为唯一碳源的微生物用于分解香豆素。具体方案为：将种植玉米的土壤样品液接种到以香豆素为唯一碳源的选择培养基上，选择透明圈直径大的菌落（或透明圈直径与菌落直径比值大的菌落）进一步扩大培养，用培养后的菌液处理已污染的玉米样品。 【详解】（1）如图1为利用小鼠制备抗AFB的单克隆抗体（AFB单抗）的过程，其中步骤I为为细胞融合和筛选得到杂交瘤细，需进一步通过步骤Ⅱ克隆化培养和步骤Ⅲ抗体阳性检测，最后经过多次筛选得到能产生AFB单抗的杂交瘤细胞。 （2）若想确认上述流程获得的AFB单抗具有极强的特异性，可以让AFB单抗与食品中的其它有害残留毒素如黄绿青霉素（CIT）、伏马菌素（FB）进行抗原-抗体杂交，结果为阴性，则可确认AFB单抗具有极强的特异性。 （3）图3结果表明，在物质P浓度为0.8mg/mL时，探针发光性能与更高浓度时差异很小，因此科研时可选择该浓度（0.8mg/mL）作为生产检测探针的条件，可节省成本。 （4）根据科研人员制备免疫试纸和检测AFB的原理：用不同浓度的AFB标准溶液分别与等量“MP-抗AFB单抗探针”混合，可推知，随着AFB浓度增加，与之结合的探针增加，导致T线/C线的发光值比下降，从而绘制出特定范围AFB浓度的线性标准曲线（即标准曲线D）作为后续检测食品中是否含有AFB的参照曲线。 【点睛】本题考查微生物分离和培养、单克隆抗体制备相关知识，要求考生理解筛选分解尿素的细菌的原理，能结合所学的知识准确答题。 41．（23-24高二下·北京朝阳·期末）学习以下材料，回答（1）～（5）题。 阿尔茨海默病早期诊断的新技术 阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统的退行性病变。血浆外泌体是由活细胞分泌到血液中的囊泡。与健康人相比，AD患者血浆外泌体上蛋白质Aβ1-42含量显著升高，可作为AD诊断的生物标志物。我国科研人员开发了检测血浆外泌体Aβ1-42水平的新技术——免疫磁珠外泌体聚合酶链式反应（iMEP）技术。 研究者首先将抗Aβ1-42抗体与DNA单链1结合成DNA-抗体偶联物，然后除去未偶联成功的游离抗体，获得纯化的DNA-抗体偶联物，纯化过程如下：单链1上的片段b通过碱基互补配对与预先偶联了纳米颗粒（SA）的单链2上的片段b*结合，偶联物随纳米颗粒沉淀。沉淀物溶解后再加入单链3，单链3与单链1竞争性杂交结合单链2，因此可将DNA-抗体偶联物从纳米颗粒上替换下来（图1）。 CD63是外泌体表面特异性高表达的蛋白，且AD患者外泌体CD63含量与健康人相同。研究者将抗CD63抗体固定在磁珠上，抗体-磁珠偶联物能够结合血液外泌体，使其富集。再利用DNA-抗体偶联物结合外泌体表面的Aβ1-42,最后利用实时荧光定量PCR技术对DNA-抗体偶联物中的DNA进行指数扩增。PCR体系中含有荧光染料，该染料在游离状态不发光，与双链DNA结合后发出荧光，根据产物荧光强度可计算DNA模板量（图2）。 iMEP技术能够灵敏地检测血液样本AD生物标志物的含量，还可以扩展到检测外泌体上其他生物标志物，因此有可能成为复杂临床环境中疾病筛查和进展监测的新工具。 (1)制备抗Aβ1-42单克隆抗体时，多次注射_______到小鼠体内，从小鼠的脾脏中获得B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞诱导融合后，先筛选得到杂交瘤细胞，再进行______培养和抗体检测，得到能分泌抗Aβ1-42抗体的杂交瘤细胞。 (2)图1中DNA单链1的5’和3’末端碱基序列为：5’-CATGTT…CGACTA-3’，则DNA单链3的5’末端碱基序列应为__________，沉淀物溶解后加入的DNA单链3的量应_______（多于/等于/少于）溶液中DNA单链1的量。 (3)研究人员用iMEP技术检测比较健康人与AD患者血液样本外泌体中Aβ1-42含量，下列关于该实验的叙述正确的是_______ A．应在两类样本的外泌体CD63总量相等的条件下检测Aβ1-42含量 B．如果DNA-抗体偶联物中混有游离抗体，会导致检测值偏小 C．PCR扩增的模板是单链，因此PCR体系中只需要加入一种引物 D．AD患者血液样本PCR扩增终产物的荧光强度显著高于健康人 (4)iMEP技术的优点之一是灵敏度高，其高灵敏度的原因是________。 (5)在iMEP技术中，同时使用两种DNA-抗体偶联物，并将PCR产物检测环节更改为电泳检测，可以同时检测两种生物标志物分子。此时使用的两种DNA-抗体偶联物之间的区别是_________。 【答案】(1) Aβ1-42 克隆化 (2) CGACTA… 多于 (3)ABD (4)抗CD63抗体-磁珠偶联物能够富集血液中外泌体；抗Aβ1-42单抗灵敏度高；实时荧光定量PCR能够放大信号 (5)抗体不同；DNA单链长度不同 【分析】单克隆抗体制备流程： （1）对小鼠注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应； （2）从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞； （3）将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，再用特定的选择培养基进行筛选； （4）在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长； （5）对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞； （6）最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。这样从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。 【详解】（1）抗体是在相应抗原刺激机体时产生的，该实验的目的是制备抗Aβ1-42单克隆抗体，因此要用多次注射Aβ1-42使小鼠产生免疫反应，以便从小鼠脾脏中获取足够的已经免疫的B淋巴细胞。 由于一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，因此，从免疫的小鼠中获取的B淋巴细胞可能产生不同抗体。为了获得单克隆抗体，经选择培养基筛选出来的杂交瘤细胞还要经克隆化培养和抗体检测，才能得到能分泌抗Aβ1-42抗体的杂交瘤细胞。 （2）依题意，单链1上的片段b与单链2上的片段b*通过碱基互补配对结合，单链3与单链1竞争性杂交结合单链2，可知单链1上的片段b与单链3上的片段b碱基序列相同。又知，图1中DNA单链1的5’和3’末端碱基序列为：5’-CATGTT…CGACTA-3’，则DNA单链3的5’末端碱基序列应为CGACTA…。 依题意，单链3与单链1竞争性杂交结合单链2，且要将DNA-抗体偶联物从纳米颗粒上替换下来，则沉淀物溶解后加入的DNA单链3的量应多于溶液中DNA单链1的量，才能成功将单链1从纳米颗粒上替换下来。 （3）A、依题意，与健康人相比，AD患者血浆外泌体上蛋白质Aβ1-42含量显著升高。若要比较健康人与AD患者血液样本外泌体中Aβ1-42含量，则要先保证两类样本的外泌体数量相等。又知，AD患者外泌体CD63含量与健康人相同，因此，用iMEP技术检测比较健康人与AD患者血液样本外泌体中Aβ1-42含量时，应在两类样本的外泌体CD63总量相等的条件下检测Aβ1-42含量，A正确； B、依据检测的原理，若有游离抗体，则游离抗体也会与外泌体结合，但其上无单链DNA片段，无法被检测出来。因此，如果DNA-抗体偶联物中混有游离抗体，会导致检测值偏小，B正确； C、DNA-抗体偶联物上结合的是单链DNA片段，但复制一次后，会出现双链DNA片段，且检测时是检测双链DNA结合的荧光，即检测双链DNA分子的含量，因此，PCR体系中也要加入一对引物，C错误； D、依题意，AD患者血浆外泌体上蛋白质Aβ1-42含量显著升高，DNA-抗体偶联物与蛋白质Aβ1-42结合。则蛋白质Aβ1-42含量越高，结合的DNA-抗体偶联物越多，扩增产物更多。又知，荧光染料与双链DNA结合后发出荧光，因此，AD患者血液样本PCR扩增终产物的荧光强度显著高于健康人，D正确。 故选ABD。 （4）依题意，抗CD63抗体-磁珠偶联物能够富集血液中外泌体、且抗Aβ1-42单抗本身灵敏度高、实时荧光定量PCR技术对DNA-抗体偶联物中的DNA进行指数扩增，因此，iMEP技术灵敏度高。 （5）依题意，在iMEP技术中，要同时使用两种DNA-抗体偶联物分别检测不同的生物标志物，抗原-抗体的结合有特异性，若要检测不同生物标志物，则要使用不同的抗体。电泳的原理是带电粒子在电场的作用下，会向着与它所带电荷相反的电极移动，带电粒子在凝胶中的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关。因此，若要采用电泳法检测不同产物，则此时使用的两种DNA-抗体偶联物上的DNA单链长度要不同。 42．（23-24高二下·北京大兴·期末）学习以下材料,回答(1)~(4)题。 不断发展的单克隆抗体技术 1975年，生物学家创造了利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的技术。自1986年全球首个鼠源单抗药物上市以来，单抗药物治疗方向不断发展，覆盖肿瘤、心血管疾病、自身免疫病、神经性疾病和抗感染等各个领域。 最早期的单克隆抗体均为鼠源单抗，在理论研究及实践应用中发挥了重要作用。然而，鼠源单抗作为异源蛋白，在人体内活性低，稳定性差；且容易让人产生免疫反应——人抗鼠抗体反应(HAMA)而被清除。第二代人鼠嵌合单抗是从杂交瘤细胞分离出鼠源抗体可变区基因，与人源抗体恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生的。如下图.人源基因序列编码的氨基酸序列占整个抗体的大部分，降低了单抗的HAMA 反应。最新一代单抗是全人源单克隆抗体，氨基酸序列均由人源基因编码，进入人体内后发生超敏或排斥反应的可能性最低。目前制备全人源单克隆抗体的技术包括转基因鼠技术、抗体库技术以及单个B细胞技术等。 转基因鼠技术是将优化的人源抗体合成基因导入到本身不能合成抗体的免疫缺陷鼠的基因组中，在对转基因鼠进行特定抗原免疫后，后续流程与传统单抗制备方法一致，产生的抗体均由插入的人源抗体基因序列编码，也保证了单抗的抗原特异性和结合亲和力。 噬菌体展示技术是抗体库技术中的一种，将所选抗体库中抗体的可变区基因，与噬菌体壳蛋白基因构成融合基因，随着子代噬菌体重组，相关氨基酸序列会显示在噬菌体表面，从而筛选出抗体库中与特定抗原结合亲和力高的抗体基因。 单个B 细胞技术可从患者或接种疫苗人群的外周血中，根据抗原和细胞表面标记物筛选出单个B细胞，再利用逆转录 PCR 等技术直接获得抗体合成基因。单个B细胞技术的优点是只需少量细胞就可以快速高效地筛选出潜在的单克隆抗体，在新发、突发传染病等紧急事件中，可以快速获得针对病原微生物的高亲和力抗体。 (1)上述技术中，除噬菌体展示技术外，大多需要在________箱中进行动物细胞培养。当培养瓶中贴壁生长的细胞出现________现象时，用________酶处理后进行传代培养。 (2)传统方法通过杂交瘤细胞制备单抗时，需向小鼠注射________，再从小鼠脾脏中取已免疫的B细胞，与骨髓瘤细胞混合后，诱导细胞融合。对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和_________，多次筛选后才能获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 (3)文中提到的新技术中，不需要利用动物细胞融合技术的有________；需要使用基因工程技术的有_________。 A．人鼠嵌合单抗技术  B．转基因鼠技术   C．噬菌体展示技术 D．单个 B细胞技术 (4)下面是利用单个 B细胞技术，针对某新型病原体表面的抗原X，制备单克隆抗体的技术路径，请结合材料补充“_”上的内容。 采集康复者外周血→筛选能够结合 X 的 B 细胞→提取________→_________→根据抗体基因通用序列设计引物进行 PCR→获得_________基因→________→导入受体细胞→获得抗 X 的单克隆抗体。 【答案】(1) CO₂培养 接触抑制 胰蛋白(胶原蛋白) (2) 特定抗原 抗体检测 (3) CD ABCD (4) 总 RNA 逆转录得到cDNA 抗X抗体的 构建基因表达载体 【分析】单克隆抗体的制备：1、细胞来源：B淋巴细胞：能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖；骨髓瘤细胞：不产生专一性抗体，体外能无限繁殖。2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。3、两次次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。4、两次抗体检测：专一抗体检验阳性。5、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取。6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。 【详解】（1）上述技术中，除噬菌体展示技术外，大多需要在CO2培养箱中进行动物细胞培养。当培养瓶中贴壁生长的细胞出现接触抑制现象时，用胰蛋白酶处理后进行传代培养。 （2）传统方法通过杂交瘤细胞制备单抗时，需向小鼠注射特定抗原，再从小鼠脾脏中取已免疫的B细胞，与骨髓瘤细胞混合后，加入化学试剂PEG诱导细胞融合。对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选后才能获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 （3）人鼠嵌合单抗技术需要基因工程技术、动物细胞融合技术、动物细胞培养技术；B转基因鼠技术需要基因工程技术，动物细胞融合技术、动物细胞培养技术；噬菌体展示技术需要基因工程技术；单个B细胞技术需要基因工程技术，动物细胞培养技术；故文中提到的新技术中，不需要利用动物细胞融合技术的有CD，需要使用基因工程技术的有ABCD。 （4）利用单个B细胞技术，针对某新型病原体表面的抗原X，制备单克隆抗体的技术路径：采集康复者外周血→筛选能够结合X的B细胞→提取总RNA→逆转录得到cDNA→根据抗体基因通用序列设计引物进行PCR→获得抗X抗体的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→获得抗X的单克隆抗体。 43．（22-23高二下·北京石景山·期末）A型塞内卡病毒（SVA）会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度，研究人员尝试开发一种快速、准确检测SVA病毒的方法。 (1)VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA 诊断的靶蛋白。用纯化的VP1多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的_______融合，常用方法有PEG融合法、电融合法和_______。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板克隆化培养和抗体检测筛选出能够_______的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体——2E10和3E4。 (2)为进一步确定2E10和3E4在VP1上的结合位点，将VP1蛋白截为4段（VP1-1~VP1-4），电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如下图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是_______（填“相同”或“不同”）的，依据是_______。 (3)用SVA感染小鼠肾脏细胞后，37℃培养24小时，去垢剂处理增加细胞膜的通透性，将处理后的细胞分为两组，固定在介质上，分别加入2E10和3E4，一段时间后冲洗掉未结合的抗体，然后依次加入酶标抗体和底物，酶标抗体与鼠源抗体结合后可催化底物发出绿色荧光。对照组应选择_______细胞，其余处理与实验组一致，如果实验结果为_______，则证明制备的单克隆抗体具有特异性。 (4)用获得的2种单克隆抗体制作快速检测SVA病毒的试纸条，如下图所示。当待测样品滴入样品垫后会沿着试纸条向右扩散，结合垫处含有过量胶体金标记的2E10，也可向右扩散，当胶体金颗粒聚集时才会出现可见条带，检测线、质控线处包埋固定的抗体依次是3E4和山羊抗鼠IgG（可特异性结合各种鼠源抗体）。 在检测过程中，试纸上可发生待测病毒抗原与抗体结合的区域是_______。病毒检测阳性的结果为检测线和质控线处均出现条带，请解释条带形成的原因_______。 【答案】(1) B淋巴细胞与骨髓瘤细胞 灭活病毒诱导法 产生抗VP1抗体（或产生特异性抗体） (2) 不同 2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合 (3) 未感染SVA的正常小鼠肾脏细胞 对照组细胞均无绿色荧光，实验组细胞均出现绿色荧光 (4) 结合垫和检测线 样品中VP1蛋白与金标2E10结合，向右扩散又与检测线处的3E4结合产生条带，过量的2E10与质控线处的山羊抗鼠IgG结合产生条带 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）为获得抗VP1蛋白单克隆抗体，可用纯化的VP1蛋白（抗原）多次免疫小鼠，可以用PEG融合法、电融合法或灭活病毒诱导法诱导小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，使用选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板克隆化培养和抗体检测筛选出能够产生抗VP1抗体的杂交瘤细胞。 （2）由图1电泳可知，2E10仅与VP1-1结合，而3E4仅与VP1-3结合，因此2E10和3E4识别VP1上不同的抗原位点。 （3）由于实验组用SVA感染小鼠肾脏细胞，因此对照组应选择未感染SVA的正常小鼠肾脏细胞，其余处理与实验组一致（无关变量为保持一致），如果实验结果为对照组细胞均无绿色荧光，实验组细胞均出现绿色荧光，则证明制备的单克隆抗体具有特异性。 （4）根据题干信息：“当待测样品滴入样品垫后会沿着试纸条向右扩散”。如果样本中含有病毒抗原，就会首先被结合垫上的胶体金标记抗体2E10结合，形成“病毒抗原—金标抗体”复合物，并继续向试纸末端流动。在检测线（T线）上又被能识别此抗原的另一种抗体3E4捕获，形成“金标抗体—病毒抗原—T线抗体”复合物”。推测试纸上发生待检测病毒的抗原与抗体结合的区域是结合垫、检测线（T线）。由于样品中VP1蛋白与金标2E10结合，向右扩散又与检测线处的3E4结合产生条带，过量的2E10与质控线处的山羊抗鼠IgG结合产生条带，因此病毒检测阳性的结果为检测线和质控线处均出现条带。 44．（24-25高二下·北京丰台·期末）学习以下材料， 回答（1） ~ （4） 题。 噬菌体展示技术筛选单克隆抗体 噬菌体展示技术可以将外源基因整合到噬菌体基因组，使蛋白或多肽展示在噬菌体表面。此技术可通过构建噬菌体抗体库，筛选出高亲和力抗体以识别特定抗原。 噬菌体展示技术的第一步：需要构建含有抗体基因的噬菌体库，过程如图1所示。免疫动物后，获取B细胞，分别扩增抗体基因的重链可变区序列（VH）和轻链可变区序列（VL），通过接头序列（G4S）连接成VH-G4S-VL融合基因。这些基因序列被整合到编码噬菌体蛋白的质粒（噬菌粒）中，再导入大肠杆菌中，通常每个细菌含一个噬菌粒。大肠杆菌最终会释放出展示抗体的噬菌体。若实验室已有抗体基因文库，则无需免疫动物，构建噬菌体库的时间可缩短至两天左右。 噬菌体展示技术的第二步：淘选出与目标抗原结合能力强的噬菌体，过程如图 2 所示。将尾部展示抗体的噬菌体加到固定化的抗原中，经过两次目的不同的洗脱后，利用得到的噬菌体侵染大肠杆菌得到子代噬菌体。这样的淘选过程需要重复3~4轮，耗时一周左右，可从容量百亿的基因文库中快速筛选阳性噬菌体，再结合其他技术手段筛选出与目标抗原结合能力最强的阳性噬菌体单克隆。获取其中的抗体基因序列，将其导入特 定细胞中，大量表达出人类所需抗体。 噬菌体展示技术与传统制备单抗的技术相比，周期短，成本低，可以大规模筛选，在药物研发中应用广泛。 (1)构建抗体基因文库时，从动物体中获取B细胞，提取mRNA 通过_________过程生成cDNA，利用PCR 技术获取 VH-G4S-VL 融合基因。请参照下图中的基因模式图画出 PCR 的目标产物，填入方框中_________。 (2)针对噬菌体展示技术，下列叙述错误的是_。 A．该技术所需的B细胞可从动物脾脏中获取 B．噬菌粒作为载体，在噬菌体中实现抗体基因的表达 C．将抗体基因连接到噬菌粒上需要用到DNA 聚合酶 D．可直接从筛选获得的阳性噬菌体的尾部截取抗体蛋白用于生产 (3)图2中两次洗脱的目的分别是_________；淘选过程重复3~4轮的目的是_________。 (4)研究者利用噬菌体展示技术成功筛选到抗丙肝病毒抗体，为验证抗体的有效性，进行相关实验。其中，实验组先加入适量的细胞培养液和__________，然后加入_________，混匀一小时后，再加入_________，一段时间后检测宿主细胞中的病毒相对值。将实验组所测结果与对照组对比评估抗体活性。请选择下列选项前的字母填入横线处。 a.丙肝病毒液b.宿主细胞悬液c.一定稀释度的抗丙肝病毒抗体 【答案】(1) 逆转录 (2)BCD (3) 洗去未结合的噬菌体、洗脱与抗原结合的噬菌体 高倍富集阳性噬菌体 (4) c a b 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）构建抗体基因文库时，从动物体中获取B细胞，提取mRNA通过逆转录过程生成cDNA。根据引物的结合位置和PCR扩增的原理，左侧PCR目标产物应该包含VH和G4S部分，右侧PCR目标产物应该包含G4S和VL，这样经过后续的混合、变性、复性和延伸等操作，才能得到VH-G4S-VL融合基因，其模式图为：    。 （2）A、动物脾脏是B细胞分布的重要器官，该技术所需的B细胞可从动物脾脏中获取，A正确； ​ B、噬菌粒作为载体，导入大肠杆菌后，在大肠杆菌中实现抗体基因的表达，而不是在噬菌体中，B错误； ​ C、将抗体基因连接到噬菌粒上需要用到DNA连接酶，而不是DNA聚合酶，C错误； ​ D、筛选获得的阳性噬菌体的尾部展示的是抗体蛋白，但不能直接截取用于生产，还需要进一步的处理，D错误。 故选BCD。     （3）图2中两次洗脱，第一次洗脱是为了洗去未与固定化抗原结合的噬菌体，第二次洗脱是为了洗去与洗脱与抗原结合的噬菌体。淘选过程重复3-4轮的目的是进一步高倍富集阳性噬菌体。 （4）为验证抗体的有效性，实验组先加入适量的细胞培养液和一定稀释度的抗丙肝病毒抗体（c），然后加入丙肝病毒液（a），混匀一小时后，再加入宿主细胞悬液（b），这样的顺序可以先让抗体与病毒作用，再让病毒去侵染宿主细胞，通过检测宿主细胞中的病毒相对值来评估抗体活性。 45．（24-25高二下·北京平谷·期末）N1亚型禽流感病毒引发禽流感，对家禽养殖业造成重大损失。NA是N1亚型禽流感病毒表面的糖蛋白，在病毒附着和入侵阶段发挥作用，制备抗NA的单克隆抗体，对检测和治疗禽流感有重要意义。 (1)将纯化的NA抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的_____细胞，利用_______诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得4株特定的杂交瘤细胞。 (2)科研人员对上述4株杂交瘤细胞再进一步筛选，通过抗NA单抗特异性分析结果可知（如下表）： 组别 不同亚型禽流感病毒 N1亚型 N2亚型 N3亚型 N4亚型 第一株细胞上清液 +++ + - - 第二株细胞上清液 + - - - 第三株细胞上清液 ++ - - - 第四株细胞上清液 ++++ - - - NP单抗 + + + + 注：NP蛋白是不同亚型禽流感病毒的核心结构蛋白，“+”表示特异性结合，“-”表示不结合，“+”越多，表示与抗原结合的单抗含量高， ①NP单抗组是对照组，设计对照组的意义是_______。 ②应选择第_____株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体，理由是_________。 (3)制备的抗NA单抗在检测和治疗禽流感方面的具体应用是_______。（写出1条即可） 【答案】(1) 骨髓瘤 PEG/灭活病毒/电脉冲 (2) 作为对照，排除无关抗体对实验结果的干扰，确定抗NA单抗的特异性 四 与N1亚型禽流感病毒的NA抗原结合能力最强，且特异性强 (3)利用抗原 - 抗体杂交原理，检测禽类组织样液中是否含有N1亚型禽流感病毒（或用抗NA单抗治疗N1亚型禽流感患者） 【分析】单克隆抗体的制备是将骨髓瘤细胞与浆细胞结合，经过选择培养基的筛选得到杂交瘤细胞，经专一抗体检测后，培养能产生特定抗体的杂交瘤细胞，即可得单克隆抗体。 【详解】（1）骨髓瘤细胞具有无限增殖的能力，将纯化的NA抗原间隔多次注射给小鼠，一段时间后，取免疫小鼠的脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，利用PEG/灭活病毒/电脉冲诱导融合后，选择培养得到杂交瘤细胞。再经克隆化培养和抗体检测，初次筛选获得4株杂交瘤细胞。 （2）①设计对照组（NP单抗组）的意义是作为对照，排除无关抗体对实验结果的干扰，从而确定抗NA单抗的特异性。 ②从表格中可以看出，第四株杂交瘤细胞与N1亚型禽流感病毒结合的“+”最多，即与N1亚型禽流感病毒的NA抗原结合能力最强，且与其他亚型禽流感病毒不结合或结合能力很弱，特异性强。所以应选择第四株杂交瘤细胞进行大规模培养获取大量的单克隆抗体。 （3）制备的抗NA单抗在检测和治疗禽流感方面的具体应用可以是：利用抗原 - 抗体杂交原理，检测禽类组织样液中是否含有N1亚型禽流感病毒（或用抗NA单抗治疗N1亚型禽流感患者 ）。 46．（24-25高二下·北京·期末）学习以下材料，回答（1）～（3）题。 “双特异性抗体”——单克隆抗体的迭代 利用动物细胞工程技术制造的单克隆抗体在医药领域占有非常重要的地位，近年来已成为多种炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的治疗药物。抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合（见图）。 为进一步提高单克隆抗体的治疗效果，研究者在传统单抗的基础上进行了迭代，制备出了双特异性抗体（BsAb）。BsAb有独特的抗原结合片段，可以与2个不同抗原或同一抗原的2个不同抗原表位相结合。科研人员已经研究了多种制备BsAb的方法，其中一种方法的大致流程是：将2种不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞，然后通过筛选并进行克隆，用以生产BsAb。双杂交瘤细胞的遗传背景来源于两种杂交瘤细胞，可产生2种抗体中的2种H链和2种L链，这些H链、L链的随机组合配对可产生人们所需的BsAb。 与传统的单克隆抗体相比，BsAb的特异性更强，能够更加准确靶向，从而降低脱靶带来的不良反应。更重要的是，BsAb所具备的“双靶点”机制，拓展了治疗维度，提高了治疗效果，展现出其独特的优势。 (1)单克隆抗体制备中涉及的动物细胞融合与动物细胞培养技术对应的原理分别是_______。 (2)已知表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜蛋白，在癌细胞中表达量高；CD3是T细胞表面蛋白，CD3抗体与其结合后可激活信号通路，促进T细胞的免疫效力。 ①结合文中信息，画出既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的示意图。_______（注：EGFR抗体的链用H1、L1表示，CD3抗体的链用H2、L2表示） ②下图为BsAb的制备流程，其中a～c对应的细胞分别是_______。 在上述流程中，“筛选Ⅲ”_______(填“可以”或“不可以”)利用“筛选Ⅰ”中的选择培养基，原因是_______。 ③制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为_______。 (3)请结合文中信息与所学知识，提出制备既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的另一种方法，写出大致思路。______________。 【答案】(1)细胞膜的流动性、细胞增殖 (2) 骨髓瘤、分泌EGFR抗体的杂交瘤、分泌CD3抗体的杂交瘤 不可以 无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活 可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞 (3)利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使其能够分别结合EGFR与CD3。 【分析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】（1）动物细胞融合依据细胞膜具有流动性；动物细胞培养是为了让细胞增殖，获得大量细胞或细胞产物。 （2）抗体是由2条重链（H链）和2条轻链（L链）通过二硫键和非共价键连接形成的Y形结构，H链和L链均分为恒定区（C）与可变区（V），天然抗体的左右2个V区结构完全相同，每个Y形结构的臂上各有一个抗原结合位点，分别能与单个抗原结合，既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的抗体因由EGFR抗体一条链和CD3抗体的一条链用组成，其示意图为： 分别用EGFR蛋白和CD3蛋白进行免疫小鼠，已免疫的小鼠分离出B淋巴细胞与a细胞（骨髓瘤细胞）进行融合，分别获得能分泌EGFR抗体的杂交瘤和分泌CD3抗体的杂交瘤；筛选Ⅰ为选择培养基筛出杂交瘤细胞，筛选Ⅲ是为了筛出，既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的特定融合的杂交瘤细胞，而且无论杂交瘤细胞是否融合，均可在“筛选Ⅰ”中的选择培养基中存活。制备得到的上述BsAb，其优势具体表现为可拉近癌细胞与T细胞的距离，通过活化的T细胞清除癌细胞。 （3）可利用蛋白质工程技术对抗体的两个V区进行改造，使得既有既能结合EGFR，又能结合CD3的BsAb的区域。 47．（24-25高二下·北京房山·期末）生物制药时常用转入抗体基因的卵巢细胞大规模生产单克隆抗体。为探究表观遗传对该过程的影响，科研人员展开相关研究。 (1)卵巢细胞内染色体的主要成分是________，体外培养卵巢细胞时，需在培养基中添加_______等特殊成分，以满足细胞对某些生长因子的需求。 (2)研究人员选择转入ADM抗体基因的卵巢细胞（CHO-ADM）进行实验。利用溶解于DMSO的表观遗传抑制剂（I-4）处理CHO-ADM，结果如图1。 ①据图分析，对照组应采用_______处理。 ②研究人员最终选择浓度为2μmol/L的I-4开展进一步研究，理由是：_______。 (3)进一步研究I-4对细胞周期和表观遗传相关蛋白乙酰化的影响，结果如图2、图3所示。 ①据图2分析，2μmol/L的I-4处理将CHO-ADM细胞增殖抑制在________期。 ②HDAC蛋白可以去除组蛋白上的乙酰基，使染色质结构变得紧密，从而使基因不易表达。为证明I-4能抑制HDAC的表达，分别用HDAC抑制剂SAHA和I-4处理卵巢细胞，结果如图3。请在图3“I-4”相应位置绘出能证明上述结论的结果________。 (4)结合以上研究，从物质与能量和表观遗传两个角度阐述I-4提高CHO-ADM细胞单克隆抗体产量的作用机制________。 【答案】(1) DNA 和蛋白质 血清（或血浆 ） (2) 等量 DMSO 2μmol/L 时 ADM 产量最高 (3) G1 I-4 组 HDAC 条带浅于 SAHA 组 (4)I-4 阻滞细胞于 G1 期积累物质能量，抑制 HDAC 增强组蛋白乙酰化，促进抗体基因表达 【分析】从物质与能量角度，I-4 使细胞阻滞在 G1 期，G1 期是细胞为 DNA 复制等做物质和能量准备的时期，此时期阻滞可让细胞积累更多物质和能量；从表观遗传角度，I-4 抑制 HDAC（组蛋白去乙酰化酶 ），HDAC 能去除组蛋白乙酰基，抑制其活性后，组蛋白乙酰化水平提高，染色质结构变松散，利于抗体基因（ADM 基因 ）的表达，基因表达增强则抗体产量提升，所以 I-4 通过这两方面协同作用提高 CHO-ADM 细胞单克隆抗体产量 。 【详解】（1）染色体主要由 DNA（脱氧核糖核酸 ）和蛋白质组成。体外培养细胞时，培养基中除基本营养物质外，还需添加血清（或血浆 ），因为血清（血浆 ）含有多种细胞生长所需的生长因子、激素等未知成分，能满足细胞对特殊生长因子的需求。 （2） 实验中用溶解于 DMSO 的表观遗传抑制剂（I-4 ）处理细胞，对照组需遵循单一变量原则，排除溶剂 DMSO 的影响，所以用等量 DMSO 处理 。从图 1 看，不同浓度处理后，2μmol/L 时 ADM（抗体 ）产量在各浓度中最高，为获得更多抗体，选择该浓度进一步研究。 （3） 细胞周期分为 G1、S、G2、M 期，图 2 显示经 2μmol/L I-4 处理后，G1 期细胞比例显著增加，说明细胞增殖被抑制在 G1 期，因为细胞周期进程受影响，G1 期细胞积累，所以是抑制在 G1 期 。要证明 I-4 能抑制 HDAC 的表达，HDAC 蛋白量越少，条带越浅。SAHA 是已知的 HDAC 抑制剂，若 I-4 有抑制作用，I-4 组 HDAC 条带应比 SAHA 组浅（表示 HDAC 含量低 ），所以结果是 I-4 组 HDAC 条带浅于 SAHA 组。 （4）从物质与能量角度，I-4 使细胞阻滞在 G1 期，G1 期是细胞为 DNA 复制等做物质和能量准备的时期，此时期阻滞可让细胞积累更多物质和能量；从表观遗传角度，I-4 抑制 HDAC（组蛋白去乙酰化酶 ），HDAC 能去除组蛋白乙酰基，抑制其活性后，组蛋白乙酰化水平提高，染色质结构变松散，利于抗体基因（ADM 基因 ）的表达，基因表达增强则抗体产量提升，所以 I-4 通过这两方面协同作用提高 CHO-ADM 细胞单克隆抗体产量。 48．（24-25高二下·北京怀柔·期末）肾细胞癌是常见的泌尿系统肿瘤。近年来分子靶向治疗成为了晚期肾癌的重要治疗手段，针对靶点制备相应的单克隆抗体对肾癌治疗有重要意义。 (1)体内出现癌细胞时，非特异性免疫中的吞噬细胞可以吞噬、处理癌细胞，特异性免疫中的 _________免疫发挥主要的抗肿瘤作用。 (2)SFRP2蛋白是部分肿瘤细胞高表达的一种分泌型糖蛋白，推测其与肿瘤的增殖、迁移密切相关，科研人员针对该靶点制备相应的单克隆抗体（SFRP2 mAb）用于后续研究。 ①将SFRP2蛋白作为抗原制成悬液，皮下注射给5只小鼠，重复免疫3次后取血清检测，选择_________的小鼠备用。 ②取上述备用小鼠的脾脏，用胰蛋白酶处理后制成单细胞悬液，在相关试剂的诱导下与骨髓瘤细胞融合，加入HAT选择培养基，铺于96孔板中，并置于_________培养箱培养。 ③融合10天后，利用抗原抗体_________的原理筛选能产生SFRP2蛋白特异性抗体的细胞进行克隆化培养，提取并纯化该抗体。 (3)为研究SFRP2 mAb对肾癌细胞的影响，研究者进行了系列实验。 实验一：将肾癌细胞分为4组，接种于细胞培养板上，培养获得单层细胞，用硬物在培养板表面以垂直方向划宽度约１ｍｍ划痕清除该区域细胞，接下来用不同浓度的_________处理各组，48小时后显微观察拍照，实验结果如图1； 实验二：将肾癌细胞分为4组进行培养，并用SFRP2 mAb进行处理，48小时后，多次取样检测各组细胞数量并计算平均值，实验组细胞数量平均值分别为A1、A2……对照组细胞数量平均值为B，则实验组1细胞抑制率的数学表达式为： B-A1/B，进一步推算各组细胞抑制率，结果如图2. 由以上系列实验结果可知，随SFRP2 mAb浓度的增加，细胞划痕宽度变宽，细胞增殖抑制率提高，说明________。 【答案】(1)细胞 (2) 血清抗体浓度高 CO2恒温 特异性结合 (3) SFRP2 mAb 可显著抑制肾癌细胞的迁移和增殖 【分析】特异性免疫的分类 体液免疫：由B细胞介导，产生抗体，对抗游离抗原（如体液中的病原体、毒素）。 细胞免疫：由T细胞介导，细胞毒性T细胞裂解胞内寄生菌感染细胞、癌细胞、病毒感染细胞等靶细胞。 【详解】（1）特异性免疫中，细胞免疫通过细胞毒性T细胞裂解癌细胞，发挥主要抗肿瘤作用。 （2）①小鼠筛选：制备单克隆抗体时，需选血清抗体浓度高的小鼠（血清抗体浓度高，说明免疫效果好，产生的B淋巴细胞多）。②培养条件：动物细胞融合后，培养用CO2恒温培养箱（维持培养液pH稳定）。③筛选原理：利用抗原抗体特异性结合原理。 （3）实验一是划痕实验，处理因素是SFRP2 mAb，所以①应该是不同浓度的SFRP2 mAb。然后看结果，浓度越高，划痕宽度变宽（细胞迁移慢），增殖抑制率提高，说明SFRP2 mAb能显著抑制肾癌细胞的迁移和增殖，且浓度越高，抑制效果越显著。 49．（24-25高二下·北京东城·期末）表皮生长因子受体（EGFR）结构如图1，可与配体表皮生长因子（EGF）结合促进细胞增殖，其突变或过表达可驱动肿瘤发生。研究人员通过制备EGFR单抗治疗癌症。 (1)研究人员将EGFR全长蛋白注射到小鼠体内，分离出B淋巴细胞后诱导其与小鼠的_________细胞融合，经筛选及克隆化培养，最终获得EGFR单抗。利用EGFR单抗治疗癌症的机理是_________。 (2)将EGFR单抗与癌细胞混合后发现，其阻断癌细胞增殖的效率低下。研究人员进而将全长EGFR改成EGFR的_________重新制备，获得的单抗抑制癌细胞增殖效果明显提升。 (3)利用新制备的EGFR单抗治疗癌症，病人会出现耐药性。检测发现耐药病人癌细胞中的Met基因（编码另一种生长因子的受体）拷贝数增多。推测耐药性的产生可能是该基因扩增导致的，理由是_________。 (4)研究人员进一步构建了EGFR-Met双特异性抗体（如图2）。不同类型抗体的Fc段都可与杀伤细胞（如NK细胞）表面的Fc受体结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，称为抗体依赖—细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）。检测EGFR-Met双特异性抗体的作用效果。其中实验组应选用的实验材料是_________（填字母）。 a.EGFR单抗  b.EGFR-Met双特异性抗体  c.无关抗体  d.NK细胞  e.癌细胞  f.B细胞 结果表明双特异性抗体的ADCC活性相比EGFR单抗更高。请在图3中补充实验组和空白对照组的结果__________。 (5)将该双特异性抗体开发成药物用于EGFR靶点耐药患者的治疗，请提出需进一步研究的问题________。 【答案】(1) 骨髓瘤 EGFR单抗可与EGF竞争结合EGFR，降低EGF对细胞增殖的促进作用 (2)胞外区域 (3)Met基因扩增，表达出的Met蛋白增加，Met途径的作用增强，使癌细胞产生耐药性 (4) bde (5)药物对耐药肿瘤的抑制效果如何；药物对人体是否有副作用等 【分析】单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】（1）制备EGFR单抗需将EGFR全长蛋白免疫小鼠，取B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选培养获得。抗癌机理是EGFR单抗与EGF竞争结合EGFR，阻止受体与配体结合，降低EGF对细胞增殖的促进作用。 （2）因EGFR单抗阻断癌细胞增殖效率低，将全长EGFR改为胞外区域重新制备单抗，抑制效果提升，说明胞外区域是与配体结合关键区域。 （3）耐药病人癌细胞中Met基因拷贝数增多，因基因扩增会使表达出的Met蛋白增加，使Met受体增多，Met途径的作用增强，癌细胞可能通过该受体接收生长信号，摆脱EGFR单抗抑制，从而产生耐药性。 （4）实验组选 EGFR - Met 双特异性抗体（b）、NK 细胞（d）、癌细胞（e），通过 ADCC 活性检测效果。 空白对照组用无关抗体（c），实验组ADCC活性更高，图 3 中实验组曲线应高于EGFR单抗组，空白对照组曲线接近 0（因无关抗体无特异性结合，ADCC活性低）。图示为：。 （5）将该双特异性抗体开发成药物用于EGFR靶点耐药患者的治疗，需进一步研究的问题有药物对耐药肿瘤的抑制效果如何、药物对人体是否有副作用、双特异性抗体药物的安全性（对正常细胞影响）等 50．（23-24高二下·北京东城·期末）人类腺病毒55型（HAdV55）是我国流行的主要呼吸道病原体之一。目前尚无特异性治疗方法。为解决这一问题，我国科学家通过不同方法制备抗 HAdV55单克隆抗体。 (1)通过细胞工程技术制备单克隆抗体，从接种_____的小鼠中获取脾脏细胞，采用_____处理诱导与骨髓瘤细胞融合，筛选出相应的_____细胞，大量培养获得单克隆抗体。为研究抗体的特异性，用抗体与感染不同类型腺病毒的细胞提取物进行杂交检测，结果如图1。分析实验结果可知_____。 (2)如图2，HAdV55通过其表面蛋白与细胞表面受体结合，进入细胞形成囊泡，最终被溶酶体水解。然而某些病毒可以逃离囊泡，释放进入细胞质并最终到达细胞核进行复制。 据图2，抗 HAdV55抗体的作用机制分为两种：机制一是阻断_____；机制二是阻断病毒逃离囊泡，释放至细胞质和细胞核。科研人员通过基因工程制备出3 种抗 HAdV55单克隆抗体A、B和C。为探明几种抗体的作用和作用机制，用抗体处理细胞，在病毒感染后的不同时间点测量囊泡或细胞质中的病毒含量，实验结果如图3。请据此判断能通过机制一发挥作用的单克隆抗体是_____，并说明理由_____。 【答案】(1) HAdV55 PEG（或灭活的病毒） 杂交瘤 单克隆抗体仅与HAdV55结合，而不与其他类型腺病毒结合，具有良好的特异性 (2) 病毒表面蛋白与受体结合 抗体C 抗体C处理后细胞质中病毒相对数量低于无关抗体组，说明抗体对病毒有抑制作用；但囊泡中病毒含量较低，说明不是通过机制二发挥作用 【分析】单克隆抗体制备流程：（1）对小鼠注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应；（2）从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；（3）将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，再用特定的选择培养基进行筛选；（4）在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长；（5）对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞；（6）最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。这样从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。 【详解】（1）制备抗 HAdV55单克隆抗体时，对小鼠注射HAdV55使小鼠产生免疫反应，从小鼠脾脏中获取脾脏细胞，采用PEG或灭活的病毒处理诱导与骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选，获得既能无限增殖，又能产生抗 HAdV55抗体的骨髓瘤细胞，大量培养获得抗 HAdV55单克隆抗体。用抗体与感染不同类型腺病毒的细胞提取物进行杂交检测来研究抗体的特异性，分析题图1可知，单克隆抗体仅与HAdV55结合，而不与其他类型腺病毒结合，具有良好的特异性。 （2）分析题图2可知，抗 HAdV55抗体有两种作用机制，一是通过阻断病毒表面蛋白与受体结合发挥作用，二是通过阻断病毒逃离囊泡，释放至细胞质和细胞核发挥作用。现用抗 HAdV55单克隆抗体A、B和C分别处理细胞，在病毒感染后的不同时间点测量囊泡或细胞质中的病毒含量，分析题图3可知，抗体C处理后细胞质中病毒相对数量低于无关抗体组，说明抗体对病毒有抑制作用；但囊泡中病毒含量较低，说明抗体C不是通过机制二发挥作用，而是通过机制一发挥作用的。 地 城 考点03 单克隆抗体制备 51．（24-25高二下·北京海淀·期末）我国科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴“中中”“华华”，攻克了灵长类动物克隆的技术难题，过程如下图。下列叙述不正确的是（　　） A．采集的卵母细胞需在体外培养到MⅡ期后再显微操作去核 B．重构胚形成后需进一步激活才可继续完成分裂和发育进程 C．克隆猴的诞生体现出动物细胞的细胞核具有全能性 D．胚胎移植前需要使用免疫抑制剂处理代孕猴 【答案】D 【分析】动物细胞核移植技术：（1）概念：将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。（2）原理：动物细胞核的全能性。（3）生殖方式：无性生殖。 【详解】A、核移植的受体细胞一般为卵母细胞，将采集的卵母细胞在体外培养到MⅡ期，再通过显微操作去核，A正确； B、重构胚形成后，需用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）进一步激活后才可继续完成分裂和发育进程，B正确； C、克隆猴的诞生利用了动物细胞核移植技术，体现出动物细胞的细胞核具有全能性，C正确； D、代孕猴用相关激素进行同期发情处理，对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，无需再用免疫抑制剂处理，D错误。 故选D。 52．（24-25高二下·北京延庆·期末）克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，下列相关叙述错误的是（　　） A．过程①选用的一般为减数分裂Ⅱ中期的次级卵母细胞 B．过程②需要向发育培养液中加入抗生素和动物血清 C．过程③需将胚胎移入经同期发情处理的受体母牛子宫内 D．细胞培养中需提供5%CO2，目的是调节培养液的渗透压 【答案】D 【分析】题图分析，图中①是将未受精的卵细胞去核，②是动物细胞培养的过程，③是将早期胚胎进行繁殖性克隆，④是进行治疗性克隆的过程。 【详解】A、过程①选用的“未受精的卵”一般为MⅡ中期的次级卵母细胞，对其去核操作，作为体细胞核移植中细胞核的受体，A正确； B、过程②为早期胚胎培养，属于动物细胞培养的过程，加入抗生素可以防止杂菌污染，加入动物血清可提供营养物质，B正确； C、过程③需将胚胎移入经同期发情处理的受体母牛子宫内 ，为供体胚胎提供几乎相同的生理环境，保证移植胚胎正常着床，C正确； D、细胞培养中需提供95%的空气和5%CO2，其中二氧化碳的作用是维持培养液的pH，D错误。 故选D。 53．（23-24高二下·北京昌平·期末）动物细胞工程技术在动物育种中有着广泛的应用，下列叙述错误的是（　　） A．试管动物和克隆动物都是通过无性生殖方式产生 B．早期胚胎发育经过卵裂、桑葚胚、囊胚等阶段 C．三种动物的培育过程都需要动物细胞培养技术 D．转基因技术为动物育种提供了改良性状的新途径 【答案】A 【分析】克隆动物的培育一般采用了核移植技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术，因此属于无性生殖。试管动物的培育一般采用了体外受精技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术，因此属于有性生殖。 【详解】A、试管动物一般采用了体外受精技术，属于有性生殖，克隆动物一般采用了核移植技术，属于无性生殖方式产生的，A错误； B、早期胚胎发育一般经过卵裂、桑葚胚、囊胚等阶段，B正确； C、体外受精技术需要体外培养未成熟的卵细胞，动物细胞核移植技术需要体外培养供体和受体细胞，三种动物的培育过程都需要动物细胞培养技术，C正确； D、通过转基因技术可以有效改良动物的某些性状，为动物育种提供了改良性状的新途径，D正确。 故选A。 54．（23-24高二下·北京·期末）试管牛技术和核移植技术已应用于培育良种牛。下列相关叙述错误的是（    ） A．试管牛技术和核移植技术均可实现良种牛的大量克隆 B．试管牛技术和核移植技术培育良种牛均需进行胚胎移植 C．进行胚胎移植可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力 D．需要注射促性腺激素促进供卵牛超数排卵 【答案】A 【分析】试管动物和克隆动物的比较 试管动物 克隆动物 生殖方式 有性生殖 无性生殖 技术手段 体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植 核移植技术、早期胚胎培养、胚胎移植 遗传物质 来自两个个体 主要来自核供体 遗传规律 遵循 不遵循 【详解】A、试管动物技术是通过人工操作使卵子和精子在体外成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎，再经胚胎移植导入雌性受体的子宫，分娩产生后代的技术。核移植技术是将供体动物的体细胞核移入去核卵母细胞中，使这个重组细胞发育形成早期胚胎，经胚胎移植导入雌性受体的子宫，得到的新个体即为克隆动物。由此可知试管牛技术是有性生殖，不可实现良种牛的大量繁殖，A错误； B、试管牛技术和核移植技术培育良种牛的过程中都需要将早期胚胎经过移植导入雌性受体的子宫，B正确； C、胚胎移植时，供体只是产生具有优良特性的胚胎，妊娠是由雌性受体完成的，大大缩短了供体的繁殖周期，故进行胚胎移植可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，C正确； D、促性腺激素能作用于卵巢，促使卵巢产生更多卵细胞，因此对供体母牛注射促性腺激素后可促使其超数排卵，D正确。 故选A。 55．（23-24高二下·北京朝阳·期末）克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆，相关叙述正确的是（    ） A．生殖性克隆动物与其供核亲本的遗传物质组成和性状完全相同 B．生殖性克隆人严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用 C．生殖性克隆和治疗性克隆都应用了体细胞核移植和胚胎移植技术 D．取自体的细胞核进行治疗性克隆，可治疗镰状细胞贫血等遗传病 【答案】B 【分析】治疗性克隆:指利用克隆技术产生特定细胞和组织用于治疗性移植。生殖性克隆:指将克隆技术用于生育，即用于产生 人类个体。 【详解】A、生殖性克隆动物的部分遗传物质来自供细胞质的亲本，A错误； B、生殖性克隆人严重地违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用， 所以我国禁止生殖性克隆，B正确； C、治疗性克隆不需要进行胚胎移植，C错误； D、自体的细胞核含有与镰状细胞贫血有关的基因，不能取自体的细胞核进行治疗性克隆来治疗镰状细胞贫血等遗传病，D错误。 故选B。 56．（23-24高二下·北京大兴·期末）我国科学家利用基因编辑技术，获得一只生物节律核心基因敲除的猕猴。取其成纤维细胞与去核的卵母细胞融合，将发育形成的早期胚胎植入代孕雌猴，获得5只克隆猴，用于研究节律机制。以下叙述错误的是（    ） A．克隆猴基因组成差异小，作为实验动物便于研究 B．可用灭活的病毒诱导去核卵母细胞和成纤维细胞融合 C．克隆猴的遗传物质全部来自猕猴的成纤维细胞 D．克隆猴的获得体现了动物体细胞的细胞核具有全能性 【答案】C 【分析】动物体细胞核移植依据的原理是细胞的全能性。动物细胞的全能性随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到抑制，全能性表达很难，但是动物的细胞核内仍含有该种动物的全部遗传基因，具有发育成完整个体的潜能，即动物的细胞核仍具有全能性。 【详解】A、由于克隆猴基因组成差异小，用克隆猴作为实验动物，有利于使实验中的无关变量的控制，有利于增强实验的可信度，A正确； B、细胞融合的过程需要人工诱导，如聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，可用灭活的病毒诱导去核卵母细胞和成纤维细胞融合，B正确； C、克隆猴的遗传物质主要来自猕猴的成纤维细胞的细胞核，少部分来自去核的卵母细胞，C错误； D、动物细胞核含有该物种的全套遗传信息，克隆猴的获得体现了动物体细胞的细胞核具有全能性，D正确。 故选C。 57．（23-24高二下·北京西城·期末）为培育富含多聚不饱和脂肪酸的转基因奶牛，科研人员将相关合成基因转到甲牛成纤维细胞中，利用乙牛的卵母细胞，通过核移植技术构建转基因重构胚，由代孕母牛丙生产转基因克隆牛。下列说法正确的是（　　） A．通常用完整卵细胞作为核移植的受体细胞 B．重构胚在体外发育为早期胚胎不需提供营养 C．通过胚胎移植技术将早期胚胎转入丙牛子宫 D．转基因克隆牛的遗传物质与甲牛完全相同 【答案】C 【分析】动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 【详解】A、核移植技术中，需将卵细胞通过显微操作去核后再注射供体细胞核，A错误； B、重构胚在体外发育为早期胚胎所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分，B错误； C、受体丙牛具有健康的体质和正常的繁殖能力，故将早期胚胎转入丙牛子宫，C正确； D、转基因克隆牛的遗传物质核基因完全来源于甲牛，质基因来源于甲牛和乙牛，因此不完全相同，D错误。 故选C。 58．（22-23高二下·北京西城·期末）体细胞核移植技术具有广泛的应用前景，流程如下图。下列叙述正确的是（    ） A． ①②③④⑤产生的子代只含一个亲本的遗传物质 B．④胚胎移植前，需对受体注射促性腺激素促进排卵 C．⑥取囊胚滋养层细胞进行检测，可减少对胚胎的损伤 D．①②③⑦⑧为生殖性克隆，可获得所需组织、细胞 【答案】C 【分析】将动物的一个细胞的细胞核移入一个去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体，核移植得到的动物称克隆动物。 【详解】A、①②③④⑤产生的子代属于克隆动物，子代含两个亲本的遗传物质，一个提供细胞核，一个提供细胞质，A错误； B、胚胎移植前需要对代孕母即受体注射孕激素进行同期发情处理，以获得相同的生理状态，B错误； C、胚胎在植入前还要进行基因检查，过程④可提取囊胚的滋养层细胞进行基因检测，可减少对胚胎的损伤，C正确； D、①②③⑦⑧为治疗性克隆，可获得所需组织、细胞，D错误。 故选C。 59．（23-24高二下·北京海淀·期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 中国渔业育种的“双星” “中国克隆之父”童第周先生，上个世纪60年代在我国开创了鱼类的细胞核移植研究。鱼类的受精卵分裂过程，可在低倍镜下直接观察。童先生的实验过程如下图。 中国科学院院士——朱作言先生，在参与童先生的研究中发现，细胞质通过影响细胞核来改变生物性状的作用比较有限。因此，他提出将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变。 1984年，朱先生的团队培育出世界上首例转基因鲤鱼，早于美国3年。上世纪80年代末期，该团队克隆出草鱼与生长有关的基因和鲤鱼肌动蛋白基因（能表达出肌肉组织中的重要蛋白质）的启动子序列，将两者进行重组，注射到鲤鱼受精卵中，得到快速生长的基因改良鲤鱼，经过6代选育，培育了“冠鲤”品系。该品系生长迅速，生活周期缩短，食物转换效率高。一般鲤鱼在长江中下游需要两年的养殖周期，冠鲤养殖仅需一年。 为进行安全评估，朱先生的团队专门构建了100亩的人工池塘，持续实验5年时间。自然演化过程中的5年很短，但实验表明，“冠鲤”在野外环境中的生存力、繁殖力和竞争力较差，在自然选择中，冠鲤处于弱势。即便是这样，研究团队也没有将其释放到野外自然水体，而是等待我国政府监管部门审批。 水产养殖业是农业的重要组分，它的繁荣发展直接影响食品安全和人民生活水平。一路走来，我国科学家致力于渔业育种的研究从未止步，对世界的贡献有目共睹。 (1)童第周先生和朱作言先生的育种研究，从生命层次的角度看，分别属于___________水平。 (2)文中图示过程获得的杂交鱼更接近于________鱼的性状，该过程不包括__________。 a．有丝分裂b．减数分裂c．细胞分化d．细胞凋亡e．胚胎移植 (3)获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是_________。 (4)请从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点，并利用生物学原理或文中信息阐述支持该观点的依据，请按照下图结构填写在相应的序号位置______________。 【答案】(1)细胞水平和分子 (2) 草 e (3)使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产 (4)①支持②外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康； ①支持②生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍； ①反对②生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 【分析】细胞的全能性指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能，植物细胞的全能性大于动物细胞，但克隆动物的培育，证明高度分化的动物细胞的细胞核具有全能性。 【详解】（1）由题意可知，童第周进行的是细胞核移植研究，是在细胞水平进行的研究，朱作言将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变，是在分子水平上进行的研究； （2）文中图示过程获得的杂交鱼的遗传物质主要来自细胞核的供体草鱼，因此杂交鱼更接近于草鱼的性状，该过程包括有丝分裂、减数分裂、细胞分化、细胞凋亡，没有进行胚胎移植； （3）启动子是RNA聚合酶识别结合位点，驱动基因转录，进而完成基因的表达，因此获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产； （4）从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点：支持上市销售，依据是外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康；支持上市销售，依据是生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍；反对上市销售，依据是生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 60．（23-24高二下·北京大兴·期末）生殖性克隆和治疗性克隆是两个重要的工程技术，下图是小鼠相关的研究过程。 (1)核移植之前，卵母细胞要培养至_______期；可通过_______法使两细胞融合，形成重构胚。与胚胎细胞核移植相比，图示移植方式难度________。 (2)根据发育时期判断，图中早期胚胎是_______胚，其中的a将发育为________。胚胎移植之前，需要对代孕母鼠进行_______处理。 (3)图中过程⑥的实质是_______。过程③和过程⑦中不会出现免疫排斥反应的是________，为避免另一个过程出现免疫排斥反应，可以从________中取小鼠成纤维细胞。 (4)B技术是________性克隆。我国政府“不赞成、不允许、不支持、不接受”将________(填图中字母)技术应用于人类。 【答案】(1) 减数分裂Ⅱ中期(MII期) 电融合(灭活的病毒等) 高 (2) 囊 胎儿的各种组织 同期发情 (3) 基因的选择性表达 ③ 帕金森病模型鼠 (4) 治疗 A 【分析】1、核移植技术指的是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体；用核移植的方法得到的动物称为克隆动物，原理是动物细胞核的全能性；动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。2、胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。 【详解】（1）用于构建重组胚胎的卵母细胞需要培养至减数分裂Ⅱ中期（MⅡ期）；将供体细胞注入去核卵母细胞后，还需要通过电融合法使两细胞融合形成重构胚；由于动物胚胎细胞分化程度较低，表现全能性相对容易，故动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。 （2）由图可知，早期胚胎具有囊胚腔，是囊胚，a为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织；胚胎移植之前，需要对代孕母鼠进行同期发情处理。 （3）由图可知，过程⑥是细胞分化，细胞分化的实质是基因的选择性表达；过程③是胚胎移植，过程⑦是干细胞移植，胚胎移植过程中受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应；通过体外诱导帕金森病模型鼠细胞获得诱导多能干细胞（iPS细胞），取自身细胞形成的iPS细胞表面抗原相同，用于治疗疾病可避免免疫排斥反应。 （4）由题干和题图可知，A技术为生殖性克隆，B技术为治疗性克隆；我国政府“不赞成、不允许、不支持、不接受”将生殖性技术应用于人类。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $